CN115896126B - 一种用于调控月季花瓣颜色的基因RcMYB1及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于调控月季花瓣颜色的基因RcMYB1，所述基因序列包含以下核苷酸序列中的一种或多种：1)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；2)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列通过一个或几个核苷酸的取代、缺失、或添加衍生产生的核苷酸序列；3)与SEQ ID NO.1具有至少80％同源性的核苷酸序列。本发明采用上述的一种用于调控月季花瓣颜色的基因RcMYB1及其应用，基因序列RcMYB1在调控月季的花色发育中具有重要的作用，在月季瞬时表达株系中，月季的颜色明显变红，为月季花色育种提供了重要的基础。
Description
技术领域
本发明涉及基因序列及其应用技术领域，尤其是涉及一种用于调控月季花瓣颜色的基因RcMYB1及其应用。
背景技术
月季(Rosa chinensis Jacq.)，属蔷薇科蔷薇属，多年生木本植物，其不仅香气浓烈而且色泽鲜艳，有“花中皇后”的美称，广泛用于切花、盆花以及园林绿化等。
月季对环境的适应性强，花期长，花形千姿百态，花色五彩缤纷，在我国各地均有栽植。花色是决定植物观赏价值的最重要性状之一，开发出丰富多样的花色是花卉育种者的主要目标之一。月季的花色主要是由花青素苷来决定的，花色素苷的生物合成调控主要是由一些转录因子通过调控花色素苷生物合成的结构基因的表达从而影响这些酶的活力来调节的。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于调控月季花瓣颜色的基因RcMYB1及其应用，基因序列影响月季花瓣颜色，使其具有独特的观赏价值。
为实现上述目的，本发明提供了一种用于调控月季花瓣颜色的基因RcMYB1，所述基因序列包含以下核苷酸序列中的一种或多种：
(1)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；
(2)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列通过一个或几个核苷酸的取代、缺失、或添加衍生产生的核苷酸序列；
(3)与SEQ ID NO.1具有至少80％同源性的核苷酸序列。
一种用于调控月季花瓣颜色的氨基酸序列，所述氨基酸序列为由权利要求1所述的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
优选地，所述氨基酸序列包含以下序列中的一种或多种：
(1)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；
(2)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列通过一个或几个氨基酸的取代、缺失、或添加衍生产生的氨基酸序列；
(3)与SEQ ID NO.2具有至少80％同源性的氨基酸序列。
一种用于调控月季花瓣颜色的基因RcMYB1序列在调控月季花颜色方法中的应用。
一种调控月季花瓣颜色的方法，在目标植株中表达如权利要求1所述的核苷酸序列。
优选地，步骤如下：
S1、将权利要求1所述的核苷酸序列与pCAMBIA2300质粒进行连接；
S2、将重组载体转入农杆菌中，再通过农杆菌侵染目标植物；
S3、对目标植物进行培养获得花瓣颜色变化的月季。
优选地，目标植物为月季。
优选地，月季为‘白葡萄酒’品种。
因此，本发明采用上述一种用于调控月季花瓣颜色的基因RcMYB1及其应用，RcMYB1在调控月季的花色发育中具有重要的作用，在月季瞬时过表达的株系中，月季花瓣的颜色明显变深，这也为月季育种提供了重要的基础。
本发明通过将RcMYB1连接到pCAMBIA2300载体后，对月季花瓣小圆片抽真空，并培养4-7d获得瞬时过表达的月季花瓣小圆片，表明该转录因子可以影响月季花瓣颜色。
下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
图1是‘月月粉’不同发育时期的图片；
图2是RcMYB1在‘月月粉’不同发育时期中花青素含量；
图3是RcMYB1在‘月月粉’不同发育时期中的表达量；
图4是‘白葡萄酒’花瓣小圆片在pCAMBIA2300-RcMYB1抽真空侵染，5天后的对照和过表达花瓣小圆片表型；
图5是‘白葡萄酒’花瓣小圆片在pCAMBIA2300-RcMYB1抽真空侵染，5天后的对照和过表达花瓣小圆片中花青素含量；
图6是‘白葡萄酒’花瓣小圆片在pCAMBIA2300-RcMYB1抽真空侵染，5天后的对照和过表达花瓣小圆片中RcMYB1和其他花色素形成相关基因的表达量。
具体实施方式
以下通过附图和实施例对本发明的技术方案作进一步说明。
除非另外定义，本发明使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的主旨或基本特征的情况下，能够以其它的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内，不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其它实施方式。这些其它实施方式也涵盖在本发明的保护范围内。
还应当理解，以上所述的具体实施例仅用于解释本发明，本发明的保护范围并不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明/发明的保护范围之内。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。所采用的试剂，若无特殊说明，均为市售或公开渠道可以获得的试剂。
在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒等。
实施例一
月季RcMYB1基因的克隆
利用引物，引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，采用RT-PCR方法从月季cDNA中扩增出一条756bp的条带。PCR产物回收，获取RcMYB1基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，该核苷酸序列编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，由253个氨基酸残基组成，分子量为29.28千道尔顿(kDa)。
实施例二
RcMYB1在不同发育时期月季花青素含量测定
(1)测定如图1所示，不同发育时期的‘月月粉’的花青素含量，提取试剂盒为RNAplant(市售)，利用反转录试剂盒(市售)将总RNA反转录成cDNA。
(2)将不同发育时期的‘月月粉’，称重，放入1.5mL离心管中，加入1mL盐酸甲醇(1﹕99)，避光保存，放入4℃冰箱过夜。在530nm，657nm处测定提取液的吸光值，并利用公式计算花青素的含量：(A530-0.25×A657)/鲜重。
(3)对不同发育时期的‘月月粉’的花青素含量测定如图2所示，花青素在S5、S6、S7中表达较高。
实施例三
RcMYB1在不同发育时期月季表达谱
(1)提取如图1所示，不同发育时期的‘月月粉’的RNA，提取试剂盒为RNAplant(市售)，利用反转录试剂盒(市售)将总RNA反转录成cDNA。
(2)根据转录组测序数据设计引物，引物序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
(3)以不同发育时期的‘月月粉’反转录得到的cDNA为模板，对RcMYB1进行不同发育时期的表达谱验证如图3所示，RcMYB1的表达在不同发育时期不同。在花瓣着色期S2和S3以中表达较高。进一步说明RcMYB1参与月季花瓣颜色的形成。
实施例四
‘白葡萄酒’月季RcMYB1基因过表达
将RcMYB1基因的开放阅读框753bp可操作地连接于pCAMBIA2300载体，形成含有该基因片段的pCAMBIA2300-RcMYB1载体，将该载体转入农杆菌GV3101，通过农杆菌介导的方法，进行抽真空侵染月季花瓣小圆片，通过4-7d培养，观察‘白葡萄酒’月季的表型，如图4所示，‘白葡萄酒’过表达花瓣小圆片颜色均明显变红。
(1)将RcMYB1基因的开放阅读框753bp连接于pCAMBIA2300载体，形成含有该基因片段的pCAMBIA2300-RcMYB1载体。
(2)将步骤(1)中的载体转入农杆菌(GV3101)。
(3)取步骤(2)中农杆菌(GV3101)，在5ml含有100μM的乙酰丁香酮和50μg/ml卡那霉素的LB培养基中，在28℃，200rpm培养16h。
(4)将取步骤(3)中农杆菌在含有100μM乙酰丁香酮和50μg/ml卡那霉素的50ml LB培养基中继代培养，并在28℃200rpm下孵育13-16h，直到OD600达到0.8-1.0。
(5)取步骤(4)中农杆菌菌液，4℃，3700rpm，离心9min，弃上清；超净工作台中，用5mL MgCl2，重悬菌体，4℃，3700rpm，离心9min，弃上清(重复一次)；
(6)适量MgCl2使菌体沉淀重悬，双载体注射OD600为1.2；菌液中加入其1.5倍体积AS以及20倍体积MES，使细胞沉淀重悬。在室温下静置2h。
(7)使用打孔器取月季第二层和第三层花瓣，进行打孔，获得花瓣小圆片。
(8)使用抽真空仪器将步骤(6)的农杆菌转化液，侵染月季花瓣小圆片中培养4-7d；
(9)观察月季花瓣，如图5和6所示，月季过表达花瓣小圆片颜色均明显变红。
实施例五
‘白葡萄酒’月季过表达花瓣小圆片中，RcMYB1基因及花色素合成相关基因的表达验证
(1)测定如图4所示，对照和过表达花瓣小圆片的花青素含量，提取试剂盒为RNAplant(市售)，利用反转录试剂盒(市售)将总RNA反转录成cDNA。
(2)将对照和过表达花瓣小圆片，称重，放入1.5mL离心管中，加入1mL盐酸甲醇(1﹕99)，避光保存，放入4℃冰箱过夜。在530nm，657nm处测定提取液的吸光值，并利用公式计算花青素的含量：(A530-0.25×A657)/鲜重
(3)对对照和过表达花瓣小圆片的花青素含量测定如图5所示，花青素在过表达的花瓣小圆片中表达较高。
实施例六
‘白葡萄酒’月季过表达花瓣小圆片中，RcMYB1基因及花色素合成相关基因的表达验证
(1)选取如图4所示的对照和过表达的花瓣小圆片，提取其总RNA，提取试剂盒为RNAplant(市售)，利用反转录试剂盒(市售)将总RNA反转录成cDNA。
(2)根据转录组测序数据设计引物，引物序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
(3)对照和过表达花瓣小圆片的反转录得到cDNA为模板，对RcMYB1以及花色素合成相关基因进行基因过表达效率验证，如图6所示，RcMYB1以及花色素合成相关基因的表达在‘白葡萄酒’突变株系花瓣中均显著升高，证明RcMYB1过表达效率较高，也进一步说明了RcMYB1参与了‘白葡萄酒’月季花瓣颜色的形成。
因此，本发明采用上述一种用于调控月季花瓣颜色的基因RcMYB1及其应用，月季的花色各异，RcMYB1影响月季花瓣的颜色，正调控月季花色的形成，在‘白葡萄酒’RcMYB1的瞬时过表达的植株中花瓣颜色变红，而RcMYB1表达量在‘白葡萄酒’过表达的花瓣小圆片中也较对照显著升高。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其进行限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而这些修改或者等同替换亦不能使修改后的技术方案脱离本发明技术方案的精神和范围。
Claims (2)
1.一种调控月季花瓣颜色的方法，其特征在于：在目标植株中表达如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的一种调控月季花瓣颜色的方法，其特征在于，步骤如下：
S1、将权利要求1所述的核苷酸序列与pCAMBIA2300质粒进行连接；
S2、将重组载体转入农杆菌中，再通过农杆菌侵染目标植物；
S3、对目标植物进行培养获得花瓣颜色变化的月季。
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