CN112522280B

CN112522280B - 一种用于调控小兰屿蝴蝶兰花瓣颜色的基因PeMYB4序列及其应用

Info

Publication number: CN112522280B
Application number: CN202011416768.9A
Authority: CN
Inventors: 明凤; 王锐; 徐庆于; 毛婵娟; 李威
Original assignee: Shanghai Normal University
Current assignee: Shanghai Normal University
Priority date: 2020-12-07
Filing date: 2020-12-07
Publication date: 2023-05-16
Anticipated expiration: 2040-12-07
Also published as: CN112522280A

Abstract

本发明公开了一种用于调控小兰屿蝴蝶兰花瓣颜色的基因序列，所述基因序列包含以下核苷酸序列中的一种或多种：1)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；2)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列通过一个或几个核苷酸的取代、缺失、或添加衍生产生的核苷酸序列；3)与SEQ ID NO.1具有至少80％同源性的核苷酸序列；本发明基因序列PeMYB4在调控小兰屿蝴蝶兰的花色发育中具有重要的作用，在小兰屿蝴蝶兰VIGS株系中，小兰屿蝴蝶兰的颜色明显变浅，这也为小兰屿蝴蝶兰花色育种提供了重要的基础。

Description

一种用于调控小兰屿蝴蝶兰花瓣颜色的基因PeMYB4序列及其应用

技术领域

本发明涉及一种基因序列及其应用，具体涉及一种调控小兰屿蝴蝶兰花瓣颜色的基因序列及其应用。

背景技术

花卉植物具有重要的观赏价值和经济价值，其中花色作为重要的观赏性状之一，具有十分重要的研究意义；而花色主要受到MYB转录因子家族的调控。MYB基因家族广泛存在于真核细胞中，也是植物中最大的基因家族之一(Dubos et al.,2010)。MYB基因家族在序列N端附近存在着高度保守的DNA结合结构域，该结构域由1-4个不完全重复序列串联，每一个重复序列包含52个左右的氨基酸残基，第二个重复序列和第三个重复序列构成螺旋-转角-螺旋(helix-turn-helix,HTH)的结构，包含3个色氨酸，同时被18-19个氨基酸残基间隔开，形成一个可以与靶基因相互作用的二级结构；而在序列的C端，存在着差异性较大的保守结构域，使得MYB基因家族有着不同的调节功能。MYB基因可以根据不完全重复序列的数目，可将MYB基因划分为四个不同的类型，根据不完全重复序列的数目可以划分为2R(R2R3-MYB)，3R(R1R2R3-MYB)，4R(R1R2R2R1/2-MYB)和1R-MYB(MYB-related proteins)，其中R2R3-MYB基因占比较多(Ma and Constabel,2019)。

R2R3-MYB是参与调控植物花青素生物合成最大类群的MYB转录因子，在调节花青素生物合成中起着重要作用。其中，R2R3-MYB对花青素生物合成的调控有正调控和负调控两方面作用，这使得花青素在不同的植物器官中保持平衡。如拟南芥中，与花青素合成相关的R2R3-MYB正调控因子包括AtMYB75(PAP1)、AtMYB90(PAP2)、AtMYB113、AtMYB114；在茄科蔬菜中，R2R3-MYB正调控因子的编码基因是矮牵牛花PhAN2的同源基因(Teresa et al.,2016)。两种MYB基因SlANT1或SlAN2的过表达可导致花青素的积累。参与调控植物花青素生物合成作用除上述正调控因子外，还存在对花青素合成起抑制作用的负调控因子。番茄中SlMYBATV可以抑制花青素的积累，R2R3-MYB转录因子Aft(Anthocyanin fruit)可以直接与SlMYBATV启动子结合，激活其转录，从而负调控花青素合成(Yan et al.,2020)。

在对小兰屿蝴蝶兰研究中，我们对不同时期小兰屿蝴蝶兰花器官分析后找到一个R2R3-MYB家族中的MYB4转录因子，通过功能验证发现它对花色调控具有重要作用。

发明内容

本发明的目的在于解决上述现有技术的不足，提供一种调控小兰屿蝴蝶兰花瓣颜色的基因序列及其应用。所述基因序列可以影响小兰屿蝴蝶兰花瓣颜色，使其具有独特的观赏价值。

为实现上述目的，本发明的第一个方面提供了一种调控小兰屿蝴蝶兰花瓣颜色的基因序列，所属基因序列包括以下核苷酸序列中的一种或多种：

1)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

2)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列通过一个或几个核苷酸的取代、缺失、或添加衍生产生的核苷酸序列；

3)与SEQ ID NO.1具有至少80％同源性的核苷酸序列。

本发明的第二个方面提供了一种氨基酸序列，其能影响小兰屿蝴蝶兰花瓣颜色的基因，该氨基酸序列，选自如下序列中的一种或多种：

1)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；

2)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列通过一个或几个氨基酸的取代、缺失、或添加衍生产生的氨基酸序列；

3)与SEQ ID NO.2具有至少80％同源性的氨基酸序列。

本发明的第三个方面提供了如上所述的核苷酸序列或如上所述的氨基酸序列在影响小兰屿蝴蝶兰花瓣颜色中的应用。

进一步地，植物材料为小兰屿蝴蝶兰。

进一步地，小兰屿蝴蝶兰主要为野生型蝴蝶兰。

本发明的第四个方面提供了一种调控小兰屿蝴蝶兰花瓣颜色的方法，包括向目标植物中沉默如上所述的核苷酸序列。

进一步地，将如上所述的核苷酸序列通过BP反应连接到CymMV病毒载体上，然后将重组植物表达载体转入目标植物中，通过培养获得PeMYB4瞬时沉默的突变体。

本发明提供的从蝴蝶兰中克隆的转录因子PeMYB4，连接到CymMV病毒载体后，通过注射小兰屿蝴蝶兰的叶片，并通过30-40d的培养获得突变体，表明该转录因子可以影响小兰屿蝴蝶兰花瓣颜色。

本发明的优点是：本发明所述PeMYB4在调控小兰屿蝴蝶兰的花色发育中具有重要的作用，在小兰屿蝴蝶兰VIGS株系中，小兰屿蝴蝶兰花瓣的颜色明显变浅，这也为小兰屿蝴蝶兰育种提供了重要的基础。

附图说明

图1是小兰屿蝴蝶兰不同花芽发育时期的花苞图片。

图2是PeMYB4在小兰屿花芽不同发育时期的表达量。

图3是小兰屿蝴蝶兰不同组织的图片。

图4是PeMYB4在小兰屿不同组织中的表达量。

图5是小兰屿蝴蝶兰在注射CymMV-PeMYB4，30天后的对照和沉默突变株系表型。

图6是小兰屿蝴蝶兰在注射CymMV-PeMYB4，30天后的对照和沉默突变株系花瓣中PeMYB4和其他花色素形成相关基因的表达量。

图7是大辣椒蝴蝶兰在注射CymMV-PeMYB4，30天后的对照和沉默突变株系花瓣的表型。

图8是大辣椒蝴蝶兰在注射CymMV-PeMYB4，30天后的对照和沉默突变株系花瓣中PeMYB4的表达量。

图9是大辣椒蝴蝶兰在注射CymMV-PeMYB4，30天后对照和沉默突变株系萼片表型图

图10是大辣椒蝴蝶兰在注射CymMV-PeMYB4，30天后对照和沉默突变株系萼片、唇瓣、合蕊柱中PeMYB4的表达量。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明作进一步地说明，应理解这些实施例仅作为例证的目的，不用于限制本发明的保护范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。所采用的试剂，若无特殊说明，均为市售或公开渠道可以获得的试剂。

在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒等。

小兰屿蝴蝶兰的花色各异，通过研究发现小兰屿蝴蝶兰中PeMYB4影响小兰屿蝴蝶兰花瓣的颜色，正调控小兰屿蝴蝶兰花色的形成，在小兰屿蝴蝶兰与大辣椒蝴蝶兰PeMYB4的VIGS的植株中花瓣颜色变浅，而PeMYB4在小兰屿蝴蝶兰与大辣椒蝴蝶兰的表达量在沉默突变株系中也较对照的表达量显著降低。

实施例1蝴蝶兰PeMYB4基因的克隆

提取野生型蝴蝶兰花瓣总RNA，提取试剂盒为RNAplant(市售)，利用反转录试剂盒(市售)将总RNA反转录成cDNA。根据转录组测序结果设计引物，引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，采用RT-PCR方法从蝴蝶兰cDNA中扩增出一条738bp的条带。PCR产物回收，获取PeMYB4基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该核苷酸序列编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，由245个氨基酸残基组成，分子量为28.35千道尔顿。

实施例2不同发育时期小兰屿蝴蝶兰表达谱验证

(1)提取如图1所示，不同发育时期的小兰屿蝴蝶兰的RNA，提取试剂盒为RNAplant(市售)，利用反转录试剂盒(市售)将总RNA反转录成cDNA。

(2)根据转录组测序数据设计引物，引物序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

(3)以不同发育时期的小兰屿蝴蝶兰反转录得到的cDNA为模板，对PeMYB4进行不同发育时期的表达谱验证如图2所示，PeMYB4的表达在不同发育时期受到了显著诱导。说明PeMYB4可能参与了小兰屿蝴蝶兰的花瓣颜色形成。

实施例3 PeMYB4在不同组织小兰屿蝴蝶兰表达谱验证

(1)提取如图3所示，不同组织部位的小兰屿蝴蝶兰的RNA，提取试剂盒为RNAplant(市售)，利用反转录试剂盒(市售)将总RNA反转录成cDNA。

(3)以不同组织部位的小兰屿蝴蝶兰反转录得到的cDNA为模板，对PeMYB4进行不同组织部位的表达谱验证如图4所示，PeMYB4的表达在不同组织不同。在花瓣、唇瓣和萼片中表达较高。说明PeMYB4可能参与小兰屿蝴蝶兰花瓣颜色的形成。

实施例4 CymMV病毒诱导小兰屿蝴蝶兰与大辣椒蝴蝶兰PeMYB4基因沉默

将PeMYB4基因的开放阅读框200-300bp可操作地连接于CymMV病毒载体，形成含有该基因片段的CymMV-PeMYB4载体，将该载体转入农杆菌GV3101，通过农杆菌介导的方法，进行注射小兰屿蝴蝶兰叶片与大辣椒叶片的的花序，通过30-40d培养，观察小兰屿蝴蝶兰与大辣椒蝴蝶兰的表型，如图5和图7，9所示，小兰屿蝴蝶兰与大辣椒蝴蝶兰沉默突变株系的花瓣颜色均明显变浅。

(1)将PeMYB4基因的开放阅读框200-300bp可操作地连接于CymMV病毒载体，形成含有该基因片段的CymMV-PeMYB4载体。

(2)将步骤(1)中的载体转入农杆菌(GV3101)。

(3)取步骤(2)中农杆菌(GV3101)，在5ml含有100μM的乙酰丁香酮和50μg/ml卡那霉素的LB培养基中，在28℃，200rpm培养16h。

(4)将取步骤(3)中农杆菌在含有100μM乙酰丁香酮和50μg/ml卡那霉素的50ml LB培养基中继代培养，并在28℃200rpm下孵育13-16h，直到OD600达到0.8-1.0。

(5)取步骤(4)中农杆菌菌液，转移至50ml离心瓶中，并在4℃，3000g下离心10分钟。

(6)离心后，除去上清液。加入300μl含100μM乙酰丁香酮的MS培养基，使细胞沉淀重悬。在室温下静置0.5h。

(7)使用带有针头的1ml注射器吸取步骤(6)的农杆菌转化液，注射无病毒小兰屿蝴蝶兰叶片与大辣椒蝴蝶兰花序。

(8)注射后培养30-40天观察小兰屿蝴蝶兰花瓣，如图6和图9所示，小兰屿蝴蝶兰沉默突变株系的花瓣颜色均明显变浅。

实施例5 CymMV病毒诱导小兰屿蝴蝶兰与大辣椒蝴蝶兰突变株系中，PeMYB4基因及花色素合成相关基因的表达验证

(1)选取如图5和图7所示的对照和沉默突变株系的花瓣，提取其总RNA，提取试剂盒为RNAplant(市售)，利用反转录试剂盒(市售)将总RNA反转录成cDNA。

(3)对照和沉默突变株系花瓣的反转录得到cDNA为模板，对PeMYB4以及花色素合成相关基因进行基因沉默效率验证，如图6和图8所示，PeMYB4以及花色素合成相关基因的表达在小兰屿蝴蝶兰和大辣椒蝴蝶兰突变株系花瓣中均显著降低，证明PeMYB4沉默效率较高，也进一步说明了PeMYB4参与了小兰屿蝴蝶兰及大辣椒蝴蝶兰花瓣颜色的形成。

实施例6 CymMV病毒诱导小兰屿蝴蝶兰与大辣椒蝴蝶兰突变株系，PeMYB4基因在萼片、唇瓣、合蕊柱中的表达验证

(1)选取如图7和图9所示的萼片、唇瓣、合蕊柱，提取其总RNA，提取试剂盒为RNAplant(市售)，利用反转录试剂盒(市售)将总RNA反转录成cDNA。

(3)如图7和图9所示的萼片、唇瓣、合蕊柱的反转录得到的cDNA为模板，对PeMYB4进行基因沉默效率验证，如图10所示，PeMYB4的表达量在沉默突变株系的萼片、唇瓣、合蕊柱中的表达量均降低。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海师范大学

<120> 一种用于调控小兰屿蝴蝶兰花瓣颜色的基因PeMYB4序列及其应用

<130> 0

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 738

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 蝴蝶兰

<400> 1

atggtgagag ctccatgctg cgagaagatg gggctaaaga aggggccatg gactgcagag 60

gaggaccaga ttctgatctc ttatatacaa aaccatggcc atggaaactg gagagctctc 120

ccaaagctag ctggattgtt gaggtgtggg aagagttgca gacttcggtg gacgaattat 180

ctcagacctg atattaaaag agggaacttt accagggaag aagaggatgc aatcattaac 240

ttgcatcaaa tgctgggaaa cagatggtct gcaattgcag cgaagctacc tggtagaaca 300

gataatgaga tcaaaaacgt atggcacact catctgaaga aaagattaac gagaaccgat 360

aaagagaccg gacaagaacg aatcagaaaa actcaaatag aaccaaagga agagatgccc 420

acacaatcat acagcagcac tccagaacca tcttcttcct ccagtactgt agacaacagt 480

cagaactcca tggaatcttt cagccatgaa gctgaagccc aagggatcga tgagagcttc 540

tggactgaag tgctgaaaat ggatagtaat gatgagtatt actgtaactc gtcggattca 600

atggcgatgg aaggatttaa ttcctctgat ttcagttatg acaaattttg gctgtcagct 660

ggcgtgagag aagaggatga tgatttgagt ttttggttga ggatctttct gcaagctgaa 720

gaatttccac agatttga 738

<210> 2

<211> 245

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 蝴蝶兰

<400> 2

Met Val Arg Ala Pro Cys Cys Glu Lys Met Gly Leu Lys Lys Gly Pro

1 5 10 15

Trp Thr Ala Glu Glu Asp Gln Ile Leu Ile Ser Tyr Ile Gln Asn His

20 25 30

Gly His Gly Asn Trp Arg Ala Leu Pro Lys Leu Ala Gly Leu Leu Arg

35 40 45

Cys Gly Lys Ser Cys Arg Leu Arg Trp Thr Asn Tyr Leu Arg Pro Asp

50 55 60

Ile Lys Arg Gly Asn Phe Thr Arg Glu Glu Glu Asp Ala Ile Ile Asn

65 70 75 80

Leu His Gln Met Leu Gly Asn Arg Trp Ser Ala Ile Ala Ala Lys Leu

85 90 95

Pro Gly Arg Thr Asp Asn Glu Ile Lys Asn Val Trp His Thr His Leu

100 105 110

Lys Lys Arg Leu Thr Arg Thr Asp Lys Glu Thr Gly Gln Glu Arg Ile

115 120 125

Arg Lys Thr Gln Ile Glu Pro Lys Glu Glu Met Pro Thr Gln Ser Tyr

130 135 140

Ser Ser Thr Pro Glu Pro Ser Ser Ser Ser Ser Thr Val Asp Asn Ser

145 150 155 160

Gln Asn Ser Met Glu Ser Phe Ser His Glu Ala Glu Ala Gln Gly Ile

165 170 175

Asp Glu Ser Phe Trp Thr Glu Val Leu Lys Met Asp Ser Asn Asp Glu

180 185 190

Tyr Tyr Cys Asn Ser Ser Asp Ser Met Ala Met Glu Gly Phe Asn Ser

195 200 205

Ser Asp Phe Ser Tyr Asp Lys Phe Trp Leu Ser Ala Gly Val Arg Glu

210 215 220

Glu Asp Asp Asp Leu Ser Phe Trp Leu Arg Ile Phe Leu Gln Ala Glu

225 230 235 240

Glu Phe Pro Gln Ile

245

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 3

atggtgagag ctccatgctg cgag 24

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 4

tcaaatctgt ggaaattctt cagc 24

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 5

gcgaagctac ctggtagaac 20

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 6

attcgttctt gtccggtctc tc 22

Claims

1.一种使小兰屿蝴蝶兰花瓣颜色变浅的方法，其特征在于，对目标植物中沉默如SEQID NO.1所示的核苷酸序列。

2.如权利要求1所述的使小兰屿蝴蝶兰花瓣颜色变浅的方法，其中，将权利要求1所述的核苷酸序列连接到CymMV病毒质粒上面，然后将重组载体转入农杆菌，再通过农杆菌侵染目标植物，通过培养获得花瓣变浅的小兰屿蝴蝶兰。