CN101200722A - 蝴蝶兰orap11基因编码序列及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子生物学、基因工程技术领域，具体为一种在蝴蝶兰中表达的SQUA基因家族的ORAP11基因的核苷酸编码序列及其在改变花发育，成花转变和形态构建方面的应用。本发明涉及包含上述基因的重组表达载体，转基因植株，获得此基因的核苷酸引物系列，用于检测内源表达模式的寡核苷酸探针序列，以及对蝴蝶兰此内源基因的表达模式进行分析鉴定的方法。将本发明所说基因转入烟草，所获得的转基因植株开花时间和植株营养与生殖器官形态均发生明显变化。

Description

蝴蝶兰ORAP11基因编码序列及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学、基因工程技术领域，具体涉及一种在蝴蝶兰中表达的ORAP11基因的核苷酸编码序列，包含上述基因的重组表达载体，转基因植株，以及对蝴蝶兰此基因的表达模式进行分析鉴定的所使用的引物序列和方法。

背景技术

兰科属于世界性四个特大科之一，起源古老，进化速率极其不同步，是种子植物系统发育在单子叶植物中的一个高峰，具有典型性和代表性(吴征镒，2003)。

兰花结构高度特化，其花被的高度变异(如似花瓣的萼片和唇瓣)及合蕊柱的出现为研究ABC功能基因提供了新的平台和视角，并可能会拓展经典ABC功能基因概念的外延。

由于SQUA-like家族仅存在于被子植物，但MADS-box基因家族广泛存在于整个植物界，因此对其研究有助于理解被子植物的起源和系统发育。

至今，已在蝴蝶兰中发现B类和C类基因。PeMADS2～PeMADS5属于B类DEF/AP3家族基因，而PeMADS6属于B类GLO/PI家族基因。在野生型蝴蝶兰中，PeMADS2在萼片和花瓣强表达，在蕊柱弱表达，在唇瓣和花粉块不表达。PeMADS3在花瓣，唇瓣强表达，在蕊柱弱表达，在萼片和花粉块不表达。PeMADS4仅在唇瓣和蕊柱表达。PeMADS5主要在花瓣表达，但在萼片，唇瓣和蕊柱中也有表达。PeMADS6在花芽，未成熟的子房，和成花的所有花器官(除花粉块外)均有表达；但在营养器官没有表达。在授粉诱导或自然衰老的过程中，PeMADS6在花和未成熟的子房中的表达减少；表明其对子房或胚珠的发育有抑制作用。研究表明，PeMADS6在蝴蝶兰中不仅决定花器官特性，而且在控制花的寿命和胚珠发育也发挥作用。

PhalAG1和PhalAG2分别属于AG家族C类和D类基因。它们在花芽，唇瓣，蕊柱和胚珠中都有表达，在营养器官没有表达。两者相似的表达模式表明它们在花发育中功能冗余。

目前A类基因仅在石斛兰中有报道。来自Dendrobium Madame Thong-In的DOMADS2刚开始在六周的营养芽顶端分生组织表达，此时花发育明显的形态学改变还未发生；表达贯穿整个成花转变过程，随后定位于成花的蕊柱。来自Dendrobium thyrsiflorum的DthyrFL1～DthyrFL3在花序高表达，在胚珠中度表达，在根和叶为低表达。

在本研究中，我们从蝴蝶兰花芽中分离出一个SQUA-like基因，ORAP11。系统进化分析表明这个基因属于单子叶A类基因。原位杂交显示它们的表达模式不同于经典的A功能基因。转基因烟草表明它们能加速开花并改变植株的形态构建。

发明内容

本发明的目的在于提出一种从蝴蝶兰中克隆出的ORAP11基因，其编码序列和应用。

本发明的一方面提供一种新的蝴蝶兰基因，记为ORAP11，已注册于GenBank/EMBL/DDBJ，登陆号为：DQ104328。它为具有特定序列的DNA分子，包括一个753bp的开放读框，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供上述基因编码翻译出的蛋白质分子，有长250个搭配残基，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了用于调取获得蝴蝶兰样品中ORAP11基因的方法，即使用如下核苷酸引物系列，分别对基因相应区段进行扩增。包括根据所述ORAP11基因所属保守区域设计的兼并引物MonoAP1和MonoAP2；为获得基因3’和5’末端的两对引物：兼并引物ORAP1F和反向特异性引物615ORAP11R，以及正向特异性引物226ORAP11F和B25。首先使用兼并引物MonoAP1和MonoAP2获得长约750bp的cDNA部分片段。5’端序列通过兼并引物ORAP1F和基因反向特异性引物615ORAP11R获得；3’端序列通过基因正向特异性引物226ORAP11F和B25获得。具体序列信息参见SEQ ID NO.3。

本发明还提供了一种用于检测样品中蝴蝶兰ORAP11基因拷贝数的方法，其使用前述核苷酸序列SEQ ID NO.1对蝴蝶兰基因组DNA样品进行Southern杂交，然后检测目的片段的有无。样品为蝴蝶兰的基因组DNA，经限制性内切酶酶切后的核苷酸片段。而获得杂交探针分子的引物根据ORPA11基因的特异区段设计，序列为：500ORAP11F和1008ORAP11R，具体序列见SEQ ID NO.4所示。

本发明还提供了一种用于检测ORAP11基因在蝴蝶兰原植株组织中表达分布状况的方法和为获得检测分子使用的DNA引物序列。取小块组织材料，经多聚甲醛处理和梯度脱水，包埋于石蜡组织中。实验检测时取复水和蛋白酶K处理过的切片与事先制备的DNA探针分子在杂交液中混合杂交，显色后观察拍照。而杂交使用的DNA探针分子由根据ORAP11基因的特异区段设计的引物获得，两引物分别为500F11和1008R11，引物序列如SEQ ID NO.5所示。

本发明还提供了一种将上述的编码具有蝴蝶兰ORAP11基因转入烟草以改变成花过程和形态建成的方法，具体步骤如下：

(1)将编码蝴蝶兰ORAP11基因的核苷酸序列SEQ ID NO.1可操作的连接植物表达载体，形成含有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的载体；

(2)将步骤(1)中的表达载体转入农杆菌，并将菌液与烟草叶片混合培养。

(3)通过抗生素筛选，PCR鉴定，获得转化细胞并再生转基因植株。

在构建表达载体的过程中，为扩增蝴蝶兰ORAP11基因的开放阅读框，使之可操作的连接与转化质粒，使用到了引物ORAPF和ORAP11R。具体序列信息见SEQ ID NO.6。

附图说明

图1 RT-PCR扩增ORAP11基因的结果。Lane 1为根据植物中SQUA-like基因的保守区设计引物，以包括不同发育时期的蝴蝶兰花芽的cDNA为模板，利用PCR的方法获得的蝴蝶兰SQUA-like基因ORAP11。图中最亮的大小约750bp的条带即为目的片段。

图2 蝴蝶兰中ORAP11基因的Southern blot分析。基因组DNA各15μg分别用DraI(d)，EcoR V(e)和HindIII(h)三种市售的酶消化。右边数字代表分子量大小(kb，千碱基对)。结果显示ORAP11基因为单拷贝。

图3 ORAP11基因和其它SQUA-like基因的系统进化分析。利用PAUP软件，依据这些基因保守的MIK区的核苷酸序列，构建最大简约树。ORAP11基因和来自其它单子叶植物的同源基因聚为一类，形成一个单系亚家族，表明它们有且仅有一个共同的祖先。

图4 ORAP11基因在蝴蝶兰不同组织的表达模式。其中PLB圆球茎，root根，leaf叶，bud芽，sepal萼片，petal花瓣，lip唇瓣，column蕊柱。Actin为内源肌动蛋白，作为内参照。

图5原位杂交检测ORAP11基因在蝴蝶兰器官(根，顶芽，花芽和胚珠的纵切或横切切片)中的时空表达模式。ORAP11转录本在蝴蝶兰根尖、顶芽、花芽和胚珠中的表达模式。用地高辛标记的反义探针(a-e，g-i)和正义探针(f)杂交纵切或横切切片。a在刚抽梗一个节位的蝴蝶兰中，ORAP11转录本在芽顶端分生组织和苞片中没有表达。b在花序分生组织，花分生组织，花原基和萼片原基中可检测到杂交信号，在分生组织中心区的维管束原也有表达。ORAP11转录本在整个花芽发育阶段都可检测到。c-e，g在正在发育的花瓣和唇瓣的边缘和顶端可检测到杂交信号，在蕊柱的花粉块也有。h在未授粉的胚珠中可检测到信号。i-k在授粉后的胚珠中可检测到信号。l在根顶端分生组织中有表达

图6转基因烟草的PCR检测。扩增出特异性条带说明所取烟草材料中带有被转入的蝴蝶兰ORAP11基因。

图7异源表达ORAP11改变烟草花时和植株形态。较野生型WT(a)相比，转基因植株(b)出现明显的早花和矮化现象。

图8异源表达ORAP11改变转基因烟草花的发育。a，b，e裂开的花筒。c一具有7个花瓣(c1)，5个正常雄蕊和2个雄蕊化的花瓣(c2)的异常花。d花序枝缩短以致所有的花序簇成一团。f一具有裂开的花筒(f1)和雄蕊化的花瓣(f2)的异常花。g表型严重受影响的花(g1)，所有的雄蕊花瓣化(g2)。h重度表型的花，具雄蕊化的花瓣(h1，右下角)和花瓣化的雄蕊(h2)。i具有裂筒(i1)，部分雄蕊花瓣化(i2)和胚胎状雌蕊(i3)的异常花。

具体实施方式

下面结合具体实施实例进一步阐释本发明。应理解，这些实例仅以用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实例中未注明具体的实验方法，均可按照常规方法进行。如Sambrook等分子克隆：实验手册(New York：Cold Spring Harbor Labortary Press，1989)中所述条件，或按照制造生产厂商的使用说明。

实施例1

蝴蝶兰ORAP11基因的克隆。

1蝴蝶兰(Phalaenopsis hybrida)品种Formosa rosa来自上海农业科学院蔬菜园艺研究所；生长条件为光周期16h/8h(L/D)，25℃。

2 RNA提取。取100毫克左右新鲜的材料，液氮充分研磨。加1mL TriBlue试剂，用力摇15s，室温放置5min。加0.2mL氯仿，去蛋白，上清转移至新的离心管，加等体积异丙醇，充分混匀，室温放置10min。用DEPC配制的75％乙醇1mL洗涤沉淀，重复一次。室温干燥5～10min，溶于20μL DEPC水中，测OD值，电泳检测。

3基因的克隆。通过对已发表的ORAP11基因序列进行同源性比较，根据保守区设计兼并引物MonoAP1和MonoAP2，进行RT-PCR，扩增结果如图1所示。得到约750bp的cDNA部分片段，命名为ORAP11。5’端序列通过兼并引物ORAP1F和基因反向特异性引物615ORAP11R获得；3’端序列通过基因正向特异性引物226ORAP11F和B25获得。具体序列信息参见SEQ ID NO.3。

实施例2

蝴蝶兰ORAP11基因的拷贝数分析

用CTAB法抽取蝴蝶兰基因组，取10μgDNA分别用DraI，EcoRV和HindIII三种市售的酶消化，37℃酶切过夜。以0.8％琼脂糖凝胶将酶切产物进行电泳分离，电泳结果如图2所示。转移DNA并固定于尼龙膜上。探针杂交确定其为单拷贝。

实施例3

蝴蝶兰ORAP11基因表达模式分析

分别提取蝴蝶兰植株的根、叶片、花梗、花蕾以及花器官(花萼、翼瓣、唇瓣和蕊柱)的总RNA。测定OD₂₆₀后定量取出1μg RNA，反转录.以特异引物进行PCR。反应产物以1.0％琼脂糖凝胶电泳分离，结果如图4所示。

实施例4

原位杂交

1取得较小的组织材料，以4％的多聚甲醛固定12小时。再以乙醇梯度脱水，包埋于石蜡块当中。

2将载玻片和盖玻片浸于铬酸洗液中2天，然后蒸馏水漂洗。再以多聚赖氨酸(PLL，1mg/ml)浸泡或涂片，37℃或42℃烘干备用。

3特异性探针分子为基因3’末端非转录区域一段特异的长约250bp的DNA序列。

4石蜡样品切片后脱腊，复水并以蛋白酶消化组织蛋白。经预杂交后与事先变性处理的探针分子在杂交液中50℃共浴16h。

5杂交后，以血清封闭探针，利用特异性抗体与杂交上的探针分子结合，并予染色。

6水溶性封片剂封片，显微观察并照相。

原位杂交结果如图5所示。

实施例5

蝴蝶兰ORAP11基因在烟草细胞中进行真核表达及转基因植株的表型鉴定

1含目的基因(蝴蝶兰ORAP11基因)表达载体的构建

根据以蝴蝶兰ORAP11基因全长编码序列，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在正反向引物上分别引入限制性内切酶识别位点(视选用的载体而定)，以便构建表达载体。以实施例1中获得的扩增产物为模板，在5’端和3’端分别加入XbaI和SacI酶切位点。经XbaI和SacI双酶切的PCR产物与经过同样双酶切的pCAMBIA 2301M植物表达载体连接，转化，测序，确保开放读框正确。将其转入农杆菌中。利用叶圆盘法技术转化模式植物烟草。

2利用叶盘法转化烟草

●用灭菌牙签挑取LB选择培养基上的阳性克隆，接种于2mlLB液体(利福平40mg/L，卡那霉素50mg/L，链霉素50mg/L)，28℃200rpm振荡培养24-36h；

●室温下4000g离心10min；

●弃上清，菌体用1/2MS液体培养基重悬，稀释到原体积的5-20倍，使OD₆₀₀＝0.5左右；

●取生长两周左右的烟草的无菌叶片，去其叶主脉，将其剪成约1平方厘米见方的小叶片；

●将叶片放入制备好的菌液中，浸泡2-5min，在无菌滤纸上吸干菌液；

●将侵染的叶片放于MS培养基上，28℃暗培养48h；

●将叶片转到愈伤培养基(MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+卡那霉素50mg/L+头孢霉素250mg/L)上，25-28℃光照下培养，7-15天见愈伤组织形成；

●约20天后可见分化芽长出，待芽长大后，切下，置于生根培养基上(1/2MS+NAA(0.5mg/L+卡那霉素50mg/L+头孢霉素250mg/L)；

●待根系发达后，将植株取出，用无菌水洗净附着的固体培养基，移入土壤中，温室中培养。

3转基因植株的分子鉴定

以SDS方法小量抽提部分转基因植株的基因组DNA，以转pCAMBIA 2301M空载体的烟草作为对照，根据蝴蝶兰ORAP11基因序列设计引物，进行PCR检测(部分结果)，检测结果如图6所示。结果表明携带有外源蝴蝶兰ORAP11基因已经插入到烟草基因组中。4转基因植株进行表型鉴定

如图7所示，大多数转基因植物表现为提前开花；节间缩短，植株矮化；营养器官的发育严重改变，特别是叶片的形态。例如，幼叶刚开始常呈线状，随后发育成卷曲的或不完整的结构。如图8所示，转基因植物的花器官的发育也在受影响，一些花的花筒裂开，而野生型的花筒是联合的。而且有些花瓣雄蕊化；另外花序枝缩短以致所有的花序簇成一团，在一些表型严重的花中，第三轮器官带有花瓣的特征。因此，转基因研究表明这ORAP基因能加速开花，并能改变叶和花的形态。

序列表

SEQ ID NO.1：

ATGGGTCGGGGGAAGGTGCAGCTGAAGCGGATCGAGAACAAGATAAATAGGCAGGTGACGTTCTCGAAGAGGC

GATCGGGGTTGCTCAAGAAGGCCCACGAGATATCCGTCCCCTGCGACGCCGAGGTGGCGCTCGTCATTTTCTCCGCG

AAGGGGAAGCTCTATGGGTACTCCACTGACTCCTGCATGGATAGGATTCTTGACCGTTATGAGCGGTACTGCTATGC

CGAAAAAGCGCTCCAGATTACAGAACCGGAGTCACAGGGGGACATATGCAATGAATACGGAAAGCTTAAGAATAAGA

TTGAAGCATTGCAGAAAAGCCGAAGCCATCTCATGGGTGAGCAGCTAGACAGTCTAAGCATTAAAGAGCTTCAACAC

TTGGAGCAGCAGCTTGAAACTGCTCTGAATCATATAAGAACCCAAAGGATCCAGCTACTCCTTAATTGCATAACAGA

GTTTCAGAGAAAGGAGAAATCTCTGCTGGAACATAACAGTCTTCTGGAGGCGAAGTTGTGCTCTTTCCAACTTGATC

CGCAGATCACCGAGACTGCTACCCAGAATCCAAACAGGAAACAACAAAAACAAGACCAAGTAAACTCCTCGCCGTCT

CCCTTCCTACCACCAAACCACCTTCCAACCCTGAATTTAGGAACATACCCGGCGAGTGATGGCGAGGAGGCTGAAGA

TCCTACTCTTCTTCAGATGAATAGCATCAGCCTGCCGCCATGGATGCTTCGCTCCTCAACCTAATCCTCAATAGAAA

CACTGGTTCCTGTAGATCTCCCGCATGCGACCTTCTAATCAAATCCGGCTTAAATCCGGCTCTGCTAAAATATCACA

AGTCCCTATGTATACAGTGTTCTCTTGTAATGCATAACTGTGGTGTGTGCGCTCGCTGGAATATCGTACCAAAATGT

TTCTGGCAACAACGCTAAAATACTTGATGTCAAAGATATCATATCGTTGGGCGTTTATAAGATAAAACTTTTCCGGA

TTGCATCTTCTTCTTCTGCATAGAACTGTCACATCAATATATTATAAATAAGCAACTTCGATAAAAAAAAAAAAAAA

AAAAAAAAAAAAAAAA

SEQ ID NO.2：

MGRGKVQLKRIENKINRQVTFSKRRSGLLKKAHEISVPCDAEVALVIFSAKGKLYGYSTDSCMDRILDRYERY

CYAEKALQITEPESQGDICNEYGKLKNKIEALQKSRSHLMGEQLDSLSIKELQHLEQQLETALNHIRTQRIQLLLNC

ITEFQRKEKSLLEHNSLLEAKLCSFQLDPQITETATQNPNRKQQKQDQVNSSPSPFLPPNHLPTLNLGTYPASDGEE

EDPTLLQMNSISLPPWMLRSST

SEQ ID NO.3：

MonoAP1：5’-GGTGCAGCTGAAGCGRATMGAGAA-3’

MonoAP2：5’-TTSAKRTGRCTSASCATCCAYRGKGGMAG-3’

ORAP1F：5′-ATGGGKCGSGGSARGGTGCAGCTGAAGCG-3′

615ORAP11R：5′-TTTGGTGGTAGGAAGGGAGA-3’

B25：5’-GACTCGAGTCGACATCG-3’

226ORAP11F：5′-CCAGATTACAGAACCGGAGT-3′

SEQ ID NO.4：

500ORAP11F：5′-TTCTGGAGGCGAAGTTGTGC-3′，

1008ORAP11R：5′-AGAAGATGCAATCCGGAAAA-3′.

SEQ ID NO.5：

500F11：5′-TTCTGGAGGCGAAGTTGTGC-3′

1008R11：5′-AGAAGATGCAATCCGGAAAA-3′

SEQ ID NO.6：

ORAPF：5’-GC

G(CA)(AT)ATGGGTCGCGGGAGGGTGCAG-3’(XbaI)

ORAP11R：5′-GC

TTAGGTTGAGGAGCGAAGCAT-3′(SacI)

框内为酶切位点

Claims (6)

1.一种分离出的蝴蝶兰ORAP11基因，其特征在于为具有特定序列的DNA分子，包括一个753bp的开放读框；其核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

2.一种由如权利要求1所述的ORAP11基因编码的蛋白质分子，其特征在于为长250个氨基酸残基，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

3.用于调取获得蝴蝶兰样品中ORAP11基因核苷酸的引物序列，包括根据权利要求1所述ORAP11基因所属家族保守区域设计的兼并引物MonoAP1和MonoAP2，为获得基因3’和5’末端的两对引物：兼并引物ORAP1F和反向特异性引物615ORAP11R，以及正向特异性引物226ORAP11F和B25，这些引物序列如SEQ ID NO.3所示。

4.一种用于检测样品中蝴蝶兰ORAP11基因拷贝数的方法，其特征在于使用核苷酸序列SEQ ID NO.1对蝴蝶兰基因组DNA样品进行Southern杂交，然后检测目的片段的有无；样品为蝴蝶兰的基因组DNA，经限制性内切酶酶切后的核苷酸片段；获得杂交探针分子的引物根据ORPA11基因的特异区段设计，序列为：500ORAP11F和1008ORAP11R，见SEQ ID NO.4所示。

5.一种用于检测ORAP11基因在蝴蝶兰原植株组织中表达分布状况的方法，其特征在于具体步骤如下：取小块组织材料，经多聚甲醛处理和梯度脱水，包埋于石蜡组织中；实验检测时取复水和蛋白酶K处理过的切片与事先制备的DNA探针分子在杂交液中混合杂交，显色后观察拍照；杂交使用的DNA探针分子由根据ORAP11基因的特异区段设计的引物获得，两引物分别为500F11和1008R11，引物序列如SEQ ID NO.5所示。

6.一种将如权利要求1所述的编码具有蝴蝶兰ORAP11基因的核苷酸序列转入烟草以改变花发育的方法，具体步骤如下：

(1)将编码蝴蝶兰ORAP11基因的核苷酸序列SEQ ID NO.1可操作的连接于植物表达载体，形成含有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的载体；

(2)将步骤(1)中的表达载体转入农杆菌，并将菌液与烟草叶片混合培养；

(3)通过抗生素筛选，PCR鉴定，获得转化细胞并再生转基因植株。

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