CN100366744C - 蝴蝶兰pPI15编码序列及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种在蝴蝶兰中表达的花发育相关的MADS-box基因(pPI15)的编码序列及其在改变植物花的形态和育性上的应用。本发明涉及包含上述基因的重组表达载体。还涉及所说的表达载体转化植物细胞，以及由转化细胞产生的所说基因的转基因植物。本发明将所说基因在植物中表达，所获得的转基因植物花型较野生小且雄性不育。

Description

蝴蝶兰pPI15编码序列及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学、生理学以及基因工程等领域，具体涉及一种在蝴蝶兰中表达的MADS-box基因家族PI亚类基因pP115的克隆，拷贝数分析，基因表达模式分析，转基因载体的构建，植物转化，转基因植株的获得以及相应的生理特性的鉴定。

背景技术

开花过程是植物发育生物学的核心问题，其中一个关键步骤是从花原基转变成花器官原基，进而形成具有特定形状和空间排列顺序的花器官。这一过程受到一系列同源异型基因的控制。序列分析表明多数这些基因所编码的蛋白质N端都包含一个保守区，与人类和酵母的转录因子SRF和MCM1的DNA结合区高度同源，称为MADS-box。研究表明，这些花发育相关基因编码的转录因子相互间发生作用，决定花原基的时空表达模式，并使该区域的细胞分化成合适的器官类型。另外，由于MADS-box基因家族在植物界中存在普遍性和高度保守性，对研究种子植物的起源和系统发育意义重大。兰科属于世界性四个特大科之一，起源古老，进化速率极其不同步，是种子植物系统发育在单子叶植物中的一个高峰，具有代表性和典型性。

对蝴蝶兰花发育相关基因的研究不仅可以对ABC模型在单子叶植物中的应用做出有益补充而且还可以为花卉改良开辟一条途径。

本发明研究了一种从蝴蝶兰中克隆花发育相关基因pPI15，转入烟草后引起雄性不育的技术。应用该技术不仅可以使转基因烟草的花型发生改变，而且可以引起植物的雄性不育，可以在植物育种上广泛使用。

在本发明被公布之前，尚未有任何公开或报道过本发明申请中提及的蝴蝶兰pPI15序列及其核酸序列。

发明内容

本发明的第一目的就是提供一种新的蝴蝶兰MADS-box基因pPI15，该基因是一个与花发育相关的MADS-box家族基因。

本发明的第二目的是提供这种蝴蝶兰蛋白pPI15编码序列在利用转基因技术使植物产生雄性不育性状的应用。

本发明一方面提供了一种新的蝴蝶兰MADS-box家族基因，记为pPI15，该基因具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。通过网上BLAST，判定该基因是一个与花发育相关的MADS-box家族基因。与MADS-box家族基因另一兰科植物的序列同源比较见表1和表2。

本发明另一方面提供了一种蛋白质分子。该蛋白质分子序列具有编码SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的多肽。

本发明还提供了一种检测pPI15mRNA表达模式的方法，其步骤如下：

(1)提取蝴蝶兰花瓣的总RNA(Trizol，市售)。

(2)利用反转录试剂盒(市售)将总RNA反转录成cDNA，然后根据PI类MADS-box的序列保守性的第1-24，924-907的特异序列设计引物，进行PCR。

在本发明的另一方面，还提供了一种利用转基因技术将编码具有蝴蝶兰MADS-box基因pPI15的核苷酸序列转化入烟草以改变其花的育性的方法，其步骤如下：

(1)将蝴蝶兰MADS-box基因pPI15的开放读框连于植物表达调控序列，形成含有蝴蝶兰MADS-box基因pP115的植物表达载体；

(2)将步骤(1)中的表达载体转入农杆菌，将含表达载体的农杆菌同真核宿主细胞共培养，在25±2℃条件下，暗培养2天后，通过抗生素筛选，获得蝴蝶兰MADS-box家族基因pPI15的转化细胞，并再生转基因植株；含有蝴蝶兰MADS-box家族基因pPI15的转基因植株开花表现为雄性不育。

本发明还提出一种用于检测样品中蝴蝶兰MADS-box基因pPI15拷贝数的方法，它包括用SEQIDNO.1所述序列与样品杂交，然后检测探针是否发生了结合。该样品是蝴蝶兰基因组DNA，经限制性内切酶酶切后的核苷酸序列。

本发明还提出用于鉴定转基因烟草的核酸分子，它包含蝴蝶兰pPI15D NA分子中1-24个连续的核苷酸和638-654个连续核苷酸的反向互补序列。

本发明还提出一种用于检测样品中是否存在蝴蝶兰MADS-box基因pPI15核苷酸序列的方法，它包括用上述核酸分子与样品进行PCR反应；然后检测是否扩增出目的片段。这里的样品为转基因烟草基因组DNA。

在本发明中，术语“蝴蝶兰pP115基因的开放读框”指编码完整的蝴蝶兰pPI15蛋白的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1中第1-654位的核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO.1中第1-654位的核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.1中第1-654位的核苷酸序列同源性低至约85％的简并序列也能编码出SEQ ID NO.2所述的序列。

在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒等。

在本发明中，术语“宿主细胞”为真核细胞。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、烟草细胞和其他植物细胞。

此外，还可用Southern印迹法技术分析蝴蝶兰MADS-box家族基因pPI15在细胞中存在的数量。

本发明的蝴蝶兰pP115蛋白的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组方法来大批量地获得该序列。这通常是将其克隆入载体，在转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离到有关序列。

表1为本发明的蝴蝶兰MADS-box家族基因pPI15与另一兰科植物Orchis italica的MADS-box基因PI/GLO-like基因核苷酸序列(GenBank Accession No.AB094985)的同源比较(FASTA)表。从表中可以看出两个基因具有很高的同源性，因此我们推断pPI15也属于MADS-box基因家族。

表2为本发明的蝴蝶兰MADS-box家族基因pP115蛋白氨基酸序列与另一兰科植物Orchis italica OrcPIPI/GLO-like的氨基酸序列(GenBank Accession No.AB094985)的同源比较(FASTA)表。其中，相同的氨基酸在两个序列之间用氨基酸单字符标出，相似的氨基酸用“+”标出。

附图说明

图1为蝴蝶兰pPI15基因的Southernblot鉴定。lane1 DraI酶切，lane2 Hind III酶切。

图2为RT-PCR鉴定pPI15的表达模式。actin为对照.Ped1：三节位花梗，Ped2：四节位花梗，Ped3：五节位花梗，bud：花蕾，root：根，leaf：叶，sep：萼片，pet：花瓣，lip：唇瓣，colum：蕊柱.Maker DL 2000从上至下依次为：2000bp，1000bp，750bp，500bp，200bp，100bp.

图3为转基因植株的PCR鉴定(部分)。+表示用pPI15质粒为模版的阳性对照，wt是以野生型烟草DNA为模版，编号为相应的转基因烟草。

图4为转基因烟草与野生型烟草花的对比。A：花的正面观，B：花的侧面观，C：野生型烟草花的纵剖，D：转基因烟草花的纵剖，E：野生型烟草的花药，F：转基因烟草的花药，G：野生型烟草的花粉萌发，H：转基因烟草的花粉萌发。WT：野生型烟草，pP115s：转基因烟草。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验手册(New York：Gold Spring Harbor Labortary Press，1989)中所叙述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

蝴蝶兰pPI15基因的克隆

1.取蝴蝶兰叶片立即置于液氮中冷冻保存。

2.DNA的提取

取蝴蝶兰叶片，用研钵研碎，加入盛有预热的裂解液的50ml离心管，65℃保温40min，离心。上清中加入RNaseA(0.5μg/ml)，65℃消化RNA 1h；以等体积的酚/氯仿/异戊醇(25/24/1)抽一次蛋白，以乙醇沉淀DNA，70％乙醇洗涤两遍，最后用TE溶液溶解DNA。用0.8％琼脂糖凝胶检测DNA的质量。

3.全长基因的克隆

根据MADS-box基因的保守性，设计引物，采用RT-PCR方法从蝴蝶兰cDNA中扩增出一条1kb左右的条带。将PCR产物回收，连接到T-载体上，用SP6和T7做为通用引物进行测序。将测序结果提交至NCBI非冗余数据库，BLAST结果表明该序列和其他物种中相应的MADS-box基因序列高度保守。

实施例2

蝴蝶兰pPI15基因的序列信息与同源性分析

本发明新的蝴蝶兰pPI15基因的长度为853bp，详细序列见SEQIDNO.1。该基因编码的多肽由217个氨基酸残基组成，分子量25422.40道尔顿，pI为9.37。详细序列见SEQIDNO.2。

将蝴蝶兰pPI15基因的编码区序列及其编码的蛋白质序列用BLAST程序再Non-redundant GeneBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GeneBank CDS translations+PDB+SwissPort+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸和蛋白质同源性检测，结果发现它与另一兰科植物Orchis italica OrcPI存在一定的同源性。在核苷酸水平上，它与Orchis italicaOrcPI基因的mRNA编码序列(GeneBank AccessionNo.AB094985)有一定的同源性(见表1)，在氨基酸水平上，它与Orchis italica OrcPI蛋白的氨基酸残基有83％的相似性(见表2)。由上可见，该pPI15基因与Orchis italica OrcPI基因存在较高的同源性。

实施例3

蝴蝶兰pPI15基因的拷贝数分析

以SDS方法大量抽提蝴蝶兰基因组DNA，取10μg DNA分别用DraI和Hind III酶切，以0.8％琼脂糖凝胶进行片段分离，将DNA转到Hybond-N+尼龙膜上，固定；以蝴蝶兰pPI15基因的3’UTR为探针进行Southern杂交，鉴定它在蝴蝶兰中的拷贝数，结果表明，pPI15基因为单拷贝。

实施例4

蝴蝶兰pPI15基因表达模式分析

分别提取蝴蝶兰植株的根、叶片、花梗、花蕾以及花器官(花萼、翼瓣、唇瓣和蕊柱)的总RNA。测定OD260后定量取出1μgRNA，反转录.以特异引物进行PCR。反应产物以1.0％琼脂糖凝胶电泳分离。从电泳图中可以看出，基因pPI15只在植物生长的生殖器官表达，而在营养器官中没有表达。进一步对花蕾的各个器官分别检测，发现其在所有的花器官中都有表达。推测该基因与花发育有着密切的关系，而不参与营养器官生长的调控。

实施例5

蝴蝶兰pPI15基因在烟草细胞中进行真核表达及转基因植株的表型鉴定含目的基因(蝴蝶兰pPI15基因)表达载体的构建

根据以蝴蝶兰pPI15基因全长编码序列，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在正反向引物上分别引入限制性内切酶识别位点(视选用的载体而定)，以便构建表达载体。以实施例1中获得的扩增产物为模板，经PCR扩增后，将以蝴蝶兰pPI15基因正向克隆到双元表达载体pCAM2301M中，在保证阅读框架的前提下，将其转入农杆菌中。利用叶圆盘法技术转化模式植物烟草。

利用叶盘法转化烟草

1、用灭菌牙签挑取YEB选择培养基上的阳性克隆，接种于2mlYEB液体(利福平40mg/L，链霉素50mg/L，卡那霉素50mg/L)，28℃200rpm振荡培养24-36h；

2、室温下4000g离心10min；

3、弃上清，菌体用1/2MS液体培养基重悬，稀释到原体积的5-20倍，使OD600＝0.5左右；

4、取生长两周左右的烟草的无菌叶片，去其叶主脉，将其剪成约1平方厘米见方的小叶片；

5、将叶片放入制备好的菌液中，浸泡2-5min，在无菌滤纸上吸干菌液；

6、将侵染的叶片放于MS培养基上，28℃暗培养48h；

7、将叶片转到愈伤培养基(MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+Kan50mg/L+cef250mg/L)上，25-28℃光照下培养，7-15天见愈伤组织形成；

8、约20天后可见分化芽长出，待芽长大后，切下，置于生根培养基上(1/2MS+NAA(0.5mg/L+Kan50mg/L+cef250mg/L)；

9、待根系发达后，将植株取出，用无菌水洗净附着的固体培养基，移入土壤中，温室中培养。

对转基因植株进行分子鉴定

以SDS方法小量抽提部分转基因植株的基因组DNA，以转pCAM2301M空载体的烟草作为对照，根据蝴蝶兰pPI15基因的特异序列设计引物，进行PCR检测(部分结果)。结果表明约有60％的烟草携带有外源蝴蝶兰pPI15基因。

转基因植株进行表型鉴定

总共得到约79棵转基因植株，其中有三株转基因烟草已经开花，与野生型烟草的花相比转基因烟草的花雄蕊明显短于雌蕊，而野生型烟草的雄蕊比雌蕊长，有利于自花受粉。其中转基因烟草的花粉明显减少或没有，而野生型烟草的花粉量大。转基因烟草的花粉在MS培养基上几乎没有萌发，而在相同条件下，野生型烟草的花粉大量萌发。转基因烟草的花较野生型的小。推测外源pPI15基因在宿主烟草中实现了超量表达，使烟草表现为雄性不育。试验结果表明，实施例1中得到的蝴蝶兰pPI15基因为有功能的基因，可以用于利用转基因技术的作物育种中。

表1

蝴蝶兰MADS-box家族基因pPI15核苷酸序列与Orchis italica OrcPI基因核苷酸序列的同源性比较

gi|24421110|dbj|AB094985.1|Orchis italica OrcPI mRNA for PI/GLO-like protein，complete cds

          Length＝907

Score＝246bitsf124)，Expect＝9e-62

Identities＝256/300(85％)，Gaps＝0/300(0％)

Strand＝Plus/Plus

Query  19    GAGATCAAGCGGATCGAGAACTCAACCAACCGGCAAGTGACCTTCTCGAAGAGGCGGAAT   78

             ||||||||||| ||||||||||| || |||||||||||||| ||||||||| |||||| |

Sbjct  90    GAGATCAAGCGCATCGAGAACTCGACGAACCGGCAAGTGACATTCTCGAAGCGGCGGAGT   149

Query  79    GGAATCATGAAGAAGGCGAAGGAGATCAGCGTGCTCTGCGACGCCCAGGTTTCGCTTGTC   138

             ||||| |||||||| |||| ||||||||||||| |||||||||| ||||| || ||||||

Sbjct  150   GGAATCATAAAGAAAGCGAGGGAGATCAGCGTGCTCTGTGACGCACAGGTCTCCCTTGTC   209

Query  139   ATCTTTTCCAGCCTTGGAAAGATGTTTGAGTATTGTAGCCCATCCACCACGCTGTCGAAG   198

             ||||| |||||||| || ||| |||  || || || ||||| || |||||| ||||||||

Sbjct  210   ATCTTCTCCAGCCTAGGCAAGTTGTCCGAATACTGCAGCCCCTCTACCACGTTGTCGAAG   269

Query 199 ATGCTGGAGAAATACCAGCAGAACTCTGGGAAGAAGCTCTGGGACGCCAAGCACGAGAAC  258

          |||||||||| |||||||| ||||| || ||||| |||||||| || | ||||||||

Sbjct 270 ATGCTGGAGAGGTACCAGCAAAACTCGGGTAAGAAACTCTGGGATGCGACTCACGAGAAT  329

Query 259 TTGAGCGCGGAGATTGATCGTATCAAGAAGGAAAATGATAATATGCAGATCGAACTCAGG  318

          |||||||||| || ||||| |||||||||||||| |||| ||||||||||| ||||||

Sbjct 330 CTGAGCGCGGAAATCGATCGGATCAAGAAGGAAAACGATACCATGCAGATCGAGCTCAGG  389

Score＝170bits(86)，E×pect＝4e-39

Identities＝248/302(82％)，Gaps＝0/302(0％)

Strand＝Plus/Plus

Query 346 AAAGGGGAGGATCTGAACTCTCTTAACCCAAAAGAGCTTATTCCGATTGAGGAAGCCCTG  405

          |||||||||||||| |||||||| | ||| || |||||||| || || ||||||| ||

Sbjct 393 AAAGGGGAGGATCTAAACTCTCTCACCCCCAAGGAGCTTATCCCAATCGAGGAAGGACTC  452

Query 406 CAGAATGGTCTCACTAGCGTTCGGGATAAACAAATGGACTACTTGAAGATGCTTAAAAAG  465

          |||||||| | ||||| |||||||| || || |||| | |||||||||||| || |||

Sbjct 453 CAGAATGGGTTGACTAGTGTTCGGGAGAAGCAGATGGATTTTTTGAAGATGCTGAAGAAG  512

Query 466 AATGAAAGGATGCTTGAAGATGAAAATAAAAGGCTCACATACCTATTGCACCAACAACAA  525

          |||||||| ||||| |||||||||||||||| ||| ||||||| || |||||||||||

Sbjct 513 AATGAAAGAATGCTGGAAGAAGAAAATAAAAGGCTCAAATATTTATTGCAACATCAACAA  572

Query 526 ATGGCAATGGAAGGGAGTATGAGAGAACTCGACATTGGCTATCATCATAAAGATCGCGAG  585

          |||| || ||||| || ||||||||||| || || |||||||||| ||||| | ||

Sbjct 573 TTGGCTATAGAAGGCAGCATGAGAGAACTGGAGATCAGCTATCATCAGAAAGACCCAGAA  632

Query 586 TATGCGGCTCAGATGCCAATGACTTTTCGTGTCCAACCCATTCAGCCCAACTTGCAGGGA  645

          ||||||| |||||||||||||||||||| || || || | |||||||||||||| |||

Sbjct 633 TATGCGGACCAGATGCCAATGACTTTTCGCGTGCAGCCTTTCCAGCCCAACTTGCACGGA  692

Query 646 AA 647

          ||

Sbjct 693 AA 694

Query为蝴蝶兰MADS-box家族基因pPI15核苷酸序列

Sbjct为Orchis italica OrcPI基因核苷酸序列(GenBank Accession No.AB094985)。

表2

蝴蝶兰MADS-box家族基因pPI15蛋白氨基酸序列与另一兰科植物Orchis italica OrcPI的氨基酸序列的同源性比较

gi|24421110|dbj|AB094985.1|Orchis italica OrcPI mRNA for PI/GLO-like protein，complete cdsLength＝907

Score＝355bits(910)，Expect＝2e-96

Identities＝181/216(83％)，Positives＝192/216(88％)，Gaps＝8/216(3％)

Frame＝+3

Query  1    MGRGKIEIKRIENSTNRQVTFSKRRNGIMKKAKEISVLCDAQVSLVIFSSLGKMFEYCSP  60

            MGRGEIKRIENSTNRQVTFSKRR+GI+KKA+EISVLCDAQVSLVIFSSLGK+EYCSP

Sbjct  72   MGRGNTEIKRIENSTNRQVTFSKRRSGIIKKAREISVLCDAQVSLVIFSSLGKLSEYCSP  251

Query  61   STTLSKMLEKYQQNSGKKLWDAKHENLSAEIDRIKKENDNMQIELRFSWVLSRHLKGEDL  120

            STTLSKMLE+YQQNSGKKLWDAHENLSAEIDRIKKENDMQIELRLKGEDL

Sbjct  252  STTLSKMLERYQQNSGKKLWDATHENLSAEIDRIKKENDTMQIELR--------LKGEDL  407

Query  121  NSLNPKELIPIEEALQNGLTSVRDKQMDYLKMLKKNERMLEDENKRLTYLLHQQQMAMEG  180

NSL         PKELIPIEELQNGLTSVR+KQMD+LKMLKKNERMLE+ENKRLYLLQQ+A+EG

Sbjct  408  NSLTPKELIPIEEGLQNGLTSVREKQMDFLKMLKKNERMLEEENKRLKYLLQHQQLAIEG  587

Query  181  SMRELDIGYHHKDREYAAQMPMTFRVQPIQPNLQGN                          216

            SMREL+I YH KD EYA QMPMTFRVQP QPNL GN

Sbjct 588   SMRELEISYHQKDPEYADQMPMTFRVQPFQPNLHGN                          695

Query为蝴蝶兰MADS-box家族基因pPI15的氨基酸序列

Sbjct为Orchis italica OrcPI基因氨基酸序列(GenBank Accession No.AB094985)

序列表

本发明涉及的序列及记号分列如下：

SEQ ID NO.1的信息

(i)序列特征：

长度：853bp

类型：核苷酸

链型：单链

拓扑结构：线性

        (ii)分子类型：核酸

        (iii)序列描述：SEQ ID NO.1

     1 atggggcgcg gcaagatcga gatcaagcgg atcgagaact caaccaaccg gcaagtgacc

    61 ttctcgaaga ggcggaatgg aatcatgaag aaggcgaagg agatcagcgt gctctgcgac

   121 gcccaggttt cgcttgtcat cttttccagc cttggaaaga tgtttgagta ttgtagccca

   181 tccaccacgc tgtcgaagat gctggagaaa taccagcaga actctgggaa gaagctctgg

   241 gacgccaagc acgagaactt gagcgcggag attgatcgta tcaagaagga aaatgataat

   301 atgcagatcg aactcaggtt ttcctgggtt ttgagcaggc atttgaaagg ggaggatctg

   361 aactctctta acccaaaaga gcttattccg attgaggaag ccctgcagaa tggtctcact

   421 agcgttcggg ataaacaaat ggactacttg aagatgctta aaaagaatga aaggatgctt

   481 gaagatgaaa ataaaaggct cacataccta ttgcaccaac aacaaatggc aatggaaggg

   541 agtatgagag aactcgacat tggctatcat cataaagatc gcgagtatgc ggctcagatg

   601 ccaatgactt ttcgtgtcca acccattcag cccaacttgc agggaaataa gtaactgtgt

   661 tagcctactg ctttcctgtt gtttaaatga attattatat taacttttgg cagttctgtg

   721 agaatatgaa aacttatatg gctaattatc agatatgtgc ttactagtga tattcatatt

   781 gtaactctcc aaactcatta gtaactatgg ctaaatattt ttatgttcta aaaaaaaaaa

   841 aaaaaaaaaa aaa

(2)SEQ ID NO.2的信息

(i)序列特征：

(A)长度：217氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

        (ii)分子类型：多肽

        (iii)序列描述：SEQ ID NO.2

  1  MGRGKIEIKR IENSTNRQVT FSKRRNGIMK KAKEISVLCD AQVSLVIFSS

 51  LGKMFEYCSP STTLSKMLEK YQQNSGKKLW DAKHENLSAE IDRIKKENDN

101  MQIELRFSWV LSRHLKGEDL NSLNPKELIP IEEALQNGLT SVRDKQMDYL

151  KMLKKNERML EDENKRLTYL LHQQQMAMEG SMRELDIGYH HKDREYAAQM

201  PMTFRVQPIQ PNLQGNK

Claims (4)

1.一种分离出的DNA分子，其特征在于，它包括SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

2.一种蛋白质分子，其特征在于由SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列编码具有SEQ IDNO.2所示的氨基酸序列。

3.一种利用转基因技术将编码具有蝴蝶兰MADS-box基因pPI15的核苷酸序列SEQID NO.1转入烟草以改变花型和育性的方法，其特征在于：

(1)将蝴蝶兰MADS-box基因pPI15的开放读框的序列：SEQ ID NO.1中第1-654位序列连于植物表达调控序列，形成含有蝴蝶兰MADS-box基因pPI15的植物表达载体；

(2)将步骤(1)中的表达载体转入农杆菌，将含表达载体的农杆菌同真核宿主细胞共培养，在25±2℃条件下，暗培养2天后，通过抗生素筛选，获得蝴蝶兰MADS-box家族基因pPI15的转化细胞，并再生转基因植株；含有蝴蝶兰MADS-box家族基因pPI15的转基因植株开花表现为雄性不育。

4.一种用于检测样品中蝴蝶兰MADS-box基因pPI15拷贝数的方法，其特征在于它包括用SEQ ID NO.1所述序列与样品杂交，然后检测探针是否发生了结合；该样品是蝴蝶兰基因组DNA，经限制性内切酶酶切后的核苷酸序列。

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