CN114480414B

CN114480414B - 一种增强植物耐寒性或培育高耐寒性植物的方法

Info

Publication number: CN114480414B
Application number: CN202111675669.7A
Authority: CN
Inventors: 秦永华; 胡兴隆; 胡桂兵; 张志珂; 赵杰堂
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2021-12-31
Filing date: 2021-12-31
Publication date: 2023-05-12
Anticipated expiration: 2041-12-31
Also published as: CN114480414A

Abstract

本发明公开了一种增强植物耐寒性或培育高耐寒性植物的方法。本发明首次克隆出两个火龙果响应低温胁迫的基因，其是NAC基因家族的成员，长度均为819bp，编码的氨基酸数目均为272个。发现异源表达该两个新基因能够使转基因植株受低温伤害程度显著低于野生型，过表达株系存活率均显著高于野生型植株存活率，转基因植株通过降低离子渗透率、减少丙二醛、过氧化氢和超氧阴离子的积累从而增强转基因植株的耐寒性，说明其具有增强植物耐寒性的功能。在生产上对增强植物的耐寒性有着广泛的应用前景，具有很大的应用价值；利用该基因进行植物品种改良，能够有效预防和减轻低温对植物造成的伤害，提高产量和经济效益。

Description

一种增强植物耐寒性或培育高耐寒性植物的方法

技术领域

本发明涉及植物育种技术领域，具体地，涉及一种增强植物耐寒性或培育高耐寒性植物的方法。

背景技术

火龙果又称红龙果、仙蜜果、情人果等，为仙人掌科(Cactaceae)量天尺属(Hylocereus)或蛇鞭柱属(Selenicereus)的栽培品种，原产中美洲，是热带、亚热带的名优水果之一。火龙果是近年来兴起的热带亚热带水果，因容易种植、外形独特、风味好、富含甜菜素等多种营养物质备受种植户和消费者的青睐。

作为热带、亚热带果树，火龙果的抗寒能力较差，易受低温冷害或冻害的影响。在我国华南地区，周期性的低温霜冻会导致火龙果减产失收、品质下降，对火龙果产业造成严重的经济损失。

NAC是植物特有的一类转录因子，是至今发现的最大的转录因子家族之一，其功能广泛，参与调控植物生长发育、叶片衰老、激素信号转导和逆境响应等多种生物学过程。目前，已在模式植物拟南芥和水稻中，分别鉴定到117个和151个NAC基因。另外，在烟草、大豆、白菜、杨树等植物上，被发现的NAC转录因子数量都超过100个。研究报道，NAC转录因子参与多种植物的冷响应调控通路，但迄今为止，关于火龙果NAC转录因子在低温胁迫响应方面的研究还未见报道。因此，本领域有必要在火龙果基因组中筛选出NAC基因家族，并鉴定出可以增强植物耐寒性的NAC基因，进行植物品种改良，以期为抗逆基因工程育种提供理论依据和新的基因。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种火龙果低温响应基因，本发明提供了增强植物耐寒性的火龙果新基因HuNAC20(其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码基因的氨基酸序列如如SEQ ID NO.3所示)和HuNAC25(其核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示，其编码基因的氨基酸序列如如SEQ ID NO.4所示)。本发明为植物抵御低温胁迫的分子机理提供了理论依据和技术手段，在生产上对增强植物的耐寒性有着广泛的应用前景，具有很大的应用的价值；利用该基因进行植物品种改良，能够有效预防和减轻低温对植物造成的伤害，提高产量和经济效益。

本发明的第一个目的是提供一种火龙果低温响应基因。

本发明的第二个目的是提供一种火龙果低温响应蛋白。

本发明的第三个目的是提供一种重组载体。

本发明的第四个目的是提供一种重组工程菌

本发明的第五个目的是提供所述火龙果低温响应基因、所述火龙果低温响应蛋白、所述重组载体或所述重组工程菌中的任意一个或几个在增强植物耐寒性性或培育高耐寒性植物中的应用。

本发明的第六个目的是提供一种增强植物耐寒性或培育高耐寒性植物的方法。

为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：

一种火龙果低温响应基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1或2所示。

一种火龙果低温响应蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3或4所示。

具体的，火龙果低温响应基因HuNAC20，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码基因的氨基酸序列如如SEQ ID NO.3所示；HuNAC25，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，其编码基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

其中扩增所述HuNAC20和HuNAC25基因的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5～8所示。

一种重组载体，含有所述火龙果低温响应基因。

一种重组工程菌，含有所述重组载体。

所述火龙果低温响应基因、所述火龙果低温响应蛋白、所述重组载体或所述重组工程菌中的任意一个或几个在增强植物耐寒性上的应用。

一种增强植物耐寒性或培育高耐寒性植物的方法，将所述低温响应基因在植物中过表达或表达。

优选地，使用转化有所述重组表达载体农杆菌侵染植物。

更优选地，所述表达载体为pPZP6k90。

更优选地，所述农杆菌为GV3101(pSoup-p19)。

更优选地，所述植物为十字花科或仙人掌科植物。

进一步优选地，所述植物为拟南芥或火龙果。

更优选地，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.13～14或核苷酸序列如SEQ ID NO.15～16所示引物检测阳性植株。

其中，核苷酸序列如SEQ ID NO.13～14引物检测核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示火龙果低温响应基因；核苷酸序列如SEQ ID NO.15～16引物检测核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示火龙果低温响应基因。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明首次克隆出响应低温胁迫的火龙果HuNAC20和HuNAC25新基因，其是NAC基因家族的成员，长度均为819bp，编码的氨基酸数目均为272个。通过农杆菌介导的拟南芥遗传转化的方法，对上述响应低温胁迫的火龙果HuNAC20和HuNAC25新基因的功能进行了研究，发现异源表达该两个新基因能够使转基因植株受低温伤害程度显著低于野生型，过表达株系存活率均显著高于野生型植株存活率，转基因植株通过降低离子渗透率、减少丙二醛(MDA)、过氧化氢(H₂O₂)和超氧阴离子(O₂ ^-)的积累从而增强转基因植株的耐寒性，说明其具有增强植物耐寒性的功能。在生产上对增强植物的耐寒性有着广泛的应用前景，具有很大的应用的价值；利用该基因进行植物品种改良，能够有效预防和减轻低温对植物造成的伤害，提高产量和经济效益。

附图说明

图1为火龙果和拟南芥NAC基因的进化树图。

图2为部分火龙果幼嫩茎总RNA的琼脂糖凝胶电泳图。

图3为HuNAC20和HuNAC25基因在4℃低温处理下的表达模式。

图4为HuNAC20和HuNAC25基因克隆扩增的脂糖凝胶电泳图。

图5为HuNAC20和HuNAC25基因亚细胞定位图。

图6为转HuNAC20(图6上)和HuNAC25(图6下)基因拟南芥的PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图。

图7为转HuNAC20基因拟南芥和野生型植株在低温处理前后的表型图，超表达株系的表达量和存活率。

图8为转HuNAC25基因拟南芥和野生型植株在低温处理前后的表型图，超表达株系的表达量和存活率。

图9为转HuNAC20和HuNAC25基因拟南芥和野生型植株在低温胁迫下的生理指标的变化。

具体实施方式

下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1火龙果NAC相关基因的鉴定

一、实验方法

1、火龙果NAC相关基因的筛选和聚类分析

从Pfam数据库下载NAM保守结构域模型PF02365，并利用HMMER在火龙果全基因组范围内鉴定所有可能存在的NAC转录因子序列，并将其归为HuNAC家族基因。综合Pfam数据库，将不含有NAC保守结构域或结构域不完整的序列去除，最终从火龙果基因组数据库中鉴定出64个NAC基因，从1号染色体的第一个基因依次命名为HuNAC1～HuNAC64(表1)。

从TAIR(https://www.arabidopsis.org/)下载拟南芥(102个)NAC蛋白序列和火龙果NAC蛋白序列进行多重序列比对，参数设置为默认；将比对结果用MEGAX软件进行分析并构建系统进化树，比对方法用最大似然法(Maximum likelihood，ML)，设置bootstrapreplicates参数为1000。依据蛋白系统进化树的结果，对鉴定出的火龙果NAC蛋白家族进行亚家族水平的分类，进化树结果如图1所示。

2、火龙果NAC基因的序列分析及氨基酸序列的理化性质

利用ExPASy-ProtParam tool(https://web.expasy.org/protparam/)对所有64个火龙果NAC蛋白序列的氨基酸数量、分子质量、理论等电点和亲水性指数进行预测和统计。

结果见表1，结果表明：64个HuNAC基因编码的蛋白质平均含有341个氨基酸。氨基酸数量最多的是HuNAC30，编码一个含有684个氨基酸的蛋白质，预测蛋白质分子质量为75.87kDa，理论等电点为5.33，亲水性指数为-0.557；氨基酸数量最少的是HuNAC55，编码一个含有154个氨基酸的蛋白质，预测蛋白质分子质量为17.95kDa，理论等电点为9.19，亲水性指数为-0.553。64条HuNAC编码的蛋白质等电点变化范围为4.78(HuNAC21)～9.73(HuNAC10)。其中38个蛋白等电点小于7，偏酸性，其余26个蛋白等电点大于7，偏碱性。64个HuNAC蛋白的GRAVY值在-0.921～-0.490范围内变化，蛋白质的疏水性均小于0，说明HuNAC蛋白均为亲水性蛋白。

表1：

实施例2 HuNAC20和HuNAC25新基因的克隆

一、火龙果幼嫩茎总RNA的提取和cDNA第一条链的合成

1、实验方法

采用EASYspin Plus植物RNA快速提取试剂盒(RN53)(Aidlab，China)对红皮白肉火龙果幼嫩茎的总RNA进行提取(具体方法参照说明书)，取2μL RNA溶液置于核酸测定仪上检测RNA的浓度和纯度，并用1％琼脂糖凝胶进行电泳检测其完整性，符合条件的样品用于下一步的实验。

符合条件的样品采用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa，Japan)反转录试剂盒将总RNA反转录为cDNA，具体操作参照说明书。cDNA使用火龙果内参基因Actin检测合格后-20℃保存备用。

2、实验结果

琼脂糖凝胶电泳检测结果如图2所示，可以看出火龙果样品的总RNA呈现出清晰的28S和18S两条带，并且28S的亮度是18S的亮度的两倍左右，没有拖尾现象，说明无基因组DNA污染，表明提取的总RNA质量比较高，无明显降解，可以满足后续实验的需要。

二、HuNAC20和HuNAC25新基因的克隆

1、实验方法

(1)关键基因的扩增和检测

根据实施例1的鉴定结果，其中，HuNAC20基因的全长的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的HuNAC20蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，HuNAC25基因的全长的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，其编码的HuNAC25蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

以火龙果幼嫩茎的cDNA为模板，利用特异性引物克隆HuNAC20和HuNAC25，反应体系和反应步骤具体参照I-5^TM 2×High-Fidelity Master Mix(MCLAB,America)的说明书。根据HuNAC20和HuNAC25基因的全长序列，用Primer Premier 5.0软件分别于其起始子和终止子处设计引物，引物序列如SEQ ID NO.5～8所示(SEQ ID NO.5～6分别为克隆HuNAC20基因的上下游引物序列；SEQ ID NO.7～8分别为克隆HuNAC25基因的上下游引物序列)，引物由艾基生物工程(广州)有限公司合成，引物信息如下：

SEQ ID NO.5：ATGACGGCCACGACGAAT

SEQ ID NO.6：CTACCGGAGTAACATGAATATATCCTG

SEQ ID NO.7：ATGGGTTTAAGAGATGTTGGAGAAAC

SEQ ID NO.8：TCACATCTCTAAATGATCATGACATTGTG。

扩增条件为：98℃、2min；98℃、10s，56℃、15s，72℃、5min，共35个循环；72℃、10min。反应结束后取2μL扩增产物进行凝胶电泳，检测PCR扩增产物是否正确。

(2)PCR产物的回收

将PCR扩增产物全部用于普通琼脂糖凝胶电泳，用手术刀在紫外灯下切胶，最后用StarPrep快速DNA胶回收试剂盒进行回收，具体方法参见说明书。回收后取适量产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，并在核酸测定仪上检测回收产物的纯度和浓度。

(3)目的片段的连接与转化

将胶回收纯化产物与pEASY-Blunt克隆载体的摩尔比以7：1的比例将纯化产物与载体在25℃下连接10min，具体参照

Cloning Kit试剂盒说明书。吸取连接产物加入50μL DH5α感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴30min，42℃水浴热激40s，立即置于冰上2min，然后在超净工作台上将其加入600μL LB培养液，37℃下200rpm振荡培养1h，4000rpm离心3min，留下150μL上清，用枪头将沉淀重新悬浮后，吸取80μL涂到含有100μg mL^-1Amp⁺的LB固体平板培养基上，在37℃培养箱中倒置过夜培养。第2天用灭菌的牙签挑单菌落于含有100μg mL^-1Amp⁺的600μL LB液体培养液中，37℃下200rpm震荡培养3～4h后，跑菌液PCR检测阳性克隆，具体步骤参照2×Taq Master Mix(Vazyme，Nanjing)使用说明书，挑选扩增产物条带大小正确的菌液进行测序，测序在广州艾基生物有限公司完成，将测序返回的序列与基因组中的序列进行比对无误后，最终获得HuNAC20和HuNAC25基因。

2、实验结果

HuNAC20和HuNAC25基因的扩增结果如图4所示，在891bp处有明显的条带，说明PCR扩增产物正确。

实施例3火龙果HuNAC20和HuNAC25基因在低温下的表达模式

一、实验方法

为了探讨火龙果NAC基因的表达模式，本研究采用RT-qPCR分析了HuNACs在低温胁迫下不同时间的表达水平。

总RNA的提取以及将总RNA反转录为cDNA的方法参照本说明书的实施例2。设计RT-qPCR引物(HuNAC20基因的定量上下游引物如SEQ ID NO.17～18所示；HuNAC25基因的定量上下游引物如SEQ ID NO.19～20所示)。引物信息如下：

SEQ ID NO.17：GAGTATCGCCTCGCTAATGTC；

SEQ ID NO.18：TGTTGCCCTTCTTGTTGTAGAT；

SEQ ID NO.19：TTGGTGTTTTATCGGAATCG；

SEQ ID NO.20：GCATTGTTTTCTCCCTTGTTC。

以5℃低温下各时期的cDNA为模板，采用RealUniversal Color PreMIX(SYBRGreen)(TIANGEN,Beijing),在CFX384-Real-Time system(C1000 Touch Thermal Cycler,USA)荧光定量PCR仪上进行RT-qPCR反应，反应体系及程序参考说明书，每个样品进行三个生物学重复，反应结束后，采用2^-ΔΔCT法进行数据分析，计算HuNAC20和HuNAC25基因在不同处理时期中的表达情况。

二、实验结果

结果表明，HuNAC20和HuNAC25为低温响应基因，HuNAC20在5℃低温下的表达量随着时间的延长总体呈上升的趋势(图3)，至处理后48h达到峰值，上升22.5倍；HuNAC25在5℃低温下在前12h表达量很低，在24h和48h表达量显著提高。

实施例4 HuNAC20和HuNAC25新基因的亚细胞定位分析

一、实验方法

1、载体的构建

亚细胞定位实验的载体选用pC18-GFP载体，选取HindⅢ和BamH I作为重组位点，用Primer Premier 5.0软件设计带有载体同源臂的引物(SEQ ID NO.9～10分别为pC18-HuNAC20载体构建引物上下游序列；SEQ ID NO.11～12分别为pC18-HuNAC25载体构建引物上下游序列)来扩增HuNAC20和HuNAC25新基因的cDNA全长序列(不包含终止密码子)。引物信息如下：

SEQ ID NO.9：

GTCGACGGTATCGATAAGCTT ATGACGGCCACGACGAAT

SEQ ID NO.10：

TTTACTCATACTAGTGGATCC CCGGAGTAACATGAATATATCCTG

SEQ ID NO.11：

GTCGACGGTATCGATAAGCTT ATGGGTTTAAGAGATGTTGGAGAAAC

SEQ ID NO.12：

TTTACTCATACTAGTGGATCC CATCTCTAAATGATCATGACATTGTG。

参照

HD Cloning试剂盒(TaKaRa，Japan)的使用说明书将扩增产物连接到pC18-GFP载体，将PCR连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，方法同实施例1，抗生素为Kan。用带有载体同源臂的引物(SEQ ID NO.9～10分别为pC18-HuNAC20载体构建引物上下游序列；SEQ ID NO.11～12分别为pC18-HuNAC25载体构建引物上下游序列)进行菌液PCR检测和测序，将PCR检测的阳性菌株进行测序，得到pC18-HuNAC20和pC18-HuNAC25亚细胞定位重组质粒。

2、重组质粒转化根癌农杆菌，转化方法如下：

1)将农杆菌GV3101(pSoup+p19)感受态从-80℃冰箱取出，在冰上放置5min至菌株融化。

2)加入5μL重组质粒pC18-HuNAC20和pC18-HuNAC25到50μL农杆菌感受态中，轻弹离心管，使其混匀，置于冰上30min，液氮冷冻5min，37℃水浴5min，冰浴2min。

3)在超净工作台中加入600μL无抗生素的YEP液体培养基，于28℃、200rpm振荡培养3～4h，4000rpm离心5min，留下100μL上清，用枪头将沉淀重新悬浮后，吸取30μL涂到YEP固体平板培养基(含抗生素100μg mL^-1Kan和50μg mL^-1Rif)上，在28℃培养箱中倒置过夜培养2～3d。

4)用灭菌的牙签挑单菌落于含有100μg mL^-1Kan和50μg mL^-1Rif的600μL的YEP液体培养液中，于28℃、200rpm振荡培养过夜。菌液PCR验证同上述步骤，将验证结果正确的阳性农杆菌菌株保存备用。

3、根癌农杆菌介导的本氏烟草叶片瞬时表达

用空载作为对照，按照上述2的方法转化到GV3101-psoup-p19感受态中。将阳性菌液以1:300的比例加入10mL含100μg mL^-1Kan和50μg mL^-1Rif的YEP液体培养液中，28℃、200rpm振荡培养至OD₆₀₀＝0.6～0.8后，用MAA重悬液(0.5μM MES、0.02μM AS、0.5μM MgCl₂，pH 5.7)重悬至OD₆₀₀＝0.2。用1mL注射器注射入本氏烟草叶片背面，同时注射含有空载体pC18的农杆菌作为对照，使菌液扩散至整个叶片，每个处理注射两株，每株三个叶片，做好标记。本氏烟草在25℃正常培养2-3d，即可用激光共聚焦显微镜(ZEISS)观察荧光，方法如下：

1)取农杆菌浸润处理2d的烟草叶片，用剪刀将浸润区域叶片剪成约1cm²小块，置于载玻片上水滴处并浸润，用镊子小心盖上盖玻片，注意不留有气泡。

2)将制好的片子置于蔡司激光共聚焦显微镜(ZEISS LCM-800)下，设置显微镜目镜至20×，在明场下调节至清晰观察到叶片表皮细胞。

3)操作软件，选择GFP的激发波长488nm和mCherry的激发波长610nm，分别在不同的激发光下扫描，选取大部分细胞在同一平面的区域，调节荧光场GFP、mCherry及明场增益均至最佳时进行双通道荧光成像，拍摄照片。

二、实验结果

结果如图5所示，在转化后的烟草叶片中，对照载体的GFP荧光信号充满整个细胞，RFP荧光信号则只显示在细胞核位置，而将GFP-HuNAC20和GFP-HuNAC20转化烟草叶片后，结果显示其GFP与RFP的荧光信号位置完全重叠，且均只在细胞核位置中显示，表明HuNAC20和HuNAC25均定位于细胞核。

实施例5 HuNAC20和HuNAC25基因的功能

一、实验方法

1、构建载体、重组质粒和转化根癌农杆菌

将HuNAC20和HuNAC25新基因构建到由35S驱动的表达载体pPZP6k90上，抗生素为Kan，重组酶切位点为Xba I，SEQ ID NO.13～14分别为pPZP6K90-HuNAC20载体构建引物上下游序列；SEQ ID NO.15～16分别为pPZP6K90-HuNAC25载体构建引物上下游序列。引物信息如下：

SEQ ID NO.13：

CATTCTACAACTACATCTAGAATGACGGCCACGACGAAT；

SEQ ID NO.14：

AGCTTGCATGCCAATTCTAGACTACCGGAGTAACATGAATATATCCTG；

SEQ ID NO.15：

CATTCTACAACTACATCTAGAATGGGTTTAAGAGATGTTGGAGAAAC；

SEQ ID NO.16：

AGCTTGCATGCCAATTCTAGATCACATCTCTAAATGATCATGACATTGTG。

再把连接好的载体质粒转入农杆菌GV3101，经PCR检测为阳性菌液后保存备用，具体操作同实施例2。

2、根癌农杆菌介导的拟南芥转化

(1)在超净工作台中，将1mL上述菌液加在200mL YEP培养基(含抗生素100μg mL^- ¹Kan和50μg mL^-1Rif)中，28℃、220rpm振荡培养过夜，培养至OD₆₀₀＝0.8-1.0。4000rpm离心10min，收集菌体，在一个开口的大器皿用花浸润培养基[1/2MS+5％蔗糖+0.03％表面活性剂(Silwet L-77)，pH5.8]稀释菌体，使其OD₆₀₀＝0.6-0.8左右，待用。

(2)选择处于盛花期的拟南芥健壮植株，把已经开放过的花和已有的果荚剪去，将待转化的拟南芥植株平放，让花蕾完全浸入农杆菌悬浮液中约1min，再将培养钵移开侧倒放入大托盘中，晾干拟南芥表面多余液体。将处理过的拟南芥用塑料盖盖上，暗培养24h后放于23～25℃的光照条件下使其正常生长。1周后可再浸染一次。3～4周后，待拟南芥荚果开始转黄后，将其剪下放于培养皿内干燥，当拟南芥荚果大部分转黄后，即可收取全部种子存于1.5mL的离心管中(可在管内放适当的硅胶以便干燥)。待种子完全干燥后，放于1.5mL新离心管中4℃短期保存，如需要可放于-20℃冰箱内长期保存。

(3)在超净工作台上取部分拟南芥种子(200～300粒)到一个灭菌的1.5mL离心管中，先用70％的酒精处理种子2次，每次30s；再用无水乙醇悬浮种子，然后倒到一灭菌的滤纸上；待无水乙醇挥发掉后，将种子均匀地播在种子筛选培养基(1/2MS+蔗糖30g L^-1+琼脂5～6g L^-1+Kan 100mg L^-1，pH5.8)上；用Parafilm将培养皿封好并置于4℃冰箱处理24h，然后放到23～25℃的16h光照/8h黑暗条件下培养8～10d即可移栽至营养钵中，置于培养室培养2～3周后进行下一步的鉴定。

3、转基因植株的鉴定

移栽苗成活后，采集2mm左右大小的叶片，用T5 Direct PCR Kit(Plant)(TSINGKE)进行PCR扩增检测阳性，具体步骤参照说明书，PCR引物序列如SEQ ID NO.13～16所示引物(SEQ ID NO.13～14分别为pPZP6K90-HuNAC20载体构建引物上下游序列；SEQ IDNO.15～16分别为pPZP6K90-HuNAC25载体构建引物上下游序列)。

确定阳性植株后，分株收集T1代种子。将T1代种子继续消毒，并撒播至带有100mgL^-1Kan的1/2MS培养基上，将正常生长的幼苗移栽，培养至种子成熟收获T2代种子。重复种子消毒、抗性筛选，直至出现抗性不分离的株系，用于后续实验。

进一步利用RT-qPCR检测纯合转基因植株中HuNAC20和HuNAC25的表达水平。

并将转基因株系纯合子种子消毒后播撒于带有100mg L^-1Kan的1/2MS培养基上，于4℃冰箱中低温春化2d后置于正常条件下生长约10d后，移栽至培养基质中，盆栽培养2周后进行低温处理。

低温处理方法如下：

首先将培养箱降温至4℃，将盆栽苗从正常条件转移至培养箱4℃低温驯化2d，然后将培养箱逐渐降温至-4℃后，盆栽苗于-4℃处理6h后，转移至4℃培养箱黑暗处理12h后，于正常条件下恢复生长6d，进行存活率统计，并分别于低温处理前和恢复后进行表型观察及拍照。

二、实验结果

转基因植株的鉴定结果如图6所示，WT为阴性对照，野生型拟南芥中不存在HuNAC20(图6上)和HuNAC25(图6下)基因。P1和P2为阳性对照，分别为pPZP6K90-HuNAC20和pPZP6K90-HuNAC25质粒，A1-A10和B1-B10泳道在891bp处均有明显的单一条带，说明目的基因成功转到拟南芥中。

转HuNAC20和HuNAC25基因植株的表型、表达和存活率结果如图7(HuNAC20)和图8(HuNAC25)所示，本研究对HuNAC20和HuNAC25过量表达株系进行低温处理(-4℃)后恢复生长的结果显示，HuNAC20和HuNAC25过量表达株系受低温伤害程度显著低于野生型，大多数植株受冷胁迫后仍可恢复生长。HuNAC20过表达株系存活率分别为90.0％、60.0％和86.7％；HuNAC25过表达株系存活率分别为35.7％、81.7％和80.0％；而野生型植株存活率仅为14.3％。总体而言，HuNAC20和HuNAC25的过表达株系存活率都显著高于野生型植株存活率。说明过量表达HuNAC20和HuNAC25均增强了拟南芥植株的抗冻性。

实施例5 HuNAC20和HuNAC25转基因植株的生理指标的变化

一、实验方法

为了进一步探究HuNAC20和HuNAC25这两个基因的抗寒性能，检测了转HuNAC20和HuNAC25基因拟南芥株系和WT植株在低温处理后相关生理指标的变化情况。用试剂盒(Suzhou Comin Biotechnology,China)测定离子渗透率、丙二醛(MDA)、过氧化氢(H₂O₂)和超氧阴离子(O₂ ^-)的含量，具体方法参照试剂盒说明。

二、实验结果

结果图9所示，离子渗透率是植物在环境胁迫响应过程中细胞质膜损伤的重要指标。离子渗透率的检测结果表明，在正常生长条件下(22℃)，HuNAC20和HuNAC25过量表达株系中离子渗透率水平与WT植株无显著差异，而经冷处理(4℃处理48h)和冻处理(-4℃处理6h)后，HuNAC20和HuNAC25过量表达株系中离子渗透率均显著低于WT植株(图9)，表明HuNAC20和HuNAC25过量表达株系植株抗寒性较强，低温处理下的伤害程度较轻，而WT植株中细胞膜损伤严重，透性增强，因此细胞中更多电解质外渗。

与WT植株相比，转HuNAC20和HuNAC25基因拟南芥株系中MDA含量、H₂O₂和O₂ ^-的积累呈与离子渗透率变化趋势相似。在正常生长条件下(22℃)，HuNAC20和HuNAC25过表达株系和WT植株中MDA、H₂O₂和O₂ ^-含量较低，且没有显著差异，而当植株受到低温胁迫时，过表达株系和WT植株中的MDA、H₂O₂和O₂ ^-含量均逐渐上升，但过表达株系显著低于WT植株(图9)。

以上结果说明，过量表达HuNAC20和HuNAC25均增强了拟南芥植株的抗冻性。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一种增强植物耐寒性或培育高耐寒性植物的方法

<160> 20

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 891

<212> DNA

<213> Hylocereus

<400> 1

atgacggcca cgacgaatga cggattgaag ttaccggccg gatttaggtt ccaccccacc 60

gacgaggagc tcgtcgttca ctatttgtgc agaaaatgcg cttctcagag tatagctgtg 120

ccaattattg ctgaaattga tctatacaag ttcgatccat ggcagcttcc tgggatagcg 180

ctatacggag aaaaggagtg gtatttcttc tcaccaaggg accggaaata cccgaacggt 240

tcaagaccga accgggcggc cggaaccggg tattggaagg cgaccggagc ggataaaccc 300

atcggaaagc cgaagacgtt gggaatcaag aaagccctgg ttttctacgc cgggaaggct 360

cccagaggag ttaaaactaa ctggattatg cacgagtatc gcctcgctaa tgtcgaccgc 420

tccgctcacc ctggcaagaa gaccaatctt cggcttgatg attgggtgtt atgccggatc 480

tacaacaaga agggcaacat tgaaaaacac tacaacgtgg atcccaacag cacgctccaa 540

aactcggatt ttgaagatca gaagcccatg acattgacac ccaccatgaa cgctccccag 600

tttccggcag ccccatcgcc gccattgagg aacgacccaa tgcactttga cacgtcagac 660

tcggtcccac actgccacac agacacgagc gggtcagccc acatagggtc gcctgagttc 720

ccatataaca aggaggtcca aagtgagccc aaatggaatg aactagacaa ggcccttgac 780

taccagttca actacatgga cccattcccg accgacccgt tttcggcttc gggccagttc 840

cagcaagacc agttcaccaa ctttcaggat atattcatgt tactccggta g 891

<210> 2

<211> 891

<212> DNA

<213> Hylocereus

<400> 2

atgggtttaa gagatgttgg agaaacactg cctcccggat tcagattcta cccaagtgat 60

gaagaattgg tctgtcatta ccttcacaaa aagattgcta atcaagaagc aatcaaaggc 120

actttggttg agattgattt gcatacttgt gagccatggg aactccctga ggtggctaag 180

ctcaacaaaa gtgaatggta cttcttcagc tttcgcgatc gcaagtatgc cacaggtttt 240

cggaccaatc gagcaacgac atctggatac tggaaagcca cgggtaagga tcgggtcata 300

tacgacccga agacccggga gatagtaggg atgagaaaga ctttggtgtt ttatcggaat 360

cgggccccaa atgggatcaa aacaggttgg atcatgcatg agttccgctt ggaaagcccg 420

catatgcctc ctaaggaaga ctgggtgtta tgcagagtgt ttcacaagaa caagggagaa 480

aacaatgcag ataaccctat cgttgataat caaaccacaa ttagctcttc ttctccaccc 540

tttgataatc aaaaatacaa cccgcaaatt tgtagatgcc atcaaattca gtcaatatct 600

tcaactaacc cctcaatatc atcatcatct gctccaaaca acagcaatgc tttaagcaat 660

tactcgccgt cattaaaccc taacaatctc ctgaaggagt gcgcctccag cagcttctcc 720

ttgagtgatt tgatcaaccc gagcacgaaa gatggtgcag atgattatgg gttcttgtgg 780

aatgacatgg attttgagga catcagcaat aacaagttag gaggaggagc tgctcatcat 840

gattttctcc ctcctctaat tccacaatgt catgatcatt tagagatgtg a 891

<210> 3

<211> 296

<212> PRT

<213> Hylocereus

<400> 3

Met Thr Ala Thr Thr Asn Asp Gly Leu Lys Leu Pro Ala Gly Phe Arg

1 5 10 15

Phe His Pro Thr Asp Glu Glu Leu Val Val His Tyr Leu Cys Arg Lys

20 25 30

Cys Ala Ser Gln Ser Ile Ala Val Pro Ile Ile Ala Glu Ile Asp Leu

35 40 45

Tyr Lys Phe Asp Pro Trp Gln Leu Pro Gly Ile Ala Leu Tyr Gly Glu

50 55 60

Lys Glu Trp Tyr Phe Phe Ser Pro Arg Asp Arg Lys Tyr Pro Asn Gly

65 70 75 80

Ser Arg Pro Asn Arg Ala Ala Gly Thr Gly Tyr Trp Lys Ala Thr Gly

85 90 95

Ala Asp Lys Pro Ile Gly Lys Pro Lys Thr Leu Gly Ile Lys Lys Ala

100 105 110

Leu Val Phe Tyr Ala Gly Lys Ala Pro Arg Gly Val Lys Thr Asn Trp

115 120 125

Ile Met His Glu Tyr Arg Leu Ala Asn Val Asp Arg Ser Ala His Pro

130 135 140

Gly Lys Lys Thr Asn Leu Arg Leu Asp Asp Trp Val Leu Cys Arg Ile

145 150 155 160

Tyr Asn Lys Lys Gly Asn Ile Glu Lys His Tyr Asn Val Asp Pro Asn

165 170 175

Ser Thr Leu Gln Asn Ser Asp Phe Glu Asp Gln Lys Pro Met Thr Leu

180 185 190

Thr Pro Thr Met Asn Ala Pro Gln Phe Pro Ala Ala Pro Ser Pro Pro

195 200 205

Leu Arg Asn Asp Pro Met His Phe Asp Thr Ser Asp Ser Val Pro His

210 215 220

Cys His Thr Asp Thr Ser Gly Ser Ala His Ile Gly Ser Pro Glu Phe

225 230 235 240

Pro Tyr Asn Lys Glu Val Gln Ser Glu Pro Lys Trp Asn Glu Leu Asp

245 250 255

Lys Ala Leu Asp Tyr Gln Phe Asn Tyr Met Asp Pro Phe Pro Thr Asp

260 265 270

Pro Phe Ser Ala Ser Gly Gln Phe Gln Gln Asp Gln Phe Thr Asn Phe

275 280 285

Gln Asp Ile Phe Met Leu Leu Arg

290 295

<210> 4

<211> 296

<212> PRT

<213> Hylocereus

<400> 4

Met Gly Leu Arg Asp Val Gly Glu Thr Leu Pro Pro Gly Phe Arg Phe

1 5 10 15

Tyr Pro Ser Asp Glu Glu Leu Val Cys His Tyr Leu His Lys Lys Ile

20 25 30

Ala Asn Gln Glu Ala Ile Lys Gly Thr Leu Val Glu Ile Asp Leu His

35 40 45

Thr Cys Glu Pro Trp Glu Leu Pro Glu Val Ala Lys Leu Asn Lys Ser

50 55 60

Glu Trp Tyr Phe Phe Ser Phe Arg Asp Arg Lys Tyr Ala Thr Gly Phe

65 70 75 80

Arg Thr Asn Arg Ala Thr Thr Ser Gly Tyr Trp Lys Ala Thr Gly Lys

85 90 95

Asp Arg Val Ile Tyr Asp Pro Lys Thr Arg Glu Ile Val Gly Met Arg

100 105 110

Lys Thr Leu Val Phe Tyr Arg Asn Arg Ala Pro Asn Gly Ile Lys Thr

115 120 125

Gly Trp Ile Met His Glu Phe Arg Leu Glu Ser Pro His Met Pro Pro

130 135 140

Lys Glu Asp Trp Val Leu Cys Arg Val Phe His Lys Asn Lys Gly Glu

145 150 155 160

Asn Asn Ala Asp Asn Pro Ile Val Asp Asn Gln Thr Thr Ile Ser Ser

165 170 175

Ser Ser Pro Pro Phe Asp Asn Gln Lys Tyr Asn Pro Gln Ile Cys Arg

180 185 190

Cys His Gln Ile Gln Ser Ile Ser Ser Thr Asn Pro Ser Ile Ser Ser

195 200 205

Ser Ser Ala Pro Asn Asn Ser Asn Ala Leu Ser Asn Tyr Ser Pro Ser

210 215 220

Leu Asn Pro Asn Asn Leu Leu Lys Glu Cys Ala Ser Ser Ser Phe Ser

225 230 235 240

Leu Ser Asp Leu Ile Asn Pro Ser Thr Lys Asp Gly Ala Asp Asp Tyr

245 250 255

Gly Phe Leu Trp Asn Asp Met Asp Phe Glu Asp Ile Ser Asn Asn Lys

260 265 270

Leu Gly Gly Gly Ala Ala His His Asp Phe Leu Pro Pro Leu Ile Pro

275 280 285

Gln Cys His Asp His Leu Glu Met

290 295

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgacggcca cgacgaat 18

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ctaccggagt aacatgaata tatcctg 27

<210> 7

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atgggtttaa gagatgttgg agaaac 26

<210> 8

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tcacatctct aaatgatcat gacattgtg 29

<210> 9

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gtcgacggta tcgataagct tatgacggcc acgacgaat 39

<210> 10

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tttactcata ctagtggatc cccggagtaa catgaatata tcctg 45

<210> 11

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gtcgacggta tcgataagct tatgggttta agagatgttg gagaaac 47

<210> 12

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tttactcata ctagtggatc ccatctctaa atgatcatga cattgtg 47

<210> 13

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

cattctacaa ctacatctag aatgacggcc acgacgaat 39

<210> 14

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

agcttgcatg ccaattctag actaccggag taacatgaat atatcctg 48

<210> 15

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

cattctacaa ctacatctag aatgggttta agagatgttg gagaaac 47

<210> 16

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

agcttgcatg ccaattctag atcacatctc taaatgatca tgacattgtg 50

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gagtatcgcc tcgctaatgt c 21

<210> 18

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

tgttgccctt cttgttgtag at 22

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

ttggtgtttt atcggaatcg 20

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

gcattgtttt ctcccttgtt c 21

Claims

1. 一种火龙果低温响应基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1或2所示。

2. 一种火龙果低温响应蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3或4所示。

3.一种重组载体，其特征在于，含有权利要求1所述火龙果低温响应基因。

4.一种重组工程菌，其特征在于，含有权利要求3所述重组载体。

5.权利要求1所述火龙果低温响应基因、权利要求2所述火龙果低温响应蛋白、权利要求3所述重组载体或权利要求4所述重组工程菌中的任意一个或几个在增强拟南芥耐寒性或培育高耐寒性拟南芥中的应用。

6.一种增强拟南芥耐寒性或培育高耐寒性拟南芥的方法，其特征在于，将权利要求1所述低温响应基因在拟南芥中过表达或表达。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，使用转化有权利要求3所述重组载体农杆菌侵染拟南芥，所述重组载体为重组表达载体。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述表达载体为pPZP6k90。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述农杆菌为GV3101(pSoup-p19)。

10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，采用核苷酸序列如SEQ ID NO.13～14或核苷酸序列如SEQ ID NO.15～16所示引物检测阳性植株。