CN114908106A

CN114908106A - 一种玫瑰耐盐基因RrLBD40及其应用

Info

Publication number: CN114908106A
Application number: CN202210691780.3A
Authority: CN
Inventors: 王建文; 冯立国; 徐勇; 魏国; 张伟杰
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou University
Priority date: 2022-06-17
Filing date: 2022-06-17
Publication date: 2022-08-16
Anticipated expiration: 2042-06-17
Also published as: CN114908106B

Abstract

本发明提供一种玫瑰耐盐基因RrLBD40及其应用，属于植物基因工程技术领域，玫瑰耐盐基因RrLBD40为耐盐性正调控因子，过表达拟南芥植株的耐盐性增强，RrLBD40基因可以促进离子的吸收积累提高植物耐盐性，预期可利用农杆菌介导法转化玫瑰细胞胚，对于培育耐盐玫瑰新品种，以利用玫瑰主产区的盐碱地具有巨大价值。

Description

一种玫瑰耐盐基因RrLBD40及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种玫瑰耐盐基因RrLBD40及其应用。

背景技术

蔷薇科蔷薇属落叶灌木野生玫瑰(Rosa rugosa Thunb.)是国家二级濒危保护植物，自然分布于中国东北沿海地区、俄罗斯远东地区、朝鲜半岛和日本。其适应高盐度生境，具有很强的耐盐性以，是蔷薇属植物耐盐品种培育珍贵的亲本材料。栽培玫瑰的观赏、品质性状优良，富含玫瑰精油等芳香物质，广泛用于香料工业，长期的人工选择导致栽培品种耐盐性较弱，而我国玫瑰主产区存在丰富的盐渍土资源，无法被充分利用，限制了玫瑰产业的推广和发展。

LBD转录因子是一类植物特异性转录因子家族，LBD蛋白是通过保守的LOB结构域确定的。它包括一个由半胱氨酸残基“CX2CX6CX3C”组成的锌指基序，一个Gly-Ala-Ser(GAS)块，以及一个类似于与蛋白质二聚化相关的亮氨酸(Leu)拉链的螺旋卷曲结构“LX6LX3LX6”。LBD蛋白在植物花序、叶片和侧枝的发育中起着重要的作用。第一个被鉴定的LBD成员是AtLOB，通过与无茎分生蛋白和短茎细胞蛋白相互作用来调节叶片的早期发育。虽然LBD蛋白在调节植物侧边器官发育中的功能已经在模式种和非模式物种中得到证实，但近期研究表明LBD在非生物胁迫应答中同样起着重要作用。例如，在高粱(Sorghumbicolor)中，SbLBD4、SbLBD5、SbLBD7、SbLBD12～15、SbLBD32和SbLBD33在自然条件下表达水平较低，但是在油菜素内酯、干旱和盐胁迫处理下表达显著上调，在茶树(Camelliasinensis)中，CsLOB_3和CsLBD36_2受盐和干旱诱导，并参与提高CsC4H(肉桂酸4-羟化酶)、CsDFR(二氢黄酮醇4-还原酶)和CsUGT84A(UDP-葡糖醛酸基转移酶)的启动子活性，这些基因是类黄酮生物合成途径的关键基因。在小立碗藓(Physcomitrium patens)中，PpLBD27通过ABA信号通路对干旱胁迫做出响应。这意味着这些基因可能在逆境胁迫信号通路的反应中起作用，或者在生长素、油菜素内酯、盐胁迫和干旱胁迫信号之间的相互作用中起作用。

玫瑰LBD基因及其对耐盐性的调控尚未开展研究，探究玫瑰耐盐调控的LBD成员，对蔷薇属植物抗性育种具有指导意义，为培育高耐盐性同时兼具经济价值的优良玫瑰新品种的提供基础，促进玫瑰产业发展。

发明内容

针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种玫瑰耐盐基因RrLBD40。本发明的另一目的是玫瑰耐盐基因RrLBD40的应用。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的，一种玫瑰耐盐基因RrLBD40，其特征在于,所述玫瑰耐盐基因RrLBD40的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。SEQ ID NO.1：

ATGCGGATGAGCTGTAATGGATGCCGAATACTACGCAAGGGGTGCAGTGAGAATTGTAGCATCAGACCCTGTTTGCAGTGGATAAAGAGCCCCGAATCCCAAGCCAACGCCACCGTTTTCCTCGCCAAGTTTTACGGCCGCGCCGGGCTCATGAACCTCATCAACGCCGGACCCGAACACCTCCGACCTGCGATTTTCCGGTCACTGCTCTACGAGGCATGCGGGAGGATTGTGAACCCGATTTACGGGTCGGTCGGGTTGTTGTGGTCCGGGTCATGGCAGCTATGCCAAGCCGCCGTGGAGAACGTGCTGAAGGGCCAGCCGATCACGCCGATCACCTCTGAGGCCGCGGCCAGCGGGCATGGCCCACCTCTCAAGGCGTACGACATTCGACACGTGTCCAAGGACGAGAACTCCGCCGCGTCCAATGACCCCCAGAAGGCAAAGACGCGCTACCGGTTCAAGAGGTCCGTCGGGAAGCCCAAGCAGCCCAACAAGACCGGGTCGGGATCCGGAGTTGAGGACGCGGCGGCTCGCTTTGAAGCCAAGCCGAACTGGACCAGCGACGAGTTCAACCGGTCGACGAGTCACGAGTCGTCGCTGAGTCACCAGTCCGAGGCTGCCAACGTGGACGGCGACAGCAAGGAAACCGAGAGCATGGTTTCCTCGGAGACGGCCGAGGCTTCGCTGTTGTTCCGAGCCGAGCCGGAGTCATCGGCTCACAAGCGAACCGCGCCGGTTCAGGAAAACGAGTTAGGTCTGGAGCTGACTCTCGGATTCGAATCGTCATCACGTGCTCCCCACGTGGTTCCGGTCAAGAAGAGAAGGGTAGACGCCTCAGGATTCTGCGGTGGGTCGTCGTCGGGCGACGGCGCGTGTAAAATGGAGCTGGGCCTTGCTTGA。

一种玫瑰耐盐基因RrLBD40，其特征在于，所述RrLBD40的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。SEQ ID NO.2：

MRMSCNGCRILRKGCSENCSIRPCLQWIKSPESQANATVFLAKFYGRAGLMNLINAGPEHLRPAIFRSLLYEACGRIVNPIYGSVGLLWSGSWQLCQAAVENVLKGQPITPITSEAAASGHGPPLKAYDIRHVSKDENSAASNDPQKAKTRYRFKRSVAKPKQPNKTGSGSGVEDAAARFEAKPNSDEFNRSTSHESSLSHQSEAANVDGDSKETESMVSSETAEASLLFRAEPESSAHKRTAPVQENELGLELTLGFESSSRAPHVVPVKKRRVDASGFCGGSSSGDGACKVELGLA。

一种玫瑰耐盐基因RrLBD40的过表达载体pCambia1304-MCS35S：RrLBD40，其特征在于，所述pCambia1304-MCS35S：RrLBD40包含基因RrLBD40，载体为植物过表达载体pCambia1304-MCS35S。

进一步地，所述过表达载体pCambia1304-MCS35S：RrLBD40的制备方法，其特征在于，所述方法如下：设计带有NC克隆接头的RrLBD40引物，将包含RrLBD40基因全长cDNA的PCR扩增产物与载体pCambia1304-MCS35S进行快速组装，一步法获取35S启动子-RrLBD40-NOS终止子的超表达框。

优选的，所述引物序列如下：

优选的，所述RrLBD40基因的扩增方法如下：

以为野生玫瑰叶片的cDNA为模板，扩增基因编码区片段，引物序列如下：

序列名称	序列	序列编号
			Primer F	5’-ATGCGGATGAGCTGTAATGG-3’	SEQ ID NO.3
Primer R	5’-TCAAGCAAGGCCCAGCTCCA-3’	SEQ ID NO.4

。

一种的玫瑰耐盐基因RrLBD40在提高玫瑰耐盐性中的应用。

进一步地，所述应用的方法如下：用所述玫瑰耐盐基因RrLBD40序列构建过表达载体，并转化农杆菌侵染玫瑰体胚，筛选具有卡那霉素抗性的体胚，并进一步分化为植株，即得到转基因玫瑰。

优选的，所述的过表达载体为pCambia1304-MCS35S：RrLBD40。

本发明具有以下有益效果：(1)本发明以野生玫瑰为材料，克隆了RrLBD40基因，检测了RrLBD40基因在盐处理下的表达模式，通过遗传转化提高了过表达拟南芥的耐盐性，证明其为耐盐性正调控因子，过表达拟南芥植株的耐盐性增强，对培育耐盐玫瑰新种领域有重要应用价值。

(2)本发明中用RrLBD40基因序列构建可在拟南芥中过表达载体，RrLBD40基因过表达后，与野生型植株相比，超表达RrLBD40促进了拟南芥植株根系发育，提高了盐迫耐受性；RrLBD40基因可以促进离子的吸收积累提高植物耐盐性，预期可利用农杆菌介导法转化玫瑰细胞胚，对于培育耐盐玫瑰新品种，以利用玫瑰主产区的盐碱地具有巨大价值。

(3)本发明的RrLBD40基因对蔷薇属植物抗性育种具有指导意义，为培育高耐盐性同时兼具经济价值的优良玫瑰新品种的提供基础，促进玫瑰产业发展。

附图说明

图1是RrLBD40基因时空表达模式图。

图2是植物过表达载体pCambia1304-MCS35S质粒图谱。

图3是RrLBD40过表达拟南芥和野生型的生长表型。

图4是RrLBD40过表达拟南芥和野生型的根系长度柱状图。

图5是RrLBD40过表达拟南芥和野生型的根系Na+荧光表型。

具体实施方式

下面结合具体的制备实施例和应用实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围，在不背离本发明的精神和范围的情况下，任何基于本发明技术方案的等效变换、简单替换等显而易见的改变，均落在本发明保护范围之内。

实施例1：RrLBD40基因克隆

以为野生玫瑰叶片的cDNA为模板，扩增基因编码区片段，连接克隆载体并测序，得到基因核苷酸序列。

(1)引物设计

基于玫瑰转录本，设计RrLBD40基因的包含完整开放阅读框的上下游引物，引物序列如下：

。

(2)基因分离

通过FastPure Plant Total RNA Isolation Kit试剂盒(Vazyme)提取野生玫瑰叶片和根系总RNA，具体步骤如下：

1)在待用的超净工作台中喷施RNase和核酸清除剂，排除RNase对后续实验的干扰；

2)将Buffer PRL在水浴锅中预热至65℃，并在其中加入5％的β-巯基乙醇；

3)取约0.3g样品于研钵中，加入液氮迅速冷冻研磨，加入65℃预热的500μlBuffer PRL立即剧烈涡旋振荡60sec，使其充分裂解；

4)将裂解混合物在65℃水浴锅中水浴5min，期间颠倒1-2次帮助裂解，随后12000rpm离心10min；

5)吸取上清液至新的1.5ml RNase-free离心管中，并加入0.5倍上清体积的Ethanol absolute，立刻吹打混匀；

6)将FastPure gDNA-Fiter ColumnⅡ放入收集管中，并将上述混合液转入其中，12000rpm离心2min，弃滤液；

7)将FastPure gDNA-Fiter ColumnⅡ放至新的Collection Tubes 2ml中，加入500μl Buffer PRLPlus，12000rpm离心30sec；

8)向滤液中加入0.5倍上清体积的Ethanol absolute，立即吹打混匀；

9)转移混合液转移至FastPure RNA ColumnⅣ中，12000rpm离心2min，弃滤液；

10)向FastPure RNAColumnⅣ中加入500μl Buffer PRW2，12000rpm离心30sec，弃滤液；

11)重复步骤10)；

12)将FastPure RNA ColumnⅣ吸附柱放回收集管中，12000rpm离心2min；

13)将FastPure RNA ColumnⅣ转移至新的RNase-free Collection Tubes 1.5ml离心管中，向吸附柱膜中心悬空滴加30μl的RNase-free ddH2O，室温放置2min，12000rpm离心1min；

14)将收集到的RNA以1μg分装并于-80℃冰箱中保存。

通过HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit(Vazyme)试剂盒将RNA反转录为cDNA，具体操作步骤如下：

1)RNA模板变性

RNase-Free ddH2O To 8μl

Total RNA 5μg

65℃孵育5min，在碎冰中冷激处理，再于冰上静置2min；

2)基因组DNA的去除

上一步的混合液 8μl

5×gDNA wiper Mix 2μl

用移液器轻轻吹打混匀，并于42℃反应2min；

3)配置第一链cDNA合成反应液

用移液器轻轻吹打混匀；

4)按照25℃，5min；37℃，45min；85℃，5sec三步程序进行反应，得到cDNA。

通过PCR进行RrLBD40基因扩增，具体步骤如下：

1)按照50μl体系配制反应液:

2)按照95℃，3min；95℃，10sec，55℃，5sec(循环35次)；72℃，5sec；72℃，3min的程序进行扩增反应，得到PCR产物；

使用FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit试剂盒进行PCR产物纯化，步骤如下：

1)在水平电泳结束后，在凝胶图像成像分析仪下观察，并切下准确条带置于1.5ml离心管中；

2)加入约600μl的Buffer GDP。50～55℃水浴7～10min，确保胶块完全溶解，水浴期间颠倒混匀数次；

3)将小于等于700μl溶胶液体转移至吸附柱中，12000rpm离心30sec；

4)弃滤液，将吸附柱置于收集管中，加入300μl Buffer GDP至吸附柱中，静置1min后12000rpm离心30sec；

5)弃滤液，将吸附柱置于收集管中，加入700μl Buffer GW至吸附柱中，12000rpm离心30sec；

6)重复步骤5)；

7)弃滤液后把吸附柱放回收集管中，12000rpm离心2min；

8)将吸附柱置于新的1.5ml灭菌离心管中，加入15μl Elution Buffer至吸附柱中央，室温静置2min，随后12000rpm离心2min，收集得到纯化后的PCR产物。

通过pEASY-Blunt Cloning Kit(全式金)将PCR产物连接测序载体，转化大肠杆菌后测序，步骤如下：

1)按照5μl体系配制反应液：

PCR Product： 50ng

pEASY-Blunt Zero Cloning Vector 1μl

RNase-Free ddH2O To 5μl

2)25℃孵育10min得到连接产物；

3)大肠杆菌转化：将新鲜制备或-70℃冻存的Trans1-T1感受态细胞在冰上融化；取5μl连接产物，加入到100μl感受态细胞中，并轻轻混匀，冰浴30min左右；42℃水浴中热击90sec，迅速置于冰上3-5min；加入800μl LB液体培养基，37℃&100rmp摇菌1h；4000rmp离心3min，吸掉上层800μl培养基，混匀剩余菌液；将菌液涂抹于含有Kan的LB筛选固体培养基上，37℃倒置培养过夜；

4)阳性克隆筛选及测序分析

从筛选培养板上挑选单菌落接种于LB液体培养基中，37℃&250rmp摇菌6h；以培养6h菌液为模板进行菌液PCR检测后，选择阳性菌液送上海生工生物公司进行测序，成功分离得到RrLBD40基因。

实施例2：通过荧光定量PCR技术探究RrLBD40基因时空表达模式

基于RrLBD40基因的外显子区域设计荧光定量PCR上游引物5’-GACGCGCTACCGGTTCAAGA-3’(SEQ ID NO.5)和下游引物5’-GGTCCAGTTCGGCTTGGCTT-3’(SEQID NO.6)，基于内参基因(PHD)设计内参上游引物5’-GCCGACGCGCTGGTTTGATT-3’(SEQ IDNO.7)和下游引物5’-CCAGTCCTTCTCCGCCATCCC-3’(SEQ ID NO.8)。利用SYBR Premix ExTaq(Takara)和荧光定量PCR仪CFX96TM(Bio-RAD)进行实时荧光定量PCR，使用Bio-Rad CFXManager软件进行数据处理，采用2^-△△Ct法进行计算。每个生物学重复中又进行了三次技术重复，在三组平行数据中取平均值以减少误差。

如图1所示，在盐处理前，RrLBD40在叶片和根系中的表达量较低；1h盐处理后，叶片中RrLBD40表达量维持低水平，而在根系中RrLBD40表达量则急剧增加(约20倍)。表明RrLBD40表达量收到盐胁迫显著诱导(p<0.01)。

实施例3：RrLBD40过表达载体构建和拟南芥遗传转化

植物过表达载体(图2)构建方法如下：

设计带有NC克隆接头的RrLBD40引物Primer1：5’-AGTGGTCTCTGTCCAGTCCTATGCGGATGAGCTGTAATGG-3’(SEQ ID NO.9)和Primer2：5’-GGTCTCAGCAGACCACAAGTTCAAGCAAGGCCCAGCTCCA-3’(SEQ ID NO.10)，以实施例1获得的RrLBD40基因目的片段为模板进行PCR扩增，PCR扩增和产物回收过程同实施例1；

利用Nimble Cloning试剂盒(NC Biotech)进行插入片段与pCambia1304-MCS35S载体的一步法快速克隆，体系同实施例1，大肠杆菌转化与阳性克隆筛选方法同实施例1，阳性菌液送生工生物公司(南京)测序，获得RrLBD40过表达载体pCambia1304-MCS35S：RrLBD40。

通过花序蘸染法侵染拟南芥，经过筛选具有潮霉素抗性的转化苗即得到转基因植株。主要步骤和应用试剂如下所述：

I.试剂和溶液缩写

本发明中培养基所用到的植物激素的缩写表示如下：Kan(Kanamycin，卡那霉素)；Hyg(Hygromycin，潮霉素)；拟南芥转化辅助试剂(Silwet L-77)。

II.农杆菌介导的遗传转化步骤

(1)农杆菌的培养

首先，将含有目的载体的农杆菌EHA105在含有对应抗性(Kan)选择的固体LB培养基(10g/L蛋白胨+5g/L酵母提取物+10g/L NaCl+50mg/L Kan+15g/L琼脂)上28℃培养2-3天，并挑取阳性单克隆接种于对应抗性(Kan)选择的液体LB培养基(10g/L蛋白胨+5g/L酵母提取物+10g/L NaCl+50mg/L Kan)中，于28℃，200rpm摇床培养过夜，至菌液浓度OD600值为1.5-2.0。

(2)拟南芥花序蘸染法

将摇好的菌液4500rpm离心10min，并用5％的蔗糖溶液(附加20μl/100ml的拟南芥转化表面活性剂重悬)，将拟南芥花序在重悬液中浸泡30sec左右，遮光保湿并横平放置12-24h。

(3)阳性苗的筛选

侵染放置后，将拟南芥放入培养箱中正常培养，收获的种子在超净工作台通过70％酒精15sec-30sec和2％次氯酸钠15min进行消毒，无菌水洗3-4次后平铺于含抗性的1/2MS培养基(1/2MS+30g/L蔗糖+7g/L琼脂+20mg/L Hyg)进行筛选；筛选的T1代植株进行PCR阳性检测并移栽至光照培养箱等待收种。重复操作直至获得T3代纯合植株。

实施例4：RrLBD40过表达拟南芥植株耐盐表型观测

将过表达RrLBD40基因拟南芥和野生型拟南芥点播于含0mM、85mM、100mM、120mM浓度NaCl的1/2MS培养基上，并生长两周。通过表型观测(图3)发现，在不含NaCl的培养基上，过表达植株根系长度相比野生型植株显著增长(p<0.01，图4)；在85mM NaCl的培养基上，过表达植株根系长度与野生型植株根系长度差异不显著；在含100mM和120mM NaCl的培养基上，过表达植株根系长度相比野生型伸长显著(p<0.1，图4)。说明在盐胁迫浓度大于85mM时，野生型植株的盐敏感性高于过表达RrLBD40基因植株，超表达RrLBD40促进了拟南芥植株根系发育，提高了盐胁迫耐受性。

实施例5：RrLBD40过表达基因拟南芥植株根系Na+吸收检测，通过其根系Na+吸收能力变化，判断RrLBD40是否促进耐盐性

(1)选取约2周龄的转基因拟南芥和野生型拟南芥，设置0.6％的MES溶液并添加0Mm、50mM、85mM、100mM和170mM浓度的NaCl作为液体培养基，将拟南芥幼苗根部用去离子水清洗干净后在MES液体培养基中培养三天。在上镜观察前，在室温黑暗条件下，用50μMCoroNa^TM Green AM对拟南芥幼苗培养3h。然后用去离子水洗涤这些染色的幼苗三次，以除去残留的染色溶液，并将完整幼苗的根尖切成约1cm长的段，放在含有少量水的载玻片上，然后用盖玻片覆盖制片完成。

(2)使用双光子激光共聚焦显微镜，使用488nm激发激光源，505nm至525nm之间的发射波长通过FITC(异硫氰酸荧光素)绿色荧光滤光片；采用差分干涉对比度(DIC)亮透射滤光器捕获根尖图像。

将在添加了0mM、50mM、85mM、100mM、170mM浓度NaCl 0.6％MES液体培养基中培养三天的过表达RrLBD40基因拟南芥植株和野生型植株在激光共聚焦显微镜下观察Na+荧光。

如图5所示，过表达RrLBD40基因拟南芥植株和野生型植株根系只显示微弱的荧光，Na+积累无显著差异。在100mM NaCl处理下，过表达RrLBD40拟南芥植株根系显现出远高于对照组的荧光，表明RrLBD40拟南芥可以对Na+在大量吸收积累，降低盐分对自身的毒害作用。

实施例6：RrLBD40在玫瑰中的遗传转化

根据RrLBD40促进拟南芥的耐盐性，可以推测RrLBD40在玫瑰栽培品种中过表达同样可以促进其耐盐性，以常见栽培玫瑰品种“保白”玫瑰为例，通过体胚侵染并经过筛选具有卡那霉素抗性的转化苗，即得到转基因植株。主要步骤参照邢文等(Acta PhysiologiaePlantarum,2014,36(8):2013-2023.)的方法改进如下所述：

(1)侵染液准备：将含有目的载体的农杆菌(同实施例3)，进行28℃扩大培养，得到50ml菌液(OD600在0.6-0.8之间)，4500rpm离心10min，去除上清，使用含有200μmol/L AS(乙酰丁香酮)的MS溶液重悬菌体(持续2h)。

(2)侵染：将保白玫瑰的体胚和重悬液混合，摇床缓慢摇动60min。

(3)共培养：将侵染后的体胚放置于共培培养基(MS培养基+1mg/L 2,4-D+0.01mg/L6BA+200μmol/L AS)，暗培养2d。

(4)增殖和萌发：将体胚转入增殖培养基(MS培养基+1mg/L 2,4-D+0.01mg/L 6BA+300mg/L Cef+100mg/L kan)，培养60d后，挑选增殖良好的体胚，转入萌发培养基(MS培养基+1mg/L 6BA+300mg/L Cef+75mg/L kan)，培养60d。

(5)壮芽和生根：选择萌发情况好的体胚，转入壮芽培养基(MS培养基+0.5mg/L6BA+0.01mg/L NAA+300mg/L Cef+75mg/L kan)，培养60d后，转入生根培养基(MS培养基+0.5mg/L IBA+300mg/L Cef+20mg/L kan)。

(6)练苗：打开瓶盖，放置1-2天，逐步较少喷水，一周后移到土壤中盆栽，正常养护，得到完整的转RrLBD40基因“保白”玫瑰。

最后应说明的是：以上所述的各实施例仅用于说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或全部技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

序列表

<110> 扬州大学

<120> 一种玫瑰耐盐基因RrLBD40及其应用

<130> 111

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 903

<212> DNA

<213> 野生玫瑰(Rosa rugosa Thunb.)

<400> 1

atgcggatga gctgtaatgg atgccgaata ctacgcaagg ggtgcagtga gaattgtagc 60

atcagaccct gtttgcagtg gataaagagc cccgaatccc aagccaacgc caccgttttc 120

ctcgccaagt tttacggccg cgccgggctc atgaacctca tcaacgccgg acccgaacac 180

ctccgacctg cgattttccg gtcactgctc tacgaggcat gcgggaggat tgtgaacccg 240

atttacgggt cggtcgggtt gttgtggtcc gggtcatggc agctatgcca agccgccgtg 300

gagaacgtgc tgaagggcca gccgatcacg ccgatcacct ctgaggccgc ggccagcggg 360

catggcccac ctctcaaggc gtacgacatt cgacacgtgt ccaaggacga gaactccgcc 420

gcgtccaatg acccccagaa ggcaaagacg cgctaccggt tcaagaggtc cgtcgggaag 480

cccaagcagc ccaacaagac cgggtcggga tccggagttg aggacgcggc ggctcgcttt 540

gaagccaagc cgaactggac cagcgacgag ttcaaccggt cgacgagtca cgagtcgtcg 600

ctgagtcacc agtccgaggc tgccaacgtg gacggcgaca gcaaggaaac cgagagcatg 660

gtttcctcgg agacggccga ggcttcgctg ttgttccgag ccgagccgga gtcatcggct 720

cacaagcgaa ccgcgccggt tcaggaaaac gagttaggtc tggagctgac tctcggattc 780

gaatcgtcat cacgtgctcc ccacgtggtt ccggtcaaga agagaagggt agacgcctca 840

ggattctgcg gtgggtcgtc gtcgggcgac ggcgcgtgta aaatggagct gggccttgct 900

tga 903

<210> 2

<211> 298

<212> PRT

<213> 野生玫瑰(Rosa rugosa Thunb.)

<400> 2

Met Arg Met Ser Cys Asn Gly Cys Arg Ile Leu Arg Lys Gly Cys Ser

1 5 10 15

Glu Asn Cys Ser Ile Arg Pro Cys Leu Gln Trp Ile Lys Ser Pro Glu

20 25 30

Ser Gln Ala Asn Ala Thr Val Phe Leu Ala Lys Phe Tyr Gly Arg Ala

35 40 45

Gly Leu Met Asn Leu Ile Asn Ala Gly Pro Glu His Leu Arg Pro Ala

50 55 60

Ile Phe Arg Ser Leu Leu Tyr Glu Ala Cys Gly Arg Ile Val Asn Pro

65 70 75 80

Ile Tyr Gly Ser Val Gly Leu Leu Trp Ser Gly Ser Trp Gln Leu Cys

85 90 95

Gln Ala Ala Val Glu Asn Val Leu Lys Gly Gln Pro Ile Thr Pro Ile

100 105 110

Thr Ser Glu Ala Ala Ala Ser Gly His Gly Pro Pro Leu Lys Ala Tyr

115 120 125

Asp Ile Arg His Val Ser Lys Asp Glu Asn Ser Ala Ala Ser Asn Asp

130 135 140

Pro Gln Lys Ala Lys Thr Arg Tyr Arg Phe Lys Arg Ser Val Ala Lys

145 150 155 160

Pro Lys Gln Pro Asn Lys Thr Gly Ser Gly Ser Gly Val Glu Asp Ala

165 170 175

Ala Ala Arg Phe Glu Ala Lys Pro Asn Ser Asp Glu Phe Asn Arg Ser

180 185 190

Thr Ser His Glu Ser Ser Leu Ser His Gln Ser Glu Ala Ala Asn Val

195 200 205

Asp Gly Asp Ser Lys Glu Thr Glu Ser Met Val Ser Ser Glu Thr Ala

210 215 220

Glu Ala Ser Leu Leu Phe Arg Ala Glu Pro Glu Ser Ser Ala His Lys

225 230 235 240

Arg Thr Ala Pro Val Gln Glu Asn Glu Leu Gly Leu Glu Leu Thr Leu

245 250 255

Gly Phe Glu Ser Ser Ser Arg Ala Pro His Val Val Pro Val Lys Lys

260 265 270

Arg Arg Val Asp Ala Ser Gly Phe Cys Gly Gly Ser Ser Ser Gly Asp

275 280 285

Gly Ala Cys Lys Val Glu Leu Gly Leu Ala

290 295

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgcggatga gctgtaatgg 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcaagcaagg cccagctcca 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gacgcgctac cggttcaaga 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggtccagttc ggcttggctt 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gccgacgcgc tggtttgatt 20

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ccagtccttc tccgccatcc c 21

<210> 9

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

agtggtctct gtccagtcct atgcggatga gctgtaatgg 40

<210> 10

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ggtctcagca gaccacaagt tcaagcaagg cccagctcca 40

Claims

1.一种玫瑰耐盐基因RrLBD40，其特征在于,所述玫瑰耐盐基因RrLBD40的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的一种玫瑰耐盐基因RrLBD40，其特征在于，所述RrLBD40的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种如权利要求1或2所述的玫瑰耐盐基因RrLBD40的过表达载体pCambia1304-MCS35S：RrLBD40，其特征在于，所述pCambia1304-MCS35S：RrLBD40包含基因RrLBD40，载体为植物过表达载体pCambia1304-MCS35S。

4.权利要求3所述过表达载体pCambia1304-MCS35S：RrLBD40的制备方法，其特征在于，所述方法如下：设计带有NC克隆接头的RrLBD40引物，将包含RrLBD40基因全长cDNA的PCR扩增产物与载体pCambia1304-MCS35S进行快速组装，一步法获取35S启动子-RrLBD40-NOS终止子的超表达框。

5.根据权利要求4所述的过表达载体pCambia1304-MCS35S：RrLBD40的制备方法，其特征在于，所述引物序列如下：

6.根据权利要求4所述的的过表达载体pCambia1304-MCS35S：RrLBD40的制备方法，其特征在于，所述RrLBD40基因的扩增方法如下：

7.一种如权利要求1或2所述的玫瑰耐盐基因RrLBD40在提高玫瑰耐盐性中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用的方法如下：用所述玫瑰耐盐基因RrLBD40序列构建过表达载体，并转化农杆菌侵染玫瑰体胚，筛选具有卡那霉素抗性的体胚，并进一步分化为植株，即得到转基因玫瑰。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的过表达载体为权利要求3所述的过表达载体pCambia1304-MCS35S：RrLBD40。