CN115992147A - 一种玫瑰耐盐基因RrGTγ-4及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种野生玫瑰耐盐基因RrGT γ‑4及其应用，RrGTγ‑4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明通过将野生玫瑰的RrGTγ‑4基因分离后，转入模式植物拟南芥，转基因拟南芥的耐盐性显著增强，表明RrGTγ‑4基因是耐盐性的正调控因子，在培育栽培玫瑰耐盐抗逆育种领域有重要应用价值。

Description

一种玫瑰耐盐基因 RrGTγ-4及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种玫瑰耐盐基因 RrGTγ-4及其应用。

背景技术

蔷薇科蔷薇属落叶灌木野生玫瑰（ Rosa rugosa Thunb.）是国家二级濒危保护植物，自然分布于中国东北沿海地区、俄罗斯远东地区、朝鲜半岛和日本。其适应高盐度生境，具有很强的耐盐性以，是蔷薇属植物耐盐品种培育珍贵的亲本材料。栽培玫瑰的观赏、品质性状优良，富含玫瑰精油等芳香物质，广泛用于香料工业，长期的人工选择导致栽培品种耐盐性较弱，而我国玫瑰主产区存在丰富的盐渍土资源，无法被充分利用，限制了玫瑰产业的推广和发展。

Trihelix转录因子家族被发现是由于该成员的保守结构域可以与光响应所需的GT元件特异性地结合，从而行使它的正调控或负调控功能。这类蛋白对生物和非生物胁迫做出反应，并参与花、气孔、种子等发育过程[1, 2]。近年来的研究中，根据三螺旋转录因子不同的结构域，三螺旋TFs主要被分为五个亚家族，分别为SIP1、GT-1、GT-2、GTγ和SH4。Trihelix转录因子家族中GT因子的DNA结合域含有三个保守的串联螺旋结构，GT-2亚家族含有两个Trihelix保守结构域（DNA结合结构域），SH4亚家族没有第四α螺旋结构域，携带一个延伸的第三个三螺旋，其他亚家族包含一个保守结构域，一个第四α螺旋结构域和一个各不相同的α螺旋结构域。

在过去的研究报道中Trihelix转录因子在植物生长发育过程承担着重要作用，近年来有关其响应非生物胁迫的研究日益增多。迄今为止，除了SH4外每个亚家族都有成员参与非生物胁迫响应的报道，其中，GT-1和SIP1亚家族的研究主要集中于ABA敏感性变化，GTγ亚家族专注于耐盐胁迫，对于GT-2亚家族的研究较为综合全面，包含干旱、冷、盐胁迫等。另外，现有的模式种如：拟南芥、水稻、大豆等[4-6]都已有Trihelix的全基因组分析，芜菁、苦荞麦、毛竹等物种[7-13]的相关研究也相继发表，小麦物种[14, 15]还有正常环境和非生物胁迫，不同情况下的全基因组分析研究。

玫瑰Trihelix基因家族及其成员对耐盐性的调控尚未开展研究，探究玫瑰耐盐调控的Trihelix成员，对蔷薇属植物抗性育种具有指导意义，为培育高耐盐性同时兼具经济价值的优良玫瑰新品种的提供基础，促进玫瑰产业发展。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术中存在的不足，提供一种玫瑰耐盐基因 RrGTγ-4及其应用，第一个目的是提供玫瑰耐盐基因 RrGTγ-4，另一目的是玫瑰耐盐基因 RrGTγ-4的应用。

本发明的目的是这样实现的：一种玫瑰耐盐基因 RrGTγ-4，其核苷酸序列如SEQID NO.1所示。所述玫瑰耐盐基因 RrGTγ-4的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

含有所述的玫瑰耐盐基因 RrGTγ-4的过表达载体。即，含有所述玫瑰耐盐基因 RrGTγ-4植物过表达载体pNC-Cam1304-MCS35S： RrGTγ-4。所述载体组装有NC克隆框（Nimble Cloning Frame），可以一步法快速组装基因片段，获得35S启动子- RrGTγ-4-NOS终止子的超表达框，可以保证 RrGTγ-4基因稳定持续在宿主细胞内大量表达。

所述玫瑰耐盐基因 RrGTγ-4在提高玫瑰耐盐性中的应用。

通过本发明，本发明公开了一种野生玫瑰耐盐基因 RrGTγ-4及其应用， RrGTγ-4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明通过将野生玫瑰的 RrGTγ-4基因分离后，转入模式植物拟南芥，转基因拟南芥的耐盐性显著增强，表明 RrGTγ-4基因是耐盐性的正调控因子，在培育栽培玫瑰耐盐抗逆育种领域有重要应用价值。

有益效果：本发明以野生玫瑰为材料，克隆了 RrGTγ-4基因，检测了 RrGTγ-4基因在盐处理下的表达模式，通过遗传转化提高了过表达拟南芥的耐盐性，证明其为耐盐性正调控因子，对培育耐盐玫瑰新种质有重要应用价值。

附图说明

图1是 RrGTγ-4基因时空表达模式图；

图2是植物过表达载体pNC-Cam1304-MCS35S质粒图谱；

图3是 RrGTγ-4过表达拟南芥耐盐表型；

图4是 RrGTγ-4过表达拟南芥表型统计图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。

实施例1

1、 RrGTγ-4基因克隆

以为野生玫瑰叶片的cDNA为模板，扩增基因编码区片段，连接克隆载体并测序，得到基因核苷酸序列。

I.引物设计

基于玫瑰转录本，设计 RrGTγ-4基因的包含完整开放阅读框的上下游引物

Primer F：5’- TGCAGAGATTAGACTATGACA -3’

Primer R：5’- ATACATATTATCCGGTGAGGT -3’

II. 基因分离

通过FastPure Plant Total RNA Isolation Kit试剂盒（Vazyme）提取野生玫瑰叶片和根系总RNA，具体步骤如下：

1）在待用的超净工作台中喷施RNase和核酸清除剂，排除RNase对后续实验的干扰。

2）将Buffer PRL在水浴锅中预热至65 ℃，并在其中加入5 %的β-巯基乙醇。

3）取约0.3 g样品于研钵中，加入液氮迅速冷冻研磨，加入65 ℃预热的500 μlBuffer PRL立即剧烈涡旋振荡60 sec，使其充分裂解。

4）将裂解混合物在65 ℃水浴锅中水浴5 min，期间颠倒1-2次帮助裂解，随后12000 rpm离心10 min。

5）吸取上清液至新的1.5 ml RNase-free离心管中，并加入0.5倍上清体积的Ethanol absolute，立刻吹打混匀。

6）将FastPure gDNA-Fiter Column Ⅱ放入收集管中，并将上述混合液转入其中，12000 rpm离心2 min，弃滤液。

7）将FastPure gDNA-Fiter Column Ⅱ放至新的Collection Tubes 2 ml中，加入500 μl Buffer PRLPlus，12000 rpm离心30 sec。

8）向滤液中加入0.5倍上清体积的Ethanol absolute，立即吹打混匀。

9）转移混合液转移至FastPure RNA Column Ⅳ中，12000 rpm离心2 min，弃滤液。

10）向FastPure RNA Column Ⅳ中加入500 μl Buffer PRW2，12000 rpm离心30sec，弃滤液。

11）重复步骤10）

12）将FastPure RNA Column Ⅳ吸附柱放回收集管中，12000 rpm离心2 min

13）将FastPure RNA Column Ⅳ转移至新的RNase-free Collection Tubes 1.5ml离心管中，向吸附柱膜中心悬空滴加30 μl的RNase-free ddH₂O，室温放置2 min，12000rpm离心1 min。

14）将收集到的RNA以1 μg分装并于-80℃冰箱中保存。

通过HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit （Vazyme）试剂盒将RNA反转录为cDNA，具体操作步骤如下：

1）RNA模板变性：5 μg Total RNA中加入RNase-Free ddH₂O到8 μl，65℃孵育5min，冰上静置2 min。

2）基因组DNA的去除：上一步产物加入2 μl 5×gDNA wiper Mix，吹打混匀，42℃反应2 min。

3）第一链cDNA获取：上一步的产物加入2 μl 10×RT Mix，2 μl HiScript ⅢEnzyme Mix       ，1 μl Oligo (dT)₂₀VN和5 μl RNase-Free ddH₂O，吹打混匀。按照25℃，5 min；37℃，45 min；85℃，5 sec三步程序进行反应，得到cDNA。

分离 RrGTγ-4基因

1）PCR扩增 RrGTγ-4基因：在PCR管中加入25 μl PrimeSTAR Max Premix（2X），2 μl Primer F和Primer R，1 μl cDNA和20 μl RNase-Free ddH₂O，吹打混匀。按照95 ℃，3min；95 ℃，10 sec，55 ℃，5 sec（循环35次）；72 ℃，5 sec；72 ℃，3 min的程序进行扩增反应。

2）使用FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit试剂盒获得纯化的PCR产物。

通过pEASY-Blunt Cloning Kit（全式金）将 RrGTγ-4基因克隆到载体中，步骤如下：

1）连接载体：50 ng PCR 产物中加入1 μl  pEASY-Blunt Zero Cloning Vector，加入RNase-Free ddH₂O到5 μl，25 ℃孵育10 min得到连接产物。

2）大肠杆菌转化：将新鲜制备或-70 ℃冻存的Trans1-T1感受态细胞在冰上融化；取5 μl连接产物，加入到100 μl感受态细胞中，并轻轻混匀，冰浴30 min左右；42 ℃水浴中热击90 sec，迅速置于冰上3-5 min；加入800 μl LB液体培养基，37 ℃&100 rmp 摇菌1 h；4000 rmp离心3 min，吸掉上层800 μl培养基，混匀剩余菌液；将菌液涂抹于含有Kan的LB筛选固体培养基上，37 ℃倒置培养过夜。

3）阳性克隆筛选及测序分析：从筛选培养板上挑选单菌落接种于LB液体培养基中，37 ℃ & 250 rmp摇菌6 h；以培养6 h菌液为模板进行菌液PCR检测后，选择阳性菌液送上海生工生物公司进行测序验证为正确序列，成功分离得到 RrGTγ-4基因。

实施例2

通过荧光定量PCR技术探究 RrGTγ-4基因时空表达模式：

基于 RrGTγ-4基因的外显子区域设计荧光定量PCR上游引物5’-TGGTCAGCTATGCCCACCATGAAGCTG -3’ 和下游引物5’- AGCGCTGTCGTCAGCACCAAACC -3’，基于内参基因（ PHD）设计内参上游引物5’-GCCGACGCGCTGGTTTGATT-3’和下游引物5’-CCAGTCCTTCTCCGCCATCCC-3’。利用SYBR Premix Ex Taq（Takara）和荧光定量PCR仪CFX96TM（Bio-RAD）进行实时荧光定量PCR，使用Bio-Rad CFX Manager软件进行数据处理，采用2^-△△Ct法进行计算。每个生物学重复中又进行了三次技术重复，在三组平行数据中取平均值以减少误差。

如图1所示，在玫瑰根系中，盐处理0.5 h时 RrGTγ-4未响应胁迫，盐处理后2 h时 RrGTγ-4表达量达到了超高水平（约669倍）显著高于对照组（约19倍），盐处理4h和8h处理后表达水平逐渐下降到9.8倍接近对照组。表明在野生玫瑰根系中， RrGTγ-4在可以在短期内强烈响应盐胁迫（p<0.01）。

实施例3

RrGTγ-4过表达载体构建和拟南芥遗传转化

利用植物过表达载体pNC-Cam1304-MCS35S（图2）构建 RrGTγ-4超量表达载体，构建方法如下：

1）获取NC接头融合的 RrGTγ-4基因片段：设计带有NC接头 RrGTγ-4引物5’- AGTGGTCTCTGTCCAGTCCTTGCAGAGATTAGACTATGACA-3’和5’- GGTCTCAGCAGACCACAAGTATACATATTATCCGGTGAGGT-3’，以实施例1获得的 RrGTγ-4基因目的片段为模板进行PCR扩增，PCR扩增和产物回收过程同实施例1。

2）利用Nimble Cloning试剂盒（NC Biotech）获得重组载体：50ng的回收片段与1μl pNC-Cam1304-MCS35S载体，加入RNase-Free ddH₂O到5 μl，25 ℃孵育10 min得到重组产物，大肠杆菌转化与阳性克隆筛选方法同实施例1，阳性菌液送生工生物公司（南京）测序，获得重组过表达载体pNC-Cam1304-MCS35S： RrGTγ-4。

3）农杆菌转化：取-80℃保存的农杆菌EHA105感受态于室温融化，每100μl感受态加入0.01-1μg质粒DNA，用手拨打管底混匀，依次于冰上静置5分钟、液氮5分钟、37℃水浴5分钟、冰浴5分钟，加入700混匀无抗生素的YEB液体培养基，于28℃振荡培养2-3小时，6000rpm离心一分钟收菌，涂布于含卡纳抗性的YEB平板上，倒置于28℃培养箱培养2-3天，生长出阳性菌落。

实施例4

通过花序蘸染法侵染拟南芥，经过筛选具有潮霉素抗性的转化苗即得到转基因植株。主要步骤和应用试剂如下所述：

I. 试剂和溶液缩写

本发明中培养基所用到的植物激素的缩写表示如下：Kan（Kanamycin，卡那霉素）；Hyg（Hygromycin，潮霉素）；拟南芥转化辅助试剂（Silwet L-77）。

II. 农杆菌介导的遗传转化步骤

（1）农杆菌的培养

挑取阳性菌落接种于液体LB培养基（10 g/L蛋白胨+5 g/L酵母提取物+10 g/LNaCl +50 mg/L Kan）中，于28 ℃，200 rpm摇床培养过夜，至菌液浓度OD₆₀₀值为1.5-2.0。

（2）拟南芥花序蘸染法

将摇好的菌液4500 rpm离心10 min，并用5 ％的蔗糖溶液（附加20 μl /100 ml的表面活性剂Silwet L-7），将拟南芥花序在重悬液中浸泡30 sec左右，遮光保湿并横平放置12-24 h。

（3）阳性苗的筛选

将侵染后的拟南芥放入培养箱中正常培养，收获的种子在超净工作台通过70 ％酒精15 sec-30 sec和2％次氯酸钠 15 min进行消毒，无菌水洗3-4次后平铺于含抗性的1/2 MS培养基（1/2 MS +30 g/L蔗糖+7 g/L琼脂+20 mg/L Hyg）进行筛选；筛选的T1代植株进行PCR阳性检测并移栽至光照培养箱等待收种。重复操作直至获得T3代纯合植株。

实施例4

RrGTγ-4过表达拟南芥植株耐盐表型观测

将 RrGTγ-4过表达拟南芥和野生型拟南芥点播于含150mM浓度NaCl的1/2 MS培养基上，并生长两周。通过表型观测（图3）发现，过表达植株根系长度相比野生型明显伸长，且在不同转基因株系中该统计指标差异显著（p<0.1，图4）。叶片形态上无明显差异，但是叶片数量上，过表达植株相比野生型植株显著增高（p<0.01，图4）。以上证据说明超表达 RrGTγ- 4促进了拟南芥植株植株的耐盐性。

SEQ ID NO.1

ATGGAACCCAATGGTATAGGGGGAGGTTTGTTTCCAGAGATGAGGTCTGGAATGTTAGGCCTAGAAATGCCTCTGCACCAAACACAAAACCCCCCAAATCCTCAGAACCCACACCACCATATGCACCAACCCCAAATGGTCAGCTATGCCCACCAAGAAGCTGATCACAACCATCACCCACAAGCTCACCAATCTGCAAAACATGGGTACCCATATGCCACAAAGCCCAAACAGATCACCCTCAGTGATGAAGATGAACCTGGGTTTGGTGCTGATGACAGCGCTGGTGAAAACAAGAGGAAAATCTCACCATGGCAGAGAATGAAGTGGACTGACACCATGGTCAGGCTTCTAATCATGGCTGTGTTTTACATTGGGGATGAGGGTGGCTCTGAAGGCCCTGATCCCACAGGGAAGAAGAAGAGTGGTGGAGGATTGCTGCAGAAGAAAGGGAAGTGGAAATCGGTGTCGCGGGCTATGATGGAGAAGGGTTTCTATGTCTCTCCTCAGCAATGTGAGGACAAGTTCAATGATTTGAACAAGAGGTACAAGAGGGTGAATGACATACTTGGCAAGGGAACTGCTTGCAAGGTTGTGGAGAATCAAGGGTTATTGGAGAAAATGGAATTGTCGTCCAAGATGAAGGACGAAGTTAAAAAACTGCTGAATTCCAAGCACTTGTTCTTTAGGGAAATGTGTGCTTATCACAACAGTTGCGGCCATGGCACTGTTGGTGCTGCTGGAGCTAGCGGTGCGCATAACTCATCCCCGGAAGACCCTTCGGAGGTTCAATTGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCCCCAGCAGGAAAGGTGCTTTCATGTATCGGAAAATGCTCATGTCGTTGCCAATTCGGGCAGAACAGAGACGGAGGGATCCAAAATGTTCAAAGCAGAGAGTGGTGGCGAGGATGAAGATGAAGACTATGAGGATGATGGCTCCGAGGATGACGATGATGAGGAGGAAGAAGGGGTTGTTGAAGGCGGTTCGAGGGGTCAAATTGGGCATGGACATGAGGATGAGGATGAGAATGAGCATGAAAGAGCTAAGAGGCCAAGAAAGGGAAGCTGTTTTTCTGGGTCCTCACATAAAATGTTGATGCAGCAATTGGGCAGTGAAGTAAGTGGTGTGATCCAAGATGTGTCCAAGAGTCCATGGGAGAAGAAGCAGTGGATGAAAGCAAGGCTGATACAATTGGAGGAGCAACAAGTGAACTACCAATACCAATCTTTCGAGCTCGAAAAGCAGAGGCTCAAGTGGGTTAAGTATAGTAGCAAAAAGGAAAGGGATATGGAAACAGCTAAGCTTGAGAATGAGAGAAGAAGGCTTGAGAACGAGAGAATGCTATTGCTTGTTAGGCAGAAGGAGCTCGAATTGCTTGATCTGCATCACCACCAGCAGCAACAACATCAGCAACAAAATTCTTCAAACAAGAGAAGCGACCCTTCGTCCCTCACCGGATAA

SEQ ID NO.2

MEPNGIGGGLFPEMRSGMLGLEMPLHQTQNPPNPQNPHHHMHQPQMVSYAHQEADHNHHPQAHQSAKHGYPYATKPKQITLSDEDEPGFGADDSAGENKRKISPWQRMKWTDTMVRLLIMAVFYIGDEGGSEGPDPTGKKKSGGGLLQKKGKWKSVSRAMMEKGFYVSPQQCEDKFNDLNKRYKRVNDILGKGTACKVVENQGLLEKMELSSKMKDEVKKLLNSKHLFFREMCAYHNSCGHGTVGAAGASGAHNSSPEDPSEVQLQQQQQQPQQERCFHVSENAHVVANSGRTETEGSKMFKAESGGEDEDEDYEDDGSEDDDDEEEEGVVEGGSRGQIGHGHEDEDENEHERAKRPRKGSCFSGSSHKMLMQQLGSEVSGVIQDVSKSPWEKKQWMKARLIQLEEQQVNYQYQSFELEKQRLKWVKYSSKKERDMETAKLENERRRLENERMLLLVRQKELELLDLHHHQQQQHQQQNSSNKRSDPSSLTG

Claims (5)

1.一种玫瑰耐盐基因RrGTγ-4，其特征在于，玫瑰耐盐基因RrGTγ-4的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的一种玫瑰耐盐基因RrGTγ-4，其特征在于，玫瑰耐盐基因RrGT γ-4表达蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.含有权利要求1所述玫瑰耐盐基因RrGTγ-4植物过表达载体pNC-Cam1304-MCS35S：RrGTγ-4。

4.根据权利要求3所述的载体，其特征在于：所述载体组装有NC克隆框Nimble CloningFrame，可以一步法快速组装基因片段，获得35S启动子-RrGTγ-4-NOS终止子的超表达框，保证RrGTγ-4基因稳定持续在宿主细胞内大量表达。

5.权利要求1所述的玫瑰耐盐基因RrGTγ-4在培育耐盐玫瑰栽培新品种中的应用。

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