CN114774428B

CN114774428B - 一种调控小兰屿蝴蝶兰花器官发育的基因PeKAN2及其应用

Info

Publication number: CN114774428B
Application number: CN202210323508.XA
Authority: CN
Inventors: 明凤; 徐庆于; 夏萌; 张栖语; 何国仁
Original assignee: Shanghai Normal University
Current assignee: Shanghai Normal University
Priority date: 2022-03-30
Filing date: 2022-03-30
Publication date: 2023-09-29
Anticipated expiration: 2042-03-30
Also published as: CN114774428A

Abstract

本发明提供一种调控小兰屿蝴蝶兰花器官发育的基因PeKAN2及其应用。本发明第一方面提供一种调控小兰屿蝴蝶兰花器官发育的基因PeKAN2，具有以下核苷酸序列中的一种：1)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；2)SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列通过一个或几个核苷酸的取代、缺失、或添加衍生产生的核苷酸序列；3)与SEQ ID NO.1具有至少80％同源性的核苷酸序列。本发明通过基因工程的手段有效改变小兰屿蝴蝶兰花器官的发育，使三唇瓣小兰屿蝴蝶兰花器官中假唇瓣恢复成花瓣，增加蝴蝶兰花型种类和形态多样性，使其具有较高的观赏价值，为今后利用分子生物学技术定向改良花卉品种提供理论依据和新的思路。

Description

一种调控小兰屿蝴蝶兰花器官发育的基因PeKAN2及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种调控小兰屿蝴蝶兰花器官发育的基因PeKAN2及其应用。

背景技术

随着人们生活水平的提高，花卉植物越来越受到人们的喜爱，人们对于不同性状的花卉要求变得更高。为了提供更具有观赏价值和收藏价值的奇特花卉和名贵花卉，人们越来越注重花卉发育机制的研究。目前兰科植物有超过20000多种，是植物界包含种类最多的科之一。兰花花型包括外轮的三片花萼，内轮的两片花瓣以及由花瓣特化成各种形式的唇瓣，此外兰花具有雄蕊和雌蕊融合而成的合蕊柱，这种高度分化的花结构为研究兰花器官提供了良好的条件，研究观赏花卉发育机制对兰花发育模型的挖掘具有广泛的应用前景。

发明内容

本发明提供一种调控小兰屿蝴蝶兰花器官发育的基因PeKAN2，用于调控小兰屿蝴蝶兰花器官的发育，使三唇瓣小兰屿蝴蝶兰花器官中假唇瓣恢复成花瓣，使其具有独特的观赏和应用价值。

本发明第一方面提供一种调控小兰屿蝴蝶兰花器官发育的基因PeKAN2，所述基因具有以下核苷酸序列中的一种：

1)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

2)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列通过一个或几个核苷酸的取代、缺失、或添加衍生产生的核苷酸序列；

3)与SEQ ID NO.1具有至少80％同源性的核苷酸序列。

本发明第二方面提供一种调控小兰屿蝴蝶兰花器官发育的蛋白，所述蛋白由本发明第一方面提供的基因编码得到。

本发明第三方面提供一种重组载体，所述重组载体包含本发明第一方面所述的核苷酸序列。

如上述重组载体，所述重组载体为CymMV病毒。

本发明第四方面提供一种重组转化体，所述重组转化体包含本发明第三方面所述的重组载体。

如上述重组转化体，所述重组转化体为农杆菌。

本发明第五发明提供本发明第一方面所述的基因在调控小兰屿蝴蝶兰花器官发育中的应用。

本发明第六发明提供一种调控小兰屿蝴蝶兰花器官发育的方法，对所述小兰屿蝴蝶兰沉默如本发明第一方面所述的核苷酸序列。

如上述方法，将所述核苷酸序列连接到CymMV病毒质粒上面得到重组载体，然后将所述重组载体转入农杆菌，得到重组转化体，使用所述重组转化体侵染小兰屿蝴蝶兰。

如上述方法，将所述重组转化体在含有100μM的乙酰丁香酮和50μg/ml卡那霉素的LB培养基中培养；

培养结束后在含有100μM乙酰丁香酮和50μg/ml卡那霉素的LB培养基中继代培养，直到OD600达到0.8-1.0；离心去除上清液，使细胞沉淀重悬得到转化液，将所述转化液注射到无病毒的小兰屿蝴蝶兰叶片与花序中。

本发明通过基因工程的手段有效改变了小兰屿蝴蝶兰花器官的发育，使三唇瓣小兰屿蝴蝶兰花器官中假唇瓣恢复成花瓣，增加蝴蝶兰花型种类和形态多样性，使其具有较高的观赏价值，为今后利用分子生物学技术定向改良花卉品种提供理论依据和新的思路。

附图说明

图1为现有技术中三唇瓣小兰屿蝴蝶兰的表型；

图2为本发明实施例提供的PeKAN2的保守结构域预测图；

图3为本发明实施例提供的PeKAN2系统进化发育分析图；

图4为本发明实施例提供的PeKAN2转录自激活功能的验证；

图5为本发明实施例提供的PeKAN2在本氏烟草中的亚细胞定位；

图6为本发明实施例提供的PeKAN2在小兰屿花芽不同发育时期的表达量；

图7为本发明实施例提供的PeKAN2在小兰屿蝴蝶兰不同组织中的表达量；

图8为本发明实施例提供的小兰屿蝴蝶兰在注射CymMV-PeKAN2，30天后的对照和沉默突变株系表型；

图9为本发明实施例提供的小兰屿蝴蝶兰在注射CymMV-PeKAN2，30天后的对照和沉默突变株系不同部位中PeKAN2的表达量以及影响花器官发育的MADS-box基因的表达量。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。所采用的试剂、载体，若无特殊说明，均为市售或公开渠道可以获得的。

实施例1 PeKAN2基因的克隆

提取如图1所示的野生型三唇瓣小兰屿蝴蝶兰花瓣总RNA，提取试剂盒为RNAplant(市售)，利用反转录试剂盒(市售)将总RNA反转录成cDNA。根据转录组测序结果设计引物，采用RT-PCR方法从小兰屿蝴蝶兰cDNA中扩增出一条942bp的条带，PCR产物回收，获取核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的基因，命名为PeKAN2；该核苷酸序列编码的氨基酸序列如SEQID NO.2所示，由314个氨基酸残基组成，分子量为34.71kDa千道尔顿。

实施例2 PeKAN2的生物信息学分析

1、将PeKAN2编码的氨基酸序列放入NCBI数据库，检索同源蛋白。

2、运用Pfam(http://pfam.xfam.org/)软件在线分析PeKAN2编码蛋白与同源氨基酸序列之间的保守结构域，分析结果如图2所示，PeKAN2具有典型的N末端的DNA结合结构区域，中间MYB区域，C末端的激活结构域。

3、选取其他物种中的KAN基因家族氨基酸序列，运用MEGA5，分析PeKAN2系统发育关系，分析结果如图3所示，PeKAN2与同物种中深圳拟兰CeKAN2聚类在一起，亲缘关系较近。

实施例3 PeKAN2转录自激活功能的验证

1、将PeKAN2基因的314个氨基酸序列利用在线软件Pfam(http://pfam.xfam.org/)预测蛋白结构域；

2、将PeKAN2基因蛋白结构域可操作地分成三个部分N-domin和MYB-domin以及C-domin；

3、将PeKAN2基因划分后的核苷酸序列连接于pGBKT7酵母表达载体上，形成含有该基因片段的pGBKT7-PeKAN2载体；

4、将步骤3中的pGBKT7-PeKAN2载体、阴性对照组pGBKT7空载以及阳性对照组Positive载体分别转入酵母菌感受态Y2H；

5、将步骤4中的三种酵母菌株在Trp选择缺陷型固体培养基上培养；

6、将步骤5中长出的三种酵母菌株在新的Trp选择缺陷型固体培养基划线活化，随后在Trp选择缺陷型液体培养基中进行摇菌；

7、将步骤6培养的酵母菌液分别在两种Trp选择缺陷型固体培养基和Trp/His/Ade选择缺陷型固体培养基上分别培养，观察其生长状态。

如图4所示，阴性对照组pGBKT7空载在Trp/His/Ade选择缺陷型固体培养基未长，阳性对照Positive载体有生长，N末端的pGBKT7-PeKAN2载体；带有MYB结构域的pGBKT7-PeKAN2载体未有生长，N末端结构域的pGBKT7-PeKAN2载体有生长，全长pGBKT7-PeKAN2载体也有生长，说明PeKAN2是一个在N末端结构域作为激活结构域的转录激活因子。

实施例4 PeKAN2在本氏烟草中的亚细胞定位

1、将PeKAN2基因的开放阅读框942bp可操作地连接于pEG104-GFP表达载体，形成含有该基因片段的pEG104-GFP-PeKAN2载体；

2、将该载体转入农杆菌GV3101；

3、取步骤2中农杆菌GV3101，在5ml含有100μM的乙酰丁香酮、50μg/ml卡那霉素以及10μg/ml利福平的LB培养基中，在28℃、200rpm条件下培养过夜；

4、将取步骤3中农杆菌菌液在4℃、3700rpm下离心10分钟，弃上清，对沉淀使用0.5M的MgCl₂反复吹打重悬三次，得到农杆重悬菌菌液；

5、测量农杆重悬菌菌液OD值，并用0.5M的MgCl₂稀释使其OD值在0.6左右；

6、在步骤5得到的菌液中，加入总体积1.5倍的100μM AS(乙酰丁香酮)、总体积20倍的MES(吗啉乙磺酸)，使细胞沉淀重悬，在室温下静置3-4h；

7、使用1ml带有针头的注射器吸取步骤6的农杆菌转化液，注射至生长四周龄的本氏烟草叶片中，培养2-3天并观察pEG104-PeKAN2在细胞水平的位置。

观察如图5所示，在本氏烟草叶片细胞的显微结构中能清楚观察到荧光，根据荧光的位置来表明PeKAN2基因定位在细胞核结构。

实施例5不同发育时期的小兰屿蝴蝶兰的表达谱验证

1、提取图6中a所示不同发育时期的小兰屿蝴蝶兰的RNA，分别命名为B1-B5，提取试剂盒为RNAplant(市售)，利用反转录试剂盒(市售)将总RNA反转录成cDNA；

2、以不同发育时期的小兰屿蝴蝶兰反转录得到的cDNA为模板，根据转录组测序结果设计引物，对PeKAN2进行不同发育时期的表达谱验证。

验证结果如图6中b所示，PeKAN2的表达在B4时期受到了显著诱导，说明PeKAN2基因高表达可能参与了小兰屿蝴蝶兰的花器官发育的形成。

实施例6 PeKAN2在小兰屿蝴蝶兰不同花器官组织中表达谱验证

提取如图7中a所示，不同花器官组织部位的小兰屿蝴蝶兰的RNA，提取部位分别为萼片、花瓣、唇瓣、合蕊柱，提取试剂盒为RNAplant(市售)，利用反转录试剂盒(市售)将总RNA反转录成cDNA；

2、以不同花器官组织部位的小兰屿蝴蝶兰反转录得到的cDNA为模板，根据转录组测序结果设计引物，对PeKAN2进行不同组织部位的表达谱验证。

验证结果如图7中b所示，在不同花器官组织部位中，PeKAN2的表达量不同，其中，在唇瓣、合蕊柱中表达量较高，萼片、花瓣中表达量较低，说明PeKAN2通过参与小兰屿蝴蝶兰唇瓣形成来影响花器官发育的建成。

实施例7 CymMV病毒诱导小兰屿蝴蝶兰PeKAN2基因沉默

1、将PeKAN2基因的开放阅读框265bp可操作地连接于CymMV病毒载体，形成含有该基因片段的CymMV-PeKAN2载体；

2、将该载体转入农杆菌GV3101；

3、取步骤2中农杆菌GV3101，在5ml含有100μM的乙酰丁香酮和50μg/ml卡那霉素的LB培养基中，在28℃、200rpm培养16h；

4、将取步骤3中农杆菌在含有100μM乙酰丁香酮和50μg/ml卡那霉素的50ml LB培养基中继代培养，并在28℃、200rpm下孵育13-16h，直到OD600达到0.8-1.0；

5、取步骤4中农杆菌菌液，转移至50ml离心瓶中，并在4℃、3000rpm下离心10分钟；

6、离心后，除去上清液，加入300μl含100μM乙酰丁香酮的MS培养基，使细胞沉淀重悬，在室温下静置0.5h；

7、使用带有针头的1ml注射器吸取步骤6的农杆菌转化液，注射到无病毒的小兰屿蝴蝶兰叶片与花序中，培养30-40天观察小兰屿蝴蝶兰花瓣表型。

如图8所示，与对照组相比，小兰屿蝴蝶兰沉默突变株系的花器官的假唇瓣恢复成花瓣(如图箭头所指位置)。

实施例8 CymMV病毒诱导小兰屿蝴蝶兰突变株系中，PeKAN2基因表达量验证以及在影响小兰屿蝴蝶兰花器官发育发育基因MADS-box家族基因表达量验证。

1、选取如图8所示的对照和沉默突变株系的花瓣，提取其总RNA，提取试剂盒为RNAplant(市售)，利用反转录试剂盒(市售)将总RNA反转录成cDNA；

2、对照和沉默突变株系花瓣的反转录得到cDNA为模板，对PeKAN2基因进行基因沉默效率验证。

验证结果如图9所示，在小兰屿蝴蝶兰突变株系中，PeKAN2的表达显著降低，此外，本领域技术人员知晓，PeMADS3/PeMADS4/PeMADS9在调控唇瓣发育的过程中起到正调控作用，在沉默后的突变株系我们通过RT-qPCR对PeMADS3/PeMADS4/PeMADS9表达量验证，表明PeKAN2作为影响小兰屿蝴蝶兰花器官唇瓣发育的正调控基因，花瓣突变的表型是由于PeKAN2下调所致。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

序列表

<110> 上海师范大学

<120> 一种调控小兰屿蝴蝶兰花器官发育的基因PeKAN2及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 942

<212> DNA

<213> Phalaenopsis equestris

<400> 1

atggagttgt tttccgctca accagacctt tcactgcaga taagccctcc aaacagcagc 60

aaaccgagca caagatgcaa cagcagctca gcagaagaca caattgactt tggattttgg 120

aggagacccg ctgtcgccac acctattctg ccggtaaaat ccccctccgg tgcgggaacc 180

attagcttcg tcgacctttc actcacaagt ccctctccct caaccaccac tacctcacgc 240

catcctttac tcaatgaatc ccatcaccaa gatctcacct ttctacgccc cattcgtggt 300

ataccagtct accatacctc tccttccttc ccttttcctc ttcctcacca tctccacctc 360

ttcgactcct cacgctcgcc ttcaaggttt cttccccggt ttccagcaaa gaggagcatg 420

agaggaccca ggatgcggtg gacttccact ctccatgctc gcttcgttca tgccgttgag 480

ctcctcggtg gccatgaaag ggcgactcca aaatcggttc ttgagcttat ggatgtgaaa 540

gatctcacct tggctcatgt gaaatcgcac ttgcagatgt atcgaactgt caagaccact 600

gataaggcag caacttcatc aggacaaagt gagcccattg agatctccga cgacaacttg 660

tttgatacta acaattccca gggatcagat cactcttcag ttcagaactt ttggtcagca 720

gatcaaaatt gcacgaattc ttatggatta tggagcagtt ccccaagtaa gggaggctat 780

taccaggaca agccaaagga atcagccatt ggaaccatgt cttgctttga gaacaaaata 840

catgcaagaa gcttgaatat gatatcagat ctcaactcgt cttatctctc agagaatagc 900

tcaaagaagc tcaatcttga cttcactttg ggaaggtcat ag 942

<210> 2

<211> 313

<212> PRT

<213> Phalaenopsis equestris

<400> 2

Met Glu Leu Phe Ser Ala Gln Pro Asp Leu Ser Leu Gln Ile Ser Pro

1 5 10 15

Pro Asn Ser Ser Lys Pro Ser Thr Arg Cys Asn Ser Ser Ser Ala Glu

20 25 30

Asp Thr Ile Asp Phe Gly Phe Trp Arg Arg Pro Ala Val Ala Thr Pro

35 40 45

Ile Leu Pro Val Lys Ser Pro Ser Gly Ala Gly Thr Ile Ser Phe Val

50 55 60

Asp Leu Ser Leu Thr Ser Pro Ser Pro Ser Thr Thr Thr Thr Ser Arg

65 70 75 80

His Pro Leu Leu Asn Glu Ser His His Gln Asp Leu Thr Phe Leu Arg

85 90 95

Pro Ile Arg Gly Ile Pro Val Tyr His Thr Ser Pro Ser Phe Pro Phe

100 105 110

Pro Leu Pro His His Leu His Leu Phe Asp Ser Ser Arg Ser Pro Ser

115 120 125

Arg Phe Leu Pro Arg Phe Pro Ala Lys Arg Ser Met Arg Gly Pro Arg

130 135 140

Met Arg Trp Thr Ser Thr Leu His Ala Arg Phe Val His Ala Val Glu

145 150 155 160

Leu Leu Gly Gly His Glu Arg Ala Thr Pro Lys Ser Val Leu Glu Leu

165 170 175

Met Asp Val Lys Asp Leu Thr Leu Ala His Val Lys Ser His Leu Gln

180 185 190

Met Tyr Arg Thr Val Lys Thr Thr Asp Lys Ala Ala Thr Ser Ser Gly

195 200 205

Gln Ser Glu Pro Ile Glu Ile Ser Asp Asp Asn Leu Phe Asp Thr Asn

210 215 220

Asn Ser Gln Gly Ser Asp His Ser Ser Val Gln Asn Phe Trp Ser Ala

225 230 235 240

Asp Gln Asn Cys Thr Asn Ser Tyr Gly Leu Trp Ser Ser Ser Pro Ser

245 250 255

Lys Gly Gly Tyr Tyr Gln Asp Lys Pro Lys Glu Ser Ala Ile Gly Thr

260 265 270

Met Ser Cys Phe Glu Asn Lys Ile His Ala Arg Ser Leu Asn Met Ile

275 280 285

Ser Asp Leu Asn Ser Ser Tyr Leu Ser Glu Asn Ser Ser Lys Lys Leu

290 295 300

Asn Leu Asp Phe Thr Leu Gly Arg Ser

305 310

Claims

1.一种调控小兰屿蝴蝶兰花器官发育的方法，其特征在于，对所述小兰屿蝴蝶兰沉默基因PeKAN2，所述基因PeKAN2的核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示，所述花器官发育为小兰屿蝴蝶兰沉默突变株系的花器官中假唇瓣恢复成花瓣。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将权利要求1所述的核苷酸序列连接到CymMV病毒质粒上面得到重组载体，然后将所述重组载体转入农杆菌，得到重组转化体，使用所述重组转化体侵染小兰屿蝴蝶兰。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，将所述重组转化体在含有100μM的乙酰丁香酮和50μg/ml卡那霉素的LB培养基中培养；