CN112522281B

CN112522281B - 一种用于调控小兰屿蝴蝶兰花瓣发育的基因PeGRAS序列及其应用

Info

Publication number: CN112522281B
Application number: CN202011417059.2A
Authority: CN
Inventors: 明凤; 王锐; 毛婵娟; 徐庆于; 李威
Original assignee: Shanghai Normal University
Current assignee: Shanghai Normal University
Priority date: 2020-12-07
Filing date: 2020-12-07
Publication date: 2022-11-11
Anticipated expiration: 2040-12-07
Also published as: CN112522281A

Abstract

本发明公开了一种用于调控小兰屿蝴蝶兰花瓣发育的核苷酸序列及其应用，所述核苷酸序列选自如下序列中的一种或多种：1)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；2)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列通过一个或几个核苷酸的取代、缺失、或添加衍生产生的核苷酸序列；3)与SEQ ID NO.1具有至少80％同源性的核苷酸序列；所述核苷酸序列在调控小兰屿蝴蝶兰的花瓣发育中具有重要的作用，在小兰屿蝴蝶兰VIGS株系中，小兰屿蝴蝶兰花瓣部分变为唇瓣，为小兰屿蝴蝶兰育种提供了重要的基础。

Description

一种用于调控小兰屿蝴蝶兰花瓣发育的基因PeGRAS序列及其应用

技术领域

本发明涉及一种基因序列及其应用，具体涉及一种用于调控小兰屿蝴蝶兰花瓣发育的基因序列及其应用。

背景技术

在兰花中主要是MADS-Box转录因子家族调控小兰屿蝴蝶兰花的发育，PeMADS2主要在萼片、花瓣和蕊柱中表达，PeMADS3在花瓣、唇瓣和蕊柱中表达，PeMADS4仅在唇瓣合蕊柱中表达，PeMADS5在花瓣中显著表达，在萼片、唇瓣、蕊柱中少量表达(TSAI W C et al，Plant cell physiol，2004)；AP3A2(包含PeMADS4)在唇瓣的形成中具有重要的作用(PanZhao-Jun et al，Pubmed,2011)；PhAGL6a、PhAGL6b、PhMADS4表达对萼片花瓣唇瓣的影响(Huang Jian-Zhi，PloS one,2015)；PeMADS6、PeMADS3、PeMADS9三者表达倾向于形成唇瓣，PeMADS6、PeMADS2、PeMADS10倾向于形成花瓣(Hsing-Fun Hsu et al，Nature Plants，2015)。

小兰屿蝴蝶兰在自然界中存在花瓣唇瓣化的三唇瓣的自然变异体，及正常单唇瓣的原生种。为了更好阐释自然变异体形成的分子机理，利用RNA-seq与ATAC-seq相结合的方法，对测序数据进一步分析，挖掘小兰屿蝴蝶兰三唇瓣的自然变异体与单唇瓣的原生种之间差异表达的转录因子。在RNA-seq的数据分析中，利用差异分析软件edgeR进行分析，发现SP(单唇瓣原生种的花瓣)和TPL(三唇瓣变异体的花瓣)差异表达的基因有288个，SP和SL(单唇瓣原生种的唇瓣)中差异表达的基因有1028个，SL和TPL差异表达的基因有670个，通过预测获得1255个转录因子。将转录因子与差异表达基因进行Venn分析，得到SP和SL差异表达的转录因子有79个；SP和TPL差异表达的转录因子有14个；SL和TPL差异表达的转录因子有50个。在ATAC-seq数据分析中，使用iTAK软件，对差异peak关联的基因进行转录因子的鉴定与分类，得到SP和SL差异表达的转录因子有11个，TPL和SL差异表达的转录因子有3个。通过进一步分析确定得到PeGRAS可能参与小兰屿蝴蝶兰花瓣的发育。并且通过分子和生化手段确定PeGRAS调控唇瓣发育的机理，为进一步完善了小兰屿蝴蝶兰唇瓣发育的调控机制提供理论基础。

随着生活水平的提高，园林观赏植物越来越受到人们关注，研究观赏植物形态形成机制有广泛的应用前景。因此，本领域技术人员致力于寻找改变植物花瓣形态的基因及其应用。

发明内容

本发明的目的在于解决上述现有技术的不足，提供了一种用于调控小兰屿蝴蝶兰花瓣发育的基因序列及其应用，所述基因序列可以影响小兰屿蝴蝶兰花瓣发育，从而获得具有独特观赏价值的蝴蝶兰花。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种用于调控小兰屿蝴蝶兰花瓣发育的基因序列，包括以下核苷酸序列中的一种或多种：

1)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

2)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列通过一个或几个核苷酸的取代、缺失、或添加衍生产生的核苷酸序列；

3)与SEQ ID NO.1具有至少80％同源性的核苷酸序列。

本发明还提供了一种氨基酸序列，其能影响小兰屿蝴蝶兰花瓣发育的基因，包括以下氨基酸序列中的一种或多种：

1)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；

2)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列通过一个或几个氨基酸的取代、缺失、或添加衍生产生的氨基酸序列；

3)与SEQ ID NO.2具有至少80％同源性的氨基酸序列。

本发明还提供了如上所述的核苷酸序列或如上所述的氨基酸序列在影响小兰屿蝴蝶兰花瓣发育中的应用。

进一步地，小兰屿蝴蝶兰主要为野生型蝴蝶兰和自然突变体三唇瓣小兰屿蝴蝶兰。

本发明还提供了一种影响小兰屿蝴蝶兰花瓣发育方法，包括向目标植物中沉默如上所述的核苷酸序列。

进一步地，将如上所述的核苷酸序列通过BP反应连接到CymMV病毒载体上，然后将重组植物表达载体转入目标植物中，通过培养获得PeGRAS瞬时沉默的突变体。

本发明提供的从蝴蝶兰中克隆的转录因子PeGRAS，连接到CymMV病毒载体后，通过注射小兰屿蝴蝶兰的叶片，并通过30-40d的培养获得突变体，表明该转录因子可以影响小兰屿蝴蝶兰花瓣发育。

本发明的优点是：本发明PeGRAS在调控小兰屿蝴蝶兰的花瓣发育中具有重要的作用，在小兰屿蝴蝶兰VIGS株系中，小兰屿蝴蝶兰花瓣部分变为唇瓣，这也为小兰屿蝴蝶兰育种提供了重要的基础。

附图说明

图1是小兰屿蝴蝶兰PeGRAS的系统进化树分析。

图2是小兰屿蝴蝶兰PeGRAS的氨基酸序列比对图。

图3是小兰屿蝴蝶兰不同发育时期的花苞图片。

图4是PeGRAS在小兰屿不同发育时期的表达量。

图5是小兰屿蝴蝶兰注射CymMV-PeGRAS农杆菌的图片

图6是小兰屿蝴蝶兰在注射CymMV-PeGRAS，30d后的野生型和突变体表型。

图7是小兰屿蝴蝶兰在注射CymMV-PeGRAS，30d后的野生型和突变体花瓣的表型。

图8是小兰屿蝴蝶兰PeGRAS在注射CymMV-PeGRAS，30d后的野生型和突变体花瓣中的表达量。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明作进一步地说明，应理解这些实施例仅作为例证的目的，不用于限制本发明的保护范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。所采用的试剂，若无特殊说明，均为市售或公开渠道可以获得的试剂。

在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒等。

蝴蝶兰有单唇瓣的野生型和三唇瓣的自然突变体两种类型，通过研究发现小兰屿蝴蝶兰中PeGRAS影响小兰屿蝴蝶兰花瓣的发育，负调控小兰屿蝴蝶兰唇瓣的形成，在小兰屿蝴蝶兰PeGRAS的VIGS的植株中花瓣一半变为唇瓣的结构，而PeGRAS的表达量在突变体中也较野生型的表达量显著降低。

实施例1蝴蝶兰PeGRAS基因的克隆

提取野生型蝴蝶花瓣兰总RNA，提取试剂盒为RNAplant(市售)，利用反转录试剂盒(市售)将总RNA反转录成cDNA。根据转录组测序结果设计引物，引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，采用RT-PCR方法从蝴蝶兰cDNA中扩增出一条1365bp的条带。PCR产物回收，获取PeGRAS基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该核苷酸序列编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，由454个氨基酸残基组成，分子量为49.19千道尔顿。

实施例2蝴蝶兰PeGRAS基因特性分析

(1)通过https://www.ncbi.nlm.nih.gov/网站对PeGRAS氨基酸序列进行同源比对，找到其同源性较高的14条序列。

(2)利用Molecular Evolutionary Genetics Analysis软件进行分析作图，如图一所示，小兰屿蝴蝶兰主要与单子叶植物聚类，与铁皮石斛、建兰、深圳拟兰同源性较高。

(3)利用http://www.bio-soft.net/sms/网站对PeGRAS的氨基酸序列进行比对，如图2所示。其中PeGRAS主要含有LHR、VHIID、LHR、PFYRE、SAW结构，图中红色箭头所指为相对保守的氨基酸序列。

实施例3不同发育时期小兰屿蝴蝶兰表达谱验证

(1)提取如图3所示，不同发育时期的小兰屿蝴蝶兰的RNA，提取试剂盒为RNAplant(市售)，利用反转录试剂盒(市售)将总RNA反转录成cDNA。

(2)根据转录组测序数据设计引物，引物序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

(3)以花芽不同发育时期的小兰屿蝴蝶兰反转录得到的cDNA为模板，对PeGRAS进行不同发育时期的表达谱验证如图4所示，PeGRAS的表达在不同发育时期受到了显著诱导。说明PeGRAS可能参与了小兰屿蝴蝶兰花芽分化。

实施例4CymMV病毒诱导小兰屿蝴蝶兰PeGRAS沉默

将PeGRAS基因的开放阅读框200-300bp可操作地连接于CymMV病毒载体，形成含有该基因片段的CymMV-PeGRAS载体，将该载体转入农杆菌GV3101，如图5所示，通过农杆菌介导的方法，进行注射小兰屿蝴蝶兰的叶片，通过30-40天培养，观察小兰屿蝴蝶兰的表型，如图6和图7所示，小兰屿蝴蝶兰的花瓣发生明显的结构变化，其花瓣的一半变为唇瓣结构。

(1)将PeGRAS基因的开放阅读框200-300bp可操作地连接于CymMV病毒载体，形成含有该基因片段的CymMV-PeGRAS载体。

(2)将步骤(1)中的载体转入农杆菌(GV3101)。

(3)取步骤(2)中农杆菌(GV3101)，接种到5ml含有100μM的乙酰丁香酮和50μg/ml卡那霉素的LB培养基中，在28℃，200rpm培养16h。

(4)将取步骤(3)中农杆菌在含有100μM乙酰丁香酮和50μg/ml卡那霉素的50ml LB培养基中继代培养，并在28℃200rpm下孵育13-16h，培养菌液到OD600达到0.8-1.0。

(5)取步骤(4)中农杆菌菌液，转移至50ml离心瓶中，并在4℃，3000g下离心10分钟。

(6)离心后，除去上清液。加入300μl含100μM乙酰丁香酮的MS培养基，使细胞沉淀重悬。在室温下静置0.5h。

(7)使用带有针头的1ml注射器吸取步骤(6)的农杆菌转化液，注射无病毒小兰屿蝴蝶兰。

(8)注射后培养30-40天观察小兰屿蝴蝶兰花瓣，如图6和图7所示，小兰屿蝴蝶兰的花瓣发生明显的结构变化，其花瓣的一半变为唇瓣结构。

实施例5CymMV病毒诱导小兰屿蝴蝶兰PeGRAS沉默效率验证

(1)选取如图7所示的野生型和突变型花瓣，提取其总RNA，提取试剂盒为RNAplant(市售)，利用反转录试剂盒(市售)将总RNA反转录成cDNA。

(3)野生型花瓣和突变体花瓣的反转录得到的cDNA为模板，进行PeGRAS基因沉默效率验证，如图8所示，PeGRAS的表达在突变的花瓣中显著降低，证明突变体中PeGRAS沉默效率较高。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海师范大学

<120> 一种用于调控小兰屿蝴蝶兰花瓣发育的基因PeGRAS序列及其应用

<130> 0

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1365

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 蝴蝶兰PeGRAS基因

<400> 1

atgctccaaa gcctcctccc tccatccccc atcaatccca ccacgaccac ctcctcctcc 60

gaagccgctc cggcgacttc caagcgctcc tcctccccat cctcctcctc cgacccccgc 120

cccctcaaac accccaacct cgacatctcc accgacccgc ccgccgccga ctctccggag 180

atcgaatccc gcggcctccg tctcctcagc ctcctcctcc aatgcgccga atcagtcgcc 240

gtcgacaatc tctccggcgc cctcaccttc cttcccgaaa tcacttctct atcgtctccc 300

ttcggctcct cccccgaacg cgtcgccgct tacttctccg atgccctccg ggcccgcatc 360

ctctcctcat acctctcctc atactcccct ctccctctca aaaccctaac cctaactcac 420

cgcatccccc gttccttcca cctcctcaac tccctcaccc ctctcatcaa attctcacac 480

ttcacctcca accaggccat cttccaatcc atccacttct tctcccgtct ccacatcgtc 540

gatttcgaca tcatgcaggg ccttcagtgg ccgggtctct tccacatcct cgcatctcgt 600

ccccgcccca ttgaatcaat tcgaatcacc ggaattggcc ctgattccga tctcctcgaa 660

gccaccggcc ggcgattagc cgatttcgcc gcttccctca acctcccctt tcaattcacc 720

ccgctcgaag gcaagatagc cgacctcgca accgatttta ctcctttctg ccaccgtaac 780

cccgcagaag ctactgtcgt tcactggacc caacattgcc tctacgatgt cactggatca 840

gatatcgccg ccgcacaatt cttatcctcc ctccgccccc gtctcctcac cgtcgtcgaa 900

caggatctcg gccatggcag cggcggagga ttcctcggca ggtttgtcga agccctgcat 960

tactattctg ctctgtttga tgcgattggg gatggagggg gtggtgggga agagagatgg 1020

gaagtggaga gaggggtttt gggtggggag ataaaaaata ttgtggcggt tggagggccg 1080

aagaggactg gggaggtgaa ggtagaaagg tggggggatg agctccggcg agtaggcttc 1140

cgtccagttt ctctcgccgg aagtccggct gctcaggcga gcttgctttt gggaatggtg 1200

ccgtggaagg ggtacacgtt ggcggaggaa ggagggagat tgaaattggg atggaaggat 1260

ttatcgcttc ttaccgcttc ggcgtggcgg ccggcgaaca ttgccggaaa agaagaagat 1320

ggaggggagg aggaatggga caggagtgaa gggatctctt tttga 1365

<210> 2

<211> 454

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 蝴蝶兰

<400> 2

Met Leu Gln Ser Leu Leu Pro Pro Ser Pro Ile Asn Pro Thr Thr Thr

1 5 10 15

Thr Ser Ser Ser Glu Ala Ala Pro Ala Thr Ser Lys Arg Ser Ser Ser

20 25 30

Pro Ser Ser Ser Ser Asp Pro Arg Pro Leu Lys His Pro Asn Leu Asp

35 40 45

Ile Ser Thr Asp Pro Pro Ala Ala Asp Ser Pro Glu Ile Glu Ser Arg

50 55 60

Gly Leu Arg Leu Leu Ser Leu Leu Leu Gln Cys Ala Glu Ser Val Ala

65 70 75 80

Val Asp Asn Leu Ser Gly Ala Leu Thr Phe Leu Pro Glu Ile Thr Ser

85 90 95

Leu Ser Ser Pro Phe Gly Ser Ser Pro Glu Arg Val Ala Ala Tyr Phe

100 105 110

Ser Asp Ala Leu Arg Ala Arg Ile Leu Ser Ser Tyr Leu Ser Ser Tyr

115 120 125

Ser Pro Leu Pro Leu Lys Thr Leu Thr Leu Thr His Arg Ile Pro Arg

130 135 140

Ser Phe His Leu Leu Asn Ser Leu Thr Pro Leu Ile Lys Phe Ser His

145 150 155 160

Phe Thr Ser Asn Gln Ala Ile Phe Gln Ser Ile His Phe Phe Ser Arg

165 170 175

Leu His Ile Val Asp Phe Asp Ile Met Gln Gly Leu Gln Trp Pro Gly

180 185 190

Leu Phe His Ile Leu Ala Ser Arg Pro Arg Pro Ile Glu Ser Ile Arg

195 200 205

Ile Thr Gly Ile Gly Pro Asp Ser Asp Leu Leu Glu Ala Thr Gly Arg

210 215 220

Arg Leu Ala Asp Phe Ala Ala Ser Leu Asn Leu Pro Phe Gln Phe Thr

225 230 235 240

Pro Leu Glu Gly Lys Ile Ala Asp Leu Ala Thr Asp Phe Thr Pro Phe

245 250 255

Cys His Arg Asn Pro Ala Glu Ala Thr Val Val His Trp Thr Gln His

260 265 270

Cys Leu Tyr Asp Val Thr Gly Ser Asp Ile Ala Ala Ala Gln Phe Leu

275 280 285

Ser Ser Leu Arg Pro Arg Leu Leu Thr Val Val Glu Gln Asp Leu Gly

290 295 300

His Gly Ser Gly Gly Gly Phe Leu Gly Arg Phe Val Glu Ala Leu His

305 310 315 320

Tyr Tyr Ser Ala Leu Phe Asp Ala Ile Gly Asp Gly Gly Gly Gly Gly

325 330 335

Glu Glu Arg Trp Glu Val Glu Arg Gly Val Leu Gly Gly Glu Ile Lys

340 345 350

Asn Ile Val Ala Val Gly Gly Pro Lys Arg Thr Gly Glu Val Lys Val

355 360 365

Glu Arg Trp Gly Asp Glu Leu Arg Arg Val Gly Phe Arg Pro Val Ser

370 375 380

Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ala Gln Ala Ser Leu Leu Leu Gly Met Val

385 390 395 400

Pro Trp Lys Gly Tyr Thr Leu Ala Glu Glu Gly Gly Arg Leu Lys Leu

405 410 415

Gly Trp Lys Asp Leu Ser Leu Leu Thr Ala Ser Ala Trp Arg Pro Ala

420 425 430

Asn Ile Ala Gly Lys Glu Glu Asp Gly Gly Glu Glu Glu Trp Asp Arg

435 440 445

Ser Glu Gly Ile Ser Phe

450

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 3

atgctccaaa gcctcctccc tcca 24

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 4

tcaaaaagag atcccttcac tcct 24

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 5

atcagtcgcc gtcgacaatc 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 6

aagtaagcgg cgacgcgttc 20

Claims

1.一种调控小兰屿蝴蝶兰花瓣发育的方法，其特征在于，对目标植物中沉默PeGRAS基因，所述PeGRAS基因的序列如SEQ ID NO. 1所示。

2.如权利要求1所述的调控小兰屿蝴蝶兰花瓣发育的方法，其中，将PeGRAS基因的开放阅读框200-300bp可操作地连接于CymMV病毒载体，形成含有该基因片段的CymMV-PeGRAS载体，然后将载体转入农杆菌，再通过农杆菌注射目标植物叶片，通过培养获得花瓣突变的小兰屿蝴蝶兰。