CN111019954B - 烟草蛋白actb及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于烟草基因工程领域，具体涉及烟草基因及其应用专利申请。该基因碱基序列如SEQ ID NO.1所示，烟草蛋白ACTB由449个氨基酸残基组成。该蛋白与植物叶片中多酚类物质含量相关，降低该蛋白表达后，叶片中绿原酸含量明显降低。本发明通过对特定烟草蛋白ACTB的初步研究，发现其与烟草绿原酸含量高度相关，在将该基因沉默后，烟草中绿原酸含量明显降低。基于这一特性，可为烟草新品种培育一定的应用基础和参考借鉴。

Description

烟草蛋白ACTB及其应用
技术领域
本发明属于烟草基因工程领域，具体涉及一个烟草蛋白ACTB及其应用专利申请。
背景技术
人们通常所吸食的烟草属双子叶植物纲管花目茄科烟草属植物，烟草属(Nicotiana) 有60 多个种，而用于制备吸食的主要为两个栽培种，分别为普通烟草(又称红花烟草，Nicotiana tabacum)和黄花烟草(Nicotiana rustica)，其中前者占据主要栽培面积。栽培烟草按烟叶品质特点、生物学性状和栽培调制方法等特点，可分为烤烟、晒烟、晾烟、白肋烟、香料烟和黄花烟六个类型，其中烤烟是我国栽培最广的普通烟草。
作为一种叶用经济作物，烤烟的栽培技术有别于其它大田作物，不仅要求有一定的烟叶产量，而且更注重烟叶品质。烟叶品质决定烟叶的可用性，直接影响卷烟商品的色、香、味和商品价值，也关系到烟农的经济效益，是烟草行业的生命和出发点。也因此，为满足国内外卷烟企业对优质烟叶不断增长的需求，必须不断提高烟叶品质和安全性。
绿原酸（chlorogenic acid，CGA）在植物界中广泛存在，主要分布于忍冬科、菊科、杜仲科和茄科。烟草中绿原酸含量可达3%，相对较高。在烟草中，绿原酸除了本身具有清香风味之外，还可以在多酚氧化酶等的作用下生成吡嗪、吡啶、吡咯类等有坚果香物质，赋予烟草制品优雅的香气，增加烟草制品的香气量。此外，绿原酸分子含有不饱和双键、酯键与多元酚等，是重要的天然抗氧化剂，与植物细胞对低温、紫外线以及病害等非生物和生物抗性密切相关。因此，基于生物化学角度对烟草中绿原酸的生物合成与积累途径，基于基因工程角度对绿原酸合成和调控基因进行深入分析，对于提高烟草品质和增强烟草品种的抗逆性均具有十分重要的技术意义。
发明内容
基于烟草中绿原酸含量调控基因的研究，本发明目的在于提供一个烟草蛋白ACTB基因及其在烟草绿原酸含量调节方面的应用，从而为烟叶品质调控、烟草新品种培育奠定基础。
本申请所采取的技术方案详述如下。
烟草蛋白ACTB的编码基因ACTB，由1350个碱基组成，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示。
所述编码ACTB基因在叶片绿原酸含量调控中的应用，利用基因沉默技术、或者基因超表达方法，通过调节烟草ACTB蛋白表达量，来调节控制烟叶中绿原酸含量情况。
所述编码基因ACTB的PCR扩增制备方法，包括如下步骤：
（1）提取（具体例如以烟草K326叶片为样品）基因组，并反转录为cDNA备用；
（2）设计PCR扩增用引物，并进行PCR扩增，具体引物序列设计如下：
NtACTB-F：5’- ATTCAGCAGTCACTGGGACC - 3’，
NtACTB-R：5’- GTATGAGTGGAACCAACGGA - 3’。
烟草蛋白ACTB，由449个氨基酸残基组成，具体氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
所述烟草蛋白ACTB在叶片绿原酸含量调控中的应用，该蛋白与植物叶片中绿原酸含量相关，降低该蛋白表达后，叶片中绿原酸含量明显降低。
利用所述编码基因ACTB的烟草新品种培育方法，通过转基因技术、瞬时表达技术或基因组编辑技术，构建含有ACTB基因的病毒诱导沉默载体、RNAi干涉载体、超表达载体或基因组编辑载体，转化烟草，筛选获得绿原酸含量变化的烟草新品种；
具体例如：利用病毒诱导的基因沉默（VIGS）的技术，干扰ACTB基因的表达使其沉默，ACTB基因沉默植株中绿原酸含量显著下降，进而获得绿原酸含量下降的植物新品种。
换言之，一种培育低绿原酸含量烟草新品种培育方法，利用病毒诱导的基因沉默（VIGS）的技术，干扰ACTB基因的表达使其沉默，ACTB基因沉默的新烟草品种植株中绿原酸物质含量显著下降。
基于上述烟叶中绿原酸的重要作用，本申请中，发明人通过对特定烟草蛋白ACTB的初步研究，发现其与烟草绿原酸含量高度相关，进一步基因功能验证过程中，在将该基因沉默后，烟草中绿原酸含量发生了明显降低。基于这一特性，可为定向调控烟草中绿原酸的生物合成、烟叶品质调控、烟草新品种培育奠定一定的应用基础和提供一定参考借鉴。
附图说明
图1 为与对照植株相比，NtACTB基因沉默植株中该基因的相对表达量；
图2 为病毒诱导基因沉默的烟叶及对照烟叶中的绿原酸含量比较。
具体实施方式
下面结合实施例对本申请做进一步解释说明，在介绍具体实施例前，就下述实施例中具体实验背景资料情况简要介绍如下。
生物材料：
本氏烟草，一种常用烟草材料，下述实施例中烟草种植于郑州烟草院种植基地，育苗钵中育苗，待发芽后两周进行分苗，种于塑料钵（10cm×10cm）中，22℃、16h光/8h暗条件下进行日常肥水管理等栽培管理；
下述实施例中所采用的VIGS载体是一种来自烟草脆裂病毒的病毒载体（tobaccorattle virus，TRV)， 所具体利用的TRV2（一种常用载体），其带有卡那筛选标记和35S启动子，同时TRV2带有EcoR I和BamH I等多克隆位点，可以用来携带和转化外源基因；
实验试剂：
LB液体培养基，1L含量中含有：10 g细菌蛋白胨（bacteriological peptone）；10g氯化钠（NaCl）；5 g酵母抽提物（yeast extract），高温高压灭菌；
YEB液体培养基，1L含量中含有：5g 牛肉浸膏（beef extract）；5 g细菌蛋白胨（bacteriological peptone）；5 g 蔗糖（sucrose）；1 g酵母抽提物（yeast extract）；2 mL1M硫酸镁（MgSO4），高温高压灭菌；
1M 2-(N-吗啉)乙磺酸（MES）储备液：ddH2O溶解，过滤灭菌，-20℃储存备用；
200 mM乙酰丁香酮（Acetosyringone，As）储备液：二甲基亚砜（DSMO）溶解，-20℃储存备用；
MMA（100 mL）：1 mL（1 M）MgCl2；1 mL（1 M,pH5.6）MES；75 μL（200 mM）As。
实施例1
本实施例就烟草NtACTB基因克隆及沉默载体的构建过程简要介绍如下。
（1）烟草NtACTB基因克隆
根据前期对于烟草基因组及相关ACTB基因研究，选择特异编码序列为目标片段，设计PCR扩增用引物序列如下：
NtACTB-F：5’- ATTCAGCAGTCACTGGGACC - 3’，
NtACTB-R：5’- GTATGAGTGGAACCAACGGA - 3’；
以烟草K326叶片（先提取基因组，再反转录为cDNA）的cDNA为模板，进行PCR扩增获得NtACTB基因；
PCR扩增程序为：95℃预变性3 min；95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸80s，34个循环后，72℃彻底延伸 5min；
对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，并回收电泳产物备用。
（2）构建重组TRV2-NtACTB载体
将步骤（1）中的PCR扩增产物进行EcoRI、BamHI双酶切，同时对空载体TRV2进行EcoRI、BamHI双酶切，分别回收酶切产物，利用T4 DNA连接酶进行连接；
将连接产物转化大肠杆菌感受态DH5α，转化操作结束后将转化产物涂布在含50mg/L Kan的LB固体培养基上，37℃过培养夜；
挑选阳性单菌落扩增后进一步进行PCR鉴定， 并结合测序验证，确保获得构建正确的重组载体TRV2-NtACTB。
需要说明的是，
烟草NtACTB基因，包括1350个碱基，碱基序列如SEQ ID NO.1所示，具体碱基序列为：
ATGGATAACTGGTCTTCTTCTTTCACTGTTGATGATGAATTCAAGAAGCTTGTCCTCCGAATGAACCCCCCAAGGGTTACTGTTGATAATACTTCTGACAAGAAAACTACTTTGATCAAGGTAGATAGTGCAAATAAAAGAGGAAGCTTGTTAGAAGTGGTTCAGGTTCTTACTGATTTGAACCTTATAATCAGGAGAGCTTATATATCTTCTGATGGGGAATGGTTTATGGATGTATTTCATGTTACTGATCAATATGGAAATAAGCTCTCTGAAGATAATGTTGCCGAACGTATTCAGCAGTCACTGGGACCGAGGGGCCGCAGCTTCCGGTCTATGGAAAGATCTGTAGGTGTTCAATCTGCAGCAGAGCACACAACCATTGAACTGACGGGGCGAGACAGACCAGGATTGCTTTCAGAGATCTTTGCTGTTCTCGCCGACCATAAAAATAATGTTGTAGCAGCAGAAGTATGGACTCATAATTCAAGAATGGCTTCGGTTGTTTACATAACTGATGAAGAAAGTGGATTAGCAATAACTGATCCTGATAGGCTTGCCAAAATCAGGAAACTTCTGTTGTATGTTCTAAAAGGAGATAGAGATAGGCGAGGCGCCAATACAGCAGTTTCCGTTGGTTCCACTCATACTGAAAGGAGGCTACATCAAATGATGTATGCTGATCGTGATTATGATAAAGATGATACAAGTTGTGTGTCAGTTGACCAGAGGAAGCCCATGGTAACCGTAGAAAGTTGTGCAGATAAAGGCTATACCGTCGTAAATTTGAGATGTGCAGACCGTCCGAAGCTGCTCTTTGATGCAGTGTGCACATTAACAGATATGCAATATGTGGTGTATCATGCTACCATTATTGCTGAAGGACCTGAGGCTTCTCAGGAATATTACATTAGGCATATGGACGGGTGCCCCGTTAGTTCTGAAGCGGAGAGGCAACGTGTAATACACTGCTTAGAGGCAGCGGTCAAGAGGAGAACTTCTACGGGAATAAGACTGGAATTATGTGGAGATGACAGAATCGGGCTTCTATCTGATGTGACTCGCATATTTAGGGAGAACGGTCTTTCTGTTTCCCGGGCTGAGGTCATGACGAAGGGCTCGCAAGCTATTAACGTGTTTTATGTGACTGATGCATCAGGGAGTCCAGTTAAAACTGAAACGATTGAGGCAGTCCGGAACGAAATAGGTATGACTATTCTTCGAGTCAGGGACGATCTCTACTCGAATTCAACACCACAGCAAACTGCCAGGTTCTCTTTAGGTAACATATTTAGATCAAGATCAGAGAAATTTCTCTACAACTTGGGATTAACAAAGTCATATTCATGA。
烟草蛋白ACTB，包括449个氨基酸，具体氨基酸序列为：
MDNWSSSFTVDDEFKKLVLRMNPPRVTVDNTSDKKTTLIKVDSANKRGSLLEVVQVLTDLNLIIRRAYISSDGEWFMDVFHVTDQYGNKLSEDNVAERIQQSLGPRGRSFRSMERSVGVQSAAEHTTIELTGRDRPGLLSEIFAVLADHKNNVVAAEVWTHNSRMASVVYITDEESGLAITDPDRLAKIRKLLLYVLKGDRDRRGANTAVSVGSTHTERRLHQMMYADRDYDKDDTSCVSVDQRKPMVTVESCADKGYTVVNLRCADRPKLLFDAVCTLTDMQYVVYHATIIAEGPEASQEYYIRHMDGCPVSSEAERQRVIHCLEAAVKRRTSTGIRLELCGDDRIGLLSDVTRIFRENGLSVSRAEVMTKGSQAINVFYVTDASGSPVKTETIEAVRNEIGMTILRVRDDLYSNSTPQQTARFSLGNIFRSRSEKFLYNLGLTKSYS。
实施例2
在实施例1基础上，利用农杆菌介导的VIGS技术，发明人进一步将所构建的重组TRV2-NtACTB载体转化了烟草植株，并就相关植物表型变化情况做了验证分析，具体实验过程简介如下。
（1）转化农杆菌
需要说明的是，参考实施例1操作及现有技术，发明人同时制备了TRV2-PDS重组载体作为对照，具体转化过程为：
将TRV2（载体对照）、TRV2-PDS（VIGS效率对照）及TRV2-NtACTB的阳性克隆质粒，分别通过电击转化方式转化进入农杆菌GV3101感受态细胞中，利用含50mg/L Kan 和50mg/LRif的YEB平板进行培养筛选，在28℃倒置培养2d后，利用菌落PCR筛选带有目的基因的农杆菌。
（2）制备转染用菌液
将步骤（1）中筛选所得阳性农杆菌克隆在5 mL的YEB液体培养基（含50 mg/L Kan和50 mg/L Rif）中，28℃、250 rpm条件下培养过夜；
取50uL 过夜培养物接种至50 mL的YEB液体培养基（含50 mg/L Kan）中，培养至OD600 =1.0 ~ 1.5左右，然后4000g 离心5 min，收集菌体，再用MMA(1 mL（1 M）MgCl2；1 mL（1 M, pH5.6）MES；75 μL（200 mM）As)重悬，调节OD600 =1.0 左右；
最后室温放置3 h左右后，作为转染用菌液。
（3）瞬时转化
以3~4 w（周）苗龄的本氏烟草叶片为实验材料，利用1 mL规格注射器，将步骤（2）中所制备转染用菌液注射至烟草叶片中，注射后的烟草继续在人工培养箱内培养，观察表型变化。
注射3周后的烟草表型变化情况，含TRV2-PDS的农杆菌浸染植株新生叶有漂白现象，说明侵染成功；相对应的TRV2-NtACTB组烟草叶片颜色无变化。
进一步通过qRT-PCR对NtACTB基因表达情况进行了检测，结果如图1所示，可以看出，TRV2- NtACTB的侵染植株中，NtACTB的表达量显著降低。
进一步地，发明人对实验组（TRV2- NtACTB浸染植株）和对照组（TRV2-GFP浸染植株）中的植物绿原酸含量情况进行了检测（检测方法参照《基于气质和液质联用技术的烟草鲜烟叶代谢组学分析流程》（郑庆霞等，烟草科技，2019）），结果如图2。
从结果可以看出，实验组中绿原酸含量与对照组相比下降20%，这进一步表明，通过沉默NtACTB基因，可对烟草叶片中植物绿原酸的含量进行调控，进而可为烟叶品质调控奠定一定技术基础。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国烟草总公司郑州烟草研究院
<120> 烟草蛋白ACTB及其应用
<130> none
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1350
<212> DNA
<213> Nicotiana tabacum
<400> 1
atggataact ggtcttcttc tttcactgtt gatgatgaat tcaagaagct tgtcctccga 60
atgaaccccc caagggttac tgttgataat acttctgaca agaaaactac tttgatcaag 120
gtagatagtg caaataaaag aggaagcttg ttagaagtgg ttcaggttct tactgatttg 180
aaccttataa tcaggagagc ttatatatct tctgatgggg aatggtttat ggatgtattt 240
catgttactg atcaatatgg aaataagctc tctgaagata atgttgccga acgtattcag 300
cagtcactgg gaccgagggg ccgcagcttc cggtctatgg aaagatctgt aggtgttcaa 360
tctgcagcag agcacacaac cattgaactg acggggcgag acagaccagg attgctttca 420
gagatctttg ctgttctcgc cgaccataaa aataatgttg tagcagcaga agtatggact 480
cataattcaa gaatggcttc ggttgtttac ataactgatg aagaaagtgg attagcaata 540
actgatcctg ataggcttgc caaaatcagg aaacttctgt tgtatgttct aaaaggagat 600
agagataggc gaggcgccaa tacagcagtt tccgttggtt ccactcatac tgaaaggagg 660
ctacatcaaa tgatgtatgc tgatcgtgat tatgataaag atgatacaag ttgtgtgtca 720
gttgaccaga ggaagcccat ggtaaccgta gaaagttgtg cagataaagg ctataccgtc 780
gtaaatttga gatgtgcaga ccgtccgaag ctgctctttg atgcagtgtg cacattaaca 840
gatatgcaat atgtggtgta tcatgctacc attattgctg aaggacctga ggcttctcag 900
gaatattaca ttaggcatat ggacgggtgc cccgttagtt ctgaagcgga gaggcaacgt 960
gtaatacact gcttagaggc agcggtcaag aggagaactt ctacgggaat aagactggaa 1020
ttatgtggag atgacagaat cgggcttcta tctgatgtga ctcgcatatt tagggagaac 1080
ggtctttctg tttcccgggc tgaggtcatg acgaagggct cgcaagctat taacgtgttt 1140
tatgtgactg atgcatcagg gagtccagtt aaaactgaaa cgattgaggc agtccggaac 1200
gaaataggta tgactattct tcgagtcagg gacgatctct actcgaattc aacaccacag 1260
caaactgcca ggttctcttt aggtaacata tttagatcaa gatcagagaa atttctctac 1320
aacttgggat taacaaagtc atattcatga 1350
<210> 2
<211> 449
<212> PRT
<213> Nicotiana tabacum
<400> 2
Met Asp Asn Trp Ser Ser Ser Phe Thr Val Asp Asp Glu Phe Lys Lys
1 5 10 15
Leu Val Leu Arg Met Asn Pro Pro Arg Val Thr Val Asp Asn Thr Ser
20 25 30
Asp Lys Lys Thr Thr Leu Ile Lys Val Asp Ser Ala Asn Lys Arg Gly
35 40 45
Ser Leu Leu Glu Val Val Gln Val Leu Thr Asp Leu Asn Leu Ile Ile
50 55 60
Arg Arg Ala Tyr Ile Ser Ser Asp Gly Glu Trp Phe Met Asp Val Phe
65 70 75 80
His Val Thr Asp Gln Tyr Gly Asn Lys Leu Ser Glu Asp Asn Val Ala
85 90 95
Glu Arg Ile Gln Gln Ser Leu Gly Pro Arg Gly Arg Ser Phe Arg Ser
100 105 110
Met Glu Arg Ser Val Gly Val Gln Ser Ala Ala Glu His Thr Thr Ile
115 120 125
Glu Leu Thr Gly Arg Asp Arg Pro Gly Leu Leu Ser Glu Ile Phe Ala
130 135 140
Val Leu Ala Asp His Lys Asn Asn Val Val Ala Ala Glu Val Trp Thr
145 150 155 160
His Asn Ser Arg Met Ala Ser Val Val Tyr Ile Thr Asp Glu Glu Ser
165 170 175
Gly Leu Ala Ile Thr Asp Pro Asp Arg Leu Ala Lys Ile Arg Lys Leu
180 185 190
Leu Leu Tyr Val Leu Lys Gly Asp Arg Asp Arg Arg Gly Ala Asn Thr
195 200 205
Ala Val Ser Val Gly Ser Thr His Thr Glu Arg Arg Leu His Gln Met
210 215 220
Met Tyr Ala Asp Arg Asp Tyr Asp Lys Asp Asp Thr Ser Cys Val Ser
225 230 235 240
Val Asp Gln Arg Lys Pro Met Val Thr Val Glu Ser Cys Ala Asp Lys
245 250 255
Gly Tyr Thr Val Val Asn Leu Arg Cys Ala Asp Arg Pro Lys Leu Leu
260 265 270
Phe Asp Ala Val Cys Thr Leu Thr Asp Met Gln Tyr Val Val Tyr His
275 280 285
Ala Thr Ile Ile Ala Glu Gly Pro Glu Ala Ser Gln Glu Tyr Tyr Ile
290 295 300
Arg His Met Asp Gly Cys Pro Val Ser Ser Glu Ala Glu Arg Gln Arg
305 310 315 320
Val Ile His Cys Leu Glu Ala Ala Val Lys Arg Arg Thr Ser Thr Gly
325 330 335
Ile Arg Leu Glu Leu Cys Gly Asp Asp Arg Ile Gly Leu Leu Ser Asp
340 345 350
Val Thr Arg Ile Phe Arg Glu Asn Gly Leu Ser Val Ser Arg Ala Glu
355 360 365
Val Met Thr Lys Gly Ser Gln Ala Ile Asn Val Phe Tyr Val Thr Asp
370 375 380
Ala Ser Gly Ser Pro Val Lys Thr Glu Thr Ile Glu Ala Val Arg Asn
385 390 395 400
Glu Ile Gly Met Thr Ile Leu Arg Val Arg Asp Asp Leu Tyr Ser Asn
405 410 415
Ser Thr Pro Gln Gln Thr Ala Arg Phe Ser Leu Gly Asn Ile Phe Arg
420 425 430
Ser Arg Ser Glu Lys Phe Leu Tyr Asn Leu Gly Leu Thr Lys Ser Tyr
435 440 445
Ser

Claims (4)

1.烟草蛋白ACTB的编码基因ACTB在烟草叶片绿原酸含量调控中的应用，其特征在于，利用基因沉默技术，通过下调编码基因ACTB表达量，来下调烟叶中多酚类物质含量，所述多酚类物质为：绿原酸；
所述烟草蛋白ACTB的编码基因ACTB，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示。
2.烟草蛋白ACTB在烟草叶片多酚类物质含量调控中的应用，其特征在于，该蛋白与烟草叶片中多酚类物质含量相关，降低该蛋白表达后，烟草叶片中多酚类物质含量明显降低，所述多酚类物质为：绿原酸；
所述烟草蛋白ACTB，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.利用烟草蛋白ACTB的编码基因ACTB的烟草新品种培育方法，其特征在于，利用病毒诱导的基因沉默技术，构建含有ACTB基因的病毒诱导沉默载体，转化烟草，筛选获得绿原酸含量下降的烟草新品种；
所述ACTB基因，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示。
4.如权利要求3所述烟草新品种培育方法，其特征在于，构建含有ACTB基因的病毒诱导沉默载体过程中，PCR扩增制备ACTB基因时，以烟草K326的cDNA为模板，以NtACTB-F、NtACTB-R为引物，进行PCR扩增；
所述引物具体设计为：
NtACTB-F：5’- ATTCAGCAGTCACTGGGACC - 3’，
NtACTB-R：5’- GTATGAGTGGAACCAACGGA - 3’。
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