CN104644621A - 绿原酸在制备治疗心肌病的药物中的用途 - Google Patents

绿原酸在制备治疗心肌病的药物中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种绿原酸在制备治疗心肌病的药物中的用途。所述药物，具有上调心肌特异性表达结构基因ACTC1及对应蛋白，下调caspase-3基因及其对应蛋白，上调Bcl-2基因及对应蛋白作用。本发明还公开了一种用于治疗心肌病的药物，所述的药物包括绿原酸，药学上可接受的辅料或辅助性成分。本发明还公开了一种治疗心肌病的联合用药物。

Description

绿原酸在制备治疗心肌病的药物中的用途
技术领域
本发明涉及绿原酸在制备治疗心肌病的药物中的用途，属于药物领域。
背景技术
绿原酸(chlorogenic acid CGA)又名咖啡鞣酸，是由咖啡酸(caffeic acid CA)和奎尼酸(quinic acid QA)组成的缩酚酸，其化学名为3-o-咖啡酰奎尼酸(3-o-caffeoylquinicacid CGA)。绿原酸是植物在进行有氧呼吸的过程中，经磷酸戊糖途径中间产物合成的一种苯丙素类物质。绿原酸已经被开放应用于食品，保健品，化妆品和药品等多个领域。由于它广泛的存在于常见的各种蔬菜水果中，具有多种生物活性，如:心血管保护作用、抗氧化作用、抗紫外及抗辐射作用、抗诱变及抗癌作用、抗菌作用、抗病毒作用、降脂降糖作用、免疫调节作用等。在医药化工和食品等领域都具有广泛的应用。
心肌病定义为原因不明的心肌疾病，分为原发性心肌病和继发性心肌病。原发性心肌病按病因和病理心肌病被分为三型：①扩张型心肌病；②肥厚型心肌病；③限制型心肌病。目前，未见报道针对绿原酸在治疗心肌病方面的研究。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的在于提供一种绿原酸的新用途。
本发明的上述目的是通过如下技术方案实现的：一种绿原酸在制备治疗心肌病的药物中的用途。
在本发明中，所述心肌病优选为扩张型心肌病和肥厚型心肌病。
申请人研究发现，绿原酸作为药物，具有上调心肌特异性表达结构基因ACTC1及对应蛋白的作用。进一步的，绿原酸作为药物，具有下调caspase-3基因及对应蛋白的作用，而Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，其中caspase-3为关键的执行分子，它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。它的出现和激活提示着凋亡途径的开启，预示着细胞的凋亡。
申请人还研究发现，绿原酸作为药物，具有上调Bcl-2基因及对应蛋白的作用。Bcl-2基因(即B细胞淋巴瘤/白血病-2基因)是一种原癌基因，它具有抑制凋亡的作用，对其的激活从一定程度上可以抑制程序性的凋亡过程。
申请人研究得知，改善心肌病(扩张型心肌病和肥厚型心肌病)的病理变化，有效的改善心功能，明显的减轻心室负荷。上调心肌特异性表达结构基因ACTC1及对应蛋白，下调caspase-3基因及其对应蛋白，上调Bcl-2基因及对应蛋白，为其临床治疗谷心肌病(扩张型心肌病和肥厚型心肌病)提供了理论依据。通过上述作用机理，绿原酸在治疗心肌病，尤其是扩张型心肌病和肥厚型心肌病具有显著的效果。
本发明的另一目的是提供一种用于治疗心肌病的药物，所述的药物包括绿原酸，药学上可接受的辅料或辅助性成分。所述辅料或辅助性成分包括但不限于甘露醇、亚硫酸氢钠、淀粉、糊精粉、无水乙醇、注射用水、糖粉、乳糖、羟丙甲纤维素、硬脂酸镁、蔗糖、聚维酮K30。
进一步的，在本发明中，所述的药物可以是口服制剂和注射制剂。
其中，所述的制剂的每单位制剂含绿原酸1-1000mg，临床使用剂量为：1-100mg/kg。
本发明的另一目的是提供一种治疗心肌病的联合用药物，所述联合用药物包括绿原酸和治疗心肌病的药物。
进一步的，所述治疗心肌病的药物包括但不限于心得安、氨酰心安、美托洛尔、比索洛尔、异搏定、硫氮卓酮、乙胺碘呋酮、双异丙比胺。
本发明的有益效果在于：绿原酸有益于改善心功能，明显减轻心室负荷；绿原酸有益于心肌的健康收缩，有益于抑制心肌细胞的凋亡；有益于改善心肌细胞的形态，有益于心室指数的恢复。
附图说明
图1为本发明实施例1大鼠心室重量指数VW1(VW/大鼠体重)的测定结果(纵坐标为心室重量指数，单位为mg/g)。
图2为本发明实施例1大鼠心肌凋亡指数的测定(横坐标为心肌凋亡百分率，单位为％)。
图3为本发明实施例2的RT-PCR检测ACTC1、caspase-3和Bcl-2基因的表达情况。
图4为本发明实施例2的Wester-blot检测ACTC1、caspase-3和Bcl-2蛋白的表达情况。
图5为本发明实施例3的大鼠心室重量指数VW1(VW/大鼠体重)的测定结果(纵坐标为心室重量指数，单位为mg/g)。
图6为本发明实施例4各组大鼠的心肌凋亡百分比。
具体实施方式
实例1：绿原酸治疗扩张型心肌病(DCM)的体内药效学试验研究
1.实验材料
1.1动物
出生两周，母乳喂养的Wistar大鼠，雌雄各半，共110只。
1.2实验药物及仪器
呋喃唑酮，10％水合氯醛，PHLIPsonos7500彩色超声检测仪，TUNEL凋亡检测试剂盒，BNP的ELISA检测试剂盒，万分之一的电子天平,乙二胺四乙酸二钠。
2.实验方法
2.1大鼠扩张型心肌病(DCM)模型的建立和实验分组
取2周龄的Wistar大鼠115只，雌雄各半，随机挑出12只大鼠，作为实验的正常对照组，喂以正常的鼠饲料。同时，其余103只作为造模大鼠，开始喂添加有呋喃唑酮的鼠饲料，呋喃唑酮的剂量按0.2mg/g体重给予，每周按体重调整一次用药剂量，正常对照组的大鼠和造模大鼠均喂养8周。
8周后，剔除死亡的4只大鼠，剩余的99只大鼠，经超声心动图证实患有扩张型心肌病(DCM)的有78只，随机舍弃3只后，将剩余的75只患有DCM的模型大鼠随机平均分为5组，分别命名为：模型对照组(DCM组，n＝15)、美托洛尔治疗组(Metoprolol组，n＝15)、绿原酸低剂量治疗组(L-LYS组，n＝15)、绿原酸中剂量治疗组(M-LYS组，n＝15)和绿原酸高剂量治疗组(H-LYS组，n＝15)，连同正常对照组(NC组，n＝12)，共6个实验组，共87只。
2.2分组给药实验
本实验采用腹腔注射给药的方式对各组大鼠进行给药治疗，其具体的给药方案如表1所示：
表1.实验分组、给药方式及给药量(注：所有给药组的给药体积相同)
2.3观察指标及测定
2.3.1超声检测仪评估心脏结构和功能(实验第90天)
给药90天后，将各组大鼠禁食12h、禁饮2h后，用10％水合氯醛麻醉后，使用PHLIPsonos7500彩色超声检测仪进行心动图检查：测量左室舒张末期内径(LVEDd)、左室收缩末期内径(LVESd)、左室射血分数(EF)。
2.3.2血浆生化和BNP检测
待超声心动图检测完毕后，将各组大鼠分别取全血4.0mL左右，用乙二胺四乙酸二钠抗凝，静置30min后，2000g离心10min，分离血浆，于-70℃的冰箱内保存。血钾和血肌酐按常规方法检测，BNP用ELISA试剂盒直接检测。
2.3.3心室重量指数检测
超声心动图检测和取血完毕后，将各组大鼠称重后，采用劲椎脱臼法处死，迅速打开胸腔摘取心脏，肉眼观察后，剪去周围大血管，在冰等渗盐水中洗净血液，滤纸吸干水后，沿房室交界处去除左右心房，用电子天平(精确度0.0001g)称取心室重量(ventricular weight，VW)，计算心室重量指数VW1(VW/大鼠体重)。
2.3.4TUNEL法检测心肌细胞凋亡指数
使用TUNEL凋亡检测试剂盒检测心肌细胞的凋亡情况，将2.3.3中所取出的心脏标本拼凑恢复原状，用预冷的PBS冲洗，心脏中段横断面切取2～3mm厚的组织1块，放入装有10％中性缓冲福尔马林的小瓶中，入4℃冰箱固定过夜(不超过24h)，再经过脱水、浸渍和包埋等步骤，制成石蜡块。石蜡块常规切片后，应用TUNEL法原位标记凋亡细胞核，操作严格按照试剂盒的说明书进性。征程的心肌细胞核呈蓝色，而凋亡的心肌细胞核呈深浅不一的棕褐色。心肌细胞凋亡指数(CMAI)的计算方法：凋亡的心肌细胞数/心肌细胞总数×100％。
3.实验结果
3.1超声心动图检查结果
表2超声心动图检测结果
实验结果如表2所示：(1)DCM组与NC组大鼠相比，各项数据具有非常显著差异，p<0.01；造模效果良好。(2)Metoprolol治疗组与DCM组相比，LVEDd(mm)和LVESd(mm)均有了明显的降低，具有非常显著性差异p<0.01，与NC组相比，其仍具有显著性差异p<0.05，LVEF(％)也有明显的升高，与DCM组相比，有非常显著性差异p<0.01，与NC组相比，也具有非常显著性差异，p<0.01；(3)LYS高、中、低三个剂量的给药组，LVEDd(mm)和LVESd(mm)均有了一定程度的下降，其中，L-LYS组下降幅度较小，而M-LYS和H-LYS组的下降幅度较大，与DCM组表现出非常显著性差异p<0.01，与NC组间无显著性差异；LVEF(％)值在3个剂量的治疗组中，均有一定程度的升高，其中，M-LYS和H-LYS组与DCM组相比，表现出非常显著性差异p<0.01，而与NC组相比，仍表现出显著性差异p<0.05；与Metoprolol相比，M-LYS和H-LYS组的LVEDd(mm)、LVESd(mm)和LVEF(％)均没有表现出显著性差异。
3.2血浆生化和BNP检测结果
表3血浆生化和BNP检测实验结果
实验结果如表3所示：各组的血钾和血肌酐水平均没有统计学差异(p>0.05)；与NC组相比，DCM组的BNP值有了明显的升高，具有非常显著性差异p<0.01，而Metoprolol和LYS的3个剂量治疗组，与DCM组相比，BNP水平显著下降，各组数据均有显著性差异，其中M-LYS和H-LYS组的BNP值较DCM组有非常显著性差异P<0.01，表明其降低BNP的程度较大。
3.3心室重量指数检测
心室重量指数VW1(VW/大鼠体重)的测定结果如图1所示：与NC组相比各组的DCM组的VW1值有显著增高，二者之间有极显著性差异(p<0.01)，DCM组表现出明显的心室扩张病理现象。各治疗组的VW1值比DCM组均有了一定程度的下降，其中H-LYS组对VW1的下调作用最为显著，其与DCM模型组之间有显著性差异p<0.05。图1中与NC组相比，*p<0.05,**p<0.01与HCM组相比，△p<0.05，△△p<0.01；与Metoprotol相比，×p<0.05
3.4TUNEL法检测心肌细胞凋亡指数
用TUNEL法检测心肌细胞凋亡的实验中，结果如图2所示，各治疗组与DMC组相比，凋亡指数均有明显的恢复，各组与DMC相比均有非常显著性差异p<0.01。
4统计学处理
连续型变量形式的实验数据以x±sd表示，2组数据间的比较用两样本t检验。采用SPSS13.0统计软件，P<0.05为有统计学意义。
5，实验结果
本实施例中，采用呋喃唑酮的方法成功建立了大鼠扩张型心肌病模型，以Metoprolol作为阳性对照药物，设置了高、中、低3个剂量绿原酸的治疗组，以正常大鼠作为阴性对照组，通过腹腔注射的方式对扩张型心肌病大鼠进行治疗。(1)超声心动图检测实验结果显示，与模型不治疗组(DCM)相比，高、中、低剂量的绿原酸能有效降低LVEDd(mm)和LVESd(mm)，LVEF(％)值也得到较大的恢复，该部分治疗效果与阳性药物Metoprolol相近，且中、高剂量的绿原酸治疗组(M-LYS组和H-LYS组)与Metoprolol治疗相比，各组数据之间无显著性差异。(2)血浆生化的结果显示，与DCM组相比，各治疗组均能有效的显著降低血浆BNP水平，且高、中、低剂量的绿原酸治疗组，与阳性药物Metoprolol相比，治疗效果相当，无显著性差异。(3)心室重量指数检测结果显示，与DCM组相比，高、中、低剂量的绿原酸治疗组，能够显著的恢复心室重量指数，其与DCM组相比，均有非常显著性差异(p<0.01),而与阳性药物Metoprolol治疗组相比，高、中剂量绿原酸治疗组能更有效的降低心室重量指数(p<0.05)。(4)凋亡细胞的检测实验结果显示，高、中、低剂量绿原酸治疗组的大鼠心肌细胞，其凋亡百分比，较DCM组，明显降低，且降低程度与阳性药物Metoprolol治疗组接近，无统计学差异(p>0.05)。
以上实验结果显示，绿原酸可以有效的改善心功能，明显的减轻心室负荷，且中、高剂量腹腔注射绿原酸后的部分治疗效果，优于阳性对照药物Metoprolol治疗组，显示其对扩张型心肌病具有较好的治疗效果。
实例2：绿原酸对扩张型心肌病大鼠模型心肌细胞中的ACTC1、caspase-3、Bcl-2基因及其各自对应蛋白的表达情况的影响。
1.实验材料
1.1动物
出生两周，母乳喂养的Wistar大鼠，雌雄各半，共80只。
1.2实验药物及仪器
呋喃唑酮，10％水合氯醛，PHLIPsonos7500彩色超声检测仪，PCR仪，总RNA提取试剂盒，cDNA第一链合成试剂盒，电泳仪，凝胶成像仪。
2.实验方法
2.1大鼠扩张型心肌病(DCM)模型的建立和实验分组
取2周龄的Wistar大鼠60只，雌雄各半，随机挑出10只大鼠，作为实验的正常对照组，喂以正常的鼠饲料。同时，其余50只作为造模大鼠，开始喂添加有呋喃唑酮的鼠饲料，呋喃唑酮的剂量按0.2mg/g体重给予，每周按体重调整一次用药剂量，正常对照组的大鼠和造模大鼠均喂养8周。
8周后，剔除死亡的2只大鼠，剩余的48只大鼠，经超声心动图证实患有扩张型心肌病(DCM)的有38只，将38只患有DCM的模型大鼠随机舍弃2只后，随机平均分为3组，分别命名为：模型对照组(DCM组，n＝12)、美托洛尔治疗组(Metoprolol组，n＝12)、绿原酸治疗组(LYS组，n＝12)连同正常对照组(NC组，n＝10)，共4个实验组，共46只。
2.2分组给药实验
本实验采用灌胃给药的方式对各组大鼠进行给药治疗，其具体的给药方案如表4所示：
表4.实验分组、给药方式及给药量(注：所有给药组的给药体积相同)
2.3检测实验
2.3.1RT-PCR法检测各组大鼠心肌细胞中的ACTC1、caspase-3和Bcl-2基因的表达情况。
(1)心肌细胞总RNA的提取
利用RNAprep Pure培养细胞/细菌总RNA提取试剂盒(离心柱型)提取细胞内的总RNA，在整个提取过程当中应该预防和避免RNase污染，所用的离心管等均做无酶处理，及时更换手套，所有操作均在超净台上进行。操作过程按说明书进行，具体提取步骤简述如下：
1.60天实验结束后，采用劲椎脱臼法处死，迅速打开胸腔摘取心脏，分组编号。每只老鼠的心脏被均匀的剪碎，之后，从每份心脏碎片中称取20mg样品，其余的样品冻存于-70℃冰箱内，备用；
2.向每份心肌组织中加入300μl的预先加有β-巯基乙醇的裂解液RL，用电动匀浆器彻底的研磨组织。向匀浆液中加入600μl的RNase-free ddH2O和10μl的蛋白酶K,混匀后56℃处理20min；
3.将上述液体在12,000rpm条件下离心5min，小心吸取上清液使用；
4.向上清液中缓慢加入0.5倍体积的无水乙醇，混匀后转移至吸附柱CR3中，12,000rpm离心1min，弃去废液，留吸附柱；
5.加入去蛋白液RW1至吸附柱中，去除蛋白，之后离心1min，弃去废液；
6.加入DNase I工作液，去除柱体上的DNA；
7.用去蛋白液和漂洗液分别清洗吸附柱后，将吸附柱放于收集管中，充分挥干上面的残留液体；
8.向吸附柱中加入60μlRNase free ddH2O，放置2min后，12,000rpm离心2min，即得mRNA样品；
(2)mRNA的逆转录
利用cDNA第一链合成试剂盒和上述提取得到的RNA溶液合成对应的第一链cDNA。具体逆转录过程按照说明书操作，简述如下：
1.取200μl的无酶离心管置于冰浴上，并于其中加入下列溶液：
2.离心后，将离心管放置于PCR仪中，70℃孵育5min后，简短收集液体后，迅速将其转移到冰上冷却2min后补加如下试剂：
3.将离心管轻轻混匀并简短离心后，设置PCR仪42℃孵育50min，之后95℃加热5min。最后向得到的cDNA溶液中加入30ul RNase-Free ddH2O稀释至50ul，记得第一链cDNA。
4.将得到的产物置于－20℃条件下保存。
(3)RT-PCR定量
EvaGreen荧光染料与双链的DNA结合会产生很强的荧光，通过检测最终的荧光强度，我们可以得到反应生成DNA的总量。在试管中加入荧光染料、(1)(2)步中所合成的cDNA产物、ACTC1引物(上游引物5’-ATCTCACGTTCAGCTGTGGTCA-3’，下游引物5’-ACCACCGGCATCGTGTTGGAT-3’),caspase-3引物(上游引物5’-CAAGTCGATGGACTCTGGAA-3’，下游引物5’-GTACCATTGCGAGCTGACAT-3’)，Bcl-2引物(上游引物5；-CCGGGAGAACAGGGTATGATAA-3’，下游引物5’-CCCACTCGTAGCCCCTCTG-3’)，分组混合均匀后进行RT-PCR检测本体系使用RNase-freewater代替cDNA products组为NTC对照。每个样品均设β-actin引物组为相对值，进行相对定量。
2.3.2ACTC1，caspase-3和Bcl-2蛋白表达的分析
(1)Western Blot检测
①将之前冻存的生物样本取出，每份样品切取80mg左右的心肌组织，加适量PBS匀浆，弃去上清，加入5倍体积的细胞裂解液，冰上放置20min，12000rpm4℃离心1h，收集上清液；
②BCA法定量样品的蛋白浓度；
③把蛋白样品制成相同的浓度，加入样品缓冲液，沸水煮5min；
④按常规方法进行电泳；
⑤取下PVDF膜，TBS浸泡10min，5％脱脂奶粉封闭1h，TBS洗脱2次，加入一抗(1:300)，孵育2h后，TBST洗脱2次，再加入二抗(1:4000)1h，TBST洗脱2次，之后用Western-blue染液显色后观察结果。
3.实验结果
3.1RT-PCR法检测各组大鼠心肌细胞中的ACTC1、caspase-3和Bcl-2基因的表达情况
RT-PCR实验结果如图3所示：与NC组相比，DCM组的ACTC1、Caspase-3和Bcl-2mRNA的表达均明显下调。LYS治疗组的ACTC1mRNA水平显著上调，Caspase-3mRNA也有明显下调，此外，Bcl-2mRNA表达也有明显的上调。与阳性药物Metoprolol治疗组相比，其ACTC1基因表达更显著的增高。
3.2Western Blot电泳试验结果
电泳试验结果如图4所示：与NC组相比，DCM组的ACTC1、Caspase-3和Bcl-2蛋白的表达均显著降低。LYS治疗组的ACTC1有显著的提高，Caspase-3蛋白表达有一定程度的减弱，另外Bcl-2蛋白表达也得到较大的恢复。与阳性药物Metoprolol治疗组相比，其ACTC1蛋白的表达显著增高。该实验结果，与基因层面ACTC1、Caspase-3和Bcl-2对应mRNA的表达水平结果基本一致。
4统计学处理
连续型变量形式的实验数据以±sd表示，2组数据间的比较用两样本t检验。采用SPSS13.0统计软件，P<0.05为有统计学意义。
5.结论
该实施例从基因和蛋白两个层检测了LYS用于治疗扩张型心肌病时，心肌组织中ACTC1、Caspase-3和Bcl-2基因及其对应蛋白的表达情况，其中，ACTC1基因是心肌细胞特异性表达的基因，对于心肌的健康收缩等具有重要作用。而Csapase-3和Bcl-2基因及对应蛋白与扩张型心肌病的病程发展、细胞凋亡等密切相关，反映着扩张型心肌病的病理状态。实施例的结果显示，绿原酸治疗扩张型心肌病可以显著的降低凋亡相关Caspase-3基因及其蛋白的表达，促进Bcl-2基因及其蛋白的表达，对抑制心肌凋亡具有非常积极的作用。且绿原酸能够显著的上调心肌特异性表达的ACTC1基因及其蛋白的表达，有利于心肌的正常收缩功能维持，这一作用，与阳性药物Metoprolol相比，具有显著性差异。此项研究对于绿原酸临床治疗扩张型心肌病提供了理论依据。
实施例3绿原酸对肥厚型心肌病的治疗效果的体内药效学研究
1.实验材料
1.1动物
cTnTR92Q转基因肥厚型心肌病(HCM)模型C57BL/6J小鼠
1.2实验药物及仪器
10％水合氯醛，PHLIPsonos7500彩色超声检测仪，万分之一的电子天平，高倍显微镜。
2.实验方法
2.1小鼠的分组
将cTnTR92Q转基因肥厚型心肌病模型C57BL/6J小鼠32只，随机分为4组，每组8只小鼠。分别设置为模型对照组(HCM组，n＝8)、美托洛尔治疗组(Metoprolol组，n＝8)、绿原酸治疗组(L-LYS组，n＝8)。同时，取野生型的C57BL/6J小鼠8只作为作为实验的正常对照组(NC组，n＝8)。
2.2实验的给药方案设计
本实验采用腹腔注射的给药方式对各组小鼠进行给药治疗，其具体的给药方案如表5所示：
表5.实验给药方案(注：所有给药组的给药体积相同)
2.3观察指标及测定
2.3.1超声检测仪评估心脏结构和功能(实验第90天)
给药90天后，将各组大鼠禁食12h、禁饮2h后，用10％水合氯醛麻醉后，使用心脏超声仪器检测，对各组小鼠收缩期左室前壁厚度(LVAWs)、舒张期左室前壁厚度(LVAWd)、收缩期左室后壁厚度(LVPWs)、舒张期左室前壁厚度(LVPWd)进行检测。
2.3.2心室重量指数检测
超声心动图检测和取血完毕后，将各组大鼠称重后，采用劲椎脱臼法处死，迅速打开胸腔摘取心脏，肉眼观察后，剪去周围大血管，在冰等渗盐水中洗净血液，滤纸吸干水后，沿房室交界处去除左右心房，用电子天平(精确度0.0001g)称取心室重量(ventricular weight，VW)，计算心室重量指数VW1(VW/大鼠体重)
2.3.3心肌组织观察
心室重量指数称重完毕后，将所得到的各组心脏组织进行脱水、包埋、切片和HE染色，然后置于高倍显微镜下观察。
3.实验结果
3.1心脏超声仪器检测结果
表6心脏超声仪器检测结果
实验结果如表6所示：(1)HCM组与NC组大鼠相比，p<0.01；肥厚型心肌病模型小鼠的心室壁比野生小鼠明显厚肥许多。(2)Metoprolol治疗组与HCM组相比，各组数据均有了明显的下降，心室壁明显变薄，两组之间具有非常显著性差异p<0.01，与NC组相比，没有显著性差异p>0.05。(3)LYS治疗组中，各组数据也均有了一定程度的下降，与HCM组相比，表现出非常显著性差异p<0.01，与NC组间无显著性差异；与Metoprolol组相比，二者的治疗效果没有表现出统计学意义(p>0.05)。
3.2心室重量指数检测
心室重量指数VW1(VW/大鼠体重)的测定结果如图5所示：与NC组相比，HCM组的VW1明显较高，是典型的心肌肥大的现象，两组之间具有非常显著性差异(p<0.01)，LYS治疗组与Metoprolol治疗组的VW1均有较大幅度的下降。图5中与NC组相比，*p<0.05,**p<0.01；与HCM组相比，△p<0.05，△△p<0.01；与Metoprotol相比，×p<0.05，××p<0.01。
3.3心肌组织显微观察结果
HE染色之后，对各组小鼠的心肌组织进行观察后发现：与野生型的NC组相比，HCM组的小鼠其心肌细胞明显增大，形态变形，且排列紊乱。LYS治疗组合Metoprolol治疗组的小鼠，其心肌细胞也有一定程度的变大，但是基本排列整齐，致密，较HCM组有明显的改善。
4.统计学处理
连续型变量形式的实验数据以±sd表示，2组数据间的比较用两样本t检验。采用SPSS13.0统计软件，P<0.05为有统计学意义。
5.实验结果
本实施例以转基因的肥厚型心肌病小鼠作为实验对象，以Metoprolol作为阳性对照药物，实验结果显示LYS治疗组可以明显的改善肥厚型心肌病的心室壁厚度，显著改善心肌细胞形态，使心室指数有明显下调，且其治疗效果与阳性药物相当。绿原酸在治疗肥厚型心肌病中，反应出良好的药效。
实施例4绿原酸联合美托洛尔治疗大鼠扩张型心肌病的体内药效学考察
1.实验材料
1.1动物
出生两周，母乳喂养的Wistar大鼠，雌雄各半，共58只。
1.2实验药物及仪器
呋喃唑酮，10％水合氯醛，PHLIPsonos7500彩色超声检测仪，TUNEL凋亡检测试剂盒，BNP的ELISA检测试剂盒，万分之一的电子天平,乙二胺四乙酸二钠。2.实验方法
2.1大鼠扩张型心肌病(DCM)模型的建立和实验分组
取2周龄的Wistar大鼠58只，随机挑出10只大鼠，作为实验的正常对照组，喂以正常的鼠饲料。同时，其余48只作为造模大鼠，开始喂添加有呋喃唑酮的鼠饲料，呋喃唑酮的剂量按0.2mg/g体重给予，每周按体重调整一次用药剂量，正常对照组的大鼠和造模大鼠均喂养8周。
8周后，剔除死亡的5只大鼠，剩余的43只大鼠，经超声心动图证实患有扩张型心肌病(DCM)的有43只，随机舍弃3只后，将剩余的40只患有DCM的模型大鼠随机平均分为4组，分别命名为：模型对照组(DCM组，n＝10)、美托洛尔治疗组(Metoprolol组，n＝10)、绿原酸低剂量治疗组(LYS组，n＝10)、绿原酸联合美托洛尔治疗组(LM组，n＝10)，连同正常对照组(NC组，n＝10)，共5个实验组，共50只。
2.2分组给药实验
本实验采用腹腔注射给药的方式对各组大鼠进行给药治疗，其具体的给药方案如表7所示：
表7.实验分组、给药方式及给药量(注：所有给药组的给药体积相同)
2.3观察指标及测定
2.3.1超声检测仪评估心脏结构和功能(实验第90天)
给药90天后，将各组大鼠禁食12h、禁饮2h后，用10％水合氯醛麻醉后，使用PHLIPsonos7500彩色超声检测仪进行心动图检查：测量左室舒张末期内径(LVEDd)、左室收缩末期内径(LVESd)、左室射血分数(EF％)。
2.3.2血浆生化和BNP检测
待超声心动图检测完毕后，将各组大鼠分别取全血4.0mL左右，EDTA-2Na抗凝，静置30min后，2000g/min离心10min，分离血浆，于-70℃的冰箱内保存。血钾和血肌酐按常规方法检测，BNP用ELISA试剂盒直接检测。
2.3.3TUNEL法检测心肌细胞凋亡指数
使用TUNEL凋亡检测试剂盒检测心肌细胞的凋亡情况，将2.3.3中所取出的心脏标本拼凑恢复原状，用预冷的PBS冲洗，心脏中段横断面切取2～3mm厚的组织1块，放入装有10％中性缓冲福尔马林的小瓶中，入4℃冰箱固定过夜(不超过24h)，再经过脱水、浸渍和包埋等步骤，制成石蜡块。石蜡块常规切片后，应用TUNEL法原位标记凋亡细胞核，操作严格按照试剂盒的说明书进性。征程的心肌细胞核呈蓝色，而凋亡的心肌细胞核呈深浅不一的棕褐色。心肌细胞凋亡指数(CMAI)的计算方法：凋亡的心肌细胞数/心肌细胞总数×100％。
3.实验结果
3.1超声心动图检查结果
表8超声心动图检测结果(±sd)
与NC组相比a:p<0.05；与DCM组相比b:p<0.05；与Metoprolol组相比c:p<0.05；与绿原酸组先比d:p<0.05。
实验结果如表8所示：(1)DCM组与NC组大鼠相比，各项数据两两比较均具有显著差异(p<0.05)提示造模效果良好；(2)Metoprolol治疗组、绿原酸治疗组及联合给药组的各组数据，分别与DCM组的各组数据相比，LVEDd(mm)和LVESd(mm)均有了明显的降低，而EF(％)也均有一定程度的回升。其中，绿原酸单独治疗组的各组数据与NC组相比，不存在统计学差异。Metoprolol治疗组的各组数据与NC组相比，尚有显著性差异(p<0.05)。(3)联合给药(LM组)的各组数据比单独使用Metoprolol或单独使用绿原酸均更加的接近NC组的各组数据，其EF(％)组的数据也恢复到临床EF(％)正常值(50％以上)的水平，显示出联合用药相比与其它各种给药方式的治疗优越性。
3.2血浆生化和BNP检测结果
表3血浆生化和BNP检测实验结果(±sd)
实验结果如表9所示：各组的血钾和血肌酐水平，两两相比之后均没有统计学差异(p>0.05)；与NC组相比，DCM组的BNP值有了明显的升高，具有显著性差异p<0.05，提示BNP含量增加是扩张型心肌病的病理特征之一。Metoprolol组、LYS组和LM组的BNP值，较DCM组均有了一定程度的下降，其分别与NC组相比，均没有表现出统计学差异(P>0.05)。其中，联合给药组的下降趋势最为明显，其BNP的结果也最接近正常值。
3.3TUNEL法检测心肌细胞凋亡指数
用TUNEL法检测心肌细胞凋亡的实验中，结果如图6所示，各治疗组与DMC组相比，凋亡指数均有明显的恢复，分别与DMC相比均有显著性差异p<0.05，其中联合给药组凋亡指数的恢复程度最为显著，表现出更为明显的抑制心肌细胞凋亡的疗效。
4统计学处理
连续型变量形式的实验数据以±sd表示，2组数据间的比较用两样本t检验。采用SPSS13.0统计软件，P<0.05为有统计学意义。
5，实验结果
本实施例中，采用呋喃唑酮的方法成功建立了大鼠扩张型心肌病模型，为了考察绿原酸与Metoprolol联合用药的用药效果，特设计了联合给药组，并将所有试验结果与Metoprolol单独治疗组以及绿原酸单独治疗组的结果进行全面的比较，以上实验结果显示，绿原酸可以有效的改善心功能，明显的减轻心室负荷，且中、高剂量腹腔注射绿原酸后的部分治疗效果，优于阳性对照药物Metoprolol治疗组，显示其对扩张型心肌病具有较好的治疗效果。结果显示，联合给药组在所有给药治疗组中，能更为有效的改善扩张型心肌病的超声心动各指数(左室舒张末期内径、左室收缩末期内径、左室射血分数)，调节模型大鼠的血清BNP含量，此外，联合用药在抑制心肌细胞的凋亡方面也显示出更为突出的效果。综上，绿原酸可以联合治疗心肌病的有效药物(Metoprolol)有效的治疗扩张型心肌病，而不限于此类心肌病的治疗。
实施例5：用绿原酸制备冻干粉针剂
1.绿原酸的提取：
本实施例中所用的绿原酸原料药，系由金银花中提取、纯化得到，纯度为99.42％。
2.绿原酸冻干粉针剂的制备
2.1处方：
纯度为99.42％的绿原酸(主药) 50g
甘露醇(支撑剂) 60g
亚硫酸氢钠(抗氧化剂) 5g
将以上处方完全溶解于注射用水中，过滤后，再用0.22μm的除菌微孔滤膜精滤，调节pH后，按照无菌粉针剂的常规操作共制成2ml粉针剂1000支，每支含绿原酸50mg。
实施例6：用绿原酸制备丸剂
1.绿原酸的提取
本实施例中所使用的绿原酸，系由牛蒡子中提取、纯化得到的，纯度为98.41％。
2.绿原酸丸剂的制备
2.1处方
纯度为98.41％的绿原酸(主药) 1g
淀粉(稀释剂) 50g
糊精粉(粘合剂) 适量
无水乙醇(润湿剂) 适量
2.2.制法：
取适量的聚维酮K30，用无水乙醇配制成溶液，再取处方量的绿原酸和淀粉，采用等量稀释法混合均匀之后，加入糊精粉的乙醇溶液中，充分搅拌后制得软材，采用搓丸法制得绿原酸丸剂1000粒，每粒丸剂含绿原酸1mg。
实施例7：用绿原酸制备口服溶液剂
1.绿原酸的提取：本实施例中所使用的绿原酸，系由杜仲叶中提取、纯化得到，纯度为99.39％。
1.绿原酸口服溶液剂的制备
2.1处方
纯度为99.39％的绿原酸(主药) 20g
亚硫酸氢钠(抗氧化剂) 10g
注射用水(溶剂) 10L
2.2制法
取处方量的绿原酸和亚硫酸氢钠，溶解于10L注射用水中，按照口服液的常规制备工艺，过滤后，无菌灌装成100支口服液，每支口服液为100mL，含绿原酸200mg。
实施例8：用绿原酸制备片剂
1.绿原酸的提取：
本实施例中所使用的绿原酸，系由金银花中提取、纯化得到，纯度为99.17％。
2.绿原酸片剂的制备
2.1处方：
纯度为99.17％的绿原酸(主药) 100g
糖粉(填充剂) 100g
乳糖(填充剂) 200g
羟丙甲纤维素(粘合剂) 50g
硬脂酸镁(润滑剂) 50g
2.2制法：
本实施例采用制湿颗粒压片法制备绿原酸片剂。(1)按处方量取羟丙甲纤维素制成水溶液；(2)取处方量的绿原酸、糖粉和乳糖混合均匀后，加入羟丙甲纤维素水溶液，充分搅拌均匀后制成软材；(3)将制备好的软材按常规的湿法制粒的操作规程，过筛、干燥和整粒后得到大小均一的颗粒；(4)将制得的颗粒与硬脂酸镁混合均匀后压片，共制成1000片剂，每片含绿原酸100mg。
实施例9：用绿原酸制备胶囊剂
1.绿原酸的提取：
本实施例中所使用的绿原酸，系由杜仲叶中提取、纯化得到的，纯度为99.35％。
2.绿原酸胶囊剂的制备：
2.1处方：
纯度为99.35％的绿原酸 100g
糖粉 200g
2.2制法：
取处方量的绿原酸和淀粉，混合均匀，加入80％乙醇溶液制成软材，干燥，整粒后按照胶囊剂的常规制备工艺制备2000粒胶囊，每粒胶囊含绿原酸50mg。
实施例10：用绿原酸制备颗粒剂
1.绿原酸的提取
本实施例中所使用的绿原酸，系由杜仲叶中提取、纯化得到的，纯度为99.66％。
2.绿原酸颗粒剂的制备
2.1处方：
纯度为99.66％的绿原酸(主药) 200g
甘露醇(稀释剂) 100g
蔗糖(稀释剂) 400g
聚维酮K30(粘合剂) 适量
2.2制法：
取聚维酮K30，加入注射用水，制成溶液。取处方量的绿原酸、甘露醇和乳糖混合均匀之后，加入聚维酮K30溶液，制成软材。按照颗粒剂的常规制备工艺，对软材进行过筛、干燥和整粒之后，得到颗粒剂。在无菌条件下分装颗粒剂，制备400袋颗粒剂，每袋颗粒剂含绿原酸500mg。
实施例11：用绿原酸制备散剂
1.绿原酸的提取：本实施例所用的绿原酸原料药，系由牛蒡叶中提取、纯化得到的，纯度为98.97％。
2.绿原酸散剂的制备：
2.1处方
纯度为98.97％的绿原酸1000g；
2.2制法
取处方量绿原酸过筛后，按照散剂的常规制备工艺，无菌分装成含1000瓶/袋散剂，每瓶/袋散剂含绿原酸1000mg。

Claims (10)

1.一种绿原酸在制备治疗心肌病的药物中的用途。
2.如权利要求1所述的用途，其中所述心肌病优选为扩张型心肌病和肥厚型心肌病。
3.如权利要求1或2所述的用途，所述药物上调心肌特异性表达结构基因ACTC1及对应蛋白。
4.如权利要求1-3任一项所述的用途，所述药物下调caspase-3基因及对应蛋白。
5.如权利要求1-3任一项所述的用途，所述药物上调Bcl-2基因及对应蛋白。
6.一种用于治疗心肌病的药物，所述的药物包括绿原酸，药学上可接受的辅料或辅助性成分。
7.如权利要求6所述药物，所述的药物是口服制剂和注射制剂。
8.如权利要求7所述药物，,每单位制剂含绿原酸1-1000mg，临床使用剂量为1-100mg/kg。
9.一种治疗心肌病的联合用药物，所述联合用药物包括绿原酸和治疗心肌病的药物。
10.如权利要求9所述的联合用药物，其中治疗心肌病的药物选自心得安、氨酰心安、美托洛尔、比索洛尔、异搏定、硫氮卓酮、乙胺碘呋酮、双异丙比胺中的一种或几种。
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