CN110923244B - 烟草线粒体RNA编辑因子NtMEF1及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于烟草基因工程领域，具体涉及一个烟草线粒体RNA编辑因子NtMEF1及其应用专利申请。基因NtMEF1由2163个碱基组成，具体碱基序列如SEQ ID NO.1所示。烟草线粒体RNA编辑因子NtMEF1，由756个氨基酸残基组成，具体氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本申请中，发明人通过对特定线粒体RNA编辑因子NtMEF1的初步研究，发现其与烟草甘油酸物质含量高度相关，在将该基因沉默后，烟草中甘油酸物质含量发生了明显降低。基于这一特性，可为烟叶品质调控、烟草新品种培育奠定一定的应用基础和参考借鉴。

Description

烟草线粒体RNA编辑因子NtMEF1及其应用

技术领域

本发明属于烟草基因工程领域，具体涉及一个烟草线粒体RNA编辑因子NtMEF1及其应用专利申请。

背景技术

人们通常所吸食的烟草属双子叶植物纲管花目茄科烟草属植物，烟草属(Nicotiana) 有60 多个种，而用于制备吸食的主要为两个栽培种，分别为普通烟草(又称红花烟草，Nicotiana tabacum)和黄花烟草(Nicotiana rustica)，其中前者占据主要栽培面积。栽培烟草按烟叶品质特点、生物学性状和栽培调制方法等特点，可分为烤烟、晒烟、晾烟、白肋烟、香料烟和黄花烟六个类型，其中烤烟是我国栽培最广的普通烟草。

作为一种叶用经济作物，烤烟的栽培技术有别于其它大田作物，不仅要求有一定的烟叶产量，而且更注重烟叶品质。烟叶品质决定烟叶的可用性，直接影响卷烟商品的色、香、味和商品价值，也关系到烟农的经济效益，是烟草行业的生命和出发点。也因此，为满足国内外卷烟企业对优质烟叶不断增长的需求，必须不断提高烟叶品质和安全性。

有机酸是烟草化学组成中一个重要的组成部分。烟草中的有机酸主要是指除氨基酸以外的有机酸, 其种类繁多,含量差异大, 总含量一般为12%~16%，且大部分以与碱金属或有机碱合成盐或以酯类的形式存在。烟草中有机酸通常分为挥发酸、半挥发酸和非挥发酸。已有研究，普遍认为有机酸不仅在烟草生长发育过程中起着重要的作用,而且对烟叶和卷烟的质量有着重要的影响。一般而言，有机酸可以增加烟气酸性, 醇和烟气,并使烟味变得甜润舒适。尤其是挥发性有机酸, 尽管其含量很低（最多达0.1%~0.2%, 有的甚至只有0.01%~0.05%）, 但其对烟叶感官质量的影响却远远大于多元酸和高级脂肪酸。

总之，随着烟草基因工程深入，结合有机酸类物质组分对于烟叶品质的重要影响，对于与烟草中有机酸类物质相关编码基因的深入研究和开发，可为烟草品质调控奠定良好的技术基础。

发明内容

基于烟草甘油酸物质含量调控基因的研究，本发明目的在于提供一个烟草线粒体RNA编辑因子NtMEF1基因及其在烟草甘油酸物质含量调节方面的应用，从而为烟叶品质调节、烟草新品种培育奠定一定技术基础。

本申请所采取的技术方案详述如下。

烟草线粒体RNA编辑因子NtMEF1的编码基因NtMEF1，由2163个碱基组成，具体碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

所述编码基因NtMEF1在叶片甘油酸物质含量调控中的应用，利用基因沉默技术、或者基因超表达方法，通过调节烟草线粒体RNA编辑因子NtMEF1表达量，来调节控制烟叶中甘油酸物质含量情况。

所述编码基因NtMEF1的PCR扩增制备方法，包括如下步骤：

（1）提取（具体例如以烟草K326叶片为样品）基因组，并反转录为cDNA备用；

（2）设计PCR扩增用引物，并进行PCR扩增，具体引物序列设计如下：

NtMEF1-F：5’- GGAGATAATGGGGATTCTGC - 3’，

NtMEF1-R：5’- CTCAATACCACTGGAATGCG - 3’。

烟草线粒体RNA编辑因子NtMEF1，由756个氨基酸残基组成，具体氨基酸序列如SEQID NO.2所示。

所述线粒体RNA编辑因子NtMEF1在叶片甘油酸物质含量调控中的应用，该蛋白与植物叶片中甘油酸物质含量相关，降低该蛋白表达后，叶片中甘油酸物质含量明显降低。

利用所述编码基因NtMEF1的烟草新品种培育方法，通过转基因技术、瞬时表达技术或基因组编辑技术，构建含有NtMEF1基因的病毒诱导沉默载体、RNAi干涉载体、超表达载体或基因组编辑载体，转化烟草，筛选获得甘油酸含量变化的烟草新品种；

具体例如：利用病毒诱导的基因沉默（VIGS）的技术，干扰NtMEF1基因的表达使其沉默，NtMEF1基因沉默植株中甘油酸物质含量显著下降，进而获得甘油酸含量下降的植物新品种。

换言之，一种培育低甘油酸含量烟草新品种培育方法，利用病毒诱导的基因沉默（VIGS）的技术，干扰NtMEF1基因的表达使其沉默，NtMEF1基因沉默的新烟草品种植株中甘油酸物质含量显著下降。

一般而言，挥发性酸由于其挥发性在卷烟抽吸过程中可直接进入烟气, 对吃味和香气有良好的作用，因此作为挥发性的脂肪酸甘油酸对烟草的品质有重要影响。基于甘油酸的重要作用，对烟草甘油酸物质调控基因进行深入研究，利用基因工程构建新的烟草品种，可为改善烟草品种奠定良好应用基础。本申请中，发明人通过对特定线粒体RNA编辑因子NtMEF1的初步研究，发现其与烟草甘油酸物质含量高度相关，在将该基因沉默后，烟草中甘油酸物质含量发生了明显降低。基于这一特性，可为烟叶品质调控、烟草新品种培育奠定一定的应用基础和参考借鉴。

附图说明

图1 为与对照植株相比，NtMEF1基因沉默植株中该基因的相对表达量；

图2 为病毒诱导基因沉默的烟叶及对照烟叶中的甘油酸含量比较。

具体实施方式

下面结合实施例对本申请做进一步解释说明，在介绍具体实施例前，就下述实施例中具体实验背景资料情况简要介绍如下。

生物材料：

本氏烟草，一种常用烟草材料，下述实施例中烟草种植于郑州烟草院种植基地，育苗钵中育苗，待发芽后两周进行分苗，种于塑料钵（10cm×10cm）中，22℃、16h光/8h暗条件下进行日常肥水管理等；

下述实施例中所采用的VIGS载体是一种来自烟草脆裂病毒的病毒载体（tobaccorattle virus，TRV)， 所具体利用的TRV2（一种常用载体），其带有卡那筛选标记和35S启动子，同时TRV2带有EcoR I和BamH I等多克隆位点，可以用来携带和转化外源基因；

实验试剂：

LB液体培养基，1L含量中含有：10 g细菌蛋白胨（bacteriological peptone）；10g氯化钠（NaCl）；5 g酵母抽提物（yeast extract），高温高压灭菌；

YEB液体培养基，1L含量中含有：5g 牛肉浸膏（beef extract）；5 g细菌蛋白胨（bacteriological peptone）；5 g 蔗糖（sucrose）；1 g酵母抽提物（yeast extract）；2 mL1M硫酸镁（MgSO4），高温高压灭菌；

1M 2-(N-吗啉)乙磺酸（MES）储备液：ddH₂O溶解，过滤灭菌，-20℃储存备用；

200 mM乙酰丁香酮（Acetosyringone，As）储备液：二甲基亚砜（DSMO）溶解，-20℃储存备用。

实施例1

本实施例就烟草NtMEF1基因克隆及沉默载体的构建过程简要介绍如下。

（1）烟草NtMEF1基因克隆

根据前期对于烟草基因组及相关NtMEF1基因研究，选择特异编码序列为目标片段，设计PCR扩增用引物序列如下：

NtMEF1-F：5’- GGAGATAATGGGGATTCTGC - 3’，

NtMEF1-R：5’- CTCAATACCACTGGAATGCG - 3’；

以烟草K326叶片（先提取基因组，再反转录为cDNA）的cDNA为模板，进行PCR扩增获得NtMEF1基因；

PCR扩增程序为：95℃预变性3 min；95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸30s，34个循环后，72℃彻底延伸 5min；

对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，并回收电泳产物备用。

（2）构建重组TRV2-NtMEF1载体

将步骤（1）中的PCR扩增产物进行EcoRI、BamHI双酶切，同时对空载体TRV2进行EcoRI、BamHI双酶切，分别回收酶切产物，利用T4 DNA连接酶进行连接；

将连接产物转化大肠杆菌感受态DH5α，转化操作结束后将转化产物涂布在含50mg/L Kan的LB固体培养基上，37℃过培养夜；

挑选阳性单菌落扩增后进一步进行PCR鉴定， 并结合测序验证，确保获得构建正确的重组载体TRV2- NtMEF1。

需要说明的是，

烟草NtMEF1基因，包括2163个碱基，碱基序列如SEQ ID NO.1所示，具体碱基序列为：

ATGATTTTGGATAAAGCTTTGGACCCATTCAATCTTGACTTCAGAGAAGCACTTTCACTGATAAAAGAAGGTGAAAAGAAAGTGGAATCAGCTGCTTATGTTCCACTATTACAAGAATGTATCAAGAATAATTCAGTTTCAGAAGCTGAAGCAATTCATGCCCACATAATCAAAATGGGTATCCATGAGGACTTGTTTCTCATGACATTCTTAGTTAATGTGTATGCGAAATGTGGGACTATGGATTGTGCACGTAAGGTTTTCGATAATTTGCCTAAAAGAAATGTTGTTACCTGGACATCCTTGATGTCTGGCTATGTTCACAATGCACAGCCGGAGGTAGCTATTTCCGTGTTTCAGGAAATGTTGGAAGTTGGTGGATTTCCCACGAATTATACGTTAGGTGTTGCATTCAAAGCTTGCTCTTTGTTGGCTGATTTCGAGTTAGGAAAGCAGATTCATGGGTATGTGGTAAAATATGAAATTGAGGATGATACAAGTATTGGCAATGCTCTTTGTAGCTTGTATTGCAAAAGCGGTAATCTGGAATCTGCTGTTAAAGCATTTCGGAGGATTTCTGATAAGAATGTGATCTCTTGGACAACTGCTATATCTGCCTGCGGAGATAATGGGGATTCTGCAATGGGATTAAGCCTTTTTGTTGAGATGCTTTGCGCGAATGTGGAGGCTAATGAGTTCACATTGACAAGCGTAATGAGCATGTGTTGCATAATGCAGGCTCTAAAGATGGGATCACAAATTCATTCTTTGAGCATTAAACTAGGGTATGGTTCTAATTTACGAGTAATGAATTCAATTATGTACTTATACTTGAAAAATGGATGGATTATAGAGGCAAAAAAGCTGTTTGATGGAATGGAGACAATTAGTTTGGTTACATGGAATGCAATGATTGCAGGTCTAGCTCAAATGATGGATCTTGCCGAGGATGGTATCATCAATGCGCATTCCAGTGGTATTGAGGCGCTGAACACTTTTCTGAGACTGCATCGATCAGGGATGAAGCCTGATTTATTCACCTTCTCAAGTGTGTTAACTGTATGTAGTAGTTTGGTTGCTTTGGAACAAGGGGAGCAAATCCATGCTCAGGTTATTAAGTCCGGTTTTTTGTCTGATGTTGTAGTGGGAACTGCCCTAGTTAACATGTATAGTAAATGTGGAAGCATTGACAGGGCAAGTAAAATTTTTGTGGAGATGTCTACGCGAACTTTGATATCTTGGACATCTATGATTACTGCCTTCGCACAACATGGCTACTCTAAACAAGCATTACAGCTATTTGAGGATATGAGGTTCGTAGGAGCTAGACCAAACAAGGTTACATTTGTGGGCGTGCTCTCCGCATGTAGCCATGCTGGACTGGTTGAAGAGGCATTGGCATATTTTGACATGATGAAAAAAGAGTATAAAATTAAGCCCGTGATGGACCATTATGCATGCTTGATTGATATGTTTGTGAGGTTAGGTAGGATAGATGAAGCTTTTGACTTCGTAAAGAAGATGGATTTTGAGCCTAATGAATTTATATGGTCACTTTTAATAGCGGGCTGTAGAAGCCATGGGAAATCAGAGCTCGGCTTTTATGCTGCTGAACAACTACTAAACCTGAATCCGAAAAATTCAGAGGCTTACTTCTTGTTGTTAAACATGTACCTCTCAACGGAGAGATGGAAGGATGTTTCCAAGGTGAGAAAGTTAATGAAAGATGAAAAAATTGGAAAGCTAAAGGATTGGAGCTGGATCAGCATCAGGGACAAAGTTCATTCATTTAGAACAGGTGATCGGTTGAATCCTCCATATGAAAATATAGACAATTTCTTAAGGGATTTGGATGACAAAGCAAGTACTATGGGATTTGAGTTACAGACAACATTGGAGCTGCGAACTGAAGAAGATGATGAAGCAGCTTTTCCTAGAGGTCGACACGGTGAGAAGTTGGCTGTTGCGTTTGGATTGCTGAGCACACCAAGTGCTGCACCCATCCGAGTTATTAAGAGTATTAGCATGTGTAGAGATTGTCACAGCTTTATGAAATTCATCTCACAGCTAACTTCAAGAAAAATCCTCATTAGAGATAGTAAAAGGCTGCACAAATTTGTAAATGGACATTGTTCTTGTGGTGATTTTGGTAGTCTTGTTTAA。

烟草线粒体RNA编辑因子NtMEF1，包括756个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体氨基酸序列为：

MAFLPSVIVGSTLKLEPDFKKPTLASLPLEKRNHSPMILDKALDPFNLDFREALSLIKEGEKKVESAAYVPLLQECIKNNSVSEAEAIHAHIIKMGIHEDLFLMTFLVNVYAKCGTMDCARKVFDNLPKRNVVTWTSLMSGYVHNAQPEVAISVFQEMLEVGGFPTNYTLGVAFKACSLLADFELGKQIHGYVVKYEIEDDTSIGNALCSLYCKSGNLESAVKAFRRISDKNVISWTTAISACGDNGDSAMGLSLFVEMLCANVEANEFTLTSVMSMCCIMQALKMGSQIHSLSIKLGYGSNLRVMNSIMYLYLKNGWIIEAKKLFDGMETISLVTWNAMIAGLAQMMDLAEDGIINAHSSGIEALNTFLRLHRSGMKPDLFTFSSVLTVCSSLVALEQGEQIHAQVIKSGFLSDVVVGTALVNMYSKCGSIDRASKIFVEMSTRTLISWTSMITAFAQHGYSKQALQLFEDMRFVGARPNKVTFVGVLSACSHAGLVEEALAYFDMMKKEYKIKPVMDHYACLIDMFVRLGRIDEAFDFVKKMDFEPNEFIWSLLIAGCRSHGKSELGFYAAEQLLNLNPKNSEAYFLLLNMYLSTERWKDVSKVRKLMKDEKIGKLKDWSWISIRDKVHSFRTGDRLNPPYENIDNFLRDLDDKASTMGFELQTTLELRTEEDDEAAFPRGRHGEKLAVAFGLLSTPSAAPIRVIKSISMCRDCHSFMKFISQLTSRKILIRDSKRLHKFVNGHCSCGDFGSLV。

实施例2

在实施例1基础上，利用农杆菌介导的VIGS技术，发明人进一步将所构建的重组TRV2- NtMEF1载体转化了烟草植株，并就相关植物表型变化情况做了验证分析，具体实验过程简介如下。

（1）转化农杆菌

需要说明的是，参考实施例1操作及现有技术，发明人同时制备了TRV2-GFP重组载体作为对照，具体转化过程为：

将TRV2-GFP（载体对照）及TRV2- NtMEF1的阳性克隆质粒，分别通过电击转化方式转化进入农杆菌GV3101感受态细胞中，利用含50mg/L Kan 和50mg/L Rif的YEB平板进行培养筛选，在28℃倒置培养2d后，利用菌落PCR筛选带有目的基因的农杆菌。

（2）制备转染用菌液

将步骤（1）中筛选所得阳性农杆菌克隆在5 mL的YEB液体培养基（含50 mg/L Kan和50 mg/L Rif）中，28℃、250 rpm条件下培养过夜；

取50uL 过夜培养物接种至50 mL的YEB液体培养基（含50 mg/L Kan）中，培养至OD₆₀₀ =1.0 ~ 1.5左右，然后4000g 离心5 min，收集菌体，再用MMA重悬，调节OD₆₀₀ =1.0 左右；

最后室温放置3 h左右后，作为转染用菌液。

（3）瞬时转化

以3~4 w（周）苗龄的本氏烟草叶片为实验材料，利用1 mL规格注射器，将步骤（2）中所制备转染用菌液注射至烟草叶片中，注射后的烟草继续在人工培养箱内培养，观察表型变化。

进一步通过qRT-PCR对NtMEF1基因表达情况进行了检测，结果如图1所示，可以看出，TRV2- NtMEF1的侵染植株中，NtMEF1的表达量显著降低。

进一步地，发明人对实验组（TRV2- NtMEF1浸染植株）和对照组（TRV2-GFP浸染植株）中的植物甘油酸含量情况进行了检测（检测方法参照《基于气质和液质联用技术的烟草鲜烟叶代谢组学分析流程》（郑庆霞等，烟草科技，2019）），结果如图2所示。

从图2结果可以看出，实验组中甘油酸含量与对照组相比均有显著下降，下降百分比为54.75%左右。这进一步表明，通过沉默NtMEF1基因，可对烟草叶片中植物甘油酸的含量进行调控，进而可为烟叶品质调控、烟草新品种培育奠定一定技术基础。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国烟草总公司郑州烟草研究院

<120> 烟草线粒体RNA编辑因子NtMEF1及其应用

<130> none

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2163

<212> DNA

<213> Nicotiana tabacum

<400> 1

atgattttgg ataaagcttt ggacccattc aatcttgact tcagagaagc actttcactg 60

ataaaagaag gtgaaaagaa agtggaatca gctgcttatg ttccactatt acaagaatgt 120

atcaagaata attcagtttc agaagctgaa gcaattcatg cccacataat caaaatgggt 180

atccatgagg acttgtttct catgacattc ttagttaatg tgtatgcgaa atgtgggact 240

atggattgtg cacgtaaggt tttcgataat ttgcctaaaa gaaatgttgt tacctggaca 300

tccttgatgt ctggctatgt tcacaatgca cagccggagg tagctatttc cgtgtttcag 360

gaaatgttgg aagttggtgg atttcccacg aattatacgt taggtgttgc attcaaagct 420

tgctctttgt tggctgattt cgagttagga aagcagattc atgggtatgt ggtaaaatat 480

gaaattgagg atgatacaag tattggcaat gctctttgta gcttgtattg caaaagcggt 540

aatctggaat ctgctgttaa agcatttcgg aggatttctg ataagaatgt gatctcttgg 600

acaactgcta tatctgcctg cggagataat ggggattctg caatgggatt aagccttttt 660

gttgagatgc tttgcgcgaa tgtggaggct aatgagttca cattgacaag cgtaatgagc 720

atgtgttgca taatgcaggc tctaaagatg ggatcacaaa ttcattcttt gagcattaaa 780

ctagggtatg gttctaattt acgagtaatg aattcaatta tgtacttata cttgaaaaat 840

ggatggatta tagaggcaaa aaagctgttt gatggaatgg agacaattag tttggttaca 900

tggaatgcaa tgattgcagg tctagctcaa atgatggatc ttgccgagga tggtatcatc 960

aatgcgcatt ccagtggtat tgaggcgctg aacacttttc tgagactgca tcgatcaggg 1020

atgaagcctg atttattcac cttctcaagt gtgttaactg tatgtagtag tttggttgct 1080

ttggaacaag gggagcaaat ccatgctcag gttattaagt ccggtttttt gtctgatgtt 1140

gtagtgggaa ctgccctagt taacatgtat agtaaatgtg gaagcattga cagggcaagt 1200

aaaatttttg tggagatgtc tacgcgaact ttgatatctt ggacatctat gattactgcc 1260

ttcgcacaac atggctactc taaacaagca ttacagctat ttgaggatat gaggttcgta 1320

ggagctagac caaacaaggt tacatttgtg ggcgtgctct ccgcatgtag ccatgctgga 1380

ctggttgaag aggcattggc atattttgac atgatgaaaa aagagtataa aattaagccc 1440

gtgatggacc attatgcatg cttgattgat atgtttgtga ggttaggtag gatagatgaa 1500

gcttttgact tcgtaaagaa gatggatttt gagcctaatg aatttatatg gtcactttta 1560

atagcgggct gtagaagcca tgggaaatca gagctcggct tttatgctgc tgaacaacta 1620

ctaaacctga atccgaaaaa ttcagaggct tacttcttgt tgttaaacat gtacctctca 1680

acggagagat ggaaggatgt ttccaaggtg agaaagttaa tgaaagatga aaaaattgga 1740

aagctaaagg attggagctg gatcagcatc agggacaaag ttcattcatt tagaacaggt 1800

gatcggttga atcctccata tgaaaatata gacaatttct taagggattt ggatgacaaa 1860

gcaagtacta tgggatttga gttacagaca acattggagc tgcgaactga agaagatgat 1920

gaagcagctt ttcctagagg tcgacacggt gagaagttgg ctgttgcgtt tggattgctg 1980

agcacaccaa gtgctgcacc catccgagtt attaagagta ttagcatgtg tagagattgt 2040

cacagcttta tgaaattcat ctcacagcta acttcaagaa aaatcctcat tagagatagt 2100

aaaaggctgc acaaatttgt aaatggacat tgttcttgtg gtgattttgg tagtcttgtt 2160

taa 2163

<210> 2

<211> 756

<212> PRT

<213> Nicotiana tabacum

<400> 2

Met Ala Phe Leu Pro Ser Val Ile Val Gly Ser Thr Leu Lys Leu Glu

1 5 10 15

Pro Asp Phe Lys Lys Pro Thr Leu Ala Ser Leu Pro Leu Glu Lys Arg

20 25 30

Asn His Ser Pro Met Ile Leu Asp Lys Ala Leu Asp Pro Phe Asn Leu

35 40 45

Asp Phe Arg Glu Ala Leu Ser Leu Ile Lys Glu Gly Glu Lys Lys Val

50 55 60

Glu Ser Ala Ala Tyr Val Pro Leu Leu Gln Glu Cys Ile Lys Asn Asn

65 70 75 80

Ser Val Ser Glu Ala Glu Ala Ile His Ala His Ile Ile Lys Met Gly

85 90 95

Ile His Glu Asp Leu Phe Leu Met Thr Phe Leu Val Asn Val Tyr Ala

100 105 110

Lys Cys Gly Thr Met Asp Cys Ala Arg Lys Val Phe Asp Asn Leu Pro

115 120 125

Lys Arg Asn Val Val Thr Trp Thr Ser Leu Met Ser Gly Tyr Val His

130 135 140

Asn Ala Gln Pro Glu Val Ala Ile Ser Val Phe Gln Glu Met Leu Glu

145 150 155 160

Val Gly Gly Phe Pro Thr Asn Tyr Thr Leu Gly Val Ala Phe Lys Ala

165 170 175

Cys Ser Leu Leu Ala Asp Phe Glu Leu Gly Lys Gln Ile His Gly Tyr

180 185 190

Val Val Lys Tyr Glu Ile Glu Asp Asp Thr Ser Ile Gly Asn Ala Leu

195 200 205

Cys Ser Leu Tyr Cys Lys Ser Gly Asn Leu Glu Ser Ala Val Lys Ala

210 215 220

Phe Arg Arg Ile Ser Asp Lys Asn Val Ile Ser Trp Thr Thr Ala Ile

225 230 235 240

Ser Ala Cys Gly Asp Asn Gly Asp Ser Ala Met Gly Leu Ser Leu Phe

245 250 255

Val Glu Met Leu Cys Ala Asn Val Glu Ala Asn Glu Phe Thr Leu Thr

260 265 270

Ser Val Met Ser Met Cys Cys Ile Met Gln Ala Leu Lys Met Gly Ser

275 280 285

Gln Ile His Ser Leu Ser Ile Lys Leu Gly Tyr Gly Ser Asn Leu Arg

290 295 300

Val Met Asn Ser Ile Met Tyr Leu Tyr Leu Lys Asn Gly Trp Ile Ile

305 310 315 320

Glu Ala Lys Lys Leu Phe Asp Gly Met Glu Thr Ile Ser Leu Val Thr

325 330 335

Trp Asn Ala Met Ile Ala Gly Leu Ala Gln Met Met Asp Leu Ala Glu

340 345 350

Asp Gly Ile Ile Asn Ala His Ser Ser Gly Ile Glu Ala Leu Asn Thr

355 360 365

Phe Leu Arg Leu His Arg Ser Gly Met Lys Pro Asp Leu Phe Thr Phe

370 375 380

Ser Ser Val Leu Thr Val Cys Ser Ser Leu Val Ala Leu Glu Gln Gly

385 390 395 400

Glu Gln Ile His Ala Gln Val Ile Lys Ser Gly Phe Leu Ser Asp Val

405 410 415

Val Val Gly Thr Ala Leu Val Asn Met Tyr Ser Lys Cys Gly Ser Ile

420 425 430

Asp Arg Ala Ser Lys Ile Phe Val Glu Met Ser Thr Arg Thr Leu Ile

435 440 445

Ser Trp Thr Ser Met Ile Thr Ala Phe Ala Gln His Gly Tyr Ser Lys

450 455 460

Gln Ala Leu Gln Leu Phe Glu Asp Met Arg Phe Val Gly Ala Arg Pro

465 470 475 480

Asn Lys Val Thr Phe Val Gly Val Leu Ser Ala Cys Ser His Ala Gly

485 490 495

Leu Val Glu Glu Ala Leu Ala Tyr Phe Asp Met Met Lys Lys Glu Tyr

500 505 510

Lys Ile Lys Pro Val Met Asp His Tyr Ala Cys Leu Ile Asp Met Phe

515 520 525

Val Arg Leu Gly Arg Ile Asp Glu Ala Phe Asp Phe Val Lys Lys Met

530 535 540

Asp Phe Glu Pro Asn Glu Phe Ile Trp Ser Leu Leu Ile Ala Gly Cys

545 550 555 560

Arg Ser His Gly Lys Ser Glu Leu Gly Phe Tyr Ala Ala Glu Gln Leu

565 570 575

Leu Asn Leu Asn Pro Lys Asn Ser Glu Ala Tyr Phe Leu Leu Leu Asn

580 585 590

Met Tyr Leu Ser Thr Glu Arg Trp Lys Asp Val Ser Lys Val Arg Lys

595 600 605

Leu Met Lys Asp Glu Lys Ile Gly Lys Leu Lys Asp Trp Ser Trp Ile

610 615 620

Ser Ile Arg Asp Lys Val His Ser Phe Arg Thr Gly Asp Arg Leu Asn

625 630 635 640

Pro Pro Tyr Glu Asn Ile Asp Asn Phe Leu Arg Asp Leu Asp Asp Lys

645 650 655

Ala Ser Thr Met Gly Phe Glu Leu Gln Thr Thr Leu Glu Leu Arg Thr

660 665 670

Glu Glu Asp Asp Glu Ala Ala Phe Pro Arg Gly Arg His Gly Glu Lys

675 680 685

Leu Ala Val Ala Phe Gly Leu Leu Ser Thr Pro Ser Ala Ala Pro Ile

690 695 700

Arg Val Ile Lys Ser Ile Ser Met Cys Arg Asp Cys His Ser Phe Met

705 710 715 720

Lys Phe Ile Ser Gln Leu Thr Ser Arg Lys Ile Leu Ile Arg Asp Ser

725 730 735

Lys Arg Leu His Lys Phe Val Asn Gly His Cys Ser Cys Gly Asp Phe

740 745 750

Gly Ser Leu Val

755

Claims (4)

1.烟草线粒体RNA编辑因子NtMEF1的编码基因NtMEF1在烟叶甘油酸含量调控中的应用，其特征在于，所述调控是利用基因沉默技术，通过下调编码基因NtMEF1表达量，来下调烟叶中甘油酸含量；

所述烟草线粒体RNA编辑因子NtMEF1的编码基因NtMEF1，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

2.烟草线粒体RNA编辑因子NtMEF1在烟叶甘油酸含量调控中的应用，其特征在于，烟草线粒体RNA编辑因子NtMEF1与烟叶中甘油酸物质含量相关，所述调控是降低烟草线粒体RNA编辑因子NtMEF1表达后，烟叶中甘油酸含量明显降低；

所述烟草线粒体RNA编辑因子NtMEF1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.利用烟草线粒体RNA编辑因子NtMEF1的编码基因NtMEF1的烟草品种培育方法，其特征在于，通过转基因技术，构建含有编码基因NtMEF1的病毒诱导沉默载体，转化烟草，筛选获得甘油酸含量下调的烟草品种；

所述烟草线粒体RNA编辑因子NtMEF1的编码基因NtMEF1，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

4.如权利要求3所述烟草品种培育方法，其特征在于，构建含有编码基因NtMEF1的病毒诱导沉默载体过程中，PCR扩增获得编码基因NtMEF1时，通过如下步骤制备获得：

（1）提取基因组，并反转录为cDNA备用；

提取基因组时，以烟草K326叶片为样品；

（2）设计PCR扩增用引物，并进行PCR扩增，具体引物序列设计如下：

NtMEF1-F：5’- GGAGATAATGGGGATTCTGC - 3’，

NtMEF1-R：5’- CTCAATACCACTGGAATGCG - 3’。

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