CN110484544A

CN110484544A - 烟草基因lbm1、其筛选方法及在调控植物表皮毛发育方面的应用

Info

Publication number: CN110484544A
Application number: CN201910820109.2A
Authority: CN
Inventors: 吴拥军; 包峻州; 曹宁
Original assignee: Guizhou University
Current assignee: Guizhou University
Priority date: 2019-08-31
Filing date: 2019-08-31
Publication date: 2019-11-22

Abstract

本发明公开了一种烟草基LBM1、其筛选方法及在调控植物表皮毛发育方面的应用，该基因具有AB028649.1所示的核苷酸序列和氨基酸序列，烟草基因LBM1在调控植物表皮毛发育方面的应用。本发明能调控植物表皮的发育，且能快速、高效地实现植物表皮毛数量增加。

Description

烟草基因LBM1、其筛选方法及在调控植物表皮毛发育方面的应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，主要是涉及一种烟草基因LBM1，同时还涉及该烟草基因LBM1的筛选方法，以及该烟草基因LBM1在调控植物表皮毛发育方面的应用。

背景技术

表皮毛是由植物表皮细胞发育的突出植物表皮的多细胞结构，也被称为毛被，作为植物组织表面的表皮毛，它通过增加植物表皮层的厚度来减少水分散失以及调节植物表面的温度，同时可以保护植物防止机械损伤和昆虫等植物的侵害等。植物腺毛对植物抗逆境胁迫、植物病虫害防御等起重要作用。根据表皮毛是否有分泌腺，将表皮毛分为分泌腺型和非分泌腺型。非分泌型腺毛为植物保护毛，构成植物的第一道防线；分泌型腺毛通过分泌挥发性的萜类等来抵御病虫害。

烟草的烟叶腺毛和拟南芥的表皮毛有其特殊价值。烟草烟叶腺毛主要产生代谢分泌物，这些代谢分泌物能够影响植物本身的生长。其中萜类代谢途径是分泌型腺毛最活跃的代谢途径之一，烟叶分泌的萜类化合物不仅能提升烟草的商业价值，同时也能形成其特殊的化学防御体系。拟南芥的表皮毛是典型的特化无腺体的单细胞表皮毛，分布于整个叶片、茎和花瓣上。拟南芥表皮毛作为一种特化的、典型的单细胞结构，可作为一种很好的模式系统来研究细胞周期调控、细胞极性以及细胞增大等细胞分化方面的问题。

拟南芥已成为全球应用最广泛的模式植物，被誉为“植物中的果蝇”，其植株较小，生长周期短，结实多且易于转化。植物进化发育出表皮毛不仅可以适应不利生长的环境，还具有特殊的经济价值。

目前调控植物表皮毛生长发育的方法，主要是通过喷洒或注射植物激素来提高植物表皮毛的数量。但植物激素调控植物表皮毛发育效率低、成本高、不稳定且不能形成遗传稳定，导致每一次都需要喷洒或注射，后续工作繁琐，还会影响植物自身的生理发育过程，比如植物叶片提前脱落，果实早熟等情况。利用基因工程手段调控植物表皮毛发育具有以下优点：效率高、经济能够形成遗传稳定性。

发明内容

本发明的目的在于对植物抗逆境胁迫、植物病虫害防御而提供的一种能调控植物表皮的发育，且能快速、高效地实现植物表皮毛数量增加的烟草基因LBM1。

本发明的另一个目的在于提供该烟草基因LBM1的筛选方法。

本发明的再一个目的是提供该烟草基因LBM1在调控植物表皮毛发育方面的应用。

本发明的烟草基因LBM1，具有AB028649.1所示的核苷酸序列：ATTTCTTGAAGAAAAGAGAGCACTGAAAAAGAGCTAAAACTTTCTGTTCAAAAACACATCCAAAAGAAACAGTACACTTCTGAAGAATAAAACCAAGTGATTAAAGAGTCATTTGTTCACAAATCAAGATTAGCAAGTGATTAAAGCAAAAATGGTGAGAGCTCCTTGTTGTGAGAAGATGGGGTTGAAAAAAGGACCATGGACTCCTGAAGAAGATCAAATTCTTGTTTCTTATATTCAAACAAATGGCCATGGCAATTGGAGAGCCCTCCCTAAACTAGCTGGACTTTTGAGATGTGGGAAGAGTTGCAGATTGCGTTGGACTAACTATTTGCGTCCAGATATAAAGAGGGGAAACTTTACTAGAGAAGAAGAAGACTCCATTATTCAGTTACATGAAATGCTTGGCAATAGATGGTCTGCAATAGCAGCGAGATTACCGGGACGAACGGACAATGAAATTAAAAATGTATGGCACACCCACTTGAAAAAGAGGCTTAAAAATTACCAGCCTCCTCAAAACTCCAAAAGACACTCCAAAAACAACCTTGATTCCAAAGCTCCTAGTACTTCTCAAACCTTCAATAATTCAGACAATTTTAGCAATATCCAAGAAGATATTAATGGGCCCGTGACCGGCCCGAACTCGCCACAACGATCGTCTAGTGAGATGTCGACTGTCACGGTTGATTCAACAGCCATGACGACCATCACAATCGATGATCAGAATATGTTTAAGCAATTAGATGAGATGGACTCGTCTGAAAATTTTATTCCAGAGATTGATGAGAGTTTTTGGACGGATGATTTATCCACAAGCGATAACTCGACTTTTGGTATGGAGGGTACCGGTGGAGAATTACAAGTCCAATTTCCATTTTCTTCGGTGAAGCAAGAAAGTATGGACATGGTTGGAGCAAAATTAGAGGACGACATGGACTTTTGGTACAATGTTTTCATAAAGTCCGGGGACTTACTAGATTTACCGGAATTTTGAGTGGTCAATTTGATTGTAATACAAAACTTGAAGTAGTGGAATGCCAGCTAATTATTGGGAGTCAACAAGTTTGAAACTTCATGTTTGTTTATTGACCTTTACCTCTTGATAGGACCACCAAATACTACAAGTTGATACTTTCTTTTTTTTAGTTAGGATAATCTTTTTCTTTTCTTTTCTTTTTCCTACTTTTTTTCCTGTCTTTATTTTAACCCTTTTAGTTAGTTTAATTGGGAGAAAGCATATAGTGGATGGTGATATGAAAAAAGAAAGATTATGATGGAATAATTATTAGTAATATTAATTAGGATTAGGAAAAAAAAGATTTTAGAGAAAAGACTTCAAGAAACTCTAGTCAACATCCTCCTAACTTAGCTTAATTGTATGTGAATTACCTCTTTTGTAACATGACATTACCCAAAAAGAATAAAAATGTTTTCATTTAAAAAAAAAAAAAAAAAA

具有AB028649.1所示的氨基酸序列：

MVRAPCCEKMGLKKGPWTPEEDQILVSYIQTNGHGNWRALPKLAGLLRCGKSCRLRWTNYLRPDIKRGNFTREEEDSIIQLHEMLGNRWSAIAARLPGRTDNEIKNVWHTHLKKRLKNYQPPQNSKRHSKNNLDSKAPSTSQTFNNSDNFSNIQEDINGPVTGPNSPQRSSSEMSTVTVDSTAMTTITIDDQNMFKQLDEMDSSENFIPEIDESFWTDDLSTSDNSTFGMEGTGGELQVQFPFSSVKQESMDMVGAKLEDDMDFWYNVFIKSGDLLDLPEF

本发明的烟草基因LBM1筛选方法，包括以下步骤：

(1)烟草基因LBM1的克隆

采用天根公司的RNAprep Pure Plant Kit植物总RNA提取试剂盒，对烟草(Nicotiana tabacum cv.Xanthin)提取烟草植物总RNA，可将其作为模板进行目的基因的反转录扩增。分别利用AB028649.1的LBM1克隆正向引物5'-ATGGTGAGAGCTCCTTGTTG-3'和LBM1克隆反向引物5'-TCAAAATTCCGGTAAATCTAG-3'通过RT-PCR的方法从烟草中扩增目的基因；

RT-PCR反应程序为:50℃ 30min，94℃ 2min，94℃ 30S,55-65℃ 30S，72℃ 1min/kb，72℃ 10min,4℃∞，30个循环；

LBM1克隆载体的获得：将扩增获得的PCR产物直接按照TA克隆方法克隆到如图1所示的克隆中间载体:pGEM–T上；在T4 DNA连接酶的作用下，将PCR产物与T载体充分混匀，于16℃水浴反应连接过夜；将连接产物转化到大肠杆菌DH5α，并在其中扩繁，随后进行菌落PCR和质粒PCR筛选阳性克隆，并测序；

(2)植物过表达载体构建和遗传转化拟南芥

目的DNA片段的酶切引物扩增：

根据目的基因的酶切位点分析结果，pSH737所含的酶切位点以及内切酶之间的双酶切活性等方面综合考虑，分别利用Xba I和Sma I进行对双酶切，合成两端添加酶切位点的引物；根据pSH737所含的酶切位点设计LBM1上游引物序列为5'-GCTCTAGAATGGTGAGAGCTCCTTGTTG-3'，下游引物序列为5'-TCCCCCGGGTTATCAAAATTCCGGTAAATC-3'；以测序正确的TA克隆重组质粒为模板，进行酶切引物扩增，扩增产物通过1.2％琼脂糖凝胶电泳进行检测，同时回收纯化，经核酸分析仪分析检测浓度；

对酶切引物扩增产物和pSH737进行双酶切，37℃恒温水浴酶切反应1.5h，酶切完成，对产物进行电泳检测并切胶回收目的片段；表达载体和外源DNA的双酶切产物会形成线性互补的粘性末端，在T4连接酶的作用下，粘性末端互补配对，连接成为一个新的核酸分子，即为重组表达载体，于恒温水浴16℃连接过夜；将连接产物转化到农杆菌LBA4404，并在其中扩增，由于pSH737带有Kan抗性基因，选择Kan LB进行抗性筛选，然后进行菌落PCR验证其为阳性重组菌落，提取质粒并进行质粒PCR验证，并测序，成功转入E.coli DH5α，成功得到pSH737-LBM1。

本发明的烟草基因LBM1在调控植物表皮毛发育方面的应用。

本发明与现有技术相比，具有明显的有益效果，从以上技术方案可知：本发明从烟草(Nicotiana tabacum cv.Xanthin)品种中通过提取野生型烟草总RNA，采用Agilent公司的烟草表达谱4*44K芯片，检测烟草全基因表达谱，根据芯片结果对基因的功能注释，结合KEGG、GO分析，筛选出1个与腺毛发育的关键基因：LBM1，其表达载体为pSH737。将LBM1构建到表达载体pSH737上后，在农杆菌LBA4404中扩繁。通过蘸花遗传转化法，将pSH737-LBM1携带的LBM1转入植株中，获得转化植株。结果显示，转烟草基因LBM1的表皮毛密度较野生型拟南芥平均高出一倍，表明烟草基因LBM1能够直接或间接地正调控拟南芥表皮毛的发育。其GUS染色结果也表明烟草基因LBM1在拟南芥表皮毛能够启动表达。因此，烟草基因LBM1及其编码蛋白可以调控植物表皮毛的发育，且能快速、高效地实现植物表皮毛数量的增加，从而提高植物表皮毛的利用价值以及其对外界环境的抗逆性和抗虫性。

附图说明

图1为LBM1的RT-PCR扩增图。

图2为克隆中间载体pGEM-T的结构示意图。

图3为菌落PCR鉴定图。

图4质粒PCR鉴定。

图5为烟草总RNA凝胶电泳图。

图6为植物表达载体pSH737的结构示意图。

图7为DH5α重组菌落PCR验证图。

图8为DH5α质粒PCR验证图。

图9为转LBM1拟南芥抗性植株的基因组PCR鉴定图。

图10为转LBM1拟南芥GUS染色图。

图11为转LBM1拟南芥和野生型的表皮毛密度图。

具体实施方式

实施例1

烟草基因LBM1筛选方法，包括以下步骤：

(1)烟草基因LBM1的筛选

从烟草(Nicotiana tabacum cv.Xanthin)品种中通过提取野生型烟草总RNA，采用Agilent公司的烟草表达谱4*44K芯片，检测烟草全基因表达谱，根据芯片结果对基因的功能注释，结合KEGG、GO分析，筛选出1个与腺毛发育相关的关键基因：LBM1

(2)烟草基因LBM1的克隆

分别利用AB028649.1的LBM1克隆正向引物5'-ATGGTGAGAGCTCCTTGTTG-3'和LBM1克隆反向引物5'-TCAAAATTCCGGTAAATCTAG-3'通过RT-PCR的方法从烟草中扩增目的基因，结果如图1所示；

LBM1克隆载体的获得：将扩增获得的PCR产物直接按照TA克隆方法克隆到如图2所示的克隆中间载体:pGEM-T上；在T4 DNA连接酶的作用下，将PCR产物与T载体充分混匀，于16℃连接过夜；将连接产物转化到大肠杆菌DH5α，并在其中扩增，随后进行菌落PCR和质粒PCR筛选阳性克隆，并测序；重组子菌落PCR与质粒PCR验证结果如图3与图4所示，LBM1菌落PCR在约850bp处出现特异性条带，结果都与RT-PCR扩增目的DNA片断条带大小相符，即获得了阳性重组菌落；将阳性重组菌落按1％接种到液体培养基中培养，提取质粒，进行质粒PCR验证，获得一条大小符合的质粒PCR条带，与RT-PCR和菌落PCR结果一致，证明目的基因已连接到pGEM–T质粒上并已转化成功，将提取的质粒送往生物公司测序；

(3)烟草基因LBM1的植物表达载体的构建及遗传转化

目的DNA片段的酶切引物扩增。根据目的基因的酶切位点分析结果、pSH737所含的酶切位点以及内切酶之间的双酶切活性等方面综合考虑，分别利用Xba I和Sma I进行对双酶切，合成两端添加酶切位点的引物。根据pSH737所含的酶切位点设计LBM1上游引物序列为5'-GCTCTAGAATGGTGAGAGCTCCTTGTTG-3'，下游引物序列为5'-TCCCCCGGGTTATCAAAATTCCGGTAAATC-3'；以测序正确的TA克隆重组质粒为模板，酶切引物扩增，扩增产物通过1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，同时回收纯化，经核酸分析仪分析检测浓度；对酶切引物扩增产物和pSH737进行双酶切，37℃恒温水浴酶切反应1.5h，酶切完成对产物进行电泳检测并切胶回收目的片段如图5；表达载体和外源DNA的双酶切产物会形成线性互补的粘性末端，在T4连接酶的作用下，粘性末端互补配对，连接成为一个新的核酸分子，即为重组表达载体，于恒温水浴16℃连接过夜；将连接产物转化到农杆菌LBA4404，并在其中扩增，由于pSH737带有Kan抗性基因，选择Kan LB进行抗性筛选，然后进行菌落PCR验证其为阳性重组菌落，提取质粒并进行质粒PCR验证，并测序；植物表达载体pSH737的结构示意图如图6；对重组质粒转化E.coli DH5α的结果进行菌落PCR验证，以Kan 100mg/L平板培养获得的阳性单菌落进行菌落PCR，结果都扩增出了符合预期大小的特异性条带(图7)；对菌落PCR验证结果为阳性的重组子提取质粒进行质粒PCR，其结果与菌落PCR结果一致，均特异性扩增得到了符合预期大小的目的片段(图8)，表明目的片段已连接到表达载体上，并成功转化到E.coli DH5α。

将LBM1构建在pSH737-IspH上，用于在植物中过表达，研究其功能。拟南芥的遗传转化方法采用蘸花法进行。植物中的筛选标记为Kan和Rif，从而获得烟草基因LBM1的转化植株。

试验例1：烟草基因LBM1在调控植物表皮毛发育方面的应用

(1)抗性植株的筛选和鉴定

转化野生型拟南芥获得的种子经Kan 100mg/L的抗性筛选1/2MS培养基筛选，抗性植株在筛选平板上能够正常生长，可以明显区别于白化的非抗性幼苗。待长到开花期后利用植物基因组提取试剂盒提取随机挑选的LBM1抗性植株基生叶基因组DNA，并进行PCR验证及GUS组织化学染色鉴定。植物的表达载体pSH737的GUS报告基因位于35S启动子后，如果外源基因在拟南芥中表达，则会激活报告基因，所以使用GUS染色验证拟南芥抗性植株是否为转基因植株。剪取抗性拟南芥植株基生叶进行GUS染色：将叶片和GUS染色液置于PCR管中，37℃恒温培养箱避光培养12h，依次用75％乙醇溶液、95％乙醇和无水乙醇相继脱色处理并在体视镜下观察染色情况。转化野生型拟南芥获得的种子经kan 100mg/L的抗性筛选1/2MS培养基筛选，抗性植株在筛选平板上能够正常生长，可以明显区别于白化的非抗性幼苗，筛选出了超过200株的抗性幼苗，经统计转化率大于10％，但由于空间制约随机各选取40株进行移栽培养，LBM1存活35株，待长到开花期后随机挑选LBM1抗性植株10株剪取基生叶提取基因组DNA进行PCR验证及GUS染色鉴定，基因组PCR特意性扩增出了符合预期大小的条带(图9)，GUS染色表明叶片GUS报告基因能够启动表达(图10)，两者鉴定结果均为阳性，LBM1已经成功转入到拟南芥中。

同一时期转LBM1植株长势较野生型稍好，叶片较厚，叶面积要明显大于野生型的植株，并且叶脉颜色较深。对转LBM1拟南芥的基生叶进行GUS染色，叶片的表皮毛细胞能被着色，表皮毛基部的表皮细胞也能被着色，这表明该基因在拟南芥的表皮毛能启动表达。

(2)转LBM1拟南芥和野生型拟南芥表皮毛数量差异比较

在体式显微镜低倍镜下对比表皮毛性状差异。选取开花期(10周)野生型拟南芥和转LBM1拟南芥基生叶各10片，在体式显微镜1*2放大倍数下，随机抽取8个视野(实际面积170mm2)进行表皮毛数量统计并绘制图表(如图11)。发现转LBM1拟南芥表皮毛在叶片上的分布与野生型大致相同，没有成簇状表皮毛的出现，整体上比较均匀，形状没有太大差异，但数量整体上多于野生型。可看出转LBM1拟南芥的表皮毛数量较野生型拟南芥平均多1倍以上，这表明LBM1能正调控拟南芥表皮毛发育。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，任何未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

序列表

<110>贵州大学

<120>烟草基因LBM1、其筛选方法及在调控植物表皮毛发育方面的应用

<130>

<140>

<141>

<160>

<170>

<210>1

<211>

<212> PRT

<213> 烟草 Nicotiana tabacum cv. Xanthin

<400> 1

Met Val Arg Ala Leu Cys Cys Glu Lys Met Gly Leu Cys Cys Gly Pro

1 5 10 16

Trp Thr Pro Glu Glu Asp Glu Ile Leu Leu Ser Tyr Ile Glu Thr Asn

17 20 25 30

Gly His Gly Asn Trp Arg Ala leu Pro Lys Leu Ala Gly Leu Leu Arg

35 40 45

Cys Gly Lys Ser Cys Arg Leu Arg Trp Thr Asn Tys Leu Arg Pro Asp

50 55 60

Ile Lys Arg Gly Asn Phe Thr Arg Glu Glu Glu Asp Ser Ile Ile Glu

65 70 75 80

Leu His Glu Met Leu Gly Asn Arg Trp Ser Ala Ile Ala Ala Arg Leu

85 90 95

Pro Gly Arg Thr Asp Asn Lys Asn Lys Asn Val Trp His Thr His Leu

100 105 110

Lys Lys Arg Leu Lys Asn Tyr Glu Pro Pro Glu Asn Ser Lys Arg His

115 120 125

Ser Lys Asn Asn Leu Asp Ser Lys Ala Pro Ser Glu Ser Glu Thr Phe

130 135 140

Asn Asn Ser Asp Asn Phe Ser Asn Ile Glu Glu Asp Ile Asn Gly Pro

145 150 155 160

Val Thr Gly Pro Asn Ser Pro Glu Arg Ser Ser Ser Glu Met Leu Thr

165 170 175

Val Thr Val Asp Ser Thr Ala Met Thr Thr Ile Thr Ile Asp Asp Glu

180 185 190

Asn Met Phe Lys Glu Leu Asp Glu Met Asp Ser Ser Glu Asn Phe Ile

195 200 205

Pro Glu Ile Asp Glu Ser Phe Trp Thr Asp Asp Leu Ser Thr Ser Asp

210 215 220

Asn Ser Thr Phe Gly Met Glu Gly Thr Gly Gly Glu Leu Glu Val Glu

225 230 235 240

Phe Pro Phe Ser Ser Val Lys Glu Glu Ser Met Asp Met Val Gly Ala

245 250 255

Lys Leu Phe Ser Ser Met Asp Phe Trp Tyr Asn Val Phe Ile Lys Ser

260 265 270

Gly Asp Leu Leu Asp Leu Pro Glu Phe Stop

275 280

<210>2

<211>

<212>DNA

<213> 烟草 Nicotiana tabacum cv. Xanthin

<400>2

ATGGTGAGAGCTCCTTGTTGTGAGAAGATGGGGTTGAAAAAAGGACCA 48

TGGACTCCTGAAGAAGATCAAATTCTTGTTTCTTATATTCAAACAAAT 96

GGCCATGGCAATTGGAGAGCCCTCCCTAAACTAGCTGGACTTTTGAGA 144

TGTGGGAAGAGTTGCAGATTGCGTTGGACTAACTATTTGCGTCCAGAT 192

ATAAAGAGGGGAAACTTTACTAGAGAAGAAGAAGACTCCATTATTCAG 240

TTACATGAAATGCTTGGCAATAGATGGTCTGCAATAGCAGCGAGATTA 288

CCGGGACGAACGGACAATGAAATTAAAAATGTATGGCACACCCACTTG 336

AAAAAGAGGCTTAAAAATTACCAGCCTCCTCAAAACTCCAAAAGACAC 384

TCCAAAAACAACCTTGATTCCAAAGCTCCTAGTACTTCTCAAACCTTC 432

AATAATTCAGACAATTTTAGCAATATCCAAGAAGATATTAATGGGCCC 480

GTGACCGGCCCGAACTCGCCACAACGATCGTCTAGTGAGATGTCGACT 528

GTCACGGTTGATTCAACAGCCATGACGACCATCACAATCGATGATCAG 576

AATATGTTTAAGCAATTAGATGAGATGGACTCGTCTGAAAATTTTATT 624

CCAGAGATTGATGAGAGTTTTTGGACGGATGATTTATCCACAAGCGAT 672

AACTCGACTTTTGGTATGGAGGGTACCGGTGGAGAATTACAAGTCCAA 720

TTTCCATTTTCTTCGGTGAAGCAAGAAAGTATGGACATGGTTGGAGCA 768

AAATTAGAGGACGACATGGACTTTTGGTACAATGTTTTCATAAAGTCC 816

GGGGACTTACTAGATTTACCGGAATTTTGA 846

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> LNM1克隆正向引物

<400>3

ATGGTGAGAGCTCCTTGTTG 20

<210>4

<211> 21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>LNM1克隆反向引物

<400>4

TCAAAATTCCGGTAAATCTAG 21

<210>5

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>LNM1 PCR上游引物

<400>5

GCTCTAGAATGGTGAGAGCTCCTTGTTG 28

<210>6

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>LNM1 PCR下游引物

<400>6

TCCCCCGGGTTATCAAAATTCCGGTAAATC 30

Claims

1.烟草基因LBM1，具有AB028649.1所示的核苷酸序列。

2.如权利要求1所述的烟草基因LBM1，其具有AB028649.1所示的氨基酸序列。

3.如权利要求1或2所述的烟草基因LBM1在调控植物表皮毛发育方面的应用。