CN116496373A - MYBHv33转录因子在植物抗盐性中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，提供了MYBHv33转录因子在植物抗盐性中的应用。具体的，本发明首次报道一种抗盐性负调控相关蛋白MYBHv33及其编码基因。本发明通过研究发现，在盐胁迫条件下甜高粱中的MYBHv33基因的表达量显著下调，将其导入拟南芥中，对其进行功能鉴定，表明MYBHv33的过量表达，使得植株抗盐能力下降，从而表明其对植株抗盐能力起到负调控作用，从而为培育抗性植物提供基础，具有良好的潜在实际应用之价值。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及MYBHv33转录因子在植物抗盐性中的应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
土壤盐渍化是全世界人类共同面临的难题，世界上有超过9.5亿公顷的土地受盐渍化影响，而且还有不断增加的趋势。这给农业生产造成巨大损失，并且还限制了造林。盐渍化土壤中过量的盐离子浓度，盐胁迫对植物的生长发育有重大的影响，如影响种子萌发、抑制植物根系生长、影响根系的导水率和膜透性、抑制植物光合作用等。因此对植物耐盐的机理进行研究能够有效的开发盐碱地，变废为宝。目前，植物抗逆性研究已逐渐深入到细胞、分子水平，并与遗传学和遗传工程研究相结合，可以利用生物技术改进植物生长特性，进而提高植物对逆境的适应能力。
转录因子是一种调节基因，是调控网络中重要的分子，它通过信号转导和对逆境响应基因的调控，几乎参与生物体所有的生命过程，其中MYB转录因子是近年来研究发现的一类重要的转录因子，参与响应植物的逆境应答调节过程，在多种生命过程调控起关键作用。但发明人发现，目前主要针对少量模式生物如拟南芥等进行研究，而对其他植物中的MYB转录因子研究甚少。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本发明的目的是提供MYBHv33转录因子在植物抗盐性中的应用。本发明通过研究发现，在盐胁迫条件下，甜高粱中的MYBHv33基因的表达量显著下调，将其导入拟南芥中，对其进行功能鉴定，结果表明MYBHv33基因在植株抗盐过程中起到负调控作用。
为了实现上述目的，本发明的技术方案为：
本发明的第一个方面，一种蛋白质，命名为MYBHv33，是如下a1)-a3)任一种：
a1)序列表中SEQ ID NO.1所示的蛋白质；
a2)将序列表中SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能由SEQ ID NO.1衍生的蛋白质；
a3)其它基因编码的与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成具有相似性达到50％以上并且具有SEQ ID NO.1所示的蛋白的活性的蛋白。
上述a2)中，所述“一个或多个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加”为不超过5个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
上述a1)-a3)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
本发明的第二个方面，提供一种核酸分子，所述核酸分子编码上述蛋白质。
上述核酸分子可以是如下b1)-b4)中任一种的DNA分子；
b1)编码区为序列表中SEQ ID NO.2所示的DNA分子；
b2)核苷酸序列是序列表中SEQ ID NO.2所示的DNA分子；
b3)与b1)或b2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述蛋白质MYBHv33的DNA分子；
b4)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述蛋白质MYBHv33的DNA分子。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
本发明的第三个方面，含有编码上述蛋白质MYBHv33的核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系、宿主菌或转基因植物亦在本发明的保护范围之内。
其中所述宿主菌可为真核菌类或原核菌类。
重组载体包括将编码上述蛋白质MYBHv33的核酸分子插入表达载体pEASY-Blunt3simple，为过表达MYBHv33基因载体，命名为pEASY-Blunt3 simple-MYBHv33。
本发明的第四个方面，提供扩增编码上述蛋白质MYBHv33的核酸分子全长或其任意片段的引物。
本发明的第五个方面，提供上述蛋白质、上述核酸分子、上述重组载体、表达盒、转基因细胞系、宿主菌或转基因植物在调控植物抗逆性中的应用。
上述应用中，所述调控植物抗逆性为降低植物的抗逆性或增加植物的抗逆性；优选为增加植物的抗逆性。本发明通过研究发现，在植株中缺失或抑制MYBHv33基因表达能够提高植物的抗逆性，具体表现为提高植物的抗盐性。
上述应用中，所述MYBHv33基因包括与其同源性较高的基因，如拟南芥中的AtMYB86基因。且本发明在实施例中验证了拟南芥中同源基因AtMYB86具有与MYBHv33相同的功能。因此，与甜高粱MYBHv33氨基酸序列同源的蛋白序列及其编码核苷酸序列及其抗逆性应用亦在本发明的保护范围之内。
上述应用中，所述抗逆性可以为抗盐性。
上述应用中，所述植物可以是双子叶植物(如拟南芥、棉花、蓖麻、花生、木薯等)，也可以是单子叶植物(如甜高粱、高粱、玉米、小麦、水稻等)。
本发明的第六个方面，一种植物育种方法，所述方法包括：所述方法包括敲除或抑制上述MYBHv33基因表达，提高植物抗逆性。
需要强调的是，上述方法中，所述MYBHv33基因包括与其同源性较高的基因，如拟南芥中的AtMYB86基因。且本发明在实施例中验证了拟南芥中同源基因AtMYB86具有与MYBHv33相同的功能。因此，与甜高粱MYBHv33氨基酸序列同源的蛋白序列及其编码核苷酸序列及其调控植物抗逆性的应用均在本发明的保护范围之内。
上述方法中，所述抗逆性为抗盐性；
上述方法中，所述植物可以是双子叶植物(如拟南芥、棉花、蓖麻、花生、木薯等)，也可以是单子叶植物(如甜高粱、高粱、玉米、小麦、水稻等)。
上述一个或多个技术方案的有益效果在于：
上述技术方案首次报道一种抗盐性负调控相关蛋白MYBHv33及其编码基因，具体的，上述技术方案从甜高粱中筛选到MYBHv33基因，其在盐处理条件下表达量降低，将其导入拟南芥中，对其进行功能鉴定，表明MYBHv33的过量表达，导致植物钠离子明显升高，钾离子含量明显降低，影响植株体内的生物量积累，钠钾离子稳态，植物清除自由基的能力，过氧化酶的活性，ROS以及膜脂过氧化程，从而使得植株抗盐能力下降，从而表明其对植株抗盐能力起到负调控作用，上述技术方案为培育抗性植物提供基础，因此具有良好的实际应用之价值。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为SbMYBHv33的结构域；
图2为SbMYBHv33的三级结构；
图3为SbMYBHv33蛋白的亲疏水性分析图；
图4为SbMYBHv33蛋白序列的结构域分析图；
图5为SbMYBHv33进化树分析；
图6为SbMYBHv33基因在甜高粱根中150mM NaCl处理不同时间的表达量；
图7为SbMYBHv33基因在甜高粱茎中150mM NaCl处理不同时间的表达量；
图8为SbMYBHv33基因在甜高粱叶中150mM NaCl处理不同时间的表达量；
图9为SbMYBHv33基因的克隆以及载体连接；其中，A为SbMYBHv33基因CDS序列945bp；B为35S:SbMYBHv33-GFP载体菌落PCR结果；C为2，3泳道为带有酶切位点的SbMYBHv33基因片段，5，6泳道为PGBKT7载体酶切；D为PGBKT7-SbMYBHv3菌落PCR结果；
图10为SbMYBHv33蛋白的亚细胞定位；
图11为SbMYBHv33的转录活性分析；
图12为拟南芥转化阳性苗，上排为OE-2株系，下排为OE-5株系；
图13为拟南芥转化阳性苗PCR鉴定，泳道1为2000maker，2-5泳道为OE-2株系的PCR鉴定；泳道6-9为OE-5株系的PCR鉴定；
图14为T3代拟南芥转化阳性苗，上排为OE-2株系，下排为OE-5株系；
图15为T3代拟南芥转化阳性苗PCR鉴定，泳道1为2000maker，2-5泳道为OE-2株系的PCR鉴定；泳道6-9为OE-5株系的PCR鉴定；
图16为转基因拟南芥不同株系SbMYBHv33的相对表达量；
图17为过表达高粱株系SbMYBHv33的相对表达量；
图18为纯合突变体atmyb86-1的筛选；
图19为AtMYB86在突变体株系中的表达；
图20为盐处理下不同株系的表型分析；
图21为盐处理下拟南芥株系的萌发率；
图22为盐处理下拟南芥株系的主根长；
图23为盐胁迫下拟南芥各株系幼苗表型；
图24为NaCl处理对不同拟南芥株系总鲜重影响；
图25为NaCl处理对不同拟南芥株系总干重影响；
图26为NaCl处理对不同拟南芥株系地下部分鲜重影响；
图27为NaCl处理对不同拟南芥株系地下部分干重影响；
图28为NaCl处理对不同拟南芥根系中钠离子含量的影响；
图29为NaCl处理对不同拟南芥根系中钾离子含量的影响；
图30为NaCl处理对不同拟南芥根系中Na+/K+含量的影响；
图31为NaCl处理对不同拟南芥株系叶片中MDA含量的影响；
图32为不同拟南芥株系NBT染色；
图33为不同拟南芥株系DAB染色；
图34为不同拟南芥株系抗氧化酶活性；
图35为盐胁迫下野生型和SbMYBHV33过表达高粱系的生长状况；
图36为盐胁迫下野生型和过表达SbMYBHV33高粱系中生物量测定；
图37为盐胁迫下高粱Tx430和SbMYBHV33过表达株系中Na+的含量；
图38为盐胁迫下高粱Tx430和SbMYBHV33过表达株系中K+的含量；
图39为盐胁迫下高粱Tx430和SbMYBHV33过表达株系DAB染色；
图40为盐胁迫下高粱Tx430和SbMYBHV33过表达株系NBT染色。
具体实施方式
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例1：甜高粱MYBHv33基因的生物信息学分析
1、实验材料
SbMYBHv33蛋白序列
2、试验方法
SbMYBHV33的CDS序列是通过NCBI数据库获得的，并根据其注释命名(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/？term＝SORBI_3003G270300)。使用了Ensembl(http://ensembl.gramene.org/)、SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)、EvolView(http://www.evolgenius.info/evolview/)和MEGA6软件用于蛋白质序列分析和系统发育树分析。
3、实验结果与分析
3.1SbMYBHv33的氨基酸序列以及结构的分析
MGRHAASGGGGGVQQKLRKGLWSPEEDEKLYNHIIRYGVGCWSSVPKLAGLQRCGKSCRLRWINYLRPDLKRGSFSQQEEDAIVGLHEILGNRWSQIASHLPGRTDNEIKNFWNSCLKKKLRQRGIDPSTHKPISANTAAAALEQPAASQERKPLSTAAADGGFDTKHQHQQVFDPFPLTDSFGGGFDAAAGAALYGHMGGGGGKQDAGAFVDYSSVLDVSENLGYGESSSNSSNWNCAPEANNALDGGDAPLHWASESKATPHFAGYGGGEEQSLEEHKFLLPCHGQQEQSLPHFDFDISRGAVVGDFNLEFF(SEQ ID NO.1)
SbMYBHv33(SORBI_3003G270300)基因共945个碱基，能够编码314个氨基酸。在SMART在线网站分析后发现，该蛋白的第18-68、71-119位之间是两个高度保守的MYB功能域(图1)。蛋白质的三级结构具有特定的螺旋-转角-螺旋结构的三维结构(图2)。
SbMYBHv33基因序列如下：
ATGGGACGCCACGCGGCCTCCGGCGGCGGCGGCGGCGTGCAGCAGAAGCTGCGCAAGGGACTCTGGTCGCCCGAGGAAGACGAGAAGCTCTACAACCACATCATCCGCTACGGCGTCGGGTGCTGGAGCTCCGTGCCCAAGCTCGCAGGGCTGCAGAGGTGCGGCAAGAGCTGCCGACTTCGGTGGATCAACTACCTGCGCCCCGACCTGAAGCGGGGCAGCTTCTCGCAGCAGGAGGAGGACGCCATCGTCGGCCTCCACGAGATCCTGGGGAACAGGTGGTCGCAGATCGCGTCGCACTTGCCGGGCCGGACGGACAACGAGATCAAGAACTTCTGGAACAGCTGCCTCAAGAAGAAGCTGCGCCAGCGCGGCATCGACCCCAGCACCCACAAGCCCATCTCCGCCAACACGGCGGCGGCGGCATTGGAACAGCCGGCGGCGTCGCAAGAGCGCAAGCCGTTGTCCACAGCCGCCGCTGATGGCGGCTTCGACACGAAGCACCAGCACCAGCAGGTGTTCGACCCGTTCCCGCTGACCGACAGCTTCGGCGGCGGCTTCGACGCGGCAGCTGGCGCCGCATTGTATGGCCACATGGGCGGCGGCGGCGGCAAGCAGGACGCGGGCGCGTTCGTGGACTACAGCAGCGTGCTGGACGTGTCGGAGAACCTGGGCTACGGCGAGAGCTCCAGCAACAGCAGCAACTGGAACTGCGCGCCGGAGGCGAACAATGCGCTCGACGGCGGCGACGCGCCGCTGCACTGGGCCTCCGAGAGCAAGGCCACGCCCCACTTCGCCGGCTACGGCGGCGGCGAGGAGCAGTCGCTGGAGGAGCACAAGTTCTTGCTGCCCTGCCACGGGCAGCAGGAGCAGAGCCTGCCGCATTTCGACTTCGACATCAGCCGGGGCGCCGTGGTCGGCGACTTCAACCTCGAGTTCTTCTGA(SEQ ID NO.2)
3.2SbMYBHv33蛋白序列的亲疏水性分析
ExPASy在线网站能够对蛋白序列进行分析，该分析中的分值越小表明蛋白的亲水性越强。SbMYBHv33蛋白的分值大多数小于0，多肽链显示是亲水性，所以该基因编码亲水蛋白(图3)。
3.3SbMYBHv33蛋白跨膜结构及信号肽预测
通过SignalP5.0、TMHMM在线网站来分析SbMYBHv33蛋白，SbMYBHv33蛋白无跨膜螺旋区，无信号肽，是细胞外的蛋白。
3.4SbMYBHv33蛋白与其他同源蛋白的关系
通过对SbMYBHv33蛋白序列和其他同源物种蛋白序列比对发现，自N端开始的第18个氨基酸到第68个氨基酸，以及第71个氨基酸到第119个氨基酸，为保守结构域，因此SbMYBHv33基因是一个R2R3型的MYB转录因子(图4)。通过对进化树分析发现，SbMYBHv33蛋白与野生型二粒小麦(Triticum dicoccoides)中的TRIDC3AG038170和TRIDC3BG042930蛋白同源性近，与拟南芥的AtMYB86(AT5G26660)蛋白的同源性较近。通过对同源性相近的蛋白进行结构域的分析发现，同源性相近的蛋白中具有相同的保守结构域(图5)。
实施例2：甜高粱SbMYBHv33的表达模式分析
1.试验材料
甜高梁SbMYBHv33的基因序列，甜高粱耐盐自交系M-81E种子，Ensembl在线网站，Beacon Designer 7软件。
2.试验处理材料方法
挑取差异不大的M-81E种子，过夜浸泡后种在沙子里。生长至三叶一心时期，用含有150mM NaCl的Hoagland营养液浇灌甜高粱幼苗，分别处理0、3、6、12、24、48小时后进行取材。提取RNA，用qRT-PCR方法检测SbMYBHv33基因在各个组织中的表达情况。
其中，采用华越洋RNA提取试剂盒(0416-50)提取RNA。RNA提取完毕后，测定并记录其浓度。之后使用艾科瑞生物的反转录试剂盒Evo M-MLV反转录试剂盒(Code No.AG11711)进行反转录。
在NCBI在线网站用Primer Blast设计定量引物，所用引物序列如下：
Sbactin-S:TGGCATCTCTCAGCACATTC
Sbactin-A:AATGGCTCTCTCGGCTTGC
Hv33-F:CCGGGAAGAACAGACAACGA
Hv33-R:TTGTTGCGATGAGACGACCA
配制荧光定量PCR反应体系。
3.试验结果与分析
3.1SbMYBHv33基因的组织和诱导表达模式
在150mM的NaCl处理0、3、6、12、24、48h后，SbMYBHv33在甜高粱M-81E的根(图6)、茎(图7)、叶(图8)中的表达情况。在根中，SbMYBHv33在150mM NaCl处理下，表达量先升高，在6h达到最高，而后降低。在茎中，SbMYBHv33的表达量先升高，在3h达到最高，后降低。在叶中，SbMYBHv33的表达量也是先升高后降低，在12h表达量最高。
通过qRT-PCR，发现在根，茎，叶中均能检测到SbMYBHv33的表达，因此该基因为组成型。甜高粱SbMYBHv33的表达受高盐诱导，在48h，SbMYBHv33的表达水平最低，为负调控植物盐胁迫的转录因子。
实施例3：SbMYBHv33基因的克隆、亚细胞定位以及转录活性分析
1.试验材料
本生烟草、pEASY-Blunt3 simple载体，35S:GFP载体以及pGBKT7载体。
2.试验方法
2.1克隆SbMYBHv33基因
根据SbMYBHv33基因CDS片段设计基因克隆的引物，具体引物如下：
Hv33 -1300-F:CGGGATCCATGGGACGCCACGCGGCC
Hv33 -1300-R:GCGTCGACGAAGAACTCGAGGTTGAA
以cDNA为模板，以Hv33 -1300-F、Hv33 -1300-R为引物，配置PCR反应体系并进行PCR反应的目的片段。将目的片段与克隆载体pEASY-Blunt3 simple连接，将上述连接产物转化大肠杆菌感受态DH5α。进行克隆菌落PCR，同时划线培养。后进行测序。将测序正确的菌落菌液用天根TIANprep Rapid Mini Plasmid Kit(DP105-03)试剂盒提取质粒。
2.2表达载体的构建
通过酶切连接的方式获得带有SbMYBHv33的35S:GFP-SbMYBHv33载体和pGBKT7-SbMYBHv33载体。转化DH5α后，进行菌落PCR、测序，测序正确的菌液用天根TIANprep RapidMini Plasmid Kit(DP105-03)试剂盒提取质粒。
2.3农杆菌GV3101感受态转化
将35S:GFP-SbMYBHv33载体加入到融化的农杆菌感受态GV3101，转化培养。
2.4酵母细胞AH109的转化
将pGBKT7-SbMYBHv33载体和酵母细胞AH109混合，转化培养。
2.5SbMYBHv33的亚细胞定位分析
采用农杆菌瞬时转化烟草，采用双光子激光扫描共聚焦显微镜观察烟草荧光情况并进行拍照。
3.试验结果与分析
3.1SbMYBHv33基因的克隆及载体构建
用Hv33-1300-F和Hv33-1300-R扩增SbMYBHv33基因CDS序列，得到945bp的目的条带(图9A)。回收条带较亮的目的条带，连接转化DH5α，菌落PCR成功后，摇菌提取质粒，送擎科生物进行测序。将测序正确的酶切载体用相应的酶切位点酶切后，回收连接表达载体PGBKT7和35S:GFP，如图9B、9D所示，为阳性菌落。
3.2SbMYBHv33的亚细胞定位分析
将转化35S:SbMYBHv33-GFP的GV3101注射烟草，在激光扫描共聚焦显微镜下发现在细胞核有强烈的GFP荧光信号。细胞用DAPI染料染色发现细胞核为蓝色荧光，因此SbMYBHv33蛋白定位在细胞核(图10)，是具有调控作用的核转录因子。
3.3SbMYBHv33的转录活性分析
如图11所示，在单缺培养基上，两组都能够正常生长，在三缺培养基上，试验组正常生长，并且在含X-α-gal培养基上，试验组菌落变蓝，对照组均无法生长，这说明SbMYBHv33具有转录活性，能够启动报告基因的正常表达。
实施例4：盐胁迫下SbMYBHv33基因的功能研究
1.试验材料与处理
野生型(Col-0)拟南芥植株，从Tair网站上购买的AT5G26660(atmyb86)，突变体分别是myb86-1(SALK_016998)，myb86-2(SALK_143117C)。高粱近交系Tx430种子。
2.试验方法
2.1拟南芥SbMYBHv33过表达株系的鉴定
农杆菌介导法侵染拟南芥，用潮霉素筛选过表达株系纯合苗。
提取拟南芥过表达各株系的DNA，用35s、Hv33-1300-R和Hv33-1300-F作为引物进行PCR扩增；将提取的拟南芥过表达纯合株系RNA反转进行荧光定量PCR，对过表达株系中SbMYBHv33基因的表达量进行检测，引物如下:
35S:ATTTGGAGAGGACACGCT
Hv33-F：GCACAAGTTCTTGCTGCCCTG
Hv33-R：AACTCGAGGTTGAAGTCGCCG
Atactin-F：TGGTCGTACCACAGGTATTGTGTT
Atactin-R：AAGGTCGAGACGAAGGATAGCAT
2.2拟南芥MYB86突变体纯合株系的筛选
设计引物，引物如下：
LBb1.3：ATTTTGCCGATTTCGGAAC
016998-LP：CTCGCAGGTTTGGTCTCTATG
016998-RP：ACGATGATGATGCTGATCTCC
143117-LP：TTGTTTATCGAACCCGTTGAC
143117-RP：TCACATTTTTCTATCTATCGTTCGAG
CTAB方法提取DNA；
突变体纯合体的鉴定与筛选
以各突变体的DNA为模板，采用引物筛选T-DNA插入纯合突变体。
2.3高粱SbMYBHv33过表达株系的鉴定
将授粉12-16天后将未成熟种子去壳，用70％(v/v)乙醇消毒5min，然后用12％(v/v)漂白剂消毒10-15min，最后用无菌水冲洗3次。将1.0～1.5mm长的未成熟胚从种子中分离到侵染液培养基(0.44g/l Murashige-Skoog盐、1×B5维生素、68g/l蔗糖、36g/l葡萄糖、1g/l天冬酰胺、1g/l酪氨酸、0.2g/l半胱氨酸、2mg/l 2,4-二氯苯氧乙酸、200μM乙酰丁香酮、pH 5.2)中。用热休克法将载体SbMYBHv33-OE导入农杆菌EHA105。EHA105阳性细胞在YEB液体培养基中培养过夜，待吸光值600nm(OD 600nm)＝1.0备用。侵染时，选取大约100-200个未成熟胚经43℃热处理3min后，接种1ml细菌细胞约5min。将侵染后的胚移入共培养培养基中，在25℃暗处共培养2-3天。
2.3.2除草剂筛选过表达株系
将暗处理后的胚芽置于含有250mg/L特美汀的CIM培养基上，在黑暗中培养6-7天，然后转移到含有除草剂的CIM选择培养基中培养约10天，筛选出能正常生长的胚芽，在相同的选择培养基中再培养20天，直到抗性愈伤组织形成，并转移到SM培养基中，在28℃16小时光照8小时黑暗条件下，培养2-3周。将长度为1-3厘米的细长芽转移到生根培养基中生根。将有健康根系的转基因高粱先移入花盆中，一周后移入田间继续生长。
2.3.3高粱Tx430过表达株系中SbMYBHv33基因的实时荧光定量分析
为了进一步分析SbMYBHv33的表达量情况，进行了实时荧光定量分析。从高粱Tx430过表达株系中提取RNA，反转录获得cDNA，以cDNA为模板进行real-time PCR扩增，对过表达株系中SbMYBHv33基因的表达量进行检测，引物如下：
Hv33-RT-F：GCTCTACAACCACATCAT
Hv33-RT-R：TAGTTGATCCACCGAAGT
Sbactin-1-F：ACGGCCTGGATGGCGACGTACATG
Sbactin-1-R：GCAGAAGGACGCCTACGTTGGTGAC
2.4盐处理下拟南芥萌发期实验
2.4.1盐处理下拟南芥种子萌发率与根长的测定
在含有0、50、100、150mM NaCl的培养基中，成排点播消毒后的WT，atmyb86，OE-2，OE-5种子，春化3天后统计24h时的萌发率，7天后测量主根长度。
2.5盐处理下拟南芥幼苗期实验
2.5.1植株干鲜重的测定
分别用0，150mM NaCl处理拟南芥野生型、突变体株系，过表达株系的幼苗植株7天后取材。挑选6颗长势相似的植株分别称量各株系的鲜重，记为Fresh weight，同时称量地下部分鲜重。然后放入65℃的烘箱中，一周之后再分别称量植株的干重，记为Dry weight，同时记录地下部分干重。
2.5.2Na+、K+离子含量的测定
在ddH2O的试管中，将材料煮沸2h，定容至10mL，然后用火焰分光光度计测定Na+、K+含量。各设置三个重复。
2.5.3丙二醛(MDA)含量的测定
0.1％ TCA研磨叶片，0.5％ TBA，混匀后煮沸10min。3000rpm/min，15min，用记录上清液体积，以0.5％TBA为空白对照，测OD532 nm和OD600 nm。MDA含量(mmol/g Fw)＝(A532-A600)×上清体积/150×(叶片的重量)
2.5.4超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定
配置如下所示体系：
在干净的试管中加入如表所示的溶液，对照组放在黑暗的环境中反应作为对照，其余试管放置在4200lx光下反应20min，以黑暗中反应的溶液作为对照，测定在OD560。
SOD总活性＝[(ACK-AE)×V]/[ACK×1/2×W×Vt]
ACK—照光对照管的OD值吸光度；AE—样品的吸光度；V—样品液的总体积(mL)；Vt—测定的酶液用量(mL)；W—样品鲜重(g)；
2.5.5过氧化氢酶(CAT)活性的测定
取3mL CAT反应液加入0.1mL酶液，用PBS作为对照，每隔40s测定OD240的吸光值。
CAT＝[△A240×Vt]/[W×Vs×0.01×t]
△A240—反应时间内吸光值的变化情况；W—样品鲜重(g)；t—反应时间(min)；Vt—测定的提取液用量(mL)；Vs—测定的酶液用量(mL)；
2.5.6抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性的测定；
取0.1mL的酶液，加入1.9mL APX反应液，每隔40s测定OD290的吸光值。
APX＝(△OD/△t×Vr×VT)/(A×d×Vt×W)
△OD—反应时间内吸光值的变化情况；△t—反应时间(min)；Vr—反应液的总体积(mL)；VT—测定的提取液用量(mL)；A—消光系数；d—比色杯厚度；Vt—测定的酶液用量(mL)；W—样品鲜重(g)
2.5.7DAB和NBT染色
将相同长度的野生型和突变体叶片放入5mL EP管中，加入DAB染色液(1mg/mL)或NBT染色液(0.5mg/mL)，使染色液完全浸没叶片，室温避光保存。倒掉染色液，加入80％乙醇煮沸10-15min，直至叶片褪色。观察叶片的颜色并拍摄图像。
2.6盐处理下高粱Tx430幼苗期实验
2.6.1生物量的测定
将高粱Tx430野生型与SbMYBHv33过表达株系中的OE1，OE6，OE7的种子，过夜浸泡后种在沙子里，生长至三叶一心时，分别用含有0mM和150mM NaCl的Hoagland营养液分别处理7天后，进行取材，进行鲜重(Fresh weigh)的称量。
2.6.2Na+、K+离子含量的测定
在ddH2O的试管中，将材料煮沸2h，定容至10mL，然后用火焰分光光度计测定Na+、K+含量。各设置三个重复。
2.6.3DAB和NBT染色
将相同长度的Tx430野生型和SbMYBHv33过表达株系的叶片放入5mL EP管中，加入DAB染色液(1mg/mL)或NBT染色液(0.5mg/mL)，使染色液完全浸没叶片，室温避光保存。倒掉染色液，加入80％乙醇煮沸10-15min，直至叶片褪色。观察叶片的颜色并拍摄图像。
2.6.4盐处理下相关基因的荧光定量PCR分析
在非生物胁迫条件下，植物主要会受到离子胁迫、渗透胁迫和氧化胁迫。在植物抗盐过程中，是由相关基因控制离子转运，进而减弱植物自身受到的离子毒害，提高抗盐能力，为了探究SbMYBHv33过表达株系中Na+、K+离子的变化是否是由离子转运相关基因直接调控的，对SbMYBHv33过表达株系和野生型高粱中离子转运相关基因进行了qRT-PCR分析。选取SOS途径的相关基因：SOS1、SOS2、SOS3、AKT1、ZIFL2、NHX1进行实验，引物如下：
SbSOS1-RT-F：CGCTGCTGAGGTTGA
SbSOS1-RT-R：GAGTCGTCGCTTGAGT
SbSOS2-RT-F：CCAAGAACTCGTATCACTATT
SbSOS2-RT-R：TCATAAGAGGACCACCAT
SbSOS3-RT-F：GCGAAGAGTTGAAGGAA
SbSOS3-RT-R：ATGTCTGCTTGCTTGAA
SbAKT1-RT-F：GATGCTGAGTTGCTTGAG
SbAKT1-RT-R：TTGTTGTCCTGCTTGTTG
SbZIFL2-RT-F：CCGTTGCTGGAGAAGA
SbZIFL2-RT-R：TAGATGAAGTTGGCGTAGG
SbNHX1-RT-F：ACTGTATTCTTCTGCGGTAT
SbNHX1-RT-R：TGCTTGGTTGTAACTCTTG
此外，植物内源激素在调控植物生长发育与抗逆方面起到重要作用，其中ABA是主要的胁迫响应激素，在盐、干旱等非生物胁迫下含量会升高，对SbMYBHV33过表达株系和野生型高粱盐处理前后ABA途径中相关基因进行了qRT-PCR分析。选取ABF4、ABI5、SnRK2.6、NCED5、BGLU22、PYL3、PYL7、CYP701A、EAR1、MYB2进行实验，引物如下：
SbABF4-RT-F：AGGCTTATACAATGGAGTT
SbABF4-RT-R：TTCTTCCTGCTTCTTCTG
SbABI5-RT-F：GCTTGAGGCTGAACTGAACC
SbABI5-RT-R：TCTTGGCGCTCACATTCTCC
SbSnRK2.6-RT-F：AAGTCATCAGTTCTACAC
SbSnRK2.6-RT-R：CATCGTATTCCTTCTTCA
SbNCED5-RT-F：AAGTTCATCTACGGCGAGGG
SbNCED5-RT-R：GTTGACGACGAGCATTTCCG
SbBGLU22-RT-F：TGACCCTGTACCACCTGGAT
SbBGLU22-RT-R：GATGGAGATCACGTTCGGCT
SbPYL3-RT-F：GAACTACCGCTCTGTCAC
SbPYL3-RT-R：GAGCTTCTGGAGGTTGAG
SbPYL7-RT-F：GATGACAACGAGCACATA
SbPYL7-RT-R：GAGGATGGAGGAGTAGTT
SbCYP701A-RT-F：TACCTGGACTTTCTGCTGGC
SbCYP701A-RT-R：TTCTGGGTGCTTCGCAATCT
SbEAR1-RT-F：GAGGTGATGGAGGAGGAG
SbEAR1-RT-R：GCCGACGAACTTGTTGAT
SbMYB2-RT-F：GCCGTCGTCGTCAAC
SbMYB2-RT-R：TCGTCGTCAGTCGTCAT
2.7数据统计分析
确保实验准确性，所有实验均设置对照试验，均设置三组重复组，实验数据为3次或3次以上的平均值±标准差。实验数据利用Office EXCEL进行数据处理，SPSS17.0等生物软件进行显著性差异分析。
3.试验结果与分析
3.1拟南芥SbMYBHv33过表达纯合株系的获得
3.1.1筛选及鉴定过表达株系
将侵染野生型拟南芥得到的种子在带有抗生素的培养基上培养后发现，大部分的苗子长势弱小，黄化，根部短小，逐渐死亡，少数的阳性苗长势正常，提取阳性苗的DNA进行PCR鉴定，有正确目的条带说明带有目的基因，如图12、13所示。每一株成活的阳性苗为一株系，经过三代筛选，阳性苗株系进行PCR验证都有目的条带，如图14、15所示，则确定为纯和的过表达株系。
3.1.2拟南芥不同过表达株系的Real-time PCR分析
如图16所示，对各个株系进行Real-time PCR验证，测定各株系的表达量，从中筛选表达量位于最高，中等水平的OE-2和0E-5作为过表达株系，进行后续研究。
3.1.3高粱Tx430不同过表达株系的Real-time PCR分析
如图17显示，对转基因高粱各个株系进行Real-time PCR验证，测定各株系的表达量，从中筛选表达量位于较高水平的OE6，表达中等水平的OE-7和表达水平较低的OE1作为代表性株系，进行后续研究。
3.2拟南芥突变体纯合株系的获得
3.2.1筛选及鉴定突变体纯合株系
如图18所示，引物LBb1.3+RP扩增的PCR产物有条带，而LP+RP扩增无条带即为纯合的突变体，因此通过鉴定筛选出纯合突变体myb86-1(SALK_016998)，以下简称atmyb86。
3.2.2拟南芥突变体株系的Real-time PCR分析
如图19所示，对鉴定出纯合的突变体进行实时荧光定量分析后发现，Atmyb86在突变体拟南芥种的表达水平显著降低。
3.3盐处理下拟南芥野生型、过表达，突变体株系萌发期实验
3.3.1盐处理下各株系的表型分析
从图20中看出，用不同的盐浓度处理7天，植株表型出现差异，在未经盐处理的条件下，atmyb86的长势明显好于野生型和过表达株系。随着盐浓度的增加，在50mM NaCl处理下，各个株系的长势都受到影响，atmyb86的子叶和根生长情况明显优于野生型和过表达的株系。在100mM NaCl的处理下，atmyb86和过表达株系之间差异显著，atmyb86株系长势最好，过表达株系的子叶发黄，甚至有的植物无法萌发。在150mM NaCl的处理下，各个株系的生长均受到抑制，过表达株系的抑制程度最为严重。这表明，SbMYBHv33的过表达会在萌发期提高植株的盐敏感性。
3.3.2野生型和突变体种子萌发率与根长的测定
种子的萌发是植物能顺利生长的关键。如图21所示，24h后测定各株系的萌发，在0mM NaCl的处理下，野生型和突变体atmyb86以及过表达株系OE-2和OE-5的萌发率没有差异。随着NaCl浓度的升高，每个株系的萌发率都降低。50mM NaCl的处理后，atmyb86的萌发率显著高于突变体和过表达株系，过表达株系的萌发率的下降程度明显高于野生型。在100mM NaCl和150mM NaCl的处理条件下，atmyb86的萌发率都显著高于野生型和过表达株系。
盐处理7天后，如图22所示，通过测量拟南芥各个株系的主根长发现，随着盐浓度的增加，各个株系的根的生长都受到了抑制，根长降低，且显著下降。在50mM NaCl和100mMNaCl的处理下，突变体的根长显著大于野生型，过表达的根长显著低于野生型。在150mMNaCl处理下，各个株系的根长都很短，过表达株系的根长最短，没有生长。
3.4野生型和突变体株系的幼苗期实验
3.4.1正常条件和盐处理一周的幼苗表型
如图23所示，通过观察野生型，突变体atmyb86，OE-2，OE-5四个株系的表型看出，在正常条件下，拟南芥各株系的生长情况良好，大致相同。150mM NaCl处理7d后，观察到突变体atmyb86的生长受到抑制程度最轻，野生型和过表达株系叶片变小，发黄，甚至萎蔫，说明突变体atmyb86受到盐胁迫损伤较小，野生型和过表达株系受到盐胁迫较大。
3.4.2盐处理对干鲜重的影响
在正常生长条件(0mM NaCl)下突变体atmyb86的干重和鲜重都高于野生型和过表达株系，盐处理后，各个株系的干重和鲜重都显著下降，但是atmyb86的下降程度明显低于野生型和过表达株系。atmyb86干重下降了28.23％，野生型和OE-2，OE-5分别下降30.42％、34.77％、34.50％，atmyb86鲜重下降了30％，野生型和OE-2，OE-5分别下降39.78％、46.23％、48.01％(图24)。
对地下部分的干重和鲜重进行分析发现，在150mM NaCl处理下，atmyb86的地下部分的干重和鲜重高于野生型和过表达株系，atmyb86，野生型和OE-2，OE-5的干重分别下降26.52％、28.67％、31.48％、37.01％，鲜重分别降低43.58％、55.56％、58.33％、61.76％，对这些生物的数据变化分析可得，突变体atmyb86生物量的降低程度小，其次是野生型，过表达的株系生物量的降低程度较大，说明盐胁迫对过表达株系生物量的抑制程度高于野生型，对突变体株系的抑制程度低于野生型。
3.4.3盐处理对拟南芥根系中的Na+、K+含量的影响
Na+、K+参与植物体渗透调节，盐胁迫下，植物积累的Na+越少，K+越多，说明植物越耐盐。如图28-30所示，在不加盐的处理下，拟南芥各个株系的Na+、K+含量差异不大。在150mMNaCl处理后，各个株系的Na+含量都显著升高，过表达株系中Na+含量和Na+/K+相较于野生型增加，突变体atmyb86中Na+含量和Na+/K+相较于野生型显著降低。突变体中K+含量显著降低，atmyb86中K+含量的下降程度要小于野生型和过表达株系。
3.4.4盐处理对拟南芥叶片MDA的影响
植物受到胁迫时会产生大量的自由基，产生MDA，损伤细胞膜，导致蛋白质产生聚合作用，因此MDA作为膜脂过氧化指标能够反映出植物对逆境响应程度。如图31所示，经过盐处理后，atmyb86中的MDA含量比野生型少，过表达株系的MDA比野生型高，这说明，atmyb86相较于野生型膜脂过氧化的程度低。
3.4.5盐处理对拟南芥叶片中过氧化氢和超氧阴离子含量的影响
盐胁迫能够增加植物中活性氧含量，通过硝基蓝四氮唑(NBT)和二氨基联苯胺(DAB)染色方法来显示植物体内ROS水平。NBT能够与超氧阴离子自由基(O2-)结合生成蓝色物质，而DAB能够与过氧化氢结合生成红色斑点。在不加盐处理的条件下，各株系的NBT和DAB染色程度差异不显著。在150mM NaCl处理下，各个株系的NBT和DAB染色程度都有所加深，atmyb86的NBT和DAB的染色程度比野生型浅，过表达株系的染色程度比野生型的深(图32、33)。这说明，过表达株系受到的氧化胁迫高于野生型，atmyb86受到的氧化胁迫低于野生型。
3.4.6盐处理对拟南芥叶片中抗氧化酶活性的影响
通过对抗氧化酶APX，CAT，SOD活性的测定，可以看出，在正常的处理条件下，拟南芥的各个株系的抗氧化酶的活性差异不大，随着盐浓度的增加，不同株系拟南芥的抗氧化酶的活性都显著增加，突变体中APX，CAT，SOD活性显著高于野生型，过表达株系的过氧化物酶活性低于野生型(图34)。过表达SbMYBHv33基因的株系清除自由基的能力弱，使过表达拟南芥植株的氧化损伤更加敏感。
3.5盐处理下高粱Tx430野生型和过表达幼苗期实验
3.5.1盐处理对高粱幼苗生物量的影响
如图35所示，在正常条件下，OE1、OE6、OE7相对于WT的株高和生物量显著降低。
如图36所示，在150mM NaCl处理7天后，与对照组相比，WT和过表达株系的生长均受到抑制。其中过表达株系受到的生长抑制更为严重，其株高降低，侧根数量减少，地上部分和底下部分生物量降低程度比野生型更显著。
3.5.2盐处理对高粱Tx430根系中的Na+、K+含量的影响
由图37可以看出在0mM NaCl处理下，Tx430各个株系的Na+含量没有什么差异，并且含量都很低，但当用150mM NaCl处理7天后，Tx430野生型与表达株系的Na+含量显著升高，且过表达株系的Na+含量要显著高于野生型，说明过表达株系中吸收了更多的Na+。大量Na+进入细胞通常会导致细胞对K+离子的吸收减少，从而破坏细胞内离子平衡。
从图38可以看出，在0mM NaCl处理时Tx430各个株系的K+含量无明显差异，但在150mM NaCl时，K+含量显著下降，且过表达株系的K+含量下降程度显著高于野生型，说明SbMYBHv33基因过表达株系中Na+的积累，导致了对K+吸收能力的减弱。
3.5.3盐处理对高粱Tx430叶片中过氧化氢和超氧阴离子含量的影响
在盐胁迫条件下，植物自身由于氧化作用产生H2O2、O2 -.等物质，这些物质与相应的染料会形成色素沉淀。H2O2在过氧化酶的催化下可与DAB产生棕色化合物；NBT在O2 -.的作用下还原成蓝色不溶于水的二甲替。从图39、40可以看出，在0mM NaCl处理下，各个株系在DAB和NBT中染色程度差异不大，说明在无盐环境中，植物所受的氧化胁迫大致相同。在150mM NaCl处理下，各个株系在DAB和NBT中的染色程度相较于0mM NaCl处理下的均有所加重，过表达株系染色程度比野生型更深。这说明在150mM NaCl处理下，各个株系受到的氧化胁迫都加重，且过表达株系胁迫程度重于Tx430野生型。
3.5.4盐处理下相关基因的荧光定量PCR分析
在盐胁迫下，我们通过分析一些与离子运输相关的基因表达水平，试图找出MYBHv33可能调控的目标基因。SOS途径是植物耐受Na+胁迫的重要防御通路，在植物应答盐胁迫过程中起着非常重要的作用。在SOS途径SbSOS1、SbSOS2、SbSOS3以及K+转运途径SbAKT1、SbZIFL2、SbNHX1的基因表达在盐处理后均有不同程度的升高，但SbMYBHv33过表达株系和野生型株系中的区别不大。说明离子转运基因可能并不直接受到SbMYBHv33的转录调控。
植物内源激素在调控植物生长发育及抗逆中发挥着重要的作用，其中ABA是主要的胁迫响应激素，在盐、干旱等非生物胁迫下升高。分析了SbMYBHV33过表达株系和野生型高粱盐处理前后ABA途径中相关基因的表达。结果显示，ABA信号反应mark基因COR15A、RD29A、RD17、RD22、MYB2的表达在过表达株系中显著上调，这表明SbMYBHV33介导了ABA信号传导途径。ABA响应转录因子ABF4、ABI5的表达在过表达株系中下调表达，ABA上游信号调节因子SbSnRK2.2、SbSnRK2.4上调，ABA合成途径基因SbNCED5、SbBGLU22在过表达株系上调，但在盐处理条件下调表达。ABA受体(负调控ABA)PYL3、PYL7上调表达，ABA信号负调节剂EAR1上调表达，ABA降解途径CYP701A上调。整体而言，SbMYBHV33的过量表达，促进了正常条件下ABA通路大部分基因的表达，而在盐处理后这些基因的表达水平恢复到和野生型相似的水平。
实施例5：盐胁迫下野生型和突变体株系的转录组测序分析
1.试验材料
1.1试验材料
哥伦比亚生态型(Col-0)以及实施例4中筛选出来的拟南芥突变体atmyb86种子。
1.2材料处理
将种子将消毒以后，点播在培养基上，低温春化，放入组培室内培养。大约长到4片真叶时，将其转移到营养土中放到培养箱中进行培养。两个星期以后，分别用含有0mM和150mM的NaCl的Hoagland营养液处理。处理七天以后，对叶部和根部进行取材，各自三个重复，一部分根部材料进行转录组测序，剩余部分材料用于测定各项生理指标。
2.试验方法：转录组测序
3.结果与分析
通过对转录组的测序发现，在突变体atmyb86中，有723个基因上调，936个基因下调。在WT_S VS atmyb86_S比较组中，有98个基因上调，116个基因下调。通过对基因的注释分析，GO分析中，参与最多的生物过程是中有9个基因注释到对盐胁迫的响应中。在细胞组分中有65个基因注释到细胞外区域条目，这说明这些基因调控的大多是分泌蛋白。在分子功能中有8个基因注释到DNA结合转录因子活性条目。通过对atmyb86_0VSWT_0比较组的分析，发现在ABA传导途径中，有关ABA合成的基因和ABA响应转录因子表达量下调，这与在高粱过表达株系中的情况相反，SbMYBHV33的拟南芥同源基因突变体atmyb86表现出ABA传导途径中的减弱，在正常条件下具更高的生物量，进一步说明在正常条件及盐胁迫条件下ABA途径基因表达的差异，可能是导致SbMYBHV33过表达高粱和拟南芥生长和抗逆性差异产生的重要原因。此外，有11个基因注释到根形成发育过程，能够调控根主要是侧根的形成、发育、以及形态，这也与观察的生理表型相一致。通过对转录组的分析，将筛选出来的差异表达基因在甜高粱中进行BLAST，得到在甜高粱中的同源基因。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种蛋白质，是如下a1)-a3)任一种：
a1)序列表中SEQ ID NO.1所示的蛋白质；
a2)将序列表中SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能由SEQ ID NO.1衍生的蛋白质；
a3)其它基因编码的与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成具有相似性达到50％以上并且具有SEQ ID NO.1所示的蛋白的活性的蛋白。
2.编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子；
进一步的，所述核酸分子是如下b1)-b4)中任一种的DNA分子；
b1)编码区为序列表中SEQ ID NO.2所示的DNA分子；
b2)核苷酸序列是序列表中SEQ ID NO.2所示的DNA分子；
b3)与b1)或b2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述蛋白质MYBHv33的DNA分子；
b4)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述蛋白质MYBHv33的DNA分子。
3.含有编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系、宿主菌或转基因植物。
4.扩增编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子全长或其任意片段的引物。
5.权利要求1所述蛋白质、权利要求2所述核酸分子、权利要求3所述重组载体、表达盒、转基因细胞系、宿主菌或转基因植物在调控植物抗逆性中的应用。
6.如权利要求5所述应用，其特征在于，所述调控植物抗逆性为降低植物的抗逆性或增加植物的抗逆性；进一步为增加植物的抗逆性。
7.如权利要求5所述应用，其特征在于，所述抗逆性为抗盐性。
8.如权利要求5所述应用，其特征在于，所述植物是双子叶植物或单子叶植物；所述植物包括拟南芥和甜高粱。
9.一种植物育种方法，其特征在于，所述方法包括：所述方法包括敲除或抑制权利要求2所述核酸分子的表达，提高植物抗逆性。
10.如权利要求9所述育种方法，其特征在于，所述抗逆性为抗盐性；
所述植物是双子叶植物或单子叶植物；所述植物包括拟南芥和甜高粱。
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