CN114990154B - GmFBX193基因在负调控大豆盐胁迫应答中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种GmFBX193基因在负调控大豆盐胁迫应答中的应用，属于基因调控技术领域。本发明通过耐盐性检测发现，GmFBX193基因可有效降低大豆根对盐胁迫的耐受性；通过生理数据进一步发现，GmFBX193基因可通过影响相对电导率、MDA含量、SOD含量和叶绿素含量来调节大豆对盐胁迫的响应。该发现的获得对于研究大豆盐胁迫应答分子机理研究，通过基因编辑方法培育耐盐大豆新品种拓展了有效解决途径。

Description

GmFBX193基因在负调控大豆盐胁迫应答中的应用

技术领域

本发明属于基因调控技术领域，尤其涉及一种GmFBX193基因在负调控大豆盐胁迫应答中的应用。

背景技术

土壤盐碱化是影响农业生产的重要非生物因素。土壤盐碱化会导致土壤渗透势降低、离子失衡、对植物的生长发育产生不利的影响，降低作物的产量和品质。大豆是一种广泛栽培的作物，在畜禽饲料加工中占据非常重要的地位。大豆的生长过程容易受到盐胁迫的影响，高盐浓度会抑制大豆的生长，对大豆农艺性状产生不利影响。目前一些大豆耐盐相关基因与调控因子已被发现，但对其机制的研究还较少。挖掘大豆耐盐基因及调控因子为大豆耐盐分子育种提供候选基因具有非常重要的价值。

F-box蛋白参与调控细胞周期、种子萌发、控制开花时间、植物器官大小、激素信号转导以及防御反应。F-box蛋白主要作为Skp1-Cullin-F-box复合物的一部分，参与泛素化降解蛋白质。随着高通量测序技术的发展，许多F-box基因被发现，在拟南芥、水稻、大豆中分别含有694、678、509个F-box基因。

拟南芥F-box蛋白相关基因的研究较为深入，随着干旱处理时间的延长，AtPP2-B11的表达显著增加，过表达AtPP2-B11的转基因植株在种子萌发和成熟植株中表现出对干旱胁迫的敏感性。F-box蛋白相关基因OsFBX76调控水稻籽粒大小。水稻一个编码F-box蛋白的基因OsFBX352，该基因在种子萌发中发挥了重要的作用。小麦F-box基因TaFBA1的表达受一系列胁迫条件的诱导，包括高盐、干旱胁迫、脱落酸处理和氧化胁迫。紫花苜蓿F-box蛋白基因MsFTL响应多种非生物胁迫。与之相比大豆F-box基因的研究较为有限，虽然在大豆中已经发现了许多F-box相关的基因，但是对其机制的研究还很少。

发明内容

本发明提供了一种GmFBX193基因在负调控大豆盐胁迫应答中的应用，该应用的获得对于研究大豆盐胁迫应答分子机理研究，通过基因编辑方法培育耐盐大豆新品种拓展了有效解决途径。

为了达到上述目的，本发明提供了一种GmFBX193基因在负调控大豆盐胁迫应答中的应用。

作为优选，通过对GmFBX193基因的编码区进行基因编辑或RNAi抑制，致使GmFBX193基因功能丧失，从而获得耐盐大豆植物。

作为优选，GmFBX193基因通过相对电导率、叶绿素含量、MDA含量、SOD含量来影响大豆对盐胁迫的耐受性。

作为优选，所述GmFBX193基因的序列如SEQ ID NO：1所示。

作为优选，所述盐胁迫的条件为：

在营养土条件下，待长出毛状根后，将复合体大豆转移至营养土中培养20d，停止浇水3d后进行250mM NaCl胁迫6d，每两天浇一次胁迫液；或者，

在水培条件下，将复合体大豆水培进行250mM NaCl胁迫24h。

大豆耐盐转基因植物，其特征在于，通过对GmFBX193基因的编码区进行基因编辑或RNAi抑制，致使GmFBX193基因功能丧失，从而产生耐盐大豆植物。

本发明还提供了一种提高大豆根盐胁迫应答能力的方法，包括以下步骤：

构建大豆基因GmFBX193的RNAi载体，经发根农杆菌介导转化到大豆根中，获得提高大豆根盐胁迫应答能力的转基因植株。

作为优选，构建大豆基因GmFBX193的RNAi载体的方法为：

根据GmFBX193序列设计以下引物：

GmFBX193-RNAi-F：

5'-CATGGCTCAAATTTCAATTGGAAGGTTTCAAGAGAACCTTCCAATTGAAATTTGAGC-3'

GmFBX193-RNAi-R：

5'-GATCGCTCAAATTTCAATTGGAAGGTTCTCTTGAAACCTTCCAATTGAAATT TGAGC-3'

具体方法如下：

将上述引物退火后形成带有酶切位点的双链，并插入pCAMBIA3301载体，构建GmFBX193-RNAi-pCAMBIA3301重组质粒；

将上述GmFBX193-RNAi-pCAMBIA3301重组质粒转化发根农杆菌K599，得到RNAi抑制载体。

作为优选，构建大豆基因GmFBX193的RNAi抑制载体后，利用发根农杆菌进行大豆转化产生转基因毛状根，通过对所得转基因植株的GmFBX193基因表达量分析，得到提高大豆干旱胁迫应答能力的转基因植株。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：

本发明发现GmFBX193基因可作为一个负调控因子参与大豆根对盐胁迫的响应，通过耐盐性检测发现，其有效降低了大豆根对盐胁迫的耐受性；通过生理数据进一步发现，GmFBX193基因可能通过影响相对电导率、MDA含量、SOD含量和叶绿素含量来调节大豆根对盐胁迫的响应。该发现的获得对于研究大豆根盐胁迫应答分子机理研究，通过基因编辑方法培育耐盐大豆新品种拓展了有效解决途径。

附图说明

图1为GmFBX193基因的克隆示意图，其中M：DL2000 marker；A：GmFBX193目的片段的扩增，引物为nGmFBX193-F，nGmFBX193-R；B：质粒PCR检测GmFBX193-pMD19-T，1：以nGmFBX193-F，nGmFBX193-R引物扩增检测，2：以M13F，M13R引物扩增检测；

图2为GmFBX193植物表达载体的构建示意图，其中M：DL2000 marker；A：目的片段的扩增，1：GmFBX193开放阅读框的扩增，引物为nGmFBX193-256F，nGmFBX193-256R；B：菌液PCR检测GmFBX193开放阅读框，1-4：阳性菌株，引物为nGmFBX193-256F，nGmFBX193-256R。

图3为GmFBX193基因表达模式分析示意图，其中数据通过内参基因CYP2校准，A：GmFBX193在大豆不同组织表达量；B：盐胁迫下不同时间段GmFBX193的相对表达量；“*”表示P<0.05，“**”表示P<0.01；

图4为GmFBX193-ORF-pEGAD转化K599菌液PCR检测，1-5：阳性菌株，6：GmFBX193-ORF-pEGAD质粒对照，7：水对照；

图5为大豆毛状根转化流程示意图；

图6为GmFBX193转基因大豆毛状根分子鉴定示意图，其中A：GmFBX193转基因大豆毛状根在基因组水平的鉴定，1-6：PCR检测结果，7：GmFBX193-ORF-pEGAD质粒对照，8：pEGAD空载体对照，9：清水对照；B：GmFBX193转基因大豆毛状根在转录水平的鉴定，数据通过内参基因CYP2校准，“**”表示P<0.01；

图7为过表达GmFBX193转基因毛状根大豆复合体植株表型及存活率示意图；

图8为过表达GmFBX193转基因毛状根复合体大豆生理指标的测定示意图，其中A：过表达GmFBX193转基因大豆复合体植株相对电导率检测；B：过表达GmFBX193转基因大豆复合体植株叶绿素含量的检测；C：过表达GmFBX193转基因大豆复合体植株MDA含量的检测；D：过表达GmFBX193转基因大豆复合体植株SOD含量的检测。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1 GmFBX193基因克隆

通过新型植物基因组DNA提取试剂盒，进行大豆毛状根DNA提取，具体方法参照试剂盒说明书。根据GmFBX193基因序列设计克隆引物nGmFBX193-F与nGmFBX193-R，以大豆毛状根DNA为模板扩增GmFBX193基因，扩增体系、引物如下：

表1 PCR扩增体系

表2所用引物

反应条件：94℃，5min；94℃，30s，58℃，30s，72℃，40s，35个循环；72℃，10min，通过1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。通过普通DNA凝胶回收试剂盒进行目的片段纯化回收，具体步骤参照说明书。将回收产物(大小为1074bp)与pMD19-T载体连接，充分混匀，短暂离心，22℃连接8h。

连接体系如下：

表3克隆连接体系

将连接产物通过热激转化法转入大肠杆菌DH5α中，涂布含有氨苄抗生素的LB固体平板，37℃培养箱中培养12h。挑取白色单克隆，置于1mL的LB液体培养中，37℃摇床230rpm培养12h，待浑浊后进行菌液PCR检测。将正确菌液送至上海生工生物工程股份有限公司进行测序，测序无误后，对正确菌液提质粒，具体步骤参照天根质粒小提试剂盒说明书，经测序验证成功克隆GmFBX193基因(序列如SEQ ID NO：1所示)，将质粒标记为GmFBX193-pMD19-T。如图1所示，A图泳道1为扩增的含有GmFBX193开放阅读框序列的片段，大小为1074bp。B图泳道1为采用nGmFBX193-F和nGmFBX193-R引物检测GmFBX193-pMD19-T质粒的PCR扩增结果，大小为1074bp。泳道2：用pMD19-T载体通用引物M13F和M13R引物检测GmFBX193-pMD19-T质粒的PCR扩增结果，扩增片段大小大于1074bp，说明GmFBX193已经成功插入到pMD19-T载体中。

实施例2 GmFBX193植物表达载体的构建

以克隆目的序列为基础，设计表达载体引物，并在引物中插入正向Nco I和反向Bgl II酶切位点，引物序列为：

nGmFBX193-256F：

5'-TTTGAATTCATGGCATCTGAAGAAGTTCTGAA-3'

nGmFBX193-256R：

5'-TTTGGATCCTTACTTCCAGTCAAGCATGTCC-3'

以GmFBX193-pMD19-T质粒为模板，进行GmFBX193基因开放阅读框的扩增，扩增反应体系如表4所示。然后通过普通DNA凝胶回收试剂盒进行目的片段纯化回收，具体步骤参照说明书。

表4扩增反应体系

利用限制性内切酶Nco I和Bgl II将回收产物与pEGAD载体质粒进行双酶切，反应条件为37℃过夜酶切，酶切反应体系如表5所示。

表5酶切体系

酶切后通过普通DNA产物回收试剂盒进行回收，并将回收产物与pEGAD表达载体进行连接，反应条件为22℃过夜连接，连接体系如表6所示。

表6表达载体连接体系

将连接产物通过热激击转化法转入大肠杆菌DH5α中，涂布含有卡那抗生素的LB固体平板，37℃培养箱中培养12h。挑取白色单克隆，置于1mL的LB液体培养中，37℃摇床230rpm培养12h，待浑浊后进行菌液PCR检测。将正确菌液送至上海生工生物工程股份有限公司进行测序。所得GmFBX193基因开放阅读框为786bp，经测序验证，成功构建了GmFBX193植物表达载体，标记为GmFBX193-ORF-pEGAD。如图2所示，利用引物nGmFBX193-256F和nGmFBX193-256R从GmFBX193-pMD19-T质粒中扩增出786bp的GmFBX193开放阅读框序列(A)。重组菌液PCR检测表明GmFBX193开放阅读框786bp已经插入到植物表达载体pEGAD256中(B)。

实施例3在盐胁迫的大豆根中GmFBX193表达模式分析

为了鉴定GmFBX193是否参与大豆盐胁迫响应。分别提取水培20天大豆不同组织的总RNA，利用实时荧光定量PCR技术分析了在大豆根，茎，叶和子叶中，GmFBX193的转录水平，如图3A所示，GmFBX193在上述四种组织中都有表达，在根中GmFBX193表达量最高。

因为GmFBX193在大豆根中表达量最高，所以选择对根进行盐胁迫来分析GmFBX193在盐胁迫的大豆根中的转录水平。250mM NaCl胁迫后大豆根2h，6h，12h和24h。提取胁迫后的大豆根RNA，利用实时荧光定量PCR技术对其在盐胁迫下的表达量进行分析，结果如图3B所示，在盐胁迫6h的大豆根中GmFBX193表达量与对照相比表达量呈显著下调的趋势，说明GmFBX193在大豆根中应答盐胁迫。

实施例4GmFBX193基因转化大豆毛状根

利用冻融法将GmFBX193-ORF-pEGAD过表达载体转化发根农杆菌K599菌株中，经菌液PCR验证，农杆菌转化成功。如图4所示，能够从转化发根农杆菌K599菌株中扩增出GmFBX193大小为786bp的开放阅读框序列。利用平板划线法将GmFBX193过表达载体菌株活化。将K599、过表达GmFBX193载体的K599发根农杆菌涂抹大豆子叶下部区域，将侵染过的大豆幼苗置于保湿系统盖上保鲜膜，室内温度25℃湿度50％，每天进行通风2-4min，每隔两天在滤纸上喷一次水，操作过程中防止将水喷在大豆子叶上会造成植株腐烂，7天后开始长出毛状根，随后将其转移到水中及土壤中培养15-20天观察生长情况进行后续的试验。大豆毛状根转化流程如图5所示。获得转化大豆毛状根。

实施例5转基因大豆毛状根分子水平的鉴定

对转基因大豆毛状根进行基因组水平的鉴定与转录水平的鉴定。大豆毛状根的DNA提取方法参照天根新型植物基因组DNA提取试剂盒说明书。以载体上游引物与自身引物进行PCR检测目的条带，反应体系参照试剂说明书。

在GmFBX193过表达大豆毛状根中利用qRT-PCR方法检验GmFBX193的相对表达量，RNA的提取方法参照Bio Flux植物总RNA提取试剂盒说明书，通过天根FastKing cDNA第一链合成试剂盒反转录合成cDNA，全式金Green qPCR SuperMix荧光定量试剂盒进行qRT-PCR，反应程序及体系参照说明书。

随机取GmFBX193转基因毛状根各6株提取基因组DNA进行基因组水平的鉴定，以GmFBX193-ORF-pEGAD质粒为阳性对照，pEGAD空载体与水为阴性对照，结果如图6A所示，表明目的基因成功转化大豆毛状根。此外，如图6B所示，通过qRT-PCR检测转基因毛状根中GmFBX193表达情况发现，与对照植株K599相比，GmFBX193基因在过表达株系中表达量较高。

实施例6转基因复合体大豆耐盐性检测

待转化对照植株K599、过表达GmFBX193载体的大豆长出毛状根后，一组将复合体大豆转移至营养土中培养20d，停止浇水3d后进行250mM NaCl胁迫6d，每两天浇一次胁迫液。另一组将复合体大豆进行250mM NaCl胁迫24h，胁迫后对过表达GmFBX193株系进行观察统计，实验重复3次(每个株系30个重复)，观察表型并统计存活率。

结果如图7所示，一组将复合体大豆植株转移至营养土中培养20d，停止浇水3d后进行250mM NaCl胁迫6d，每两天浇一次胁迫液观察表型并统计存活率发现，对照植株的存活率为46％，GmFBX193复合体大豆的存活率为33.3％。另一组将转化植株转移水中培养20d，进行250mM NaCl胁迫24h，对盐胁迫后存活率统计发现，对照植株的存活率为53.3％，GmFBX193的存活率为37％，以上结果说明，过表达GmFBX193基因降低了复合体大豆的耐盐性。

实施例7盐胁迫下复合体大豆生理指标测定

将对照植株K599、过表达GmFBX193载体转化的大豆毛状根转移至水中培养20d，使用250mM NaCl胁迫24h对大豆叶片叶绿素含量、相对电导率、SOD(超氧化物歧化酶)含量、MDA(丙二醛)含量进行测定，测定方法参照试剂盒说明书。

对GmFBX193复合体大豆相关生理指标进行检测，结果如图8所示，复合体大豆与对照大豆盐胁迫前相对电导率(A)、叶绿素含量(B)、MDA含量(C)、SOD含量(D)等并无显著差异，但盐胁迫后，与对照植株相比，过表达GmFBX193植株中相对电导率(A)、MDA含量(C)较高，盐胁迫后过表达GmFBX193株系叶绿素含量(B)、SOD含量(D)低于对照植株。由此表明，过表达GmFBX193降低了复合体大豆的耐盐性。

实施例8

根据GmFBX193的开放阅读框序列，选择区域进行RNAi载体构建。

将抑制区段构建到pCAMBIA3301载体中，将构建好的GmFBX193-RNAi载体转化发根农杆菌K599，转化大豆产生转基因毛状根。

一组将对照植株K599、GmFBX193-RNAi载体转化的复合体大豆转移至营养土中培养20d，停止浇水3d后进行250mM NaCl胁迫6d，每两天浇一次胁迫液。另一组将对照植株K599、GmFBX193-RNAi载体转化的复合体大豆进行250mM NaCl胁迫24h，胁迫后对GmFBX193-RNAi株系进行观察统计，实验重复3次(每个株系30个重复)，观察表型并统计存活率。

结果表明抑制GmFBX193-RNAi基因提高了复合体大豆的耐盐性。

将对照植株K599、GmFBX193-RNAi载体转化的大豆毛状根，转移至水中培养20d，使用250mM NaCl胁迫24h对大豆叶片叶绿素含量、相对电导率、SOD含量、MDA含量进行测定，测定方法参照试剂盒说明书。

对GmFBX193-RNAi复合体大豆相关生理指标进行检测，复合体大豆与对照大豆盐胁迫前相对电导率、叶绿素含量、MDA含量、SOD含量等并无显著差异，但盐胁迫后，与对照植株相比，GmFBX193-RNAi植株中相对电导率、MDA含量较低，盐胁迫后GmFBX193-RNAi株系叶绿素含量、SOD含量高于对照植株。由此表明，抑制GmFBX193提高了复合体大豆的耐盐性。

序列表

<110> 新疆农业大学

<120> GmFBX193基因在负调控大豆盐胁迫应答中的应用

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 786

<212> DNA

<213> GmFBX193基因

<400> 1

atggcatctg aagaagttct gaaggctgtt ttccctttcc tggacagtgt tgatcttgct 60

tcttgcatgg gcgtttgtac gcagtggaaa gacatagcta gcgatgattt cttttggaaa 120

tgtctgtgtg ccaagagatg gccttcaatc tgcaagcgac ccaatccttc aactttaaca 180

tactacaact tgtacaaaac ctttcataaa cgccagcatc acagaactct tctccctctg 240

agaatttctt ttgatgattt ggagttcttc attgacactt gggctgaaaa cacattactc 300

ttctcggaag tggtgcctgg ctctgtcctt caagcaggtt ttaaaattcc agcatctgga 360

ggttgcaacg tgctcaaatt tcaattggaa ggttctaaat acaagatgac ttttcctgtg 420

gaacataggt tcactatccc ttcaggacaa aaccagaatg ttagtgtctc tgtgatggtt 480

gggagaaagg attcaaataa ggttgctcgc atagtaacca agtccacggt tgattgcatt 540

gtagtaacca agtccatgtc tggttacatc gatcgttcat tacatagagc catgggtttt 600

gattacctag acatatcccc ttgctaccct tttgtgtctc gcatccgtgc atggatctct 660

ttgctattca tggaagataa aaatgaagat ctcatggatg tatttgcgat ccaaatgaat 720

ttctgtgatg tggcaaattc taaggaagaa gtcttgtggc tgttggacat gcttgactgg 780

aagtaa 786

Claims (3)

1.GmFBX193基因在负调控大豆盐胁迫应答中的应用，其特征在于，所述基因的编码区序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种制备耐盐胁迫大豆的方法，其特征在于，通过对GmFBX193基因的编码区进行基因RNAi抑制，致使GmFBX193基因功能丧失，从而获得耐盐大豆植物，所述基因的编码区序列如SEQ ID NO：1所示。

3.抑制GmFBX193基因的RNAi载体在制备耐盐大豆中的应用，其特征在于，所述基因的编码区序列如SEQ ID NO：1所示。