CN107354161B - 西瓜Cla005622基因在提高喜温作物低温胁迫抗性中的应用 - Google Patents

西瓜Cla005622基因在提高喜温作物低温胁迫抗性中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了MYB‑related转录因子Cla005622基因在提高在低温下烟草抗逆性的应用，属于植物基因工程技术领域。通过构建过表达烟草植株，对Cla005622基因进行低温胁迫功能验证，对其过表达烟草的表型鉴定、细胞膜损伤鉴定、部分冷胁迫基因表达谱构建得出，过表达Cla005622能提高烟草对低温逆境的抗性。在今后的研究中可以通过转基因的手段将Cla005622基因整合到西瓜或者其他物种的基因组中，从而提高植株在低温下的抗逆性，起到保护植株、增加产量的作用。

Description

西瓜Cla005622基因在提高喜温作物低温胁迫抗性中的应用
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及到Cla005622基因在提高喜温作物植株低温胁迫抗性的应用。
背景技术
西瓜(Citrullus lanatus)是重要的葫芦科作物，在世界蔬菜种植面积中占7％。西瓜年产量约为90亿吨，具有较高的市场供应。西瓜是典型的喜温作物，在早春西瓜生产中，为提早上市而进行早播种，因此常会遭受到低温的影响。低温已经成为西瓜生产中主要的非生物限制因子，严重制约着西瓜的周年供应和种植效益的提高。在西瓜物种中，利用分子育种选育耐低温品种是应对西瓜低温胁迫的最高效、最有效的措施。因此，发掘西瓜中的低温抗逆基因是研究西瓜低温胁迫的重要前提条件。
转录因子在参与植物逆境调控中担任重要角色。其中MYB蛋白组成了植物最大的转录因子家族之一，同时MYB转录因子在植物应答外界胁迫环境中起着重要作用。本发明以10℃低温处理西瓜植株后取样进行转录组测序分析发现MYB-related转录因子Cla005622的表达量显著上调，进一步通过超量表达烟草遗传转化的方法鉴定其耐低温功能及调控作用。
发明内容
本发明的第一个目的是提供西瓜Cla005622基因在提高喜温作物低温胁迫抗性中的应用。本发明的第二个目的是提供一种提高烟草低温胁迫抗性的方法。
为了实现本发明目的，通过对Cla005622基因超量表达烟草遗传转化，获得转基因烟草植株，并对超表达烟草植株进行低温胁迫处理验证其耐低温功能。
本发明涉及的Cla005622基因序列为：Seq ID NO：1所示为核苷酸序列。该基因位于西瓜第10号染色体Chr10:2675363..2675869(+strand)，为MYB家族转录因子。测序物种为西瓜97103。
本发明还提供异源基因构建转基因烟草的方法，包括以下步骤：
1)以西瓜总cDNA为模板，设计特异性引物，扩增西瓜Cla005622基因ORF全长序列，并在基因两端分别加上pHellsgate8通用接头位点和Xho I、Xba I的酶切位点，将扩增产物构建到表达载体pHellsgate8上，获得重组表达载体pHellsgate8-Cla005622；
2)用构建的重组表达载体pHellsgate8-Cla005622转化农杆菌，然后利用转化的农杆菌介导转化烟草，获得转基因烟草植株，
所述西瓜Cla005622基因的核苷酸序列如Seq ID NO：1所示。
优选地，步骤1)中所述的特异性引物为：
F：AGACGAAAGAGGCGTTCCAG
R：AGACGAAAGAGGCGTTCCAG。
优选地，所述农杆菌为LBA4404。
将转基因植株超表达后进行低温处理功能验证，结果证明Cla005622基因在烟草中具有较强的耐低温能力。
采用本发明提供的方法还可以通过转基因的手段将西瓜Cla005622基因整合到西瓜、西红柿或者其它喜温作物的基因组中，从而提高植株在低温下的抗逆性，起到保护植株、增加产量的作用。
附图说明
图1构建的目的基因、pHellsgate8载体质粒、重组质粒表达载体及农杆菌感受态的胶图。
图2转基因植株以DNA为模板的阳性鉴定(1-9：超量表达植株)。
图3植株低温逆境处理下的表型变化。
图4冷害指数变化。
图5 4℃低温处理不同时间点相对电导率变化。
图6 4℃低温处理不同时间点丙二醛含量变化。
图7低温胁迫下植物逆境胁迫下Cla005622表达量变化。
图8低温胁迫下植物逆境胁迫下应答基因rab18表达量变化。
图9低温胁迫下植物逆境胁迫下应答基因ABI1表达量变化。
图10低温胁迫下植物逆境胁迫下应答基因ABI2表达量变化。
图11低温胁迫下植物逆境胁迫下应答基因DREB2A表达量变化。
图12低温胁迫下植物逆境胁迫下应答基因P5CS表达量变化。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行详细地说明。
实施例1Cla005622超量表达烟草遗传转化
1.1从葫芦科数据库网站(http://cucurbitgenomics.org/feature/gene/Cla005622)下载目的基因序列，西瓜Cla005622基因的核苷酸序列如Seq ID NO：1所示。
1.2Primer3plus(http://primer3plus.com/cgi-bin/dev/primer3plus.cgi)设计特异性引物扩增西瓜Cla005622基因，所设计的引物序列为：
F：AGACGAAAGAGGCGTTCCAG
R：AGACGAAAGAGGCGTTCCAG
1.3西瓜cDNA的提取
RNA提取使用TransZol法(Transgen Biotech生物公司)。取0.2g的叶片在2mL的RNA专用离心管中研磨，之后按照实际说明书植物材料样品操作进行。反转录参考
Figure BDA0001366008760000031
ⅡqRT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)(Vazyme生物公司)试剂盒说明书进行，得到西瓜cDNA。
1.4PCR反应
基因克隆采用50μL反应体系，包括2*High-Fidelity Master Mix 25μL、前后引物各2μL(0.4μmol)、西瓜cDNA 1μL(200ng)、ddH2O 7μL。PCR反应程序为：98℃预变性2min，98℃变性10s，57℃退火15s，72℃延伸15s，35个循环，72℃终延伸5min。图1A所示，条带在1000bp左右，符合正确位置。对正确位置的目的片段进行切胶回收，Nanodrop 2000进行浓度测定。
1.5在基因两端加上pHellsgate8通用接头位点和Xho I、Xba I的酶切位点，引物及pHellsgate8通用接头位点和Xho I、Xba I的酶切位点的序列如下：
F：5'–CATTTGGAGAGGACACGCTCGAGATGACGCGGCGGTGTTCA-3'
R：5'-TCTCATTAAAGCAGGACTCTAGATTAAACAGCATGGATTGGAC-3'。
1.6pHellsgate 8质粒载体双酶切及重组连接反应：
采用50μL反应体系，包括Xba I 2μL(0.4U)，Xho I 1μL(0.2U)，10*M buffer 5μL，质粒DNA 15μL(3000ng)，ddH2O补足。PCR反应程序为：37℃3h。1.5％琼脂糖电泳检测，试剂盒回收正确的线性化载体DNA片段。由图1B所示，pHellsgate8载体质粒双酶切结果为两条条带，证明酶切完成。
1.7大肠杆菌DH5α感受态细胞：
具体方法参考Trans5α Chemically Competent Cell说明书。鉴定、测序及保存，由图1C所示，大肠杆菌菌落PCR鉴定正确，送公司测序，测序比对正确后将菌液LB培养基过夜摇菌进行扩大培养，之后加入等量无菌50％甘油于-80℃中保存。得到重组质粒表达载体。
1.8制备农杆菌LBA4404感受态：
所用农杆菌LBA4404菌株是常用的植物载体菌株，本身带有链霉素抗性和利福平抗性，培养温度为28℃，摇菌转速一般为180～220rpm，是一种弱毒的农杆菌，常用YEP培养基来培养。1)划线活化农杆菌菌株，在划线平板上挑取单菌落，接种于5mL含50mg/L Rif(Rif,Rifampicin利福平)YEB液体培养基中，28℃，200r/min培养2-3天。2)从上述产物中吸取2mL接种于50mL LB/Rif(50mg/L)液体培养基中，28℃，200r/min培养至OD600处于0.6-0.8之间，冰上静置30min。3)4℃，5000r/min离心15min弃去上清，在沉淀中加入30mL10％无菌预冷甘油轻轻悬浮。重复离心去上清加甘油悬浮步骤2遍，弃掉上清的沉淀中加入30mL10％预冷甘油。离心弃上清，加入1mL 10％甘油保存后按需要体积进行-80℃分装保存。
1.9电转化农杆菌LBA4404感受态：
取100ng-150ng重组质粒植物表达载体和50μL农杆菌LBA4404感受态细胞轻轻混匀，冰浴30min。转移至提前清洗干净且在冰上预冷20min后的电转杯，1.8KV，6ms电击。向电转杯中立即加入1mL YEB无抗液体培养基反复吹打混匀，之后全部转入无菌的1.5mL离心管，28℃，200r/min培养2h使其复苏。取200μL菌液涂布于涂布YEB/Rif/Spe(均为50mg/L)固体培养基，28℃，倒置培养2-3d。挑取单克隆进行菌落PCR，如图1D所示，农杆菌菌落PCR鉴定检测，无误后25％甘油-80℃保存。
1.10农杆菌介导转化野生烟草：
抗生素准备：Rif(Rifampicin利福平)；6-BA(6-Benzylaminopurine 6-苄氨基嘌呤)；Kana(kanamycin卡那霉素)；Spe(spectinomycin壮观霉素)；Car(carbenicillin羧苄青霉素)。
农杆菌菌液准备：将测序结果正确的菌液扩大培养，取200μL加入到50mL YEB液体培养基(Rif 50mg/L，Spe 50mg/L)中，28℃，220r/min黑暗培养至OD600值约为0.8，此时菌的活性最高。
培养基准备：配制MS固体培养基，121℃高压灭菌15min，取出待温度降至55℃左右时，加入6-BA使终浓度达到3mg/L为共培养培养基；分别加入6-BA 3mg/L、卡那霉素100mg/L、羧苄青霉素200mg/L为筛选培养基；加入羧苄青霉素200mg/L为生根培养基。
无菌烟草叶片准备：挑选新鲜嫩绿的叶片，沿叶脉切成羽状，50mL试管中加入20mLMS液体培养基和2mL菌液，将切好的叶片放入管中，50r/min轻摇40min。用事先准备好的无菌滤纸吸去叶片残留的液体，然后将滤纸揭开，晾干约20min，然后将叶片放入共生培养基室温避光培养3d。共培养结束之后，将叶片转移至筛选培养基中。约3-4周后，切掉长出来的根系，转移到生根培养基中生长约2周后出现新的根系。将生有根系的植株转移至灭菌后的土壤中，高温高度环境下生长1周，之后将烟草接触空气生长，控制条件在室温25℃，光周期16h/8h、光强100μmol m-2s-1条件下培养。将获得的植株进行分栽移植，获得T0代植株，收种编号后保存。
实施例2T1代超表达烟草低温处理表型鉴定
2.1T0代阳性鉴定
转基因烟草植株阳性鉴定：以DNA为模板做PCR扩增目标基因片段。引物序列F：5’-ATGACGCGGCGGTGTTCA-3’，R：5’-TTAAACAGCATGGATTGGAC-3'。采用20μL反应体系，其中包含模板DNA 20ng，上下游引物各1μL(0.25μmol/L)， PCR SuperMix 10μL，ddH2O补齐。反应程序为95℃3min；94℃30s，57℃30s，72℃1min，30个循环；72℃5min。用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测目的基因条带正确与否。其中转基因烟草阳性植株不同株系表达量鉴定：筛选NtL25和NtActin作为定量表达的内参基因(Schmidt and Delaney 2010)。引物信息如下：
实时荧光定量PCR引物
基因名称 上游引物5'-3' 下游引物5'-3'
Cla005622 ACGCGGCGGTGTTCACATTG AACCGTCGGTCAATCGGACTC
NtL25 CCCCTCACCACAGAGTCTGC AAGGGTGTTGTTGTCCTCAATCTT
NtActin AATGGAACTGGAATGGTCAAGGC TGCCAGATCTTCTCCATGTCATCCCA
2.2T1代低温处理
通过上步骤的鉴定后表达量高的株系进行筛种与播种。种子使用次氯酸钠消毒，之后播种于含有50mg/L卡那霉素的MS培养基上，生长的光周期为16h/8h，光强为100μmolm-2s-1，4d-5d之后开始发芽，当植株长出两片叶时，挑取长势较好、植株颜色较绿的植株移栽至灭菌过的基质中生长，观察长势状况。移栽至土中的开始一周内，使用塑料膜覆盖，防止水分过多蒸发而导致叶片干枯。期间定期浇水，营养液在生长半月之后补充一次。30d之后，在培养的植株中筛选长势相同的野生型和转基因行植株，放置于冷库中培养生长，观察长势。冷库中的环境指数为温度4℃，光周期16h/8h，光强100μmol m-2s-1，分别在处理6h、12h、24h、48h时间点观察烟草的长势状况，拍照后通过表型变化进行初步判断，并同时取部分叶片进行液氮速冻保存用于后续实验的进行，将取样叶片保存至-80℃的环境中。从图2中可以看出，Cla005622在WT野生型烟草植株中不表达，在转基因植株中均有表达。选择表达量较高的株系能够增加实验的准确性，因此选用1和2进行后续实验，命名为OE1及OE2。
2.3冷害指数测定
参考许勇论文中的方法稍作改变(许勇1998)。每种株系各75株，4℃低温处理(光周期16h/8h，光强100μmol m-2s-1)，分别在0h，6h，12h，24h，48h时间点拍照并进行冷害级别对应之下的数量统计。计算公式为：冷害指数＝Σ(各级株数×级数)/总株数。由图4可知，在低温逆境处理6h后，植株的冷害指数达到70％以上，WT比例高于OE1、OE2；继续处理到12h，WT植株萎蔫比例达到85％以上，此时冷害指数达到最高，与表型变化中12h萎蔫最严重结果相符，但OE1、OE2的萎蔫程度比WT植株低；低温处理24h及48h后，冷害指数比例逐渐下降，与表型变化中48h植株萎蔫状态逐渐恢复相符。由图3表型观察看出，6h和12h植株叶片萎蔫严重，其中WT比OE1和OE2萎蔫程度更加明显；24h及48h植株逐渐恢复，但是WT恢复程度弱于OE1及OE2，由植株表型萎蔫程度说明Cla005622对低温胁迫是正调控作用。
2.4电导率、丙二醛测定
电导率测定参照邹琦2000年出版的《植物生理学实验指导》中的实验方法。分别取低温处理不同时间点的新鲜植物叶片0.1g，叶片需平整无褶皱。采用直径1cm的打孔器在相应位置打孔，事先准备50mL装有10mL ddH2O的相同带盖离心管，25℃，200r/min摇床摇3h后测定电导率E1；测定结束后放置在100℃水浴锅中煮沸30min，室温静置冷却，测定电导率E2；相对电导率计算采用公式REC(％)＝E1/E2×100％。相对电导率的含量变化趋势为：4℃低温处理前，WT、OE1、OE2植株的电导率差异较小；4℃低温处理6h，WT和OE1、OE2的测定值均有不同程度升高，WT的增加率高于OE1、OE2；4℃处理12h，WT和OE1、OE2植株的测定值仍在不断升高，植株细胞膜仍处于受损状态，WT的增加率显著高于OE1、OE2；4℃处理24h，测定值逐渐下降，表明植株逐渐适应逆境，自身调控系统功能逐渐恢复；4℃处理48h后，植株的测定值缓慢下降。从图5趋势来看，Cla005622在低温胁迫下具有一定的抗性。
丙二醛测定使用植物丙二醛(MDA)测试盒，产自南京建成生物工程研究所。依据实验需求方法稍作变动，基本原理不变。4℃低温处理前，WT和OE1、OE2丙二醛含量差异较小；4℃处理6h，WT和OE1、OE2植株的测定值均不同程度升高，WT植株受损伤程度更严重；4℃处理12h，WT和OE1、OE2植株测定值不断加大，细胞膜脂过氧化程度加深，WT测定值明显高于OE1、OE2植株；4℃处理24h、48h，测定值逐渐下降，测定值下降，植株的受损伤程度降低。因此本部分实验得出结论：由图6可知，从细胞膜损伤角度验证Cla005622对低温胁迫是正调控作用。
2.5冷胁迫基因表达量测定
对转基因植株进行DNA和RNA提取。选取植物中的比较常见的生物胁迫和ABA介导途径相关的调控基因ABI1、ABI2、rab18、DREB2A、P5CS和对照NtL25及NtActin基因进行qRT-PCR表达量测定。
实时荧光定量PCR引物
Figure BDA0001366008760000071
2.5.1Cla005622对冷胁迫基因rab18、ABI1、ABI2表达量的影响
植物在对低温逆境应答过程中，ABA含量会明显增加(Chen and Gusta 1983)。ABA参与很多逆境反应，其信号转导途径包含两种，受ABA诱导表达的多数基因来自于对环境胁迫的响应过程。因此，选择rab18(Lang and Palva 1992)、ABI1(Strizhov et al 1997)、ABI2(Koornneef et al 1984)来判断ABA信号转导途径下基因的表达量变化。
Cla005622在WT和转基因株系中的表达量鉴定。由图7可知，由于基因来自于西瓜物种中，因此在烟草的WT物种中没有表达。在转基因株系中低温处理6h下植物受到低温胁迫，Cla005622的表达量升高。
rab18是响应ABA信号转导途径的正调控基因，在植物受到逆境胁迫时，表达量升高来提高植物对逆境的抵抗能力。从图8可看出，低温处理6h和12h时，受到低温逆境胁迫后rab18在OE株系中表达量增加较多，抵抗胁迫能力较强，而WT株系中变化不大，在低温处理24h及48h后，植物由于长时间处于低温状态，rab18表达量逐渐减少，但是OE株系表达量降低较慢，推测是由于Cla005622超量表达提高了rab18的表达量，进而提升植株对低温胁迫的抗性。
ABI1、ABI2基因是负调控ABA信号转导途径的两个基因，在植物遭受逆境胁迫时，抑制应激ABA的产生，使植物对逆境抵抗性降低。由图9、图10可知，低温处理6h和12h时，植物受到低温逆境胁迫后ABI1、ABI2的表达量均降低，但OE株系中表达量降低较多，受到抑制性较WT植株低，对逆境抵抗能力较强。推测是由于Cla005622超量表达降低了ABI1、ABI2的表达量，植株受到的抑制性减弱，进而提升植株对低温胁迫的抗性。
2.5.2Cla005622对冷胁迫基因DREB2A、P5CS表达量的影响
植物受到低温胁迫后机体内部会产生一系列变化，基因与基因间的某种调控引起各自表达量变化，使植株在表型上发生变化。通过鉴定低温胁迫基因表达量变化，推测目的基因超量是否会引起冷胁迫基因表达量变化共同调控逆境抗性。本部分筛选DREB2A(Shinozaki and Yamaguchi2000)、P5CS(Strizhov et al 1997)2个冷胁迫基因进行表达量变化分析。
DREB2A是DREB转录因子家族基因中的一员，主要参与植物逆境胁迫响应，是一种正调控作用的转录因子。DREB转录因子中多数基因都能够提高植物对于低温胁迫的应答，只有少数基因的正负调控机制尚不明确。由图11可知，低温处理6h和12h时，植物受到低温逆境胁迫下DREB2A的表达量均升高，但OE转基因株系中表达量升高较多，同时处理24h及48h后，OE株系DREB2A的表达量仍比WT株系表达量高。推测是由于Cla005622超量表达提高了DREB2A的表达量，提升植株对低温胁迫的抗性。
P5CS是一种典型的逆境胁迫基因，主要促进逆境胁迫时细胞中游离脯氨酸的合成，保护细胞免受胁迫损伤。游离脯氨酸是一种细胞保护性物质，在植物遭受低温胁迫时大量合成保护细胞免受胁迫损伤。由图12可知，低温处理6h和12h时，植物受到低温逆境胁迫后P5CS的表达量均有不同程度的升高，但OE株系中表达量升高较多。推测是由于Cla005622超量表达提高了P5CS的表达量，提升植株对低温胁迫的抗性。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 西瓜Cla005622基因在提高喜温作物低温胁迫抗性中的应用
<160> 1
<210> 1
<211> 1005
<212> DNA
<213> 西瓜
<400> 1
ATGACGCGGC GGTGTTCACA TTGCAGCCAC AATGGCCATA ACTCTCGGAC TTGTCCGAAT 60
CGCGGTGTCA AGCTCTTTGG AGTCCGATTG ACCGACGGTT CCATCCGGAA GAGTGCTAGT 120
ATGGGGAATC TGAACCACTA TGCAGGATCC GGGTCGGGTG CTCTGCAAGG CGGGTCGAAC 180
AATCCGGCTT CTCCCGGAGA GACTCCTGAG CATGGCGTTG CGGCTGACGG CTATGCGTCG 240
GAGGATTTCG TTCCTGGCTC ATCTTCTAGT TGCCGTGAGA GGAAGAAAGG TGTTCCATGG 300
ACTGAGGAGG AGCATAGGAT GTTTTTATTG GGATTACAGA AACTTGGAAA AGGAGACTGG 360
CGTGGGATAG CACGCAATTA TGTTGTATCT AGGACACCTA CACAGGTGGC AAGCCATGCC 420
CAAAAGTATT TCATAAGGCA GACCAATGTA TCAAGACGAA AGAGGCGTTC CAGTTTGTTT 480
GATATTGTTG CTGACGAACA TGCTGAGAAT TCAATTGTGC AGCAAGACTT CCTATCTGTC 540
AACAGTTCGC ATGCTGAATC ACAAAGCAAT AACCCATTGC CTACACCTCC TACTGTGGAT 600
GAAGAATGCG AATCGATGGA TTCCACCAAC TCAAATGATG GAGAAACAGC ACCTGCAGAG 660
CCAGATGGTC CGCAATGCTG TTATCCAGTG GTATACCCTG CATATGTTGC ACCATTCTTT 720
CCATTTTCTA TACCATTCTA CTCGGGATAC GGTGCAGAGA CCACTAATAA GGAGACACAT 780
GAGGTTCTTA AGCCAACAGC CGTGCATTCA AAGAGTCCTC TCAATGTTGA TGAGCTGATT 840
GGTATGTCGA AACTAAGTCT GGGAGAATCG ATTGGTCATG CTGGCCCCTC TTCTCTTTCA 900
CTGAAACTAC TTGAAGGATC ATCTAGACGG TCTGCTTTCC ATGCAAATCC AGCTTCTGGC 960
AGTGAAAACA TGAATTCTGG TGGCAGTCCA ATCCATGCTG TTTAA 1005

Claims (5)

1.西瓜Cla005622基因在提高喜温作物低温胁迫抗性中的应用，所述西瓜Cla005622基因的核苷酸序列如Seq ID NO：1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述喜温作物为西瓜、西红柿或烟草。
3.一种提高烟草低温胁迫抗性的方法，其特征在于包括以下步骤：
1)以西瓜总cDNA为模板，设计特异性引物，扩增西瓜Cla005622基因ORF全长序列，并在基因两端分别加上pHellsgate8通用接头位点和Xho I、Xba I的酶切位点，将扩增产物构建到表达载体pHellsgate8上，获得重组表达载体pHellsgate8-Cla005622；
2)用构建的重组表达载体pHellsgate8-Cla005622转化农杆菌，然后利用转化的农杆菌介导转化烟草，获得转基因烟草植株，
所述西瓜Cla005622基因的核苷酸序列如Seq ID NO：1所示。
4.根据权利要求3所述提高烟草低温胁迫抗性的方法，其特征在于，步骤1)中所述的特异性引物为：
F：AGACGAAAGAGGCGTTCCAG
R：AGACGAAAGAGGCGTTCCAG。
5.根据权利要求3所述提高烟草低温胁迫抗性的方法，其特征在于：所述农杆菌为LBA4404。
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Assignee: Qicai Vegetable Core (Beijing) Technology Co.,Ltd.

Assignor: HUAZHONG AGRICULTURAL University

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Denomination of invention: Application of Watermelon Cla005622 Gene in Improving Low Temperature Stress Resistance of Thermophilic Crops

Granted publication date: 20200214

License type: Exclusive License

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