CN103214564B - 香蕉MYB转录因子MaMYB的克隆及表达载体构建 - Google Patents

Abstract

本发明公开香蕉MYB转录因子MaMYB的克隆及表达载体构建，提取香蕉“Musa spp.”总RNA，反转录合成cDNA，以此为模板，设计特异引物，利用PCR方法获得MaMYB基因的全长cDNA，与pMD-18T载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆得到香蕉MaMYB基因，该基因的cDNA全长946bp，包括起始密码子前的上游序列和多聚A尾巴。利用实时荧光定量PCR测定了果实发育不同阶段MaMYB基因的表达水平，证实果皮光滑的野生型的表达水平明显高于果皮有绒毛的突变体中的表达水平，连接到植物表达载体Cam35S-gfp上，构建一个新的植物表达载体。该基因会影响香蕉果皮表皮毛发育。

Description

香蕉MYB转录因子MaMYB的克隆及表达载体构建

技术领域

本发明涉及香蕉中MYB转录因子基因MaMYB的克隆、重组及对逆境胁迫反应功能的分析和应用，属于分子生物学和生物技术领域。

背景技术

表皮毛（trichome）是由表皮细胞发育而来的植物表面特有的一种结构，根据形态不同，可分为单细胞或多细胞、有分支或无分支、有腺体或无腺体，同种植物可能有多种不同类型的表皮毛。作为植物的天然屏障，表皮毛可以增加表皮厚度，减少热量和水分的散失，减弱紫外线、干旱、辐射、有毒物质等非生物胁迫对植物的伤害，并可以保护植物器官免受昆虫、病原体的侵害及部分机械损伤。

MYB类转录因子是指存在MYB结构域的一类基因，这类基因广泛参与植物次生代谢、激素应答、抗逆反应、组织分化及毛状体发育等过程。根据基因序列中MYB结构域重复数目的不同，可分为MYB1R，R2R3 MYB，MYB3R三种类型，高等植物绝大多数MYB属于第二类，研究表明决定表皮毛发育起始的关键转录因子之一即为MYB基因。

拟南芥中，GL1是最早被鉴定调控表皮毛起始的R2R3-MYB基因，该基因在表皮毛早期发育中表达。其突变体表现为叶片表皮毛减少或缺失，同时，该基因过量表达也会抑制表皮毛的发育，使表皮毛数量减少，表明它对表皮毛的启动还存在一定的负调控作用。目前，还没有关于香蕉MYB类基因的报道。

通过抑制差减杂交（SSH）从香蕉中克隆得到一个597bp的片段，BLAST对比显示其与其他植物的MYB基因具有较高的同源性，带有两个典型的SANT结构域，可以推断获得的序列为一个新的香蕉MYB基因。实时荧光定量PCR结果表明，果实发育初期，果皮无毛时MaMYB基因在野生型与突变体中的表达水平几乎一致，随着果实的发育，果皮逐渐出现表皮毛，MaMYB的表达量开始升高，但是野生型的表达水平明显高于突变体中的表达水平，说明MaMYB可能影响了表皮毛的发育。为了进一步了解MaMYB基因功能，将该基因转化模式植物拟南芥。结果发现，转基因拟南芥叶片表皮毛有所减少，花器官缺少表皮毛，进一步说明MaMYB的高表达影响了香蕉果皮表皮毛的发育。

发明内容

本发明首次从香蕉中分离出MaMYB基因的全长cDNA。

一、香蕉MaMYB基因的克隆

以巴西蕉（Musa spp.）为材料，利用CTAB法提取总RNA，反转录合成cDNA,设计全长cDNA扩增引物：

5’端引物:5’AGAAGAAGCGAGGGGGAGG3’

3’端引物:5’CAAATAGGACTAGGAAATGGGAG3’

PCR体系及条件为：

Ingredient	Amount(μl)
		PCR-Grade Water	40
10X Advantage2PCR Buffer	5
		cDNA Template(100ng/μl)	1
Primer LF5O(10μM ea.)	1
		Primer LF3O(10μM ea.)	1
50X dNTP Mix(10mM ea.)	1
		50X Advantage2Polymerase Mix	1
Total volume	50

获得全长的cDNA为946bp,包括部分起始密码子前的5’UTR和终止密码子后的3’UTR。开放阅读框部分为681bp，由此推得具有226个氨基酸的一段序列，将此氨基酸序列在国际基因库中进行比较，表明与已发表的玉米、水稻、葡萄的MaMYB蛋白的氨基酸同源性分别为71%、69%、67%。

二、MaMYB基因在野生型与突变体果实发育不同时期的表达

利用实时荧光定量PCR测定了果实发育不同阶段MaMYB基因的表达水平，结果显示，在果实发育初期及后期，即果皮表皮毛未发育和发育成熟后，MaMYB基因在野生型与突变体中的表达水平几乎一致，而在表皮毛发育旺盛期，野生型的表达水平明显高于突变体中的表达水平，约为突变体中的两倍，这说明，MaMYB基因可能参与了香蕉表皮毛发育的过程，并且在其发育过程中起抑制作用。

三、香蕉MaMYB基因表达载体的构建

根据已测序的MaMYB基因序列，设计在5’端加上KpnI酶切位点的上游引物P1（5’-CGAGCTCAGAAGAAGCGAGGGGGAGG-3’）和在3’端加上XbalI酶切位点的下游引物P2（5’-GCTCTAGA CAAATAGGACTAGGAAATGGGAG-3’）。通过PCR反应扩增目的片段，回收PCR产物，经测序无误后再用KpnI和XbalI双酶切该产物和植物表达载体CaMV35S-GFP，并将酶切获得的含有两个酶切位点的基因和CaMV35S-GFP载体酶切后的回收大片段连接获得含有MaMYB基因的表达载体。

四、MaMYB基因的功能鉴定

利用农杆菌介导法转化拟南芥。取拟南芥品种哥伦比亚（ecotype columbia），开花后使用携带有MaMYB基因的植物表达载体的农杆菌进行侵染，并获得潜在的转基因种子，然后在50mg/L潮霉素的MS固体平板培养基上进行抗性筛选，获得T1代阳性转基因植株，待其成熟并结籽，再在50mg/L潮霉素的MS固体平板培养基上进行抗性筛选，获得稳定遗传的T2代阳性转基因植株。通过观察发现转MaMYB基因的拟南芥植株叶片表皮毛明显少于野生型；花器官表皮毛缺失；在MS培养基中培养一周，转基因植株根系约3cm，野生型拟南芥根系长度约2.5cm；成熟期角果长度约为2.5cm，较野生型短。

具体实施方式

下面对本发明作进一步说明。

实施例1：香蕉基因的克隆方法

1、总RNA的提取：

（1）取1ml CTAB提取液分装到2ml离心管中，65℃预热；

（2）称取0.2g材料，在液氮中研磨后立即转入含有CTAB提取液的离心管中，涡旋混合，65℃温浴2～3min；

（3）立即加入等体积的氯仿/异戊醇（24:1），涡旋混合，室温，10000rpm离心15min；

（4）吸取上清到一新的离心管中，重复步骤3；

（5）取上清到一新的离心管中，加入1/3体积的8M LiCl，4℃沉淀过夜；

（6）4℃，10000rpm离心30min；

（7）弃上清，沉淀用70％乙醇洗涤，再用无水乙醇洗涤；

（8）将沉淀溶解在100μl STE（65℃预热）中，立即用氯仿/异戊醇抽提一次；

（9）取上清，加入2倍体积的无水乙醇，－80℃沉淀30min，或－20℃沉淀2h；

（10）4℃，10000rpm离心20min；

（11）沉淀分别用70％乙醇和无水乙醇洗涤，干燥后用20μl RNase-free水溶解；

2、MaMYB基因的克隆及序列分析

（1）利用Invitrogen公司的Superscript III Kit将RNA反转录为cDNA，作为PCR模板备用。

（2）设计全长cDNA扩增引物：

5’端引物:5’AGAAGAAGCGAGGGGGAGG3’

3’端引物:5’CAAATAGGACTAGGAAATGGGAG3’

（3）根据引物的Tm值进行PCR条件的优化后，按照发明内容一所述的方法进行PCR扩增，并将获得的产物连接到大肠杆菌，经PCR和酶切鉴定后进行序列测定。

（4）同源检索：利用BLAST软件将分离出的序列与基因银行中的序列进行比较。

实施例2：香蕉MaMYB基因在果实发育不同时期的实时荧光定量RT-PCR表达检测：

提取香蕉野生型和突变体果实表皮毛不同发育时期RNA，利用实时荧光定量PCR测定MaMYB基因在果实表皮毛不同发育时期的表达，利用实时荧光定量PCR仪对各胁迫取样点的cDNA模板进实时荧光定量PCR分析。

正向引物5’GCTCATCATCAAGCTCCACA3’，

反向引物为5’CTGCCATACCGATGACTCCT3’。

实施例3：香蕉MaMYB基因植物表达载体CaMV35S-GFP的构建

1、根据分离出的香蕉MaMYB基因的核苷酸序列,设计引物:

正向引物：5'-CGAGCTCAGAAGAAGCGAGGGGGAGG-3'

反向引物：5'-GCTCTAGA CAAATAGGACTAGGAAATGGGAG-3'

以总RNA反转录的5’Race的cDNA为模板,进行聚合酶链式反应。

2、取1μl PCR产物与pMD18-T载体进行连接，操作步骤按TakaRa公司产品pMD18-T Vector system说明书进行。然后转化大肠杆菌DH5α菌株，在表面涂异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）和5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X－gal）的含氨苄青霉素（100微克/毫升）的LB平板上生长过夜。挑取白色菌落，在LB液体培养基中培养过夜。碱法提取质粒DNA,进行序列测定。

3、用KpnI和XbaI两个限制性内切酶将该基因从pMD18-T Vector载体上切下,与相同酶酶切的CaMV35S-GFP连接。连接产物转化DH5α细胞，然后在含卡那霉素的LB固体平板上培养，对菌落进行PCR鉴定和质粒DNA的酶切分析。将构建好的重组子命名为CaMV35S-MaMYB。

实施例4：MaMYB基因的功能鉴定

1、拟南芥种植

称取适量的拟南芥（ecotype columbia）野生型种子，假如要种100株苗，一般需要500粒种子，以免种子不萌发，每粒种子约重0.02μg，总共需要10μg种子。将种子加去离子水，置于4度冰箱春化，24h后换一次水（4℃预冷），春化72h之后播种。播种前将种子置于光下放置6h。栽培介质为椰糠，播种前充分吸水，用移液器从水中吸5粒种子，播到培养钵中，尽量使种子分散。播种完覆盖保鲜膜，置于合适条件（湿度60%；温度23℃；光周期16h光/8h暗）下等待发芽，3d左右可以将保鲜膜去掉。种子出芽之后，间苗两次，尽量选取大小一致的苗留下，最终每个营养钵中只剩下一株苗。两天浇水一次，一周浇MS营养液一次。

2、侵染菌液的制备

挑取含有目的基因的阳性菌落，在5mL含有相应抗生素的LB液体培养基中，28℃，200r/min培养约24h，期间对菌液进行PCR鉴定，确保目的基因的存在；吸取培养过的菌液2ml，加入到50mL新鲜的含有相应抗生素的LB液体培养基，继续振荡培养至OD600约为1.0，离心收集菌体，用适量拟南芥转化液（MS+0.3mg/L6-BA+150g/L蔗糖+15g/L EMS+0.06%silwet L-77，PH=5.7）重悬菌体，终浓度OD600约为0.8。

3、转化

拟南芥种植约一个月，植株开始陆续开花，挑选生长健壮的植株为待转化植株，转化前不断去除顶端花序，以使植株产生更多的花蕾。转化前一天需将待转化植株充分浇水。将准备好的转化液装在喷壶中，轻轻喷洒在拟南芥花序上，喷至叶片滴水为止，将喷过菌液的植株用保鲜袋包裹，黑暗条件下培养24h，去除保鲜袋，正常培养。视植株生长及开花情况，约一周后可再喷一次，以后正常培养，直至收获T1代种子。

4、转基因植株的筛选

将收获的拟南芥种子至于离心管中，先用1ml0.1%的升汞灭菌2min,然后用无菌水冲洗5-6遍，用枪头吸取种子，播于潮霉素浓度为25mg/L的MS固体培养基上。4℃黑暗条件下春化72h，转移至培养室，温度23℃；光周期16h光/8h暗条件下培养。约两周后，选取叶片绿色、根系发育正常的抗性植株移植到栽培基质中继续培养。移植前栽培基质充分吸水，移植后覆盖保鲜膜，约3d去除，以后管理同上，收获T2代种子，做好标记，继续筛选，至得到纯合转化植株。

5、转基因拟南芥的分子鉴定

提取拟南芥苗期DNA，利用基因特异引物进行PCR检测目的基因存在与否，所用引物为：上游引物5’-GCAACTTCACCGAGGAAGAG-3’和下游引物5’-TTGCACTCCTTGCTGTTCTG-3’；对检测的阳性植株，提取其RNA，反转录后PCR，检测目的已经是否正常转录，所用引物同上。

6、转基因拟南芥表型观察

对转基因拟南芥在生长不同阶段进行观察，并用显微镜、相机等工具记录。转基因拟南芥叶片表皮毛有所减少，花器官缺少表皮毛，进一步说明MaMYB的高表达影响了香蕉果皮表皮毛的发育，符合理论推测。

以上所揭露的仅为本发明的较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于本发明所涵盖的范围。

Claims (3)

1.香蕉MYB转录因子MaMYB，其特征在于其编码核苷酸序列为：

2.包含权利要求1所述的香蕉MYB转录因子MaMYB编码核苷酸序列的表达载体。

3.如权利要求2所述的香蕉MYB转录因子MaMYB编码核苷酸序列的表达载体，其特征在于：用权利要求1所述的香蕉MaMYB编码核苷酸序列插入到植物表达载体CaMV35S-GFP上，构建成在CaMV35S启动子下游含有香蕉MaMYB编码核苷酸序列的高效表达载体。