CN102174525B

CN102174525B - 甘蓝型油菜抗病相关基因BnWRERF50及制备方法和应用

Info

Publication number: CN102174525B
Application number: CN201110024607A
Authority: CN
Inventors: 刘胜毅; 汪承刚; 周瑢; 董彩华; 黄军艳; 刘越英
Original assignee: Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agriculture Sciences
Current assignee: Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agriculture Sciences
Priority date: 2011-01-24
Filing date: 2011-01-24
Publication date: 2012-08-29
Anticipated expiration: 2031-01-24
Also published as: CN102174525A

Abstract

本发明公开了一种甘蓝型油菜抗病相关基因BnWRERF50及制备方法和应用，从甘蓝型油菜中获得一种分离的基因，其序列为SEQIDNo．1所示核苷酸序列；一种分离的多肽，其序列为SEQIDNo．2所示的氨基酸序列。油菜BnWRERF50基因的克隆：在液氮中将植物幼嫩叶片样品研磨，利用Trirol提取试剂盒进行RNA的提取。提取的总RNA溶于双蒸水中。去除残留的DNA。获得的RNA为模板进行逆转录。一种BnWRERF50基因在增强植物对腐生营养型真菌核盘菌和灰霉菌抗性中的应用。BnWRERF50基因增强植物对腐生营养型真菌核盘菌和灰霉菌的抗性。通过基因工程技术升高BnWRERF50基因的表达能够增强植物对腐生营养型真菌核盘菌和灰霉菌的抗性，作为抗性标记用于油菜抗病品种的选育，或者作为基因工程的候选基因用于分子育种。

Description

甘蓝型油菜抗病相关基因 BnWRERF50 及制备方法和应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程和生物技术领域。具体涉及一种增强植物对菌核病抗性的BnWRERF50基因，同时还涉及一种增强植物对菌核病抗性的BnWRERF50基因的制备方法，还涉及BnWRERF50基因在增强植物对核盘菌抗性、对灰霉菌抗性中的应用。

背景技术

植物生长位置固定，本身不能迁移，依靠根系统固定在土壤中，获得营养和

水分，因此缺乏任何可能的危险逃避机制，来防止来自生物如病原，咀嚼昆虫或更大的食草动物的侵害，和非生物例如风，雨和冰雹的伤害。为了生存，一些植物物种已经进化出了复杂的自然防御机制来避免受到侵害，从分化出生理屏障，包括角质层，木质，荆棘和表皮毛(Levin, D. The role of trichomes in plant defense. Quarterly Review of Biology. 1973.48:3-15)，到产生毒性物质，如生物碱的（Baldwin, I. Mechanism of damage-induced alkaloid production in wild tobacco. Journal of Chemical Ecology.1989.15:1661-1680）和单宁（Scalbert, A. Antimicrobial properties of tannins. Phytochemistry.1991. 30:3875-3883）。然而，一旦侵害发生，因为植物细胞被封闭在细胞壁中，不能移动，不可能像哺乳动物那样，聚集特殊的免疫细胞去愈合伤口，因此植物发展进化出使每一个细胞都有能力通过转录激活一系列抗性响应来抑制病原侵染，达到自我保护的目的（Feys, B. J., and Parker, J. E. Interplay of signaling pathways in plant disease resistance. Trends Genet. 2000.16:449-455. Glazebrook, J. Genes controlling expression of defense responses in Arabidopsis-2001 status. Curr. Opin. Plant Biol. 2001.4:301-308.）对特异病原的识别启动了这些快速的细胞反应，激活了一个或者多个抗性信号传导途径，导致了一系列抗性基因的快速诱导表达(Bostock, R. M. Signal crosstalk and induced resistance: Straddling the line between cost and benefit. Annu. Rev. Phytopathol. 2005.43:545-580 Rojo, E., Solano, R., and Sanchez-Serrano, J. J. Interactions between signaling compounds involved in plant defense. J. Plant Growth Regul. 2003.22:82-98)。这些抗性途径主要被水杨酸，茉莉酸，乙烯，和他们的衍生物所调节(Thatcher LF, Anderson JP, Singh KB Plant defense responses: What have we learnt from Arabidopsis, Funct Plant Biol 2005，31: 1–19)。他们与不同的病源抗性相关，大量研究表明，水杨酸在植物抵抗活体营养型病源的局部和系统获得性抗性中发挥着关键作用(Durrant W. E., and Dong, X. Systemic acquired resistance. Annu. Rev. Phytopathol. 2004. 42:185-209. Gaffney T., Friedrich, L., Vernooij, B., Negrotto, D., Nye, G., Uknes, S., Ward, E., Kessmann, H., and Ryals, J. Requirement of salicylic acid for the induction of systemic acquired resistance. Science 1993. 261:754-756)；而诱导系统性抗性依赖于茉莉酸和乙烯信号途径，这两种激素信号途径对于植物抵抗腐生型病源，如灰霉等，是很重要的(Thomma B., Eggermont, K., Penninckx, I., Mauch-Mani, B., Vogelsang, R., Cammue, B., and Broekaert, W. Separate jasmonate-dependent and salicylate-dependent defense-response pathways in Arabidopsis are essential for resistance to distinct microbial pathogens. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1998. 95:15107-15111. Thomma B., Eggermont, K., Tierens, K., and Broekaert, W. Requirement of functional ethylene-insensitive 2 gene for efficient resistance of Arabidopsis to infection by Botrytis cinerea. Plant Physiol. 1999. 121:1093-1102.)。然而，这种简单的二分法，把SA和MJ/ET信号割裂开来，即认为他们分别针对于活体营养型和腐生营养型病源的看法，可能过于简单；最近，水杨酸信号也被发现参与了对腐生营养型病源灰霉的局部抗性，用水杨酸处理后显著的抑制了灰霉的侵染(Ferrari S., Plotnikova, J. M., De, L. G., and Ausubel, F. M. Arabidopsis local resistance to Botrytis cinerea involves salicylic acid and camalexin and requires EDS4 and PAD2, but not SID2, EDS5 or PAD4. Plant J. 2003. 35:193-205.)。病源的侵染激活的不是一个单一的信号途径，而是一个复杂的相互作用的信号网络。

植物的抗性调节是复杂的，牵涉进大量的转录因子家族(Singh KB, Foley RC, On˜ ate-Sa´nchez L (2002) Transcription factors in plant defense and stress responses. Curr Opin Plant Biol 5: 430–436)，鉴定和利用关键的转录因子，对于改造农作物，提高抗性是非常重要的，其中一个被利用的转录因子家族就是乙烯响应因子(ERF)家族，它属于AP2/ERF超家族的一部分。在拟南芥中，AP2/ERF超家族大约有147个成员，他们编码的蛋白有不同的功能，相关于植物的整个生命过程，包括调节发育(van der Graaff E, Dulk-Ras AD, Hooykaas PJ, Keller B (2000) Activation tagging of the LEAFY PETIOLE gene affects leaf petiole development in Arabidopsis thaliana. Development 127: 4971–4980 Banno H, Ikeda Y, Niu QW, Chua NH (2001) Overexpression of Arabidopsis ESR1 induces initiation of shoot regeneration. Plant Cell 13:2609–2618)，响应于非生物压力，如干旱，寒冷等(Liu Q, Kasuga M, Sakuma Y, Abe H, Miura S, Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K (1998) Two transcription factors, DREB1 and DREB2, with an EREBP/AP2 DNA binding domain separate two cellular signal transduction pathways in drought- and low-temperature-responsive gene expression, respectively, in Arabidopsis. Plant Cell 10: 1391–1406 Stockinger EJ, Gilmour SJ, Thomashow MF (1997) Arabidopsis thaliana CBF1 encodes an AP2 domain-containing transcriptional activator that binds to the C-repeat/DRE, a cis-acting DNA regulatory element that stimulates transcription in response to low temperature and water deficit. Proc Natl Acad Sci USA 94: 1035–1040)，生物压力，如真菌侵染(Berrocal-Lobo M, Molina A, Solano R Constitutive expression of ETHYLENE-RESPONSE-FACTOR1 in Arabidopsis confers resistance to several necrotrophic fungi. Plant J, 2002 29: 23–32 Luis Onate-Sanchez, Jonathan P. Anderson, Jodi Young, and Karam B. Singh* AtERF14, aMember of the ERF Family of Transcription Factors, Plays a Nonredundant Role in PlantDefense Plant Physiology, 2007, 143;400–409, Martial Pre´ , Mirna Atallah, Antony Champion, Martin De Vos2, Corne´ M. J. Pieterse, and Johan Memelink* The AP2/ERF Domain Transcription Factor ORA59 Integrates Jasmonic Acid and Ethylene Signals in Plant Defense Plant Physiology, 2008, 147; 1347–1357)。AP2/ERF超家族都含有一个AP2/ERF保守结构域，它由60-70个氨基酸组成，与DNA结合相关；AP2/ERF超家族被分成ERF, AP2, 和RAV三个亚家族。ERF亚家族包含了所有的抗病相关的AP2/ERF基因(Gutterson N, Reuber TL，Regulation of disease resistance pathways by AP2/ERF transcription factors. Curr Opin Plant Biol, 2004, 7: 465–471)。ERF1和ORA59被证明是拟南芥中茉莉酸和乙烯信号的节点，组成型表达ERF1激活了一系列抗性相关基因的表达，包括PDF1.2 and ChiB，显著增强了对灰霉等真菌的抗性(Solano, R., Stepanova, A., Chao, Q.M. and Ecker, J.R. (1998) Nuclear events in ethylene signaling: a transcriptional cascade mediated by ETHYLENE-INSENSITIVE3 and ETHYLENERESPONSE-FACTOR1. Genes Dev, 12, 3703-3714. Berrocal-Lobo M, Molina A, Solano R (2002) Constitutive expression of ETHYLENE-RESPONSE-FACTOR1 in Arabidopsis confers resistance to several necrotrophic fungi. Plant J 29: 23–32 Lorenzo O, Piqueras R, Sanchez-Serrano JJ, Solano R (2003) ETHYLENE RESPONSE FACTOR1 integrates signals from ethylene and jasmonate pathways in plant defense. Plant Cell 15: 165–178 Martial Pre´ , Mirna Atallah, Antony Champion, Martin De Vos2, Corne´ M. J. Pieterse, and Johan Memelink* The AP2/ERF Domain Transcription Factor ORA59 Integrates Jasmonic Acid and Ethylene Signals in Plant Defense Plant Physiology, July 2008, Vol. 147, pp. 1347–1357)。在拟南芥中组成型表达AtERF2 (McGrath KC, Dombrecht B,Manners JM, Schenk PM, Edgar CI,Maclean DJ, Scheible WR, Udvardi MK, Kazan K (2005) Repressor- and activatortype ethylene response factors functioning in jasmonate signaling and disease resistance identified via a genome-wide screen of Arabidopsis transcription factor gene expression. Plant Physiol 139: 949–959)和AtERF14 (Luis Onate-Sanchez, Jonathan P. Anderson, Jodi Young, and Karam B. Singh* AtERF14, aMember of the ERF Family of Transcription Factors, Plays a Nonredundant Role in Plant Defense Plant Physiology, January 2007, Vol. 143, pp. 400–409)也被报道引起高水平的抗性相关基因PDF1.2和ChiB的表达；然而，AtERF4却抑制抗性相关基因PDF1.2的表达(McGrath KC, Dombrecht B,Manners JM, Schenk PM, Edgar CI,Maclean DJ, Scheible WR, Udvardi MK, Kazan K Repressor- and activatortype ethylene response factors functioning in jasmonate signaling and disease resistance identified via a genome-wide screen of Arabidopsis transcription factor gene expression. Plant Physiol.2005.139: 949–959)，暗示ERF家族的成员对抗性相关基因的调节作用是多样的，由正调控，也有负调控。

菌核病是一种类似于灰霉的腐生营养型真菌，这种破坏性病源侵染超过400种植物，分布广泛。油菜是最世界上重要的油料作物之一，菌核病造成油菜的根，茎和角果的腐烂，导致了巨大的产量损失。尽管菌核病严重威胁了农业生产，植物对核盘菌的寄主抗性的分子机制，我们依然知之甚少。暨今为止还没有发现完全免疫或者高抗的油菜栽培品种(Liu, S., Wang, H., Zhang, J., Fitt, B. D., Xu, Z., Evans, N., Liu, Y., Yang, W., and Guo, X. 2005. In vitro mutation and selection of doubled-haploid Brassica napus lines with improved resistance to Sclerotinia sclerotiorum. Plant Cell Rep. 24:133-144.), 因此，探究植物对这种病源的抗性机制，发现新的抗性基因具有深远意义。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种增强植物对腐生营养型真菌抗性的BnWRERF50基因，该基因在核盘菌侵染过程中被诱导表达，该基因的组成型表达可以增强植物对腐生营养型真菌核盘菌和灰霉的抗性，应用于抗性育种。

本发明的另一个目的是在于提供了一种油菜BnWRERF50基因的制备方法，方法易行，操作简便，根据本实验室进行甘蓝、甘蓝型油菜和白菜型油菜基因组测序结果提供的基因片段序列信息，通过BLAST比对油菜的EST数据库，获得油菜全长序列的电子克隆后，应用简单的PCR方法即可以获得该基因的序列。

本发明的再一个目的是在于提供了一种油菜BnWRERF50基因在增强植物对腐生营养型真菌核盘菌的抗性中的应用。BnWRERF50基因的超表达显著增强了植物对核盘菌的抗性。

本发明的还有一个目的是在于提供了一种油菜BnWRERF50基因在增强植物对腐生营养型灰霉菌的抗性中的应用。BnWRERF50基因的超表达显著增强了植物对灰霉菌的抗性。

为了完成上述目的，本发明采用如下技术方案：

为了获得本发明，申请人对油菜菌核病抗性相关基因进行了深入和全面的研究，结果发现了一个新基因，该基因在核盘菌侵染后被显著诱导表达，该基因超表达显著提高了病源相关基因PDF1.2 和ChiB 的表达，增强了对腐生营养型真菌核盘菌和灰霉的抗性。因此，本发明开发了一个增强植物对腐生营养型真菌抗性的BnWRERF50基因。通过半定量PCR检测该基因在主要在根中表达；核盘菌侵染后显著诱导该基因的表达；该基因的超表达显著提高了病源相关基因PDF1.2和ChiB的表达，增强了对腐生营养型真菌核盘菌和灰霉的抗性。预示着该基因在油菜抗性育种中具有相当的应用前景。

根据本发明的一个方面，上述目的可以通过提供植物核盘菌响应基因来实现，所述基因含有SEQ ID No．1核苷酸序列或与SEQ ID No．1实质上同源的核苷酸序列。

根据本发明的一个方面，上述目的可以通过提供植物核盘菌响应蛋白来实现，所述的蛋白含有SEQ ID No．2核苷酸序列或与SEQ ID No．2实质上同源的氨基酸序列。

根据本发明的另一个方面，上述目的通过提供含有BnWRERF50基因超表达重组载体OX-BnWRERF50（申请人构建，请见实施例3）来实现对植物体中BnWRERF50基因表达量的抑制。

根据本发明的另一个方面，上述目的可以通过提供用所述重组载体OX-BnWRERF50转化的微生物（根癌农杆菌EHA105,购自大连宝生物生物制品有限公司，以下相同）来实现对拟南芥以及其他植物的转化, 从而增强拟南芥以及其他植物中BnWRERF50基因的表达量。

根据本发明的另一个方面，上述目的可以通过提供用所述微生物(包含有OX-BnWRERF50重组载体的根癌农杆菌EHA105)转化的转基因植物来实现对核盘菌抗性的调控,获得抗性转基因植株。

1、油菜BnWRERF50基因的克隆：

在液氮中将植物幼嫩叶片样品研磨至粉状，利用Trirol提取试剂盒（购自Invitrogen公司，以下相同）的要求进行RNA的提取。提取的总RNA溶于无RNase的双蒸水中。DNaseⅠ（购自Promega公司，以下相同）去除可能残留的DNA。用蛋白检测仪（DU 650 BECKMAN，USA）分别检测RNA在260纳米和280纳米光吸收值，结合1%（质量体积比）琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的纯度及浓度。以获得的RNA为模板进行逆转录，得到的cDNA 分装后于-20℃保存备用。

根据GenBank中拟南芥AtWRERF50基因序列（At5g07580）,在NCBI网站上用BLASTN (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)与本实验室测序获得的甘蓝型油菜DNA序列进行比对，获得与拟南芥AtWRERF50基因序列同源的甘蓝型油菜的BnWRERF50基因序列，然后根据获得的甘蓝型油菜BnWRERF50基因的DNA序列,在与拟南芥AtWRERF50基因CDS（Coding sequence,编码序列，以下相同）起始密码子和终止密码子同源区域设计引物，从而确保扩增产物为全长序列。以甘蓝型油菜的根、茎、叶、花、角果的cDNA为模版，进行PCR扩增。回收并纯化扩增的PCR产物，连接到pMD18-T载体上(购自Promega公司，以下相同)，用冻融法转化大肠杆菌（J.萨姆布鲁克. D.W.拉塞尔著，黄培堂等译分子克隆试验指南（第三版）科学出版社，96-99），涂布于含有氨苄青霉素 50 μg/mL的LB固体（配方如下：分别称取10克胰蛋白胨，5克酵母提取物和10克氯化钠，8克琼脂依次溶解于蒸馏水中，定容于1000毫升。分装于500毫升三角瓶中， 121℃，6.859×104 Pa下高压消毒15分钟。4℃冷藏备用）平板上，37℃培养过夜，各挑选白斑三个，做菌落PCR检测：所用引物序列为：M13F 5′-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3; M13R 5’-GTAAAACGACGGCCAGT-3，以下相同），反应体系为：10×Taq酶反应缓冲液2ul、25mM MgCL₂ 1.2ul、2mM dNTP 1.5ul、10 uM引物 0.2ul、0.3单位Taq酶，加无菌水至20μl。反应程序为：94℃变性5min，94℃ 45s、55℃ 45s、72℃ 2min 32循环，72℃延伸 5min（以下相同）。以M13F/ M13R为引物（前面已述），将连接过的pMD18-T载体进行序列测定，分析结果，获得了一种分离的基因，其序列为SEQ ID No．1 所示的核苷酸序列。利用NCBI的开放阅读框，寻找程序(ORF founder)确定BnWRERF50基因的开放阅读框，推导出核苷酸序列编码的多肽，一种分离的多肽，其序列为SEQ ID No．2 所示的氨基酸序列。

对蛋白质的分子量和理论等电点进行在线计算(http://us.expasyorg/tools/pi too1.htm)。用NCBI的Conserved Domains工具(http://wwwncb.inlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi ) 在线进行保守区域分析结果表明该基因含有一个保守的ERF结构域，属于乙烯响应转录因子（ERF）家族；通过Blastx程序对NCBI的NR数据库进行同源性比对，并对具有同源性、不同物种来源的ERF蛋白用ClustalX1．83进行多序列比对；用Prosite软件在线分析该蛋白质的基本结构域。根据上述方法分析结果显示: 该基因的开放读码框所推导的蛋白质序列编码205个氨基酸。在线计算蛋白质的分子量大约为23132 Da，理论等电点约为4.68。BLASTp在线分析软件将推导的编码蛋白与Genebank中的序列进行同源性比较，发现该序列与拟南芥AtWRERF50、拟南芥ERF1、拟南芥ORA59、拟南芥AtERF5、拟南芥AtERF14、烟草Tsi1和番茄Pti4的蛋白质氨基酸序列在ERF保守结构域上的同源性分别达到96.8%、70.7%、69.1%、67.3%、79.7%、63.8%和74.2%，但是在蛋白全序列上相似性较低，分别为40.9%、13.1%、24.8%、12.4%、10.5%、13.4%、10.9%和13.6%，见图1，图2。

2 、油菜BnWRERF50基因的表达模式：

本发明所用油菜为甘蓝型油菜（Brassica napus L.）zhongshuang 9（请见遗传资源表）。供试材料播种于大田，正常田间管理。

从同一大田生长条件相同的可育植株上取根、茎、叶、花、角果，每种材料至少取三个重复，每个重复至少一株，取样后用锡箔纸包裹，迅速放置于液氮中，-80℃保存。利用Trirol提取试剂盒（前面已述）的要求进行RNA的提取。

PCR仪为DNA-Engine（BIO-RAD），采用油菜Actin作为内标基因（登录号AF111812），Actin 基因引物为5′- CTGGAATTGCTGACCGTATGAG-3′和5′- ATCTGTTGGAAAGTGCTGAGGG -3′。BnWRERF50基因引物为5′- TTTCCTCTCTCACCTGCCTTGTCTAG -3′和5′- CAATGAAACTGATCACACTTTTTGAATGT -3′。

半定量PCR反应每组实验均完成三个生物学重复，每个生物学重复至少做三次技术重复。分别检测BnWRERF50在油菜组织（根、茎、叶、花、角果）中的表达。结果如图3所示, BnWRERF50主要在根种表达，在茎和叶，花和角果中基本不表达。

3、BnWRERF50基因的表达受核盘菌侵染诱导。

对菌核病不同抗性的甘蓝型油菜品种M083(高抗)和84039 (高感)由中国农业科学院油料作物研究所生物技术育种课题组提供（请见遗传资源表），核盘菌菌核培养采用PDA培养基。PDA培养基(1L)配方：马铃薯 200g，蔗糖 10-20g，琼脂粉 17-20g，双蒸水 1000g；将去皮马铃薯切成小块，加水800ml，煮沸0.5h，用纱布滤去残渣，加水补足1000ml，然后加入糖和琼脂，加热使琼脂完全融化，趁热分装，高压灭菌后备用。

菌核病不同抗性的油菜品种M083和84039种子采用土壤盆栽,严格控制其生长条件,油菜生长至四叶一心期时进行菌丝块活体接种处理。分别在接种后0、6、24、72 h等不同时间点取局部叶, 每种材料至少取三个重复，取样后用锡箔纸包裹，迅速放置于液氮中，-80℃保存。利用Trirol提取试剂盒（前面已述）的要求进行RNA的提取。DNase I消化后进行逆转录反应,得到的cDNA分装后于- 80 ℃保存备用。

荧光定量PCR仪为RT™-Cycler（Bio-Rad公司，iCycler），采用油菜Actin作为内标基因（登录号AF111812），Actin 基因引物为5′- CTGGAATTGCTGACCGTATGAG-3′和5′- ATCTGTTGGAAAGTGCTGAGGG -3′。BnWRERF50基因引物为5′- CCAGTTCT TGATCCGGATTCGTTCG -3′和5′- CGGCCTTCTTCTCACTCCTCGGTAA-3′。荧光定量PCR反应每组实验均完成三个生物学重复，每个生物学重复至少做三次技术重复。分别检测BnWRERF50基因在不同抗性品种中，侵染后不同时间点的表达。

用比较Ct法（DDCt）计算基因的相对表达量。通过2^-DDCt估算目的基因的相对表达量和系统误差（Kenneth J Livak. Thomas D Schmittgen. 2001, Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 2^- ^△△ ^CT Method. METHODS 25, 402–408.）。在计算相对表达量时，以未接种的样本为参照，即将其值转换成1（标准值），其它样品再与其比较，获得相对表达值。结果如图4所示, BnWRERF50是一个在受核盘菌侵染诱导的基因，在抗性品种中的表达高于感性品种中的表达，表明BnWRERF50是一个抗性相关基因。

4 、BnWRERF50基因超表达载体(OX-BnWRERF50)的构建和根癌农杆菌菌株EHA105转化（购于上海沪尚生物科技有限公司）：

构建的重组载体是将实验室构建的质粒PG4A (Zheng Wang, Han Mao, Caihua Dong, Ruiqin Ji, Li Cai, Hao Fu, and Shengyi Liu Overexpression of Brassica napus MPK4 Enhances Resistanceto Sclerotinia sclerotiorum in Oilseed RapeMPMI， 22（3）, 2009, 235–244.) 上的目的基因用前期克隆得到的BnWRERF50基因替换而来。为完成此目的，首先用PstI/XhoI 双酶切克隆的BnWRERF50基因片段，同时用PstI/XhoI酶切PG4A质粒（前面已述）。酶切反应在37度培养箱中进行，约4-6个小时之后，用1%（质量体积比）琼脂糖胶电泳检测。将酶切后的BnWRERF50基因片段和PG4A质粒（前面已述）上切下的大片段用DNA凝胶回收试剂盒（前面已述）回收。把BnWRERF50基因片段比PG4A质粒（前面已述）载体片段按3:1（摩尔浓度比）的比例混合样品，加入T4 DNA连接酶5个单位，10×反应缓冲液，无菌水补充体积至20μL，16℃连接过夜。转化后，在含有卡那霉素（50 μg/mL）固体LB平板上筛选，挑斑做菌落PCR，以及提质粒，酶切验证正确的重组质粒命名为OX-BnWRERF50,并对获得的载体进行测序以验证准确性。载体结构如图5。

然后利用冻融法（前面已述）将OX-BnWRERF50转入根癌农杆菌EHA105（购自大连宝生物生物制品有限公司，以下相同），涂布于含有50 μg/mL卡那霉素和利福平（50 μg/mL）的LB固体（配方如下：分别称取10克胰蛋白胨，5克酵母提取物和10克氯化钠，8克琼脂依次溶解于蒸馏水中，定容于1000毫升。分装于500毫升三角瓶中， 121℃，6.859×104 Pa下高压消毒15分钟。4℃冷藏备用）平板上，37℃培养过夜，各挑选白斑三个，做菌落PCR检测（前面已述）。

本发明所使用的研究BnWRERF50基因功能的重组植物表达载体，含有所述BnWRERF50基因的编码区核苷酸序列，组成型35S启动子（CAMV35S）可以增强BnWRERF50基因的表达水平。该载体大小适合，在植物中易与转化，所带有的除草剂标记基因Bar表达强度高，容易检测。通过这个载体转化拟南芥可以获得菌核病抗性增强的拟南芥转基因植株。

5、BnWRERF50基因超表达载体(OX-BnWRERF50)的遗传转化：

参照文献中的方法进行拟南芥转化（Zhang X.R. et al. Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method. Nature, 2006，1:1-6）。制备含有构建好载体的根癌农杆菌EHA105（前面已述）菌液，在转化前一天转入含有卡那霉素50μg/ml、利福平50μg/ml的LB液体培养基中，28℃过夜培养。第二天，用紫外分光光度计（SPEKOL 1300）于276nm纳米波长下检测的吸光值，当菌液的吸光值达到在1.6-2.0之间时取出。室温（20-25℃，以下相同）以4000g离心10min，弃上清，将沉淀悬浮于等体积的5%蔗糖（质量体积比）中。将浑浊的蔗糖溶液倒入一大培养皿中，转化前加入终浓度为0.02%（体积比）的Silwet L-77（购自北京五洲元业科贸中心，以下相同）。混匀后把待转化的拟南芥整个花序轻轻的浸没在蔗糖中，默数15s，取出植株。转化后的植株用一个黑色塑料袋包好，放在生长箱培养。第二天将塑料袋揭开，放在光强的地方培养。隔一周再做一次转化。培养一个月左右收获种子，种子在培养箱或者日光下干燥3-5天。将转化收获的 T0代种子播在混有PNS营养液的蛭石中，（PNS营养液成份为：每升含5ml 1M KNO3，2ml 1M Ca(NO3)2_˙4H₂O，2ml 1M MgSO4_˙7 H₂O，2.5ml 20mM Fe_˙EDTA， 2.5ml 1M磷酸缓冲液（pH5.5），1ml MS 微量元素）；4℃春化一星期，在21-22℃的生长间中自然生长两星期左右，待到达四叶期的早期进行除草剂草胺磷（30 mg/L）的喷洒第一次，一星期之后进行第二次喷洒。两次喷洒后对存活的绿苗进行PCR阳性检测，获得拟南芥转基因阳性苗。

6、BnWRERF50基因超表达载体(OX-BnWRERF50)转化苗的筛选及PCR鉴定：

根据本实验室进行的除草剂草胺磷浓度梯度筛选实验，确定除草剂（草胺磷,购自拜尔公司,以下相同）筛选浓度为30mg/L,转基因T1代 (第一代)植株在苗期（播种后10天）喷施30mg/L除草剂，得到成活植株。采用CTAB法（M.G. Murray and W.F. Thompson, Rapid isolation of high molecular weight plant DNA, Nucleic Acids Research, 1980, Vol. 8, No. 19 4321-4326，以下相同）提取筛选后存活的拟南芥以及野生型拟南芥叶片DNA。根据表达载体上外源BnWRERF50基因序列，设计引物进行PCR检测（序列为F-5′ TTTCCTCTCTCACCTGCCTTGTCTAG 3′，R-5′CAATGAAACTGATCAC ACTTTTTGAATGT3′），预期扩增长度为621bp。将经过PCR检测的阳性植株编号并标记。

根据获得的上述核苷酸序列（SEQ ID No．1），通过构建BnWRERF50超表达植物重组载体（OX-BnWRERF50），转化拟南芥，申请人获得21株转基因拟南芥，分别接种腐生真菌核盘菌和灰霉菌进行抗病鉴定，结果显示BnWRERF50超表达显著增强了转基因拟南芥对核盘菌和灰霉菌的抗性（请见图7和图8）。

7、BnWRERF50基因的超表达增强了病源相关蛋白表达：

通过半定量PCR验证超表达效率并观察转基因拟南芥T1代(第一代)表型。观察结果显示，在正常生长状况下，各BnWRERF50基因超表达转基因植株与野生型植株并无明显差异； PCR鉴定后获得转基因T2代(第二代)超表达(OX-BnWRERF50)各个株系的幼苗。摘取这些幼苗的叶片，速冻于液氮中，用半定量PCR对目标基因BnWRERF50的表达水平进行分析。具体方法如下：取经过PCR检测后获得的T2代阳性植株的叶片，在液氮中将植物幼嫩叶片样品研磨至粉状，利用Trirol提取试剂盒的要求进行RNA的提取。提取的总RNA溶于无RNase的双蒸水中。DNaseⅠ去除可能残留的DNA。用蛋白检测仪（DU 650 BECKMAN，USA）分别检测RNA在260纳米和280纳米光吸收值，结合1%（质量体积比）琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的纯度及浓度。以获得的RNA为模板进行逆转录（前面已述），得到的cDNA 分装后于-20℃保存备用。

半定量PCR采用拟南芥Actin 作为内标基因。BnWRERF50引物为5′- CCAGTT CTTGATCCGGATTCGTTCG -3′和5′- CGGCCTTCTTCTCACTCCTCGGTAA-3′；拟南芥PDF1.2引物为5′- TGTTCTCTTTGCTGCTTTCGACG-3′和5′- GCATGATC CATGTTTGGCTCCT-3′；拟南芥ChiB引物为5′- ATCAGCGCTGCAAAGTCC TTC-3′ 和5′- GTGCTGTAGCCCATCCACCTG-3′。

半定量PCR反应体系如下：cDNA模板1μL (约50ng)、10 × Taq酶反应缓冲液2ul、2mM dNTP 0.5ul、10 uM引物各 0.5ul、0.3单位Taq酶，加无菌水至20μl。反应程序为：94℃变性5min，94℃ 45s、55℃ 45s、72℃ 2min，20循环，72℃延伸 5min。用1％（质量体积比）琼脂糖凝胶电泳检测PCR反应产物。每组实验均完成三个生物学重复，每个生物学重复至少做三次技术重复。结果显示BnWRERF50超表达效率非常明显，如图6所示：而BnWRERF50基因超表达转基因植株中，BnWRERF50的表达被显著上调15-25倍，相应的，病源相关蛋白PDF1.2和ChiB的表达也显著上调；表明BnWRERF50基因的超表达升高了病源相关蛋白表达, 增强了植物的抗病能力。

8、BnWRERF50基因超表达显著增强植株对腐生型真菌核盘菌和灰霉菌的抗性：

核盘菌(Scleortinia sclerotiorum)菌核采自武汉大田油菜茎杆（请见遗传资源表）；选完好菌核，先用75%酒精(体积比)泡1分钟，再用0.1% HgCl₂ 消毒8-10分钟，无菌水冲洗3-5次。把灭菌菌核切去两端，中间部分切成绿豆大小，切面朝下，接种于Minimal平板。通常每粒菌核接一板，一次接种8-9板。于22℃静置培养3-4天，当菌核即将铺满平板时，用φ2mm打孔器沿菌丝外缘打孔，取菌丝块，用于接种。Minimal培养基(1L)配方：NaOH 1g，DL-苹果酸 3g，NH₄NO₃2g，MgSO₄﹒7H₂O 0.1g，细菌琼脂粉 39g；按顺序将上面药品溶于盛有800ml的蒸馏水中，在加药品时，加入的药品充分溶解后再加入下一种药品，药品加完后加水补足1000mL，然后加入细菌琼脂粉，于117℃灭菌15min。

灰霉菌(B. cinerea)由华中农业大学李国庆教授提供（请见遗传资源表）,来源于武汉大田油菜叶片。菌株培养在PDA培养基上（前面已述）, 28 ℃培养8 d 。用无菌水从培养基上洗脱灰霉病原孢子,配制成含5×10⁵ - 1×10⁶ spores mL ^﹣ ¹的孢子悬浮液待用。

拟南芥OX-BnWRERF50 超表达株和野生型WT播种于23℃光照培养室内保湿培

养(每天16 h 光照,8 h 黑暗)；选取4周龄的拟南芥苗(包括 OX-BnWRERF50 超表达株和野生型WT)用于核盘菌和灰霉的接种实验，每种基因型至少接种12株，每株接种两片叶，试验重复三次。对于核盘菌接种，菌丝生长在mini培养基上，直径约2mm的含有核盘菌菌丝的琼脂块被接种到叶的近轴表面；对于灰霉接种，菌丝生长在PDA培养基上，PDA培养基上收集的孢子用水稀释到5×10⁵ - 1×10⁶ spores mL ^﹣ ¹，接种时先将叶用细针刺伤，然后每个接种点滴加3ul的灰霉孢子的悬浮液。核盘菌和灰霉菌接种植物都需要保持高湿，温度（23℃）和光照（每天16 h 光照,8 h 黑暗）与接种前保持一致。发病后不同时间统计病斑面积，结果如图7和图8，与野生型相比，OX-BnWRERF50 超表达株显著增强了对核盘菌和灰霉的抗性，表明BnWRERF50是腐生型真菌核盘菌和灰霉的抗性相关基因。

本发明的优点：

BnWRERF50基因可以增强植物对腐生营养型真菌核盘菌和灰霉菌的抗性。通过基因工程技术升高BnWRERF50基因的表达能够增强植物对腐生营养型真菌核盘菌和灰霉菌的抗性，可作为抗性标记用于油菜抗病品种的选育，或者作为基因工程的候选基因用于分子育种。

1 通过克隆该基因，研究该基因在植物抗病中的作用，明确了该基因具有增强植株对腐生型真菌的抗性的功能。通过该基因的过表达，申请人可以人工创造抗性增强材料，为实现抗性分子育种提供新的抗性基因。

2 通过克隆该基因，研究该基因对核盘菌侵染的响应，以及在抗性品种和感性品种中受核盘菌侵染得诱导表达水平。即研究其在植物抗病响应中的表达，从而在植物抗腐生真菌病害中应用。

3 通过构建该基因的超表达载体(OX-BnWRERF50)，转化拟南芥，获得有效的的超表达(OX-BnWRERF50)转基因植株，为研究基因功能提供了一个有效的方法。

4、通过对转基因拟南芥进行的核盘菌和灰霉的抗病接种鉴定，得到了该基因的超表达显著增强植物对腐生真菌核盘菌和灰霉抗性的结果。说明该基因是植物的抗性相关基因。

附图说明

图1 为一种BnWRERF50与其它ERF基因的氨基酸保守区的比对图，表明BNWRERF50基因与其它ERF基因在ERF保守结构域上高度相似。

图2 BnWRERF50与其它ERF基因的蛋白质序列系统进化树分析图，表明BNWRERF50基因与其它ERF基因在蛋白序列上由差异。

图3为一种甘蓝型油菜BnWRERF50基因的组织特异性表达电泳图。泳道根，茎，叶，花，角果分别代表经根，茎，叶，花，角果组织的cDNA的PCR扩增结果；

图4为一种BnWRERF50的表达对和核盘菌侵染的响应图。Y轴表示BnWRERF50基因的相对表达量，X轴核盘菌侵染的后不同时间点。

图5 为一种 BnWRERF50基因超表达载体OX-BnWRERF50的构建示意图

图6 为一种BnWRERF50超表达转化株中，BnWRERF50基因和病源相关蛋白基因的表达水平图。

图7 为一种BnWRERF50基因超表达转化株和和野生型植株的核盘菌抗病鉴定图。Y轴表示病斑面积，X轴接种后不同时间。

图8 为一种BnWRERF50基因超表达转化株和野生型植株的灰霉菌的抗病鉴定。Y轴表示病斑面积，X轴接种后不同时间。

具体实施方式

根据以下实施例，可以更好的理解本发明，但所述的实施例是为了更好的解释本发明，而不是对本发明的限制。

实施例1：（一种油菜抗性相关基因 BnWRERF50 的克隆和表达模式分析）

一种油菜BnWRERF50基因的制备方法，其步骤是：

1、一种油菜抗性相关基因BnWRERF50的克隆

根据Trirol提取试剂盒（前面已述）的要求进行RNA的提取，具体方法如下：分别取0.05-0.1g的根、茎、叶、花、角果样品，在液氮中研磨至粉状，根据Trirol提取试剂盒的要求进行RNA的提取。提取的总RNA溶于60uL的无RNase的双蒸水中。DNaseⅠ去除可能残留的DNA。用蛋白检测仪（DU 650 BECKMAN，USA）分别检测RNA在260纳米和280纳米下的光吸收值，结合1%（质量体积比）琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的纯度及浓度。以上述获得的RNA为模板按下列方案进行逆转录：2 µg RNA中加1 µL Oligo（dT），70℃温育5 min，立即置于冰上5 min，短暂离心，加入5×M-MLV Buffer 4 µL，dNTP（10mmol/L）1 µL，RNase Inhibitor 20 单位，M-MLV逆转录酶（购自Promega公司）200 单位，用DEPC处理过的无菌水补至总体积20 µL，混匀，42℃温育1 h，70℃水浴15 min，得到的cDNA 分装后于-20℃保存备用。

根据GenBank中拟南芥AtWRERF50基因序列（at5g07580）,在NCBI网站上用BLASTN (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) 与本实验室测序获得的甘蓝型油菜DNA序列进行比对，获得与拟南芥AtWRERF50基因序列同源的甘蓝型油菜的BnWRERF50基因序列，然后根据获得的甘蓝型油菜BnWRERF50基因的DNA序列,在与拟南芥AtWRERF50基因CDS（Coding sequence,编码序列，以下相同）起始密码子和终止密码子同源区域设计引物，从而确保扩增产物为全长序列。油菜BnWRERF50扩增引物序列分别为：5′- TTTCCTCTCTCACCTGCCT TGTCTAG -3′（5′ 端引物）； 5′- CAATGAAACTGATCACACTTTTTGAATGT -3′（3′端引物）。PCR程序为：94℃，5min；94℃，45 s，55℃，45s，72℃，1min，33个循环；72℃，10min。PCR反应产物在1％的（质量体积比）低熔点琼脂糖上电泳，把扩增产物条带从胶上切下放入1.5 ml Eppendoff 离心管中，65℃水浴15 min，加入等体积苯酚（PH7.9），颠倒摇匀5 min，13000 转/分钟离心8 分钟，取上清，加入等体积氯仿:异戊醇（体积比24:1）颠倒摇匀5 min，13000转/分钟离心8 分钟，取上清，加入1/10体积的3摩尔／升醋酸钠（PH5.2）溶液，2倍体积预冷的95%（质量体积比,以下相同）乙醇，混匀后置-20℃冰箱中20 min 以上，13000转/分钟离心15分钟，倒掉95%（前面已述）乙醇后再用75%（质量体积比,以下相同）乙醇浸洗沉淀，自然风干，DNA 沉淀溶于20µl无菌去离子水。按pMD18-T（购自TaKaRa公司）载体说明书，连接到pMD18-T载体上，转化大肠杆菌（J.萨姆布鲁克. D.W.拉塞尔著，黄培堂等译分子克隆试验指南（第三版）科学出版社，96-99）。方法如下：通过菌落PCR挑选阳性克隆，引物序列为：M13F 5′-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3; M13R 5’-GTAAAACGACGGCCAGT-3），反应体系为：10×Taq酶反应缓冲液2ul、25mM MgCL₂ 1.2ul、2mM dNTP 1.5ul、10 uM引物 0.2ul、0.3单位Taq酶，加无菌水至20μl。反应程序为：94℃变性5min，94℃ 45s、55℃ 45s、72℃ 2min 32循环，72℃延伸 5min。每个PCR产物分别挑选3个克隆摇菌并提取质粒，测序，获得BnWRERF50基因全长序列，一种分离的基因，其序列为SEQ ID No．1 所示核苷酸序列。利用NCBI的开放阅读框，寻找程序(ORF founder)确定BnWRERF50基因的开放阅读框，推导出核苷酸序列编码的多肽，一种分离的多肽，其序列为SEQ ID No．2 所示的氨基酸序列。

根据获得的上述核苷酸序列（SEQ ID No．1），通过构建BnWRERF50超表达植物重组载体（OX-BnWRERF50），转化拟南芥，申请人获得21株转基因拟南芥，分别接种腐生真菌核盘菌和灰霉菌进行抗病鉴定，结果显示显著增强了转基因拟南芥对核盘菌和灰霉菌的抗性。

对蛋白质的分子量和理论等电点进行在线计算(http://us.expasyorg/tools/pi too1.htm)。用NCBI的Conserved Domains工具(http://wwwncb.inlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi ) 在线进行保守区域分析结果表明该基因含有一个保守的ERF结构域，属于乙烯响应转录因子（ERF）家族；通过Blastx程序对NCBI的NR数据库进行同源性比对，并对具有同源性、不同物种来源的ERF蛋白用ClustalX1．83进行多序列比对；用Prosite软件在线分析该蛋白质的基本结构域。根据上述方法分析结果显示: 该基因的开放读码框所推导的蛋白质序列编码205个氨基酸。在线计算蛋白质的分子量大约为23132 Da，理论等电点约为4.68。BLASTp在线分析软件将推导的编码蛋白与Genebank中的序列进行同源性比较，发现该序列与AtWRERF50、ERF1、ORA59、AtERF5、AtERF14、Tsi1和Pti4的蛋白质氨基酸序列在ERF保守结构域上的同源性分别达到96.8%、70.7%、69.1%、67.3%、79.7%、63.8%和74.2%，但是在蛋白全序列上相似性较低，分别为40.9%、13.1%、24.8%、12.4%、10.5%、13.4%、10.9%和13.6%，见图1，图2。

实施例2：

一种油菜抗性相关基因 BnWRERF50 的表达模式和病菌侵染响应模式分析：

1、一种油菜抗性相关基因BnWRERF50的表达模式分析：

本发明所用油菜（Brassica napus L.）为甘蓝性油菜中双9号。供试材料播种于大田，正常田间管理。

从同一大田生长条件相同的可育植株上取根、茎、叶、花、角果，每种材料至少取三个重复，每个重复至少一株，取样后用锡箔纸包裹，迅速放置于液氮中，-80℃保存。提取RNA（方法前面已述）。

PCR仪为DNA-Engine（BIO-RAD），采用油菜Actin作为内标基因（登录号AF111812），Actin 基因引物为5′- CTGGAATTGCTGACCGTATGAG-3′和5′- ATCTGTTGGAAAGTGCTGAGGG -3′。BnWRERF50基因引物为5′- TTTCCTCTCTCACCTGCCT TGTCTAG -3′和5′- CAATGAAACTGATCACACTTTTTGAATGT -3′。

PCR反应体系为10 µL，正反向引物（10 µmol/L）各0.4 µL，模板1µL，加无菌水补足至10µL。扩增条件为：94℃，5 min：94℃，30 s，55℃，30 s，72℃，50 s，25个循环。分别检测BnWRERF50在油菜组织（根、茎、叶、花、角果）中的表达。

半定量PCR反应每组实验均完成三个生物学重复，每个生物学重复至少做三次技术重复。分别检测BnWRERF50在油菜组织（根、茎、叶、花、角果）中的表达。结果如图3所示, BnWRERF50主要在根种表达，在茎，叶，花和角果中基本不表达。

2、BnWRERF50基因的表达受核盘菌侵染诱导。

对菌核病不同抗性的甘蓝型油菜品种M083 (高抗)和84039 (高感)由中国农业科学院油料作物研究所生物技术育种课题组提供，核盘菌菌核培养采用PDA培养基（前面已述）。

荧光定量PCR仪为RT™-Cycler（博奥），采用油菜Actin作为内标基因（登录号AF111812），Actin 基因引物为5′- CTGGAATTGCTGACCGTATGAG-3′和5′- ATCTGTTGGAAAGTGCTGAGGG -3′。BnWRERF50基因引物为5′- CCAGTTCTTGATCCGGATTCGTTCG -3′和5′- CGGCCTTCTTCTCACTCCTCGGTAA -3′。荧光定量PCR反应体系为20 µL：含有SYBR Mix 10 µL，正反向引物（10 µmol/L）各0.8 µL，模板2 µL，DEPC处理过的无菌水补足至20µL。扩增条件为：94℃，5 min；94℃ 15 s，60℃ 20 s，72℃ 30 s，40个循环；每个循环于72℃复性末端进行荧光检测。反应结束后先加热到95℃，然后降至72℃，再缓慢升温至95℃，记录荧光信号的变化，得出扩增产物的熔解曲线。每组实验均完成三个生物学重复，每个生物学重复至少做三次技术重复。分别检测BnWRERF50基因在不同抗性品种中，侵染后不同时间点的表达。

用比较Ct法（DDCt）计算基因的相对表达量。利用仪器所带软件，首先优化内标基因和目的基因扩增条件，分别测定Actin和目的基因的Ct值，选取九次实验测定值中最为接近的三次结果（Ct值系统误差小于0.3）取平均值，然后通过内标基因对目的基因进行校正得到DDCt，最后通过2^-DDCt估算目的基因的相对表达量和系统误差（前面已述）。在计算相对表达量时，以水处理的拟南芥叶片样本为参照，即将其值转换成1，其它处理样品再与其比较，获得相对表达值。结果如图4所示, BnWRERF50是一个在受核盘菌侵染诱导的基因，在抗性品种中的表达高于感性品种中的表达，表明BnWRERF50是一个抗性相关基因。

实施例 3 ：

一种抗性相关的 BnWRERF50 基因在增强植物对核盘菌抗性、对灰霉菌抗性中的应用 , 其步骤是：

1 、BnWRERF50基因超表达载体(OX-BnWRERF50)的构建和根癌农杆菌菌株EHA105转化（购于上海沪尚生物科技有限公司）：

构建的重组载体是将实验室构建的质粒PG4A (Zheng Wang, Han Mao, Caihua Dong, Ruiqin Ji, Li Cai, Hao Fu, and Shengyi Liu Overexpression of Brassica napus MPK4 Enhances Resistanceto Sclerotinia sclerotiorum in Oilseed RapeMPMI， 22（3）, 2009, 235–244.) 上的目的基因用前期克隆得到的BnWRERF50基因替换而来。为完成此目的，首先用PstI/XhoI 双酶切克隆的BnWRERF50基因片段，同时用PstI/XhoI酶切PG4A质粒（前面已述）。酶切反应在37度培养箱中进行，约4-6个小时之后，用1%琼脂糖胶电泳检测。将酶切后的BnWRERF50基因片段和PG4A质粒（前面已述）上切下的大片段用DNA凝胶回收试剂盒（前面已述）回收。把BnWRERF50基因片段比PG4A质粒（前面已述）载体片段按3:1（摩尔浓度比）的比例混合样品，加入T4 DNA连接酶5单位，10×反应缓冲液，无菌水补充体积至20μL，16℃连接过夜。转化后，在含有卡那霉素（50 μg/mL）固体LB平板上筛选，挑斑做菌落PCR，以及提质粒，酶切验证正确的重组质粒命名为OX-BnWRERF50,并对获得的载体进行测序以验证准确性。载体结构如图5。

然后利用冻融法（前面已述）将OX-BnWRERF50转入根癌农杆菌EHA105（购自大连宝生物生物制品有限公司，以下相同），涂布于含有50 μg/mL卡那霉素和利福平（50μg/mL）的LB固体（配方如下：分别称取10克胰蛋白胨，5克酵母提取物和10克氯化钠，8克琼脂依次溶解于蒸馏水中，定容于1000毫升。分装于500毫升三角瓶中，121℃，6.859×104 Pa下高压消毒15分钟。4℃冷藏备用）平板上，37℃培养过夜，各挑选白斑三个，做菌落PCR检测（前面已述）。

本发明所使用的研究BnWRERF50基因功能的重组植物表达载体，含有所述BnWRERF50基因的编码区核苷酸序列，组成型35S启动子可以增强BnWRERF50基因的表达水平。该载体大小适合，在植物中易与转化，所带有的除草剂标记基因Bar表达强度高，容易检测。通过这个载体转化拟南芥可以获得菌核病抗性增强的拟南芥转基因植株。

2、BnWRERF50基因超表达载体(OX-BnWRERF50)的遗传转化

参照文献中的方法进行拟南芥转化（Zhang X.R. et al. Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method. Nature, 2006，1:1-6）。制备含有构建好载体的根癌农杆菌EHA105（前面已述）菌液，在转化前一天转入含有卡那霉素50μg/ml、利福平50μg/ml的LB液体培养基中，28℃过夜培养。第二天，用紫外分光光度计（SPEKOL 1300）于276nm纳米波长下检测的吸光值，当菌液的吸光值达到在1.6-2.0之间时取出。室温（20-25℃，以下相同）以4000g离心10min，弃上清，将沉淀悬浮于等体积的5%蔗糖（质量体积比）中。将浑浊的蔗糖溶液倒入一大培养皿中，转化前加入终浓度为0.02%（体积比）的Silwet L-77（购自北京五洲元业科贸中心，以下相同）。混匀后把待转化的拟南芥整个花序轻轻的浸没在蔗糖中，默数15s，取出植株。转化后的植株用一个黑色塑料袋包好，放在生长箱培养。第二天将塑料袋揭开，放在光强的地方培养。隔一周再做一次转化。培养一个月左右收获种子，种子在培养箱或者日光下干燥3-5天。具体流程如下：

① 把利福平配制成为50Mg/ml的浓缩液，放于4度保存，使用前要吹打均匀，稀释100倍使用。

② 在5ml的LB液体培养基中加入5微升利福平浓缩液，摇匀，挑入单菌落，活化过夜。

③ 看到活化的菌液很混浊时，吸出不少于2ml活化的菌液，加入在200ml的LB液体培养基中，28度200转培养过夜至OD值1.6-2.0。

④ 4000g室温离心10分钟（台式离心机SIGMA2-16K），4500转，弃上清，在滤纸上扣干。

⑤ 配制好5%（质量体积比）蔗糖溶液200毫升，将上一部收集获得的沉淀溶解，用枪吹打均匀。

⑥ 将溶解好的菌液加到平皿中， 50毫升溶液/平皿，然后加入40微升的SiLwet-L-77（前面已述）混匀。

⑦ 将拟南芥的植株的花序浸入平皿中，用手将分枝的花拢在一起，轻轻浸入其中15秒。

⑧ 用不透明的袋子将每一个质粒转化的拟南芥植株套好，避光保湿一天即可。

⑨ 一个星期后再重复转化一次。

将转化收获的 T0代种子播在混有PNS营养液的蛭石中，（PNS营养液成份为：每升含5ml 1M KNO3，2ml 1M Ca(NO3)2_˙4H2O，2ml 1M MgSO4_˙7H2O，2.5ml 20mM Fe.EDTA， 2.5ml 1M磷酸缓冲液（pH5.5），1ml MS 微量元素）；4℃春化一星期，在21-22℃的生长间中自然生长两星期左右，待到达四叶期的早期进行除草剂草胺磷（30 mg/L）的喷洒第一次，一星期之后进行第二次喷洒。两次喷洒后对存活的绿苗进行PCR阳性检测，获得拟南芥转基因阳性苗。

转化苗的筛选及PCR鉴定: 根据本实验室进行的除草剂草胺磷浓度梯度筛选实验，确定除草剂（草胺磷,购自拜尔公司,以下相同）筛选浓度为30mg/L。T1代植株在苗期（播种后10天）喷施30mg/L除草剂，得到成活植株。PCR检测筛选苗：待四叶苗时期，取一片真叶（播种时期大约为四星期）用CTAB法（前面已述）提取基因组DNA，根据表达载体上外源BnWRERF50基因序列，设计引物进行PCR检测（序列为F-5′TTTCCTCTCTCACCTGCCTTGTCTAG 3′ R-5′CAATGAAACTGATCACACTTTTTGAATGT 3′）； PCR反应体系如下：基因组DNA模板1μL (约50ng)、10×Taq酶反应缓冲液2ul、25mM MgCL₂ 1.2ul、2mM dNTP 1.5ul、10 uM引物各 0.2ul、0.3单位Taq酶，加无菌水至20μl。反应程序为：94℃变性5min，94℃ 45s、55℃ 45s、72℃ 2min 32循环，72℃延伸 5min。用1％（质量体积比）琼脂糖凝胶电泳检测PCR反应产物，结果表明该超表达(OX-BnWRERF50)载体已经成功转入拟南芥。

根据获得的上述核苷酸序列（SEQ ID No．1），通过构建BnWRERF50超表达植物重组载体（OX-BnWRERF50），转化拟南芥，申请人获得21株转基因拟南芥，分别接种腐生真菌核盘菌和灰霉菌进行抗病鉴定，结果显示BnWRERF50超表达显著增强了转基因拟南芥对核盘菌和灰霉菌的抗性。

实施例4：

1、BnWRERF50基因的超表达增强了病源相关蛋白表达

通过半定量PCR验证超表达效率并观察转基因拟南芥T1代表型。观察结果显示，在正常生长状况下，各BnWRERF50基因超表达转基因植株与野生型植株并无明显差异； PCR鉴定后获得转基因T2代超表达(OX-BnWRERF50)各个株系的幼苗。摘取这些幼苗的叶片，速冻于液氮中，用半定量PCR对目标基因BnWRERF50的表达水平进行分析。具体方法如下：取经过PCR检测后获得的T2代阳性植株的叶片，在液氮中将植物幼嫩叶片样品研磨至粉状，利用Trirol提取试剂盒的要求进行RNA的提取。提取的总RNA溶于无RNase的双蒸水中。DNaseⅠ去除可能残留的DNA。用蛋白检测仪（DU 650 BECKMAN，USA）分别检测RNA在260纳米和280纳米光吸收值，结合1%（质量体积比）琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的纯度及浓度。以获得的RNA为模板进行逆转录（前面已述），得到的cDNA分装后于-20℃保存备用。

半定量PCR反应体系如下：cDNA模板1μL (约50ng)、10 × Taq酶反应缓冲液2ul、2mM dNTP 0.5ul、10 uM引物各 0.5ul、0.3单位Taq酶，加无菌水至20μl。反应程序为：94℃变性5min，94℃ 45s、55℃ 45s、72℃ 2min，20循环，72℃延伸 5min。用1％（质量体积比）琼脂糖凝胶电泳检测PCR反应产物。每组实验均完成三个生物学重复，每个生物学重复至少做三次技术重复。结果显示BnWRERF50超表达效率非常明显，如图6所示：而BnWRERF50基因超表达转基因植株中，BnWRERF50的表达被显著上调15-25倍，相应的，病源相关蛋白PDF1.2和ChiB的表达也显著上调；表明BnWRERF50基因的超表达升高了病源相关蛋白表达, 增强了植物的抗性防御能力。

实施例5：

1、BnWRERF50基因超表达显著增强植株对腐生型真菌核盘菌和灰霉菌的抗性

核盘菌（S.sclerotiorum）菌核采自武汉大田油菜茎杆；选完好菌核，先用75%酒精(体积比)泡1分钟，再用0.1%HgCl₂ 消毒8-10分钟，无菌水冲洗3-5次。把灭菌菌核切去两端，中间部分切成绿豆大小，切面朝下，接种于Minimal平板。通常每粒菌核接一板，一次接种8-9板。于22℃静置培养3-4天，当菌核即将铺满平板时，用φ2mm打孔器沿菌丝外缘打孔，取菌丝块，用于接种。Minimal培养基(1L)配方：NaOH 1g， DL-苹果酸 3g，NH₄NO₃2g，MgSO₄﹒7H₂O 0.1g，细菌琼脂粉 39g；按顺序将上面药品溶于盛有800ml的蒸馏水中，在加药品时，加入的药品充分溶解后再加入下一种药品，药品加完后加水补足1000mL，然后加入细菌琼脂粉，于117℃灭菌15min。

灰霉菌(B. cinerea)由华中农业大学李国庆教授提供,来源于武汉大田油菜叶片。菌株培养在PDA培养基上（前面已述）, 28 ℃培养8 d 。用无菌水从培养基上洗脱灰霉病原孢子,配制成含5×10⁵ - 1×10⁶ spores mL ^﹣ ¹的孢子悬浮液待用。

养(每天16 h 光照,8 h 黑暗)；选取4周龄的拟南芥苗(包括 OX-BnWRERF50 超表达株和野生型WT)用于核盘菌和灰霉的接种实验，每种基因型至少接种12株，每株接种两片叶，试验重复三次。对于核盘菌接种，菌丝生长在mini培养基上，直径约2mm的含有核盘菌菌丝的琼脂块被接种到叶的近轴表面；对于灰霉接种，菌丝生长在PDA培养基上，PDA培养基上收集的孢子用水稀释到5×10⁵ - 1×10⁶ spores mL ^﹣ ¹，接种时先将叶用细针刺伤，然后每个接种点滴加3ul的灰霉孢子的悬浮液。核盘菌和灰霉菌接种植物都需要保持高湿，温度和光照与接种前保持一致。发病后不同时间统计病斑面积，结果如图7和图8，与野生型相比，OX-BnWRERF50 超表达株显著增强了对核盘菌和灰霉的抗性，表明BnWRERF50基因是腐生型真菌核盘菌和灰霉的抗性相关基因。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院油料作物研究所

<120> 甘蓝型油菜抗病相关基因BnWRERF50及制备方法和应用

<130> 甘蓝型油菜抗病相关基因BnWRERF50及制备方法和应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 621

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

atggctgcgt ttgaggaaag ctctgatttg gatgctatac aggagcatct cttggaagac 60

tttttggttg ctgatggttt catgggagat tttgacttta atgcttcttt tgtctcagga 120

ctctggtgta tagagcctgt gatgaatcaa gttcctaaac aagaacctga ttcaccagtt 180

cttgatccgg attcgttcgt cagagagttt ttacaagtgg aagctgaatc atcttcagag 240

cagaattcat caccacatga gactgatcag agtgtctcac ccaggaaaga agcaaagagg 300

ttggaagaag aagaagaacc gaggcattac cgaggagtga gaagaaggcc gtggggaaaa 360

tttgcagcag agattcggga tcctgcaaag aaaggatctc ggatctggct aggaacattt 420

gaaagtaatg ttgatgctgc aagagcatat gactgtgcag ctttcaagct ccggggaaga 480

aaagccgtgc tcaactttcc tctagacgct ggcaagtatg aagctcccgt gaatttagga 540

cggaaaagga agagaagtga tgtgcaggag gagctccaaa gaagtcagag caattcatct 600

tcatcgtcaa gtgatctgtg a 621

<210> 2

<211> 206

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 2

Met Ala Ala Phe Glu Glu Ser Ser Asp Leu Asp Ala Ile Gln Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Glu Asp Phe Leu Val Ala Asp Gly Phe Met Gly Asp Phe Asp

20 25 30

Phe Asn Ala Ser Phe Val Ser Gly Leu Trp Cys Ile Glu Pro Val Met

35 40 45

Asn Gln Val Pro Lys Gln Glu Pro Asp Ser Pro Val Leu Asp Pro Asp

50 55 60

Ser Phe Val Arg Glu Phe Leu Gln Val Glu Ala Glu Ser Ser Ser Glu

65 70 75 80

Gln Asn Ser Ser Pro His Glu Thr Asp Gln Ser Val Ser Pro Arg Lys

85 90 95

Glu Ala Lys Arg Leu Glu Glu Glu Glu Glu Pro Arg His Tyr Arg Gly

100 105 110

Val Arg Arg Arg Pro Trp Gly Lys Phe Ala Ala Glu Ile Arg Asp Pro

115 120 125

Ala Lys Lys Gly Ser Arg Ile Trp Leu Gly Thr Phe Glu Ser Asn Val

130 135 140

Asp Ala Ala Arg Ala Tyr Asp Cys Ala Ala Phe Lys Leu Arg Gly Arg

145 150 155 160

Lys Ala Val Leu Asn Phe Pro Leu Asp Ala Gly Lys Tyr Glu Ala Pro

165 170 175

Val Asn Leu Gly Arg Lys Arg Lys Arg Ser Asp Val Gln Glu Glu Leu

180 185 190

Gln Arg Ser Gln Ser Asn Ser Ser Ser Ser Ser Ser Asp Leu

195 200 205

Claims

1.一种分离的油菜基因BnWRERF50在增强油菜对腐生营养型真菌核盘菌抗性中的应用，所述基因BnWRERF50序列为SEQ ID No．1所示。

2.一种分离的油菜基因BnWRERF50在增强油菜对腐生营养型真菌灰霉菌抗性中的应用，所述基因BnWRERF50序列为SEQ ID No．1所示。