CN103215278B - 红掌MYB转录因子AN2-like的克隆及表达载体构建 - Google Patents
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Abstract
本发明公开红掌MYB转录因子AN2-like基因及其植物表达载体构建，提取红掌“阿拉巴马”总RNA，反转录合成cDNA，以此为模板，设计特异引物，利用PCR方法获得AN2基因的全长cDNA，与pMD-18T载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆得到红掌AN2基因，该基因的cDNA全长1237bp,包括起始密码子前的上游序列和多聚A尾巴。连接到植物表达载体Cam35S-gfp上，构建一个新的植物表达载体，命名为Cam35S-an2。该基因与花青素合成调控有关。因此，AN2基因的获得，为红掌不同佛焰苞颜色品种的转基因培育奠定了基础，具有重要的理论及实践意义。
Description
技术领域
本发明涉及红掌中MYB转录因子基因anthocyanin2-like(AN2-like)的克隆、重组及对花青素合成调控功能的分析和应用，属于分子生物学和生物技术领域。
背景技术
MYB是植物转录因子中最大的家族之一，大多数植物的MYB以在其N端含有一段约51-52个氨基组成的MYB结构域为共同特征。MYB蛋白的分类主要是根据这个高度保守的DNA结合结构域这个结构域通常是由至多4个氨基酸残基序列的重复(R)组成每一个都形成3个α-螺旋每一个重复的第二个和第三个螺旋形成一个带有3个有规律的间隔色氨酸残基(或疏水)的螺旋-转角-螺旋(HTH)结构，形成一个3D HTH疏水核心结构，对维持HTH的构型有极为重要的意义。MYB在拟南芥中已经有很多报道，主要集中于次生代谢调节、抗逆性的研究等，具有广泛的转录调节作用，大多数MYB转录因子是基因表达的正调控因子，但是也有一部分是负调控因子。花青素相关的MYB转录因子通常包含R2和R3两个基序(R2R3-MYB)或包含1个R3基序(R3-MYB)，含有特异的DNA序列识别区和启动子结合区。许多现象表明一些MYB转录因子有双重功能，即：作为结构基因的直接活化子和作为活化bHLH基因的活化子。迄今为止，研究发现花青素结构基因调控的一般都是由MYB转录因子、bHLH转录因子和WD40蛋白形成一个蛋白复合体，直接调控结构基因的转录，而不合成中间调控物。
红掌中AN2-like转录因子与其它作物MYB转录因子高度同源，氨基酸序列分析发现其具有两个典型的SANT结构域，其为“SWI3、ADA2、N-CoR和TFIIIB”的DNA结合域，一般为两个串联存在并通常结合于DNA端粒的序列重复部位，形成加帽结构。其结合依赖于DNA序列上重复的G/C富集识别序列[C2-3A(CA)1-6]。这种结构通常存在于转录调控抑制因子复合体的结合DNA部位。本实验中的AN2-like转录因子有可能为具有花青素合成负调控作用的MYB转录因子。
红掌花青素缺失的突变体中，植株表现为白色佛焰苞和绿色叶柄和幼叶，正常野生型应为红色佛焰苞和淡红色叶柄和幼叶。生物信息学分析和分子生物学实验显示其表达分析在突变体中显著高于野生型。转基因拟南芥植株表现为植株纯绿色(尤其在幼苗期)，而正常野生型拟南芥茎杆和部分叶片通常带有红色。
在本实验中，相较于野生型，红掌突变体中AN2-like特异性表达升高，造成转基因拟南芥植株花青素缺失现象。
发明内容
本发明首次从红掌中分离出AN2-like基因的全长cDNA。
一、红掌AN2基因的克隆
以红掌“阿拉巴马”为材料，利用CTAB法提取总RNA，反转录合成cDNA，设计全长cDNA扩增引物：
5’端引物:5’TCACAAATTAGCACAGAGGTG3’
3’端引物:5’GAGAGGAGTGTCTACGATGGT3’
PCR体系及条件为：
| Ingredient | Amount(μl) |
| PCR-Grade Water | 40 |
| 10X Advantage2PCR Buffer | 5 |
| cDNA Template(100ng/μl) | 1 |
| Primer LF5O(10μM ea.) | 1 |
| Primer LF3O(10μM ea.) | 1 |
| 50X dNTP Mix(10mM ea.) | 1 |
| 50X Advantage2Polymerase Mix | 1 |
| Total volume | 50 |
获得全长的cDNA为1237bp，包括部分起始密码子前的5’UTR和终止密码子后的3’UTR。开放阅读框部分为879bp，由此推得具293个氨基酸的一段序列，将此氨基酸序列在国际基因库中进行比较，表明与已发表的矮牵牛、马铃薯、烟草的AN2蛋白的氨基酸同源性分别为81％、69％和40％。
二、红掌AN2基因表达载体的构建
根据已测序的AN2基因序列，设计在5’端加上SmalI酶切位点的上游引物P1(5’-TCCCCCGGGGGAGGAGAGAGGAGTGTCTACGATGGT-3’)和在3’端加上XbalI酶切位点的下游引物P2(5’-GCTCTAGAGCTCACAAATTAGCACAGAGGTG-3’)。通过PCR反应扩增目的片段，回收PCR产物，经测序无误后再用Smal和Xbal双酶切该产物和植物表达载体Cam35S-gfp，并将酶切获得的含有两个酶切位点的基因和Cam35S-gfp载体大片段连接获得含有AN2基因的表达载体。
三、AN2基因的功能鉴定
利用农杆菌介导法转化拟南芥。
取拟南芥品种哥伦比亚(ecotype‘Columbia’)，开花后使用携带有AN2-like基因的植物表达载体的农杆菌进行侵染，并获得潜在的转基因种子，然后在50mg/L潮霉素的MS固体平板培养基上进行抗性筛选，获得T1代阳性转基因植株，待其成熟并结籽，再在50mg/L潮霉素的MS固体平板培养基上进行抗性筛选，获得稳定遗传的T2代阳性转基因植株。T2代转基因拟南芥种子萌发后，观察植株生长过程中表型，发现植株不再表现出红色，即花青素合成缺失，符合理论推测。
具体实施方式
下面对本发明作进一步说明。
实施例1：红掌基因的克隆方法
1、总RNA的提取：
(1)取1ml CTAB提取液分装到2ml离心管中，65℃预热；
(2)称取0.2g材料，在液氮中研磨后立即转入含有CTAB提取液的离心管中，涡旋混合，65℃温浴2～3min；
(3)立即加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)，涡旋混合，室温，10000rpm离心15min；
(4)吸取上清到一新的离心管中，重复步骤3；
(5)取上清到一新的离心管中，加入1/3体积的8M LiCl，4℃沉淀过夜；
(6)4℃，10000rpm离心30min；
(7)弃上清，沉淀用70％乙醇洗涤，再用无水乙醇洗涤；
(8)将沉淀溶解在100μl STE(65℃预热)中，立即用氯仿/异戊醇抽提一次；
(9)取上清，加入2倍体积的无水乙醇，－80℃沉淀30min，或－20℃沉淀2h；
(10)4℃，10000rpm离心20min；
(11)沉淀分别用70％乙醇和无水乙醇洗涤，干燥后用20μl RNase-free水溶解；
2、AN2基因的克隆及序列分析
(1)利用Invitrogen公司的Superscript III Kit将RNA反转录为cDNA，作为PCR模板备用。
(2)设计全长cDNA扩增引物：
5’端引物:5’TCACAAATTAGCACAGAGGTG3’
3’端引物:5’GAGAGGAGTGTCTACGATGGT3’
(3)根据引物的Tm值进行PCR条件的优化后，按照发明内容一所述的方法进行PCR扩增，并将获得的产物连接到大肠杆菌，经PCR和酶切鉴定后进行序列测定。
(4)同源检索：利用BLAST软件将分离出的序列与基因银行中的序列进行比较。
实施例2：红掌AN2基因植物表达载体Cam35S-gfp的构建
1、根据分离出的红掌AN2基因的核苷酸序列，设计引物:
正向引物：5'-TCCCCCGGGGGAGGAGAGAGGAGTGTCTACGATGGT-3'
反向引物：5 -GCTCTAGAGCTCACAAATTAGCACAGAGGTG-3’
以总RNA反转录的5’Race的cDNA为模板，进行聚合酶链式反应。
2、取1μl PCR产物与pMD18-T载体进行连接，操作步骤按TakaRa公司产品pMD18-T Vector system说明书进行。然后转化大肠杆菌DH5α菌株，在表面涂异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)和5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X－gal)的含氨苄青霉素(100微克/毫升)的LB平板上生长过夜。挑取白色菌落，在LB液体培养基中培养过夜。碱法提取质粒DNA，进行序列测定。
3、用SmalI和XabI两个限制性内切酶将该基因从pMD18-T Vector载体上切下，与相同酶酶切的Cam35S-gfp连接。连接产物转化DH5α细胞，然后在含卡那霉素的LB固体平板上培养，对菌落进行PCR鉴定和质粒DNA的酶切分析。将构建好的重组子命名为Cam35S-an2。
实施例3：AN2基因的功能鉴定
1、种植拟南芥野生型植株哥伦比亚(ecotype columbia)并待其开花。
2、将表达载体Cam35S-an2转化农杆菌EHA105，挑取鉴定好的农杆菌单克隆于含50毫克/升卡那霉素的LB液体培养基中，28℃振荡培养。
3、配制侵染液：1xMS、1mg/ml6BA、蔗糖150g/L、MES0.3g、L77600ul/L
4、农杆菌3000rpm离心5分钟，沉淀用侵染液悬浮。
5、使用喷壶将农杆菌侵染液喷雾到拟南芥花上，间隔3天重复一次，共3次。
6、成熟后收集种子，使用升汞消毒后栽种到50mg/L潮霉素的MS固体平板培养基上进行抗性筛选，获得T1代阳性转基因植株。
7、收集T1代种子，再次在50mg/L潮霉素的MS固体平板培养基上进行抗性筛选，获得稳定遗传的T2代阳性转基因植株。
8、将植株移入花盆，观察植株生长过程中表型，发现植株不再表现出红色，即花青素合成缺失，符合理论推测。
以上所揭露的仅为本发明的较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于本发明所涵盖的范围。
Claims (2)
1.红掌MYB转录因子AN2-like，其特征在于其核苷酸序列为：
。
2.包含权利要求1所述的红掌MYB转录因子AN2-like的表达载体。
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