CN103409431B - 一个控制早期水稻叶绿体发育的基因的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一个控制早期水稻叶绿体发育的基因及其检测方法和应用。本发明公开了一个控制水稻叶绿体早期发育的基因，具有SEQIDNo.1所示的核苷酸序列，该基因编码的蛋白质具有SEQIDNo.2所示的氨基酸序列。利用设计的如SEQIDNo.4和No.5特异性PCR引物，通过对水稻中所提取的DNA进行PCR扩增后经 Sca I酶切进行鉴定，能快速检测到含有该基因水稻植株，其检测准确性高，操作简单，成本低廉。水稻中该基因被破坏即可导致早期水稻植株黄化。通过本发明得到的控制水稻叶绿体早期发育的基因可应用于杂交水稻制种，可提高杂交水稻不育系自身以及它配制杂交水稻的纯度。

Description

一个控制早期水稻叶绿体发育的基因的检测方法

技术领域

本发明涉及农业和植物生物技术等领域，特别是在分子水平上进行植物遗传育种以及植物生理、基因功能等基础研究。

背景技术

叶绿体是高等植物进行光合作用的场所，而叶绿体的发育受一系列核质基因的控制。研究表明控制叶绿体发育的基因被破坏可导致叶绿体发育受阻，进而使植物叶色发生异常，甚至使光合作用效率急剧下降。目前，研究工作者们利用物理、化学、生物等诱变得到水稻叶色突变体，将其应用于水稻的遗传育种、生理及其相关基因的克隆和功能研究。本研究利用经物理诱变得到的水稻早期苗色突变体并通过图位克隆技术定位到一个控制叶绿体发育的基因，至今尚未有与水稻此基因相关的文献报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一个控制早期水稻叶绿体发育的基因、该基因编码的蛋白质及这种基因的检测方法和应用。

水稻中该控制水稻叶绿体早期发育的基因若被破坏，即可导致早期水稻植株黄化。

这种控制早期水稻叶绿体发育的基因，具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。优选的，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

所述的基因序列所编码的蛋白质，具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。优选的，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

一对用于检测上述基因的特异性引物，序列为：

上游：5′- TCATTGCTGATGCATTGGAG -3′

下游：5′- CACCCGCTGATCAGTTAAAA -3′

即SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示的序列。

检测这种控制早期水稻叶绿体发育的基因的方法为，采用上述特异性PCR引物对水稻苗期所提取的DNA进行PCR扩增反应，得到404bp核苷酸片段，说明含有控制早期水稻叶绿体发育的基因。优选的，404bp核苷酸片段序列如SEQ ID No.3所示。优选的，将所得到的得到404bp片段用ScaI酶切，出现长度为267bp和137bp的特异性片段，说明含有控制早期水稻叶绿体发育的基因。

在本发明研究中，发明人设计的特异性的PCR引物和检测方法，能对水稻苗期所提取的DNA进行PCR扩增，其产物用ScaI进行酶切鉴定，根据酶切带型能快速检测到含有此基因的水稻品种，其检测的准确性高，操作简单，成本低廉。若一个水稻品种中含有此基因，则用上述引物能够扩增出长度为404bp的特异性片段。然后用ScaI对该片段进行酶切，其酶切带型为出现两个特异性片段，长度为267bp和137bp。

水稻黄化突变体材料是由粳稻“嘉花1号”经⁶⁰Coγ射线辐照而来，经海南、上海两地多年自交加代和选择，已成为各种农艺性状稳定的品系。发明人在研究中将此突变品系与籼稻“培矮64S”配制正反交组合，构建遗传群体，利用SSR和InDel分子标记将控制叶绿体发育的基因定位在水稻的第9号染色体。

本发明控制早期水稻叶绿体发育的基因与其启动子同农杆菌表达载体连接，并通过农杆菌介导的转基因技术将该DNA序列转入黄化突变体后，其后代植株叶色变绿，说明该基因被破坏即可导致早期水稻叶绿体发育受阻，使植株黄化。通过本发明得到的控制早期水稻叶绿体发育的基因可应用于杂交水稻制种，可提高杂交水稻不育系自身以及由它配制杂交水稻的纯度。

附图说明

图1为本发明的特异性PCR引物对该基因进行PCR扩增结果；

图2为本发明对PCR扩增产物进行SacI酶切检测结果。图中，M代表Marker；T1代表扩增的PCR产物；T2代表扩增的PCR产物Taq I酶切后的片段。

具体实施方式

实施例1    水稻DNA提取

1、称取0.5g新鲜的苗期水稻叶片，把叶片剪成0.5cm长的小段，放到预冷的研钵中，加入液氮研磨至粉末状，之后转入1.5ml离心管中，加入1ml 60℃预热的2×CTAB，轻轻震荡后60℃水浴45min，期间震荡2次。

2、 取出离心管，冷却置室温，12000转/分的条件下离心5min，吸取上清液，加入等体积氯仿-异戊醇(24：1)混合液，充分混匀。

3、 将含有溶液的离心管进行平衡，12000转/分的条件下离心5min，吸取上清液，加入其2/3体积异丙醇，轻轻混匀使核酸析出。

4、 12000转/分的条件下离心5min，使核酸沉淀，弃上清，用70%乙醇洗涤，室温干燥后溶于10μl的无菌水中。

5、 取2μl 用于后续的PCR扩增反应。

实施例2   PCR扩增和基因检测

（一） 获得控制早期水稻叶绿体发育的基因

1、 25 μL PCR反应体系如下：100mM Tris-HCl pH9.0；100mM KCl; 20mM MgSO₄；80mM  (NH₄)₂SO₄；2.5 mM dNTP; 10μM 引物，5U/μl Taq酶，1μl模板DNA/10μl。

引物序列为：

F: 5'- AAAGGTACCGGCTTTGTGGAGAAGGAGAAATGTT -3'（划线处为限制性内切酶KpnI碱基识别序列）

R:5'–AAAACTGCAGTCACTAAAGGGAACAAAAGCTGGTA-3'（划线处为限制性内切酶PstI碱基识别序列）

3、 PCR扩增反应在PCR扩增仪上进行。

温度和反应条件为：94℃预变性4min， 94℃变性30sec， 50℃退火30sec， 72℃延伸60sec，35个循环；最后72℃延伸6min。

PCR扩增产物长度为4.1kbp，测序结果如SEQ ID No.1。

参照KOME网站上获得的该基因ORF序列Bioxm软件翻译成氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

（二） 检测控制早期水稻叶绿体发育的基因

1、 25 μL PCR反应体系如下：100mM Tris-HCl pH9.0; 100mM KCl; 20mM MgSO₄; 80mM  (NH₄)₂SO₄; 2.5 mM dNTP; 10μM 引物，5U/μl Taq酶，1μl模板DNA/10μl。

引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示：

上游：5′- TCATTGCTGATGCATTGGAG -3′

下游：5′- CACCCGCTGATCAGTTAAAA -3′

2、 PCR扩增反应在PCR扩增仪上进行。

温度和反应条件为：94℃预变性4min， 94℃变性30sec， 50℃退火30sec， 72℃延伸60sec，35个循环；最后72℃延伸6min。

得到的扩增产物，上样于1%琼脂糖凝胶上并电泳，经溴化乙锭染色后在UVP凝胶成像仪上成像，结果如图1，出现799bp条带，序列如SEQ ID NO.3所示，是SEQ ID No.1中的一段。

3、 酶切反应体系                                             

1μl无菌水，1μl 10×ScaI buffer，1μl 0.1%BSA， 0.5μl 10U/μl ScaI和 6.5μl PCR扩增产物（总体积10μl）。

4、 酶切处理

将酶切反应体系混匀后，放入37℃恒温水浴中，温浴1小时，每管加入1μl 10× Loading buffer 终止酶切反应。将扩增产物，于1%琼脂糖凝胶电泳，经溴化乙锭染色后在UVP凝胶成像仪上成像。结果如图2。其酶切带型为出现两个特异性片段，长度为267bp和137bp。

实施例3    基因功能验证

采用γ射线或者其他物理方法诱变，破坏水稻中SEQ ID No.1的基因序列。经测序该基因中的碱基缺失，RNA水平降低，则水稻早期植株黄化。该基因的功能互补实验结果表明含有该正常基因的突变体后代植株叶色呈绿色。

1、利用SSR和InDel分子标记进行突变基因的定位，通过测序和半定量RT-PCR技术，表明该基因序列发生突变,其RNA水平的表达量下降。

3、利用农杆菌介导的转基因技术，将SEQ ID NO.1的ORF核苷酸序列连接到含有外源启动子CaMV35S的农杆菌表达载体pCAMBIA1301S上，转化黄化突变体的愈伤组织，获得的阳性第一代转基因植株，其叶色呈绿色。

4、将第一代转基因植株的种子播种，其叶色出现分离，呈绿色和黄化表型，并符合孟德尔遗传分离比即3：1。

5、该基因正常表达是水稻植株叶色呈绿色，而其表达下调的突变植株苗期叶色呈黄化表型，因此可以通过此表型变化来鉴别水稻品种真伪，提高纯度。

序列表

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  江泉

 <120>  一个控制水稻叶绿体早期发育基因及其应用

<130>  none

<140> 201310227117.9

<141>2013-06-06

<160>  5    

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  6608

<212>  DNA

<213>  水稻

 

<400>  1

gttttgtgga gaaggagaaa tgttgatttc ttgagagttg agacgaggaa gaagagcaag     60

cggataaacc acctgtgcta aaaccctcat cgccgcgccg ccgcctccgc ctctgctccg    120

ccgctcccaa ccctgcgcgg cgggcggcgg tgagccggtc tgctcttccc tctaccggcc    180

gcccacgctg ctcctcacgg cgctctcgat tcctggttcc tctccccgtg ggcctccatg    240

tctttgacca ccgtttcttt ctcatacccc gccaagccgc ttcccaaatg gccgtgcacg    300

ctgcctaagc cgccgccgag ggctcgctgc cgttttgtgg tgcgggcgga cgtcaaggtg    360

atctcttccg gtgaggcctg ccgccgtggg ctcgccgccg gcatcgacaa gctcgccgac    420

gccgtcgcgg tcactctagg ccccaaaggt cagcctactg tttttttttg gtgctcttga    480

gtaccaattc ttgctgtcca acttctaatt tcttgcaatt tcagtgctta tatggatgat    540

tcgatgtaag atatgaatct agtgaatgca cagaaaatga gccatcagga gcctaaaagg    600

atttcaattt tttttttctt gctaaagcct aaagatgttg ggtttggtat atccatcagt    660

ttagtttgtt gttcatgttg ttgggttctc atgagcctgg attacctgtt taattgtctt    720

gtaatgctac ggaatgttga gagctcaaaa atttactgca ggcaggaatg ttgttattga    780

ccaagacgat gttcctaaag taatcaatga tggtatcaca attgccaagg ctatagagct    840

cccaaatgct gttgagcacg caggtgccat gttacttcaa gaggttgggt gccgaatgtc    900

ttcatattct ttaaattggt caatatcgac accgctgttt attttactga tagcatgtta    960

accagatagc atccaagacg aatagttctg ttggcgatgg aacaacaact gctattattt   1020

tggcaagaga aattatcaat cttgggttgt tggcagtagc cactggtgct aacccagttg   1080

ccctgagaaa gggtattgac aaagctgttc atgaacttat tgggatcttg aagactaaat   1140

gtatccctgt aagtacaaag gaggacataa aaggtaattt tgtcacctgg gaagcataca   1200

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ttattttaga aagcatatag tcgatatagc atgaagcata tcatgatttg tctgtgaatg   1320

caccgaaatt attctgtggt cagattataa aatgttgtaa atctctaaat ttcattttca   1380

gctgttgctt caatatcagc tggcaatgat gaatatgttg gcgatctcat tgctgatgca   1440

ttggagaaga taggtcctga tggaataatt aaaattgagt cctcatcttc aatatatact   1500

tcagttgagg tgcaagaagg aatgaaggta tgtttatgtg gatatgaaat ttctccctac   1560

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gtgtgtcaaa caaaatcatt ccattgaacc actaatcaac atttagtgca gaaagtagct   1680

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ggttatatct ctccacattt catcacaaat caagacaaag caattgttga atttgaaaat   1800

gctagggtac ttttaactga tcagcgggtg gatgatgtcc aagagatact tcctttgcta   1860

gagaagacca cacagttgag tgtccctttg ttgattattg cggaggatgt ttcacatacg   1920

gtgtattcaa ctcttgttct taacaaactg aatggactgc taaatgttgc tgttgttaaa   1980

tgtcctggtt tgggagatga aaagaaggct attctccaag atattgctat tatgacaggt   2040

gaagaattag tacactagaa ctatgtacct tgaaatttaa tgttagaatt attccataca   2100

tcaaagtaca tgattttatc ttgtagtaca tgcttacagg atataggcca tatcctaata   2160

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tttccctcta ccgtgttgcc gagaccagca ttttcatatt tggctttcac catctttcat   2280

gtgcatggtg aattgcttta aacttatctg tctagctccg ttaggctctg agtttttgtt   2340

tctccttcaa tttacaggtg cagatttctt tgctagtgac cttggctggt gtcttcaagg   2400

tgctacttct gatcagctag gtatggctca gaagatcact ataacaagtg atactactac   2460

tatcattgca catccttcga tgagaccaga aattgaggcc agaattcagc aacttaagaa   2520

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actctcaaga ggtattgcag ttatcaaggt gcgttgctat gacattatgt caacaaacct   2640

atattcccat tgtttaatga atatgtgctt tctgtataca attttaccgg aaagctttct   2700

ttgtgtcaaa aagattttca ggacataatg cagaaatcac tttagttgtg gtataaaact   2760

gttagtttgt gtctggggat ttgataagag tggacttttt tcaggttggt gcagctactg   2820

aagctgaact cgaggatagg aaactgagag cggaggatgc aaaaaatgca acctttgcag   2880

ccattagcga aggcataact cctggaggtg gtgtgacgta tgttcaatta tcaaagtata   2940

ttcccagtat catggatctt gtagatgact ctgaagagaa gattggtgta aatatagttg   3000

ggaaggtttg tttctctatt cactgacaac catcactttt tttttggcat atttgcatta   3060

cactgctgct gctgtattac acacttggtt tgtttctcca ttcactaaca accatcacct   3121

ttttttttct tttttttttc atattttctt acactgctgc agctgtatta cacactaggt   3180

ttgaagaata atctacattt tgaacctaag catcaaatac tcaatatggc aaatatgtca   3240

attcctttag tgactaacaa gtgcaaagac gcatcaattt aaatttaaggcgttcactgt   3300

attaacacat tctcagaaga tattttttct tgcaaaaata attaaatcag ttgcataaca   3360

tcctaattct gaaatctgtc caatgaccaa tgttgctcta ggcacttctc gtccctgcta   3420

tgacgatagc tcgcaatgct ggggcagatg gtccagctgt tgtagagaag cttcttgcga   3480

gtgaatggcg agttggatac aatgcaatga ctgacaaatt tgaagacctt gttgatgctg   3540

gtgtggtaga cccatgcagg gttgcaagat gtgtgcttca aaactctgcc tctattgcag   3600

gacttatttt aatgacgcaa gctatgatgt tcgacaaaat aaagaagaaa aagtccacca   3660

ttcctcaaat tcctggcatc ccaccattgc agataaatca aaatgcttag atttgaacta   3720

gtaacttact gtcattgaag aaaggtccat gatgcaaggc ctttgtttga tcggttagat   3780

gagttgaacc aagaattgga agtggagcct ctgagcagat catcagctgg agccactggg   3840

tacgataacg gaggaaaaga tctacttcta tggttcagat atcagtaact taaaactaac   3900

tgtatactag tcagcaaaat gtctccatat ccctcttctc tcttttccct tggaggtgca   3960

aggagcattt tttttccttc acaattttgt aacgtagaag ataggattac taatccattg   4020

cagatcccaa aatgttgaac gtgctagttt tattgtactt ttatatcttc atgaatgtgc   4080

atgatgattt gcttgatact actttgatta aacacata                       4118

 

 

 

<210>  2

<211>  584

<212>  PRT

<213>  水稻

 

<400>  2

 

Met Ser Leu Thr Thr Val Ser Phe Ser Tyr Pro Ala Lys Pro Leu Pro

1               5                   10                  15     

 

Lys Trp Pro Cys Thr Leu Pro Lys Pro Pro Pro Arg Ala Arg Cys Arg

            20                  25                  30         

 

Phe Val Val Arg Ala Asp Val Lys Val Ile Ser Ser Gly Glu Ala Cys

        35                  40                  45             

 

Arg Arg Gly Leu Ala Ala Gly Ile Asp Lys Leu Ala Asp Ala Val Ala

    50                  55                  60                 

 

Val Thr Leu Gly Pro Lys Gly Arg Asn Val Val Ile Asp Gln Asp Asp

65                  70                  75                  80 

 

Val Pro Lys Val Ile Asn Asp Gly Ile Thr Ile Ala Lys Ala Ile Glu

                85                  90                  95     

 

Leu Pro Asn Ala Val Glu His Ala Gly Ala Met Leu Leu Gln Glu Ile

            100                 105                 110        

 

Ala Ser Lys Thr Asn Ser Ser Val Gly Asp Gly Thr Thr Thr Ala Ile

        115                 120                 125            

 

Ile Leu Ala Arg Glu Ile Ile Asn Leu Gly Leu Leu Ala Val Ala Thr

    130                 135                 140                

 

Gly Ala Asn Pro Val Ala Leu Arg Lys Gly Ile Asp Lys Ala Val His

145                 150                 155                 160

 

Glu Leu Ile Gly Ile Leu Lys Thr Lys Cys Ile Pro Val Ser Thr Lys

                165                 170                 175    

 

Glu Asp Ile Lys Ala Val Ala Ser Ile Ser Ala Gly Asn Asp Glu Tyr

            180                 185                 190        

 

Val Gly Asp Leu Ile Ala Asp Ala Leu Glu Lys Ile Gly Pro Asp Gly

        195                 200                 205            

 

Ile Ile Lys Ile Glu Ser Ser Ser Ser Ile Tyr Thr Ser Val Glu Val

    210                 215                 220                

 

Gln Glu Gly Met Lys Ile Asp Lys Gly Tyr Ile Ser Pro His Phe Ile

225                 230                 235                 240

 

Thr Asn Gln Asp Lys Ala Ile Val Glu Phe Glu Asn Ala Arg Val Leu

                245                 250                 255    

 

Leu Thr Asp Gln Arg Val Asp Asp Val Gln Glu Ile Leu Pro Leu Leu

            260                 265                 270        

 

Glu Lys Thr Thr Gln Leu Ser Val Pro Leu Leu Ile Ile Ala Glu Asp

        275                 280                 285            

 

Val Ser His Thr Val Tyr Ser Thr Leu Val Leu Asn Lys Leu Asn Gly

    290                 295                 300                

 

Leu Leu Asn Val Ala Val Val Lys Cys Pro Gly Leu Gly Asp Glu Lys

305                 310                 315                 320

 

Lys Ala Ile Leu Gln Asp Ile Ala Ile Met Thr Gly Ala Asp Phe Phe

                325                 330                 335    

 

Ala Ser Asp Leu Gly Trp Cys Leu Gln Gly Ala Thr Ser Asp Gln Leu

            340                 345                 350        

 

Gly Met Ala Gln Lys Ile Thr Ile Thr Ser Asp Thr Thr Thr Ile Ile

        355                 360                 365            

 

Ala His Pro Ser Met Arg Pro Glu Ile Glu Ala Arg Ile Gln Gln Leu

    370                 375                 380                

 

Lys Lys Asp Leu Glu Glu Thr Thr Ser Ala Tyr Leu Lys Glu Arg Phe

385                 390                 395                 400

 

Ser Ser Arg Ile Ala Lys Leu Ser Arg Gly Ile Ala Val Ile Lys Val

                405                 410                 415    

 

Gly Ala Ala Thr Glu Ala Glu Leu Glu Asp Arg Lys Leu Arg Ala Glu

            420                 425                 430        

 

Asp Ala Lys Asn Ala Thr Phe Ala Ala Ile Ser Glu Gly Ile Thr Pro

        435                 440                 445            

 

Gly Gly Gly Val Thr Tyr Val Gln Leu Ser Lys Tyr Ile Pro Ser Ile

    450                 455                 460                

 

Met Asp Leu Val Asp Asp Ser Glu Glu Lys Ile Gly Val Asn Ile Val

465                 470                 475                 480

 

Gly Lys Ala Leu Leu Val Pro Ala Met Thr Ile Ala Arg Asn Ala Gly

                485                 490                 495    

 

Ala Asp Gly Pro Ala Val Val Glu Lys Leu Leu Ala Ser Glu Trp Arg

            500                 505                 510        

 

Val Gly Tyr Asn Ala Met Thr Asp Lys Phe Glu Asp Leu Val Asp Ala

        515                 520                 525            

 

Gly Val Val Asp Pro Cys Arg Val Ala Arg Cys Val Leu Gln Asn Ser

    530                 535                 540                

 

Ala Ser Ile Ala Gly Leu Ile Leu Met Thr Gln Ala Met Met Phe Asp

545                 550                 555                 560

 

Lys Ile Lys Lys Lys Lys Ser Thr Ile Pro Gln Ile Pro Gly Ile Pro

                565                 570                 575    

 

Pro Leu Gln Ile Asn Gln Asn Ala

            580                

 

<210>  3

<211>  404

<212>  DNA

<213>  水稻

 

<400>  3

tcattgctga tgcattggag aagataggtc ctgatggaat aattaaaatt gagtcctcat     60

cttcaatata tacttcagtt gaggtgcaag aaggaatgaa ggtatgttta tgtggatatg    120

aaatttctcc ctacaatatg ctacctgtat gcaaagaact tcccttttgc aacaaaatgc    180

agctatgtct cagggtgtgt caaacaaaat cattccattg aaccactaat caacatttag    240

tgcagaaagt agctggtgta aatttatagt actatggttc atgattctcc gtctggtcgt    300

tgcagataga caaaggttat atctctccac atttcatcac aaatcaagac aaagcaattg    360

ttgaatttga aaatgctagg gtacttttaa ctgatcagcg ggtg                    404

 

 

<210>  4

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  4

tcattgctga tgcattggag                                                 20

 

<210>  5

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  5

cacccgctga tcagttaaaa                                                 20

 

Claims (3)

1.一个控制早期水稻叶绿体发育的基因的检测方法，其特征在于,所述控制早期水稻叶绿体发育的基因核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；鉴别的步骤为：

用特异性PCR引物对水稻苗期所提取的DNA进行PCR扩增反应，得到404bp核苷酸片段，说明含有控制早期水稻叶绿体发育的基因；所述特异性PCR引物的核苷酸序列为：

上游：5′- TCATTGCTGATGCATTGGAG -3′，

下游：5′- CACCCGCTGATCAGTTAAAA -3′。

2.权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的404bp核苷酸片段，序列如SEQ ID No.3所示。

3.权利要求1所述的检测方法，其特征在于，将所得到的404bp片段用ScaI酶切，出现长度为267bp和137bp的特异性片段，说明含有控制早期水稻叶绿体发育的基因。