KR102539626B1

KR102539626B1 - 식물 수확량 및 이삭 당 낟알 갯수의 조절에 있어서 단백질 nog1의 용도

Info

Publication number: KR102539626B1
Application number: KR1020197031047A
Authority: KR
Inventors: 추안칭 선; 싱 후오; 루빈 탄; 펭시아 리우; 용카이 푸; 주오펭 주; 핑 구
Original assignee: 차이나 어그리컬처럴 유니버시티
Priority date: 2017-04-06
Filing date: 2017-08-16
Publication date: 2023-06-02
Also published as: JP2020516256A; KR20200002835A; WO2018184333A1; CN108690847A; CN108690847B; US20210079414A1; JP7023979B2

Abstract

본 발명은 식물 수확량 및/또는 이삭 당 낟알 갯수의 조절에 있어서 단백질 nog1의 용도를 제공한다. 단백질 nog1의 아미노산 서열은 서열 2에 나타낸다. 수확량은 식물당 수확량이며, 낟알 갯수는 주경의 이삭 당 낟알 갯수이다. 단백질 nog1의 발현이 저해된 유전자전환 처리된 Guichao 2는 처리되지 않은 Guichao 2와 비교하여 감소된 식물당 수확량 및/또는 감소된 주경의 이삭 당 낟알 갯수를 갖는다. 단백질 nog1을 암호화하는 핵산 분자를 SIL176 내로 도입함으로써 얻어진 유전자전환 식물은 형질전환되지 않은 SIL176과 비교하여 증가된 식물당 수확량 및/또는 증가된 주경의 이삭 당 낟알 갯수를 갖는다.

Description

식물 수확량 및 이삭 당 낟알 갯수의 조절에 있어서 단백질 nog1의 용도

본 발명은 생명공학의 분야, 구체적으로 식물 수확량(plant yield) 및 낟알 갯수(grain number)의 조절에 있어서 단백질 nog1의 용도에 관한 것이다.

세계에서 가장 중요한 식량 작물 중 하나인 벼는 전세계적으로 120개 초과의 국가에서 재배되며, 경작 면적은 연간 1억 5천만 헥타르 초과로 유지되고, 주식으로서 세계 인구의 50%에게 식량을 공급한다. 오늘날, 인구가 계속 증가하고 경작되는 적경지의 면적이 매년 감소함에 따라, 단위 면적당 벼 수확량을 증가시키는 것은 세계 식량 안보를 위한 강력한 수단 중 하나이다. 반 세기에 걸친 벼 육종의 역사를 검토하면, 중국의 단위 면적당 벼 수확량은 2회의 도약을 경험했으며, 첫번째는 드워프 육종(dwarf breeding)에 의해 표시되는 녹색 혁명이고, 두번째는 벼의 잡종강세(heterosis)의 이용이다. 그러나 단위 면적당 벼 수확량은 지난 20 년간 정체되어 있었다. 연구자들은 현재 생산에 사용되는 품종 중 다수가 동일하거나 유사한 유전적 근원을 가졌고, 벼 품종의 유전적 자원의 이용이 포화되는 경향이 있으며, 벼 품종 사이의 좁은 유전적 다양성이 그의 유사한 유전적 기반 및 유전자형을 유발하고, 이는 잠재적인 벼 수확량의 추가의 개선을 한정하는 병목이 되어 왔다고 생각한다.

통상의 야생형 벼(Oryza rufipogon Griff.)는 아시아의 경작되는 벼의 야생형 조상이며, 인공적으로 재배되는 경작되는 벼보다 더 풍부한 유전적 다양성 및 유전적 자원을 가지고 있다. 통상의 야생형 벼는 경작되는 벼보다 훨씬 더 많은 유전적 분화 유형을 나타내며, 벼 수확량을 증가시킬 수 있는 풍부한 유전자를 함유한다. 그러므로, 경작되는 벼에서 통상의 야생형 벼의 유전체로부터 손실되거나 약화된 우수한 재배 유전자(domesticated gene)를 발굴하고 이용하며 벼의 육종 생산에 그들을 적용하는 것은 이론적으로 매우 중요하고 실용적 가치가 있으며, 이는 또한 현재의 벼의 육종 문제를 해결할 효과적인 방식이다.

본 발명에 의해 해결하고자 하는 기술적 문제는 식물 수확량 및 낟알 갯수를 조절하는 방법이다.

상기 기술적 문제를 해결하기 위해, 본 발명은 먼저 식물 수확량 및/또는 낟알 갯수의 조절에 있어서 단백질 nog1의 용도를 제공하며; 단백질 nog1은 하기 a1) 또는 a2) 또는 a3) 또는 a4)일 수 있다:

a1) 서열 목록 내의 서열 2에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 가진 단백질;

a2) 서열 목록 내의 서열 2에 나타낸 단백질의 N-말단 또는/및 C-말단에 태그를 연결함으로써 얻어진 융합 단백질;

a3) 서열 목록 내의 서열 2에 나타낸 아미노산 서열 내의 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환 및/또는 결실 및/또는 부가에 의해 얻어진 식물 수확량 및/또는 낟알 갯수에 관련된 단백질; 및

a4) a1)에 정의된 아미노산 서열과 80% 이상의 동일성(identity)을 갖는 단백질.

여기에서，서열 목록 내의 서열 2는 389개의 아미노산 잔기로 구성된다.

a1)의 단백질의 정제를 용이하게 하기 위해, 서열 목록 내의 서열 2에 나타낸 단백질의 아미노 말단 또는 카르복실 말단에 표 1에 나타낸 바와 같은 태그를 연결할 수 있다.

태그의 서열

태그	잔기	서열
폴리-Arg	5-6(통상적으로 5)	RRRRR
FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-태그 II	8	WSHPQFEK
c-myc	10	EQKLISEEDL

상기 a3)의 단백질 내의 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환 및/또는 결실 및/또는 부가는 10개 초과의 아미노산 잔기의 치환 및/또는 결실 및/또는 부가이다.

상기 a3)의 단백질은 인공적으로 합성될 수 있으며, 또한 그의 암호화 유전자를 먼저 합성한 후에 생물학적 발현을 수행함으로써 얻을 수 있다.

상기 a3)의 단백질의 암호화 유전자는 서열 목록 내의 서열 1에 나타낸 DNA 서열 내의 하나 이상의 아미노산 잔기의 코돈(들)을 결실시키는 단계, 및/또는 하나 이상의 염기 쌍의 과오(missense) 돌연변이를 수행하는 단계, 및/또는 암호화 유전자의 5' 단부 및/또는 3' 단부에서 표 1에 나타낸 태그를 암호화 유전자에 연결하는 단계에 의해 얻어질 수 있다.

상기 a4)에 사용되는 용어 "동일성"은 서열 목록 내의 서열 2에 나타낸 단백질의 아미노산 서열에 대한 서열 유사성을 지칭한다. "동일성"은 본 발명의 서열 목록 내의 서열 2에 나타낸 아미노산 서열과 80% 이상, 또는 85% 이상, 또는 90% 이상, 또는 95% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 동일성은 육안 또는 컴퓨터 소프트웨어로 평가할 수 있다. 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여, 2개 이상의 서열 사이의 동일성을 백분율(%)로 표현할 수 있으며, 이를 사용하여 관련된 서열 사이의 동일성을 평가할 수 있다.

식물 수확량 및/또는 낟알 갯수의 조절에 있어서 단백질 nog1을 암호화하는 핵산 분자의 용도 또한 본 발명의 보호 범위에 속한다.

단백질 nog1을 암호화하는 핵산 분자는 하기와 같이 b1) 또는 b2) 또는 b3) 또는 b4)에 나타낸 DNA 분자일 수 있다:

b1) 서열 목록 내의 서열 1에 나타낸 바와 같은 암호화 영역(encoding region)을 가진 DNA 분자;

b2) 서열 목록 내의 서열 1에 나타낸 바와 같은 뉴클레오티드 서열을 가진 DNA 분자;

b3) b1) 또는 b2)에 정의된 뉴클레오티드 서열과 75% 이상의 동일성을 가지며 단백질 nog1을 암호화하는 DNA 분자; 및

b4) 엄격한 조건(stringent condition) 하에 b1) 또는 b2)에 정의된 뉴클레오티드 서열에 혼성화되며 단백질 nog1을 암호화하는 DNA 분자.

여기에서, 핵산 분자는 DNA, 예컨대 cDNA, 유전체 DNA, 또는 재조합 DNA일 수 있으며; 핵산 분자는 또한 RNA, 예컨대 mRNA 또는 hnRNA 등일 수 있다.

여기에서, 서열 목록 내의 서열 1은 1170개의 뉴클레오티드로 구성되며, 서열 목록 내의 서열 1 내의 뉴클레오티드는 서열 목록 내의 서열 2에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 암호화한다.

본 발명의 단백질 nog1을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 방향적 진화(directed evolution) 및 점 돌연변이와 같은 공지 방법을 사용하여 당업자가 용이하게 돌연변이화할 수 있다. 본 발명에서 단리된 단백질 nog1의 뉴클레오티드 서열과 75% 이상의 동일성을 갖는 이들 인공적으로 개질된 뉴클레오티드는, 그들이 단백질 nog1을 암호화하는 한, 모두 본 발명의 뉴클레오티드 서열로부터 유래되고 본 발명의 서열과 균등하다.

본 명세서에 사용되는 용어 "동일성"은 천연 핵산 서열에 대한 서열 유사성을 지칭한다. "동일성"은 본 발명의 서열 목록 내의 서열 2에 나타낸 아미노산 서열로 구성된 단백질 nog1을 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 75% 이상, 또는 80% 이상, 또는 85% 이상, 또는 90% 이상, 또는 95% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 동일성은 육안 또는 컴퓨터 소프트웨어로 평가할 수 있다. 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여, 2개 이상의 서열 사이의 동일성을 백분율(%)로 표현할 수 있으며, 이를 사용하여 관련된 서열 사이의 동일성을 평가할 수 있다.

상기 용도에서, 식물 수확량의 조절은 식물당 식물 수확량의 조절일 수 있다. 식물의 낟알 갯수의 조절은 주경(main stem)의 낟알 갯수 및/또는 식물의 평균 낟알 갯수의 조절일 수 있다.

상기 용도에서, 식물은 하기 c1) 내지 c7) 중 어느 하나일 수 있다: c1) 쌍자엽 식물; c2) 단자엽 식물; c3) 화본과 식물; c4) 벼; c5) 인디카 벼(indica rice); c6) 벼 품종 Guichao 2; 및 c7) Dongxiang 통상의 야생형 벼 이입 계통(introgression line) SIL176.

상기 기술적 문제를 해결하기 위해, 본 발명은 유전자전환 식물 A를 경작하는 방법 1 또는 유전자전환 식물 B를 경작하는 방법 2를 추가로 제공한다.

본 발명에 의해 제공되는 유전자전환 식물 A를 경작하는 방법 1은 단백질 nog1을 암호화하는 핵산 분자를 수용체 식물(recipient plant) A 내로 도입하여 유전자전환 식물 A를 얻는 단계를 포함할 수 있으며; 유전자전환 식물 A는 수용체 식물 A와 비교하여 증가된 수확량 및/또는 증가된 낟알 갯수를 갖는다.

상기 방법 1에서, 상기 "단백질 nog1을 암호화하는 핵산 분자를 수용체 식물 A 내로 도입하는 단계"는 재조합 벡터 A를 수용체 식물 A 내로 도입함으로써 달성될 수 있으며; 재조합 벡터 A는 단백질 nog1을 암호화하는 핵산 분자를 발현 벡터 내로 삽입함으로써 얻어지는 재조합 플라스미드일 수 있다.

재조합 벡터 A는 구체적으로 재조합 플라스미드 pCAMBIA1300-NOG1일 수 있다. 재조합 플라스미드 pCAMBIA1300-NOG1은 구체적으로 제한 엔도뉴클레아제 BglII의 인식 서열과 제한 엔도뉴클레아제 MluI의 인식 서열 사이에서 작은 DNA 단편이 서열 목록 내의 서열 3에 나타낸 바와 같은 뉴클레오티드 서열을 가진 DNA 분자로 대체된 개질된 식물 발현 벡터 pCAMBIA1300일 수 있다.

상기 방법 1에서, 수용체 식물 A는 하기 d1) - d6) 중 어느 하나일 수 있다: d1) 단자엽 식물; d2) 쌍자엽 식물; d3) 화본과 식물; d4) 벼; d5) 인디카 벼; d6) Dongxiang 통상의 야생형 벼 이입 계통 SIL176.

본 발명에 의해 제공되는 유전자전환 식물 A를 경작하는 방법 2는 단백질 nog1의 발현을 저해하는 물질을 수용체 식물 B 내로 도입하여 유전자전환 식물 B를 얻는 단계를 포함할 수 있으며; 유전자전환 식물 B는 수용체 식물 B와 비교하여 감소된 수확량 및/또는 감소된 낟알 갯수를 갖는다.

상기 방법 2에서, 상기 "단백질 nog1의 발현을 저해하는 물질"은 특이적 DNA 분자, 특이적 DNA 분자를 함유하는 발현 카세트, 또는 특이적 DNA 분자를 함유하는 재조합 플라스미드일 수 있다.

특이적 DNA 분자는 센스 단편(sense fragment), 안티센스 단편, 및 그 사이에 위치하는 스페이서(spacer) 단편을 포함하며; 센스 단편은 서열 목록 내의 서열 1의 5' 단부(end)로부터 155번째 위치 내지 522번째 위치에 나타낸 DNA 분자의 역 보체(reverse complement)이고; 안티센스 단편은 서열 목록 내의 서열 1의 5' 단부로부터 161번째 위치 내지 522번째 위치에 나타낸 DNA 분자이다.

상기 방법 2에서, 특이적 DNA 분자를 함유하는 재조합 플라스미드는 구체적으로 재조합 플라스미드 pRNAi-nog1일 수 있다. 재조합 플라스미드 pRNAi-nog1은 구체적으로 BamHI의 인식 서열과 KpnI의 인식 서열 사이에서 작은 DNA 단편이 서열 목록 내의 서열 1의 5' 단부로부터 155번째 위치 내지 522번째 위치에 나타낸 바와 같은 뉴클레오티드 서열을 가진 DNA 분자의 역 보체로 대체되고, SpeI의 인식 서열과 SacI의 인식 서열 사이에서 작은 DNA 단편이 서열 목록 내의 서열 1의 5' 단부로부터 161번째 위치 내지 522번째 위치에 나타낸 바와 같은 뉴클레오티드 서열을 가진 DNA 분자로 대체된 벡터 pTCK303/JL1460일 수 있다.

상기 방법 2에서, 수용체 식물 B는 하기 e1) - e6) 중 어느 하나일 수 있다: e1) 단자엽 식물; e2) 쌍자엽 식물; e3) 화본과 식물; e4) 벼; e5) 인디카 벼; 및 e6) 벼 품종 Guichao 2.

상기 기술적 문제를 해결하기 위해, 본 발명은 유전자전환 식물 C를 경작하는 방법 3을 추가로 제공한다.

본 발명에 의해 제공되는 유전자전환 식물 C를 경작하는 방법 3은 단백질 nog1의 발현 및/또는 활성을 증가시키는 물질을 수용체 식물 C 내로 도입하여 유전자전환 식물 C를 얻는 단계를 포함할 수 있으며; 유전자전환 식물 C는 수용체 식물 C와 비교하여 증가된 수확량 및/또는 증가된 낟알 갯수를 갖는다.

상기 방법 3에서, 상기 "단백질 nog1의 발현 및/또는 활성을 증가시키는 물질"은 구체적으로 재조합 벡터 A일 수 있다.

상기 방법 3에서, 수용체 식물 C는 하기 d1) - d6) 중 어느 하나일 수 있다: d1) 단자엽 식물; d2) 쌍자엽 식물; d3) 화본과 식물; d4) 벼; d5) 인디카 벼; 및 d6) Dongxiang 통상의 야생형 벼 이입 계통 SIL176.

상기 방법에서, 단백질 nog1을 암호화하는 핵산 분자는 하기 b1) 또는 b2) 또는 b3) 또는 b4)에 나타낸 바와 같은 DNA 분자일 수 있다:

b1) 서열 목록 내의 서열 1에 나타낸 바와 같은 암호화 영역을 가진 DNA 분자;

b3) b1) 또는 b2)에 정의된 뉴클레오티드 서열과 75% 이상의 동일성을 가지며 단백질 nog1을 암호화하는 DNA 분자;

b4) 엄격한 조건 하에 b1) 또는 b2)에 정의된 뉴클레오티드 서열에 혼성화되며 단백질 nog1을 암호화하는 DNA 분자.

여기에서, 서열 목록 내의 서열 1은 1170개의 뉴클레오티드로 구성되고, 서열 목록 내의 서열 1 내의 뉴클레오티드는 서열 목록 내의 서열 2에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 암호화한다.

상기 기술적 문제를 해결하기 위해, 본 발명은 또한 식물 육종(plant breeding)을 위한 방법 1 또는 식물 육종을 위한 방법 2를 제공한다.

본 발명에 의해 제공되는 식물 육종을 위한 방법 1은 식물 내의 단백질 nog1의 양 및/또는 활성을 증가시킴으로써, 식물 수확량 및/또는 낟알 갯수를 증가시키는 단계를 포함할 수 있다.

식물 육종을 위한 상기 방법 1에서, "식물 내의 단백질 nog1의 양 및/또는 활성을 증가시키는 단계"는 당업계에 주지된 방법, 예컨대 다중-복사, 프로모터, 조절 인자, 및 전환유전자의 변경 등에 의해 식물 내의 단백질 nog1의 양 및/또는 활성을 증가시키는 효과를 달성할 수 있다.

본 발명에 의해 제공되는 식물 육종을 위한 방법 2는 식물 내의 단백질 nog1의 양 및/또는 활성을 감소시킴으로써, 식물 수확량 및/또는 낟알 갯수를 감소시키는 단계를 포함할 수 있다.

식물 육종을 위한 상기 방법 2에서, "식물 내의 단백질 nog1의 양 및/또는 활성을 감소시키는 단계"는 당업계에 주지된 방법, 예컨대 RNA 간섭, 상동 재조합, 유전자 편집 등에 의해 식물 내의 단백질 nog1의 양 및/또는 활성을 감소시키는 목적을 달성할 수 있다.

상기 방법에서, 식물은 하기 f1) - f4) 중 어느 하나일 수 있다: f1) 단자엽 식물; f2) 쌍자엽 식물; f3) 화본과 식물; 및 f4) 벼.

상기 방법 중 어느 하나에서, 수확량은 식물당 수확량일 수 있다. 낟알 갯수는 주경의 낟알 갯수 및/또는 평균 낟알 갯수일 수 있다.

상기 "단백질 nog1의 발현을 저해하는 물질" 또한 본 발명의 보호 범위에 속한다.

단백질 nog1의 발현을 저해하는 상기 물질 중 어느 하나는 구체적으로 특이적 DNA 분자, 특이적 DNA 분자를 함유하는 발현 카세트, 또는 특이적 DNA 분자를 함유하는 재조합 플라스미드일 수 있다.

특이적 DNA 분자는 센스 단편, 안티센스 단편, 및 그 사이에 위치하는 스페이서 단편을 포함한다.

센스 단편은 서열 목록 내의 서열 1의 5' 단부로부터 155번째 위치 내지 522번째 위치에 나타낸 DNA 분자의 역 보체이고; 안티센스 단편은 서열 목록 내의 서열 1의 5' 단부로부터 161번째 위치 내지 522번째 위치에 나타낸 DNA 분자이다.

특이적 DNA 분자를 함유하는 재조합 플라스미드는 구체적으로 재조합 플라스미드 pRNAi-nog1일 수 있다. 재조합 플라스미드 pRNAi-nog1은 구체적으로 BamHI의 인식 서열과 KpnI의 인식 서열 사이에서 작은 DNA 단편이 서열 목록 내의 서열 1의 5' 단부로부터 155번째 위치 내지 522번째 위치에 나타낸 바와 같은 뉴클레오티드 서열을 가진 DNA 분자의 역 보체로 대체되고, SpeI의 인식 서열과 SacI의 인식 서열 사이에서 작은 DNA 분자가 서열 목록 내의 서열 1의 5' 단부로부터 161번째 위치 내지 522번째 위치에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 가진 DNA 분자로 대체된 벡터 pTCK303/JL1460일 수 있다.

단백질 nog1의 발현을 저해하는 물질(즉, 재조합 플라스미드 pRNAi-nog1)을 Guichao 2 내로 도입함으로써 유전자전환 식물 B가 얻어지며; 유전자전환 식물 B는 Guichao 2와 비교하여 감소된 식물당 수확량 및/또는 감소된 주경의 낟알 갯수 및/또는 감소된 평균 낟알 갯수를 가짐이 실험에 의해 입증된다. 유전자전환 식물 A는 단백질 nog1을 암호화하는 핵산 분자를 SIL176 내로 도입함으로써 얻어지며; 유전자전환 식물 A는 SIL176과 비교하여 증가된 식물당 수확량 및/또는 증가된 주경의 낟알 갯수 및/또는 증가된 평균 낟알 갯수를 갖는다. 결과는 벼의 수확량 및 낟알 갯수의 조절에 있어서 단백질 nog1이 중요한 역할을 담당함을 입증했다.

도 1은 SIL176과 Guichao 2 사이의 주경의 낟알의 형태학, 주경의 낟알 갯수, 및 식물당 수확량의 비교이다.
도 2는 T₂세대의 동형접합 RNAi 간섭 계통과 Guichao 2 사이의 주경의 낟알의 형태학, nog1 유전자의 발현, 주경의 낟알 갯수, 및 식물당 수확량의 비교이다.
도 3은 T₂ 세대의 동형접합 상보 계통과 SIL176 사이의 주경의 낟알의 형태학, nog1 유전자의 발현, 주경의 낟알 갯수, 및 식물당 수확량의 비교이다.

실시 형태의 최상의 방식

이하, 특이적 실시 형태를 참조하여 본 발명을 더욱 상세하게 추가로 기재할 것이며, 제공되는 실시예는 단지 본 발명을 예시하는 것이고, 본 발명의 범위는 이들 실시예로 제한되지 않는다.

달리 명시되지 않는 한, 하기 실시예에서 실험 방법은 관용적인 방법이다.

달리 명시되지 않는 한, 하기 실시예에 사용된 재료 및 시약 등은 구매가능하다.

하기 실시예에서의 정량적 시험을 위해, 3회의 반복 실험을 설정하고 결과를 평균한다.

벡터 pTCK303/JL1460은 하기 문헌에 기재되어 있다: 문헌[Wang Z，Chen CG，Xu YY，Jiang RX，Han Y，Xu ZH and Chong K. A Practical Vector for Efficient Knockdown of Gene Expression in Rice (Oryza sativa L.). Plant Molecular Biology Reporter，2004，22: 409-417].

Guichao 2는 하기 문헌에 기재되어 있다: 중국 농업 대학교(China Agriculture University)로부터 공중 이용 가능한 문헌[Zhang X，Zhou S X，Fu Y C, et al. Identification of a drought tolerant introgression line derived from Dongxiang common wild rice (O.rufipogon Griff.).Plant Mol Biol, 2006, 62:247~259]. 이하, 이를 Guichao 2라고 지칭한다. Guichao 2는 인디카 벼에 속한다.

Jiangxi Dongxiang 야생형 벼는 하기 문헌에 기재되어 있다: 문헌[Tian F，Li D J，Fu Q，Zhu Z F， Fu Y C，Wang X K，Sun C Q.2006. Construction of introgression lines carrying wild rice (Oryza rufipogon Griff.) segments in cultivated rice (O. sativa L.) background and characterization of introgressed segments associated with yield-related traits. Theoretical and Applied Genetics, 112, 570-80]. 이는 중국 농업 대학교를 통해 공중 이용 가능하다.

아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 균주 EHA105(문헌에서 아그로박테리움 투메파시엔스 균주 EHA105로 명명됨)는 하기 문헌에 기재되어 있다: 문헌[GLUTELIN PRECURSOR ACCUMULATION3 encodes a regulator of post-Golgi vesicular traffic essential for vacuolar protein sorting in rice endosperm. Plant Cell.2014 Jan; 26(1): 410-25]. 공중은 중국 농업 대학교로부터 이를 이용하여 본 출원의 실험을 반복할 수 있다.

Dongxiang 통상의 야생형 벼 이입 계통 SIL176은 Guichao 2와 Jiangxi Dongxiang 야생형 벼 사이의 다중 교배 및 역교배로부터의 자손이며, 이는 하기 문헌에 기재되어 있다: 문헌[Tian F，Li D J，Fu Q，Zhu Z F， Fu Y C，Wang X K，Sun C Q.2006. Construction of introgression lines carrying wild rice (Oryza rufipogon Griff.) segments in cultivated rice (O.sativa L.) background and characterization of introgressed segments associated with yield-related traits. Theoretical and Applied Genetics, 112, 570-80]. 이는 중국 농업 대학교로부터 공중 이용 가능하다. 이하, Dongxiang 통상의 야생형 벼 이입 계통은 SIL176이라고 지칭한다.

Guichao 2의 cDNA: Guichao 2의 2-주 모종을 실험 재료로 사용하여 TRIZOL 시약으로 총 RNA를 먼저 추출한 후, SuperScript II 역전사효소로 역전사함으로써 이를 얻었다. Guichao 2의 cDNA 내의 DNA의 양은 약 200 ng/㎕이다. SuperScript II 역전사효소는 카탈로그 번호가 18064-014인 Invitrogen의 제품이다.

개질된 식물 발현 벡터 pCAMBIA1300: 이는 벡터 pCAMBIA1300에서, 제한 엔도뉴클레아제 BglII의 인식 서열을 제한 엔도뉴클레아제 KpnI의 인식 서열의 5' 단부 내로 부가하고, 제한 엔도뉴클레아제 MluI의 인식 서열을 제한 엔도뉴클레아제 BamHI의 인식 서열의 5' 단부 내로 부가하고, 다른 뉴클레오티드 서열은 변화 없이 유지함으로써 얻은 벡터이다.

실시예 1. nog1 유전자의 발견

Jiangxi Dongxiang 야생형 벼를 공여친(donor parent)으로 사용하고 반복친(recurrent parent)으로서 Guichao 2와의 혼성화 및 역교배를 수행함으로써 265개의 계통(그 중의 하나가 SIL176임)을 포함하는 이입 계통 그룹의 세트를 작제한다. 이 그룹에서 야생형 벼의 유전체의 대표성(coverage)은 최대 79.4%에 달했으며, 여기에서 15개의 계통(그 중의 하나가 SIL176임)이 Guichao 2와 비교하여 35% 초과의 감소된 식물당 수확량을 나타낸다. Guichao 2와 SIL176 사이의 주경의 낟알의 형태학, 주경의 낟알 갯수, 및 식물당 수확량을 비교하고 계수한다. 실험은 3회 반복하며, 매번 30개의 식물을 반복한다.

실험 결과는 도 1에 나타낸다(A는 주경의 낟알의 형태학이고(막대=5cm); B는 주경의 낟알 갯수이며; C는 식물당 수확량이고; **는 P < 0.01을 표시하며 그 차이는 극도로 유의적임). 결과는 SIL176이 Guichao 2와 비교하여 유의적으로 감소된 주경의 낟알 갯수 및 유의적으로 감소된 식물당 수확량을 가짐을 입증한다.

SIL176에 대해 염색체지도 기반 클로닝(Map-based cloning) 및 기능적 분석을 수행한다. 결과로서, 벼 수확량에 관련된 QTL이 염색체 1의 장완(long arm) 상에서 발견되며, 이를 nog1 유전자로 명명한다. nog1 유전자의 개방 해독틀은 서열 목록 내의 서열 1에 나타내고, 암호화된 단백질은 nog1로 명명하며, 그의 아미노산 서열은 서열 목록 내의 서열 2에 나타내고, 389개의 아미노산 잔기로 구성된다.

실시예 2. T2 세대의 동형접합 RNAi 간섭 계통의 수득 및 표현형 동정

I. 재조합 플라스미드 pRNAi-nog1의 작제

재조합 플라스미드 pRNAi-nog1의 작제 단계는 하기와 같다:

1. 프라이머의 합성

프라이머 860-rnai-320F, 860-rnai-681R, 860-rnai-681F, 및 860-rnai-314R은 서열 목록 내의 서열 1에 나타낸 바와 같은 nog1 유전자의 서열에 따라 설계되고 합성되며; 프라이머의 특이적 서열은 하기와 같다:

860-rnai-320F: 5'-GGACTAGTGGGAGAAAGATGAGGA-3'(제한 엔도뉴클레아제 SpeI의 인식 부위는 밑줄로 표시됨);

860-rnai-681R: 5'-TCCGAGCTCGGTCAAAGCCAGGTAC-3'(제한 엔도뉴클레아제 SacI의 인식 부위는 밑줄로 표시됨);

860-rnai-681F: 5'-CGGGATCCGGTCAAAGCCAGGTAC-3'(제한 엔도뉴클레아제 BamHI의 인식 부위는 밑줄로 표시됨);

860-rnai-314R: 5'-GGGGTACCAGAGCTGGGAGAAAGA-3'(제한 엔도뉴클레아제 KpnI의 인식 부위는 밑줄로 표시됨).

2. 약 360 bp의 DNA 단편 A를 얻기 위해, Guichao 2의 cDNA를 주형으로 사용하고 860-rnai-320F 및 860-rnai-681R을 프라이머로 사용하여 PCR 증폭을 수행한다.

3. 약 360 bp의 DNA 단편 B를 얻기 위해, Guichao 2의 cDNA를 주형으로 사용하고 860-rnai-681F 및 860-rnai-314R을 프라이머로 사용하여 PCR 증폭을 수행한다.

4. DNA 단편 A를 제한 엔도뉴클레아제 SpeI 및 SacI로 분해하고, 분해 산물 1을 회수한다.

5. 벡터 pTCK303/JL1460을 제한 엔도뉴클레아제 SpeI 및 SacI로 분해하고, 약 14.6 kb의 벡터 골격 1을 회수한다.

6. 분해 산물 1을 벡터 골격 1에 결찰하여 중간체 플라스미드를 얻는다.

7. DNA 단편 B를 제한 엔도뉴클레아제 BamHI 및 KpnI로 분해하고, 분해 산물 2를 회수한다.

8. 중간체 플라스미드를 제한 엔도뉴클레아제 BamHI 및 KpnI로 분해하고, 약 14.9 kb의 벡터 골격 2를 회수한다.

9. 분해 산물 2를 벡터 골격 2에 결찰하여 재조합 플라스미드 pRNAi-nog1을 얻는다.

서열분석 결과에 따라, 재조합 플라스미드 pRNAi-nog1은 하기와 같이 구조적으로 기재된다: BamHI의 인식 서열과 KpnI의 인식 서열 사이의 작은 DNA 단편이 서열 목록 내의 서열 1의 5' 단부로부터 155번째 위치 내지 522번째 위치에 나타낸 바와 같은 뉴클레오티드 서열을 가진 DNA 분자의 역 보체로 대체되고, SpeI의 인식 서열과 SacI의 인식 서열 사이의 작은 DNA 단편이 서열 목록 내의 서열 1의 5' 단부로부터 161번째 위치 내지 522번째 위치에 나타낸 바와 같은 뉴클레오티드 서열을 가진 DNA 분자로 대체된 벡터 pTCK303/JL1460.

II. 아그로박테리움의 수득

재조합 플라스미드 pRNAi-nog1을 아그로박테리움 투메파시엔스 EHA105 내로 도입하여 재조합 아그로박테리움 EHA105/pRNAi-nog1을 얻는다.

III. T₀ 세대의 RNAi 간섭 식물의 수득

T₀ 세대의 RNAi 간섭 식물을 얻기 위해, Hiei 등의 방법(문헌[Hiei Y, Ohta S, Komari T & Kumashiro T. Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA. Plant J.1994，6:271-282])을 사용하여 재조합 아그로박테리움 EHA105/pRNAi-nog1을 Guichao 2 내로 형질전환한다.

IV. T₀세대의 RNAi 간섭 식물의 실시간 정량적 PCR 검출

실시간 정량적 PCR 검출을 위해 T₀세대의 3개의 RNAi 간섭 식물(각각 RNAi-1-T₀ 내지 RNAi-3-T₀으로 명명됨)을 무작위로 선택하며, 특이적 단계는 하기와 같다:

1. T₀ 세대의 3개의 RNAi 간섭 식물의 2-주 모종을 각각 실험 재료로 사용하여 TRIZOL 시약으로 총 RNA를 먼저 추출한 후, 침묵시킬 T₀ 세대의 각각의 식물의 cDNA를 얻기 위해 SuperScriptII 역전사효소를 사용하여 역전사를 수행한다. T₀ 세대의 3개의 RNAi 간섭 식물 각각의 cDNA 내의 DNA의 양은 약 200 ng/㎕이다.

2. RT-qPCR 기술(UBI 유전자를 내부 참조 유전자로 사용함)을 사용하여 T₀세대의 3개의 RNAi 간섭 식물 내의 nog1 유전자의 상대적 발현을 각각 검출한다.

nog1 유전자를 검출하기 위한 프라이머는 정방향 프라이머 1: 5'-TCCGACTTACAATGAACAC-3' 및 역방향 프라이머 1: 5'-GGTGACAGGACTCCACTT-3'이다. UBI 유전자를 검출하기 위한 프라이머는 정방향 프라이머 2: 5'-CTGTCAACTGCCGCAAGAAG-3' 및 역방향 프라이머 2: 5'-GGCGAGTGACGCTCTAGTTC-3'이다.

상기 방법에 따라, T₀ 세대의 RNAi 간섭 식물을 Guichao 2로 대체하고, 다른 단계는 변화되지 않으며, Guichao 2 내의 nog1 유전자의 상대적 발현이 얻어진다.

Guichao 2 내의 nog1 유전자의 상대적 발현을 1로 취하여 다른 벼 식물에서 nog1 유전자의 상대적 발현을 계수한다. 결과는 T₀세대의 3개의 RNAi 간섭 식물 각각에서 nog1 유전자의 상대적 발현이 Guichao 2와 비교하여 유의적으로 감소됨을 입증했다.

상기 결과는 RNAi-1-T₀, RNAi-2-T₀, 및 RNAi-3-T₀모두가 T₀세대의 RNAi 간섭 식물임을 입증한다.

V. T₂ 세대의 동형접합 RNAi 간섭 식물의 수득 및 실시간 정량적 PCR 검출

T₂ 세대의 동형접합 RNAi 간섭 식물을 얻기 위해, RNAi-1-T₀ 내지 RNAi-3-T₀을 2개의 연이은 세대 동안 자가-교배하고, 각각 RNAi-1 내지 RNAi-3으로 표기한다.

각각 RNAi-1 내지 RNAi-3 및 Guichao 2에 대해 단계 4의 방법에 따라 실시간 정량적 PCR 검출을 수행한다.

일부 실험적 결과를 도 2b에 나타낸다(**는 P < 0.01을 표시하며 그 차이는 극도로 유의적임). 결과는 RNAi-1 내지 RNAi-3 각각에서 nog1 유전자의 상대적 발현이 Guichao 2와 비교하여 유의적으로 감소됨을 입증했다.

VI. T₂ 세대의 동형접합 RNAi 간섭 식물의 표현형 동정

영양토(nutrient soil) 및 질석(영양토 대 질석의 부피비는 1:1임)을 함유하는 포트에 시험할 벼의 종자(Guichao 2, RNAi-1, RNAi-2, 또는 RNAi-3)를 각각 식재하고, 25 ℃에서 대체광(alternative light)을 이용하여 배양하고, 성장 및 발생 중에 시험할 벼의 주경의 낟알의 형태학, 주경의 낟알 갯수, 평균 낟알 갯수, 및 식물당 수확량을 비교하고 계수한다. 실험은 3회 반복하며, 매번 30개의 식물을 반복한다.

일부 실험 결과를 도 2의 A, C, 및 D에 나타낸다(A는 주경의 낟알의 형태학이고(막대 = 5 cm); C는 주경의 낟알 갯수이며; D는 식물당 수확량이고; **는 P < 0.01을 표시하며 그 차이는 극도로 유의적임). 결과는 RNAi-1, RNAi-2, 및 RNAi-3 각각의 주경의 낟알 갯수, 평균 낟알 갯수, 및 식물당 수확량이 Guichao 2와 비교하여 유의적으로 감소됨을 입증했다.

실시예 3. T2 세대의 동형접합 상보 계통의 수득 및 표현형 동정

I. 재조합 플라스미드 pCAMBIA1300-NOG1의 작제

재조합 플라스미드 pCAMBIA1300-NOG1의 작제 단계는 하기와 같다:

1. 유전체 DNA를 추출하기 위해 Guichao 2의 2-주 모종을 실험 재료로 사용하여 PCR 증폭을 수행하고, 이를 주형으로 사용하고 860HBF: 5'-GAAGATCTCATCTGATGCCTCATACTGA-3'(제한 엔도뉴클레아제 BglII의 인식 부위는 밑줄로 표시됨) 및 860HBR: 5'-CCGACGCGTCATGCTTAGGCTGTTGAT-3'(제한 엔도뉴클레아제 MluI의 인식 부위는 밑줄로 표시됨)을 프라이머로 사용하여 약 7 kb의 PCR 증폭 산물을 얻는다.

2. PCR 증폭 산물을 제한 엔도뉴클레아제 BglII 및 MluI로 분해하고, 분해 산물을 회수한다.

3. 개질된 식물 발현 벡터 pCAMBIA1300을 제한 엔도뉴클레아제 BglII 및 MluI로 분해하고, 약 9 kb의 벡터 골격을 회수한다.

4. 분해 산물을 벡터 골격에 결찰하여 재조합 플라스미드 pCAMBIA1300-NOG1을 얻는다.

서열분석 결과에 따라, 재조합 플라스미드 pCAMBIA1300-NOG1은 하기와 같이 구조적으로 기재된다: 제한 엔도뉴클레아제 BglII의 인식 서열과 제한 엔도뉴클레아제 MluI의 인식 서열 사이의 작은 DNA 단편이 서열 목록 내의 서열 3에 나타낸 바와 같은 뉴클레오티드 서열을 가진 DNA 분자로 대체된 개질된 식물 발현 벡터 pCAMBIA1300.

II. 재조합 아그로박테리움의 수득

재조합 플라스미드 pCAMBIA1300-NOG1을 아그로박테리움 투메파시엔스 EHA105 내로 도입하여 재조합 아그로박테리움 EHA105/pCAMBIA1300-NOG1을 얻는다.

III. T₀ 세대의 상보 식물의 수득

T₀ 세대의 상보 식물을 얻기 위해, Hiei 등의 방법(문헌[Hiei Y, Ohta S, Komari T & Kumashiro T. Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA. Plant J.1994，6:271-282])을 사용하여 재조합 아그로박테리움 EHA105/pCAMBIA1300-NOG1을 SIL176 내로 형질전환한다.

IV. T₀ 세대의 상보 식물의 실시간 정량적 PCR 검출

실시간 정량적 PCR 검출을 위해 T₀세대의 3개의 상보 식물(각각 CTP-1-T₀내지 CTP-3-T₀으로 명명됨)을 무작위로 선택하며, 특이적 단계는 하기와 같다:

1. T₀ 세대의 3개의 상보 식물의 2-주 모종을 각각 실험 재료로 사용하여TRIZOL 시약으로 총 RNA를 먼저 추출한 후, T₀ 세대의 상보 식물 각각의 cDNA를 얻기 위해 SuperScriptII 역전사효소를 사용하여 역전사를 수행한다. T₀ 세대의 3개의 상보 식물 각각의 cDNA 내의 DNA의 양은 약 200 ng/㎕이다.

2. RT-qPCR 기술(UBI 유전자를 내부 참조 유전자로 사용함)을 사용하여 T₀세대의 3개의 상보 식물 내의 nog1 유전자의 상대적 발현을 각각 검출한다.

nog1 유전자를 검출하기 위한 프라이머는 정방향 프라이머 1: 5'-TCCGACTTACAATGAACAC-3' 및 역방향 프라이머 1: 5'-GGTAGCAGGACTCCACTT-3'이다. UBI 유전자를 검출하기 위한 프라이머는 정방향 프라이머 2: 5'-CTGTCAACTGCCGCAAGAAG-3' 및 역방향 프라이머 2: 5'-GGCGAGTGACGCTCTAGTTC-3'이다.

상기 방법에 따라, T₀ 세대의 상보 식물을 SIL176으로 대체하고, 다른 단계는 변화되지 않으며, SIL176 내의 nog1 유전자의 상대적 발현이 얻어진다.

SIL176 내의 nog1 유전자의 상대적 발현을 1로 취하여 다른 벼 식물에서 nog1 유전자의 상대적 발현을 계수한다. 결과는 T₀세대의 3개의 상보 식물 각각에서 nog1 유전자의 상대적 발현이 SIL176과 비교하여 유의적으로 증가됨을 입증했다.

상기 결과는 CTP-1-T₀, CTP-2-T₀, 및 CTP-3-T₀모두가 T₀세대의 상보 유전자전환 벼임을 입증했다.

V. T₂ 세대의 동형접합 상보 계통의 수득 및 실시간 정량적 PCR 검출

T₂ 세대의 동형접합 상보 식물을 얻기 위해, CTP-1-T₀내지 CTP-3-T₀을 2개의 연이은 세대 동안 자가-교배하며, 이를 각각 CTP-1 내지 CTP-3으로 표기한다.

각각 CTP-1 내지 CTP-3 및 SIL176에 대해 단계 4의 방법에 따라 실시간 정량적 PCR 검출을 수행한다.

일부 실험적 결과를 도 3b에 나타낸다(**는 P < 0.01을 표시하며 그 차이는 극도로 유의적임). 결과는 CTP-1 내지 CTP-3 각각에서 nog1 유전자의 상대적 발현이 SIL176과 비교하여 유의적으로 증가됨을 입증했다.

VI. T₂ 세대의 동형접합 상보 식물의 표현형 동정

영양토 및 질석(영양토 대 질석의 부피비는 1:1임)을 함유하는 포트에 시험할 벼의 종자(SIL176, CTP-1, CTP-2, 또는 CTP-3)를 각각 식재하고, 25 ℃에서 대체광을 이용하여 배양하고, 성장 및 발생 중에 시험할 벼의 주경의 낟알의 형태학, 주경의 낟알 갯수, 평균 낟알 갯수, 및 식물당 수확량을 비교하고 계수한다. 실험은 3회 반복하며, 매번 30개의 식물을 반복한다.

일부 실험 결과를 도 3의 A, C, 및 D에 나타낸다(A는 주경의 낟알의 형태학이고(막대 = 5 cm); C는 주경의 낟알 갯수이며; D는 식물당 수확량이고; **는 P < 0.01을 표시하며 그 차이는 극도로 유의적임). 결과는 CTP-1, CTP-2, 및 CTP-3의 주경의 낟알 갯수, 평균 낟알 갯수, 및 식물당 수확량이 SIL176과 비교하여 유의적으로 증가됨을 입증했다.

단백질 nog1의 발현을 저해하는 물질을 시작 벼(예컨대 Guichao 2) 내로 도입하여 감소된 식물당 수확량 및/또는 감소된 주경의 낟알 갯수를 갖는 유전자전환 벼를 얻는다. 단백질 nog1을 암호화하는 핵산 분자를 시작 벼(예컨대 SIL176) 내로 도입하여 증가된 식물당 수확량 및/또는 증가된 주경의 낟알 갯수 및/또는 증가된 평균 낟알 갯수를 갖는 유전자전환 벼를 얻는다. 그러므로, 단백질 nog1은 벼 수확량 및 낟알 갯수를 조절할 수 있으며 중요한 응용 가치를 나타낸다.

SEQUENCE LISTING <110> CHINA AGRICULTURAL UNIVERSITY <120> USE OF PROTEIN NOG1 IN REGULATION OF PLANT YIELD AND GRAIN NUMBER PER EAR <130> IPA191247-CN <150> CN 201710220258.6 <151> 2017-04-06 <160> 3 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1170 <212> DNA <213> Rice（Oryza sativa L.） <400> 1 atggcggagc cggagcagca gcagcagcag gcgaatcccg acgaggtggt gctcgggcag 60 gagacaggcg gcgcgagggt ggcgatcctc aaccggccgc gccagctgaa cgtcatctcc 120 gatagagtgg tgtatctcct cgcccagttc ttggagagct gggagaaaga tgaggatgcc 180 aagctggtca tcttcaaggg ggctggacgt gcattttccg ctggtgggga tctaaagatg 240 ttctatgaag gaaaatcaga tgactcctgt ctcgaggttg tttacaggat gtattggctt 300 tgctaccata tccacacgta taagaaaacc gcggtggctc ttgttaatgg acttgtcatg 360 ggtggtggtg cagccatggt tgctccactg aagtttgcag ttgtcacaga gaaaacagtc 420 ttcgcaaccc ctgaggctag tgttggatta cacacagact gcagcttttc ttatatccat 480 tctagactcc ctggatattt aggggagtac ctggctttga ccggtgcaag gttgaatgca 540 aaggaaatga ttgctgccgg tcttgctact cattttgttc cttctgaaaa attggaagaa 600 cttgaaaaat gcctgctgaa tttaaacaca ggagatgagt ctgctgttcg agctgctatt 660 gaagagttct caactgatgt tcaacctgat gaagatagta ttttaaacaa gctcccaact 720 atcaacaaat gtttctctgc tgagactatc gaggacatca taaaagcttt tgaatcagaa 780 gggagcattg atggaaacca atggatcgct acagtactga agggcatgcg aagatcatct 840 cctacttcac tgaagatgac tcttcgatcg atcagagaag gtcggaagca gagcctgccg 900 gaatgtttga agaaggaatt ccgacttaca atgaacactc tccgatctgt agttactggc 960 gatgtctatg agggaattag agctctcagc atcgacaaag acaatgcccc taagtggagt 1020 cctgctaccc ttgaggaggt caagaacgag gacatcgacc gtcttttcga accattcagt 1080 tcagaaaagg agctccaagt cccatctgac gattccaaca gatggagtgg caaatttgag 1140 cacacagtct atggcagaac ttcagagtaa 1170 <210> 2 <211> 389 <212> PRT <213> Rice（Oryza sativa L.） <400> 2 Met Ala Glu Pro Glu Gln Gln Gln Gln Gln Ala Asn Pro Asp Glu Val 1 5 10 15 Val Leu Gly Gln Glu Thr Gly Gly Ala Arg Val Ala Ile Leu Asn Arg 20 25 30 Pro Arg Gln Leu Asn Val Ile Ser Asp Arg Val Val Tyr Leu Leu Ala 35 40 45 Gln Phe Leu Glu Ser Trp Glu Lys Asp Glu Asp Ala Lys Leu Val Ile 50 55 60 Phe Lys Gly Ala Gly Arg Ala Phe Ser Ala Gly Gly Asp Leu Lys Met 65 70 75 80 Phe Tyr Glu Gly Lys Ser Asp Asp Ser Cys Leu Glu Val Val Tyr Arg 85 90 95 Met Tyr Trp Leu Cys Tyr His Ile His Thr Tyr Lys Lys Thr Ala Val 100 105 110 Ala Leu Val Asn Gly Leu Val Met Gly Gly Gly Ala Ala Met Val Ala 115 120 125 Pro Leu Lys Phe Ala Val Val Thr Glu Lys Thr Val Phe Ala Thr Pro 130 135 140 Glu Ala Ser Val Gly Leu His Thr Asp Cys Ser Phe Ser Tyr Ile His 145 150 155 160 Ser Arg Leu Pro Gly Tyr Leu Gly Glu Tyr Leu Ala Leu Thr Gly Ala 165 170 175 Arg Leu Asn Ala Lys Glu Met Ile Ala Ala Gly Leu Ala Thr His Phe 180 185 190 Val Pro Ser Glu Lys Leu Glu Glu Leu Glu Lys Cys Leu Leu Asn Leu 195 200 205 Asn Thr Gly Asp Glu Ser Ala Val Arg Ala Ala Ile Glu Glu Phe Ser 210 215 220 Thr Asp Val Gln Pro Asp Glu Asp Ser Ile Leu Asn Lys Leu Pro Thr 225 230 235 240 Ile Asn Lys Cys Phe Ser Ala Glu Thr Ile Glu Asp Ile Ile Lys Ala 245 250 255 Phe Glu Ser Glu Gly Ser Ile Asp Gly Asn Gln Trp Ile Ala Thr Val 260 265 270 Leu Lys Gly Met Arg Arg Ser Ser Pro Thr Ser Leu Lys Met Thr Leu 275 280 285 Arg Ser Ile Arg Glu Gly Arg Lys Gln Ser Leu Pro Glu Cys Leu Lys 290 295 300 Lys Glu Phe Arg Leu Thr Met Asn Thr Leu Arg Ser Val Val Thr Gly 305 310 315 320 Asp Val Tyr Glu Gly Ile Arg Ala Leu Ser Ile Asp Lys Asp Asn Ala 325 330 335 Pro Lys Trp Ser Pro Ala Thr Leu Glu Glu Val Lys Asn Glu Asp Ile 340 345 350 Asp Arg Leu Phe Glu Pro Phe Ser Ser Glu Lys Glu Leu Gln Val Pro 355 360 365 Ser Asp Asp Ser Asn Arg Trp Ser Gly Lys Phe Glu His Thr Val Tyr 370 375 380 Gly Arg Thr Ser Glu 385 <210> 3 <211> 6921 <212> DNA <213> Rice（Oryza sativa L.） <400> 3 catctgatgc ctcatactga caattcccag tttgcgctga tattggttta ctgaaatatt 60 ataacgttgc tattttgctc actgcttatg gtagcccaat tgaataatcc gtaaaatcat 120 ggtctgattg aactgtgttt caattttctt gctgtatatg ctaatcttag tgacttgcat 180 caattgggtg ttatgtgctt attacgtaat tctgtaaaac gaaaaataca agttaattct 240 tcatgattgt tttttgtttc atgctttcat atttcattgg ttatttgttt ggcacaaccg 300 cacaaagctt tagctatcta ttttggctga tattgggtat gcatcatttt actgataggg 360 atattgattg atgctggata aaaatgtttt tcttgcatca cattcaaact tttgagtagt 420 taggatggca actttgatgg caactttgcc gaggttacca acagttaatt tggttccctt 480 tttttccctg ttgcctatat ctgattaact cttgggtgct ctcttttttc cataaaccta 540 gtggtttatt ggataagcat cctagctaac atcagctgct aaaataaagt agttttactt 600 tttaagttct cttactagtc gcattgtgag gttttgttag gcaactttgc cgaggttacc 660 aacagttaat ttggttacct ttttttccct gttgccaata tctgattagc tgttaggtgc 720 tattctttcc ataaacctag tggtttaatg gatgagcatc ttagctaaca tcagctgcta 780 aaataaataa cgatgtactt ttaagttctg atcattcttt cgttttgttt tcataatcta 840 attcaatgtt ctgtgactcc ataaatcatc ttttttactt gggctttata tctcttcgta 900 atgcaagacg gtatgcaaat tttggtcatt tcaattatgt acaaactcat cccagttgca 960 tttgctacct gtgaagttgt taggcaactt tgccgaggtt accaagacat gtttggtttc 1020 ctttttttcc ctgttgccta tatcattagt tgcttggttg cttgaactcc attgacctat 1080 ttggtttttt gggtatgcat ccatgccaac atataatatt ttccatcatt ctttttacac 1140 ttagcactgc ccaaatgttg gtttggttcg tggactgaga ttctcgggag gcttttatgt 1200 tttttgatcg aatggttcgt ggtttctttg ctggtttgtg gttattttat cttcttggag 1260 tatatgtttg tcgagataat tgtggatgta aatgcagtcg taaagctctt aaacgaactc 1320 taccaacagc tcttattccg aaaaagtagc taaactgaag gatgaagaac tctggttggg 1380 cggccgagca cctgattatc ggccactgcc ttacgagtac tttccgtctg tgaggtcgac 1440 tcgacatcaa cccttggaat tccgtctgtg tggtacacag gatttgttat ttagtaattg 1500 taaccattca aattatctac tgctattcat ttcaagtttt caacttacct agaagtgttt 1560 ttagtcgctc gtcaatcgtc atgataacga atgctcatac aacaaactga accagacgat 1620 acggacgaaa ctgcatgaag ctagaatagc tgtgtgttct agcagtgttg tctcgtagta 1680 atactgtacg taccagatcg tccagtacat tcaaattttt caccaagtca agaactgagt 1740 tctggaatcg ttaagtgaag aactgagttc tcgaatcgtg tgtgatttgt atagttccga 1800 gattagtact ccctccgatt aaggttttaa tacgttgtta gtaaaaaaaa ggttttaata 1860 cgttttgatt ttagtcaaag ttaaagttaa actgttttaa gtttgactaa atttatagac 1920 aaatataata atatttataa tactaaatta gttttatcaa atcaataatt aaatatattt 1980 tcataataaa tttattaatg gaatatattt tcataataaa ttgtttgggg ttaaaaatgt 2040 tactattttt ttatacaaac ttggttaaac ttaaatcagt ttgactttga ctaaactcaa 2100 aatgttttat aatctaaaac agagggagta gtaatatata ctctctctgt ctcattttaa 2160 gtgcaactat gattttccgt atccaacgtt gattttccgt tttatttgaa aattttttat 2220 aattagtatt tttattgtta tgagatgata aaatataaat agtaatttat gcgtgactta 2280 tattttagct tttttttcaa ataagacgaa aaatcgtagt cacacttaaa atggaaatgg 2340 ggcggcggag ggaggactag tccactgata agtgataacg catcattcaa aatgatcccg 2400 aagtgaaaac cgataaattc tcaaagaggt gtgaattaga agtcaaactg catcgaccca 2460 gctgtccatg gtctttttcc gttcgccctc gctttcttcc cgcaccaacc ccgcctaccg 2520 ctccaccact actactacac catcccctcc accggctccc cctcaccaaa cttccctcca 2580 cgcctgcttc gcccaactcg ttctcttgga gcacctaact cgagctgagc tcccttcccg 2640 cggaattcgg gtccctccct gatggcggag ccggagcagc agcagcagca ggcgaatccc 2700 gacgaggtac cgatcagccc cacgcgaacg aggccatttt cttctttctt gtagtatgtg 2760 gtgtggtgag agtgagaacg cgcggcgccg tttctttgtg caggtggtgc tcgggcagga 2820 gacaggcggc gcgagggtgg cgatcctcaa ccggccgcgc cagctgaacg tcatctccga 2880 tagagtggtg cgatttcttt cgcttcgtgc attttccgat cttatgccgg aagcagcagc 2940 tggaagctgt aattggctgg gccgtgctcg gtttctggtt gcaggtgtat ctcctcgccc 3000 agttcttgga gagctgggag aaagatgagg atgccaagct ggtcatcttc aaggtgcgcg 3060 cactgctgcc ctcttagcac cctgcattga taaagctcta gggcagaaca taactgatta 3120 taattcagac aaggataggt tttagcctag tgatgtcatg cgtgatttga taccaggaga 3180 cagctcaaac aaatcattta ccttactcta gtttgtttct tcaaagtcct tgcaatgcat 3240 ggagcacttg gctagtagta caaactatgt agagaaacgt gttgcttgtt taaggattcg 3300 gtaaggtgtg cctggtcaac atttgaactt tactcagtag ttagtactga tacataaggt 3360 aacgttttga tatggataag tttggcaata agacagcgat gaaatgaggc gtatcatgtc 3420 acaaatgaaa ctttttgtta tgactttgta tgatacccat cgattggccc aagcatatga 3480 atgtatggtc tgctgatgaa cagggggctg gacgtgcatt ttccgctggt ggggatctaa 3540 agatgttcta tgaaggaaaa tcaggtatga atatgatatg aatgtttcag tgtagcagtg 3600 gtaccacatc acatgacctt actgtataat ttgatttcca tccccaagac tcacatttgc 3660 gcacacttga tggcatttaa acctattaac agaactcctt tgcagatgac tcctgtctcg 3720 aggttgttta caggatgtat tggctttgct accatatcca cacgtataag aaaaccgcgg 3780 tgatgccctc ttttatgttt gtgggaggac tgttttctaa cttgggggcg aattctgtac 3840 tcaaattcta tggttttatt tcaattcatg caggtggctc ttgttaatgg acttgtcatg 3900 ggtggtggtg cagccatggt tgctccactg aagtttgcag ttgtcacaga gaaaacagta 3960 tgcaacacta gtccatagtc cagttctttt ggaggctttt tttatgccat attgtgttat 4020 atgtttgttt gttggtttgc tgtatttatc tgtaaaagtg taaatcaccc ctctacatgt 4080 cactatctct tcaattcagc tagtattatt attttggcaa aattggttat atagcatcga 4140 aagttcacgt ttttggtatg aaaaaaatag aaaggagaga acactcctat tcttgaaatg 4200 gacccatttg gtatcatgat tactctgtct tgggagtttc gcggtgatgt tttttgtgtg 4260 tttaggtctt cgcaacccct gaggctagtg ttggattaca cacagactgc agcttttctt 4320 atatccattc tagactccct ggatatttag gtaagtactg aattgcattt tccattcaga 4380 ggtcaaacca tcaccttact acaggcgtat tgtctcttga gatgtaatga gaaatctgat 4440 agtgacttgt gtgacaaatt aaacatatct taggacaata tggttctgta atgtatcact 4500 tgacatagat atttgtgcca atatgcttat tctctttgaa taattcttag gggagtacct 4560 ggctttgacc ggtgcaaggt tgaatgcaaa ggaaatgatt gctgccggtc ttgctactca 4620 ttttgttcct tctgaagtaa ggcattcagc atttaccatt catattcacg atggttccgg 4680 tgcatgattt cctcgattgt tctacatgta gctcgacaaa tcaaaatgtt tgttgatata 4740 ttgtctttct gtggttggac taaccaaaaa tgattataat gtgaatggca gaaattggaa 4800 gaacttgaaa aatgcctgct gaatttaaac acaggagatg agtctgctgt tcgagctgct 4860 attgaagagt tctcaactga tgttcaacct gatgaagata gtattttaaa caagttaaga 4920 actgatgtcc ttttccaaat gtaacttgct gcgcatgcat ttattattct attattgaaa 4980 taaattgaca ctggaatgac aatcttactt cgataggctc ccaactatca acaaatgttt 5040 ctctgctgag actatcgagg acatcataaa agcttttgta aggattcttt caattacttg 5100 cttgaaaagt gttgagttcc tcagactata gaatattcat cttggtttca tgctacaaaa 5160 taatctaaac aacaataagt ggacagtatt catcttatgc ccaaaatata tcatcgtcaa 5220 ccaatagctt ctggaaaaac tagacacagt acactcacca atcaccacca gtcttcactg 5280 tcctataaca aggcaatcaa ctttttcctg caaatcataa gcagcgtctt ttgtttttgt 5340 tgttgttgtt gtttgtagga atcagaaggg agcattgatg gaaaccaatg gatcgctaca 5400 gtactgaagg gcatgcgaag atcatctcct acttcactga agatgactct tcgatcggta 5460 caaactctga catcgtttct aatgctgatg attttgtctc gtcttaataa tatttgtgct 5520 tcttatgtat ggtgaatgct taaaagctat agtagctgtc cgcttctcct tggttaacaa 5580 tttatttata tgttgtgcag tgtactaatt tttgacattt tgttatgtat tgtggtgcat 5640 ttacagctcc tttttgcaca aggcaagaat gtattcttaa tattaatggt tgttttaatt 5700 cttcagatca gagaaggtcg gaagcagagc ctgccggaat gtttgaagaa ggaattccga 5760 cttacaatga acactctccg atctgtagtt actggcgatg tctatgaggt actgtgattt 5820 gccactatat gaataagtaa cggtgattct tgatacaggc aagactaaga tgtcattcat 5880 cataatattt gcacctaaaa cttggcaggg aattagagct ctcagcatcg acaaagacaa 5940 tgcccctaag gttctctcat acacactttt aaacatgtct agaaattttt atttttcata 6000 ctgtttctta atttttgttg cgatacagtg gagtcctgct acccttgagg tcaagaacga 6060 ggacatcgac cgtctttcga accattcagt tcagaaaagg agctccaagt cccatctgac 6120 gattccaaca ggtgaacaat tgctccaaaa tccatttctt ttctctgccc ttcacacaaa 6180 caacagtgta tcctaatcat ctgcactatt tccaattttg acatggacaa tgcacagatg 6240 gagtggcaaa tttgagcaca cagtctatgg cagaacttca gagtaattgg cagcagaaat 6300 agatgttcat catcctcaca agcatgtttt aagtactcgt aaccccatgt attctcatac 6360 ttccctgtat aacattgtaa cacaaaaaat tgaaaattac atgacgcacg aagcaataaa 6420 gcatctcaaa tgttttgtta catcctgaag ccaatgaata agaacttttc cggcgtgtga 6480 tctctgtaaa gagaattcca acctaagggt taaagtctag ggagtgaatg tatgtccaag 6540 agagaccagt catgtagcga cttgagagcc ctatgagcag ttgggctcca caggatactc 6600 taactccaag tagtattgtt tgtacttggt agttttcttc tgagtggggg ctttcctcac 6660 tgacaaaatt ctcctcacag cagcttcttg gtctttcggg aactccaccg ccatcttctt 6720 caggttcgtt gcttgagtta gcagaaagat aaagagttcc ttctggtacc gttgaggcct 6780 gaatccaaga aacttgagct gctccaaact cttagttagg catgataact ttgaaagcct 6840 ctcctcatga tcagcaaaat ttggcaatgc agtgtcgtct tttgcatcaa cagcctaagc 6900 atgatcaaca gcctaagcat g 6921

Claims

벼의 수확량(yield), 낟알 갯수(grain number) 또는 둘 다의 조절 방법으로서,
단백질 nog1을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 수용체(recipient) 벼 내로 도입하는 단계를 포함하고,
단백질 nog1은 하기 a1) 및 a2)로 구성되는 군으로부터 선택되는 조절 방법:
a1) 서열 목록 내의 서열 2에 나타낸 아미노산 서열을 가진 단백질;
a2) 서열 목록 내의 서열 2에 나타낸 단백질의 N-말단, C-말단, 또는 둘 다에 태그를 연결함으로써 얻어진 융합 단백질.
제1항에 있어서,
핵산 분자는 하기 b1) 및 b2)로 구성되는 군으로부터 선택된 DNA 분자인 것을 특징으로 하는 조절 방법:
b1) 서열 목록 내의 서열 1에 나타낸 바와 같은 암호화 영역(encoding region)을 가진 DNA 분자;
b2) 서열 목록 내의 서열 1에 나타낸 바와 같은 뉴클레오티드 서열을 가진 DNA 분자.
제1항 또는 제2항에 있어서, 벼 수확량의 조절은 벼당 벼 수확량의 조절인 것을 특징으로 하는 조절 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 벼의 낟알 갯수의 조절은 벼의 평균 낟알 갯수, 주경(main stem)의 낟알 갯수 또는 둘 다의 조절인 것을 특징으로 하는 조절 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 벼는 하기 c1) 내지 c3) 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 조절 방법:
c1) 인디카 벼(indica rice); c2) 벼 품종 Guichao 2; c3) Dongxiang 통상의 야생형 벼 이입 계통(introgression line) SIL176.
유전자전환 벼 A를 경작하는 방법으로서,
제1항의 단백질 nog1을 암호화하는 핵산 분자를 수용체 벼 A 내로 도입하여 유전자전환 벼 A를 얻는 단계를 포함하고;
유전자전환 벼 A는 수용체 벼 A와 비교하여 증가된 수확량, 증가된 낟알 갯수, 또는 증가된 수확량 및 증가된 낟알 갯수를 갖는 방법.
제6항에 있어서,
"단백질 nog1을 암호화하는 핵산 분자를 수용체 벼 A 내로 도입하는 단계"는 재조합 벡터 A를 수용체 벼 A 내로 도입함으로써 달성될 수 있고;
재조합 벡터 A는 단백질 nog1을 암호화하는 핵산 분자를 발현 벡터 내로 삽입함으로써 얻어진 재조합 플라스미드일 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
유전자전환 벼 B를 경작하는 방법으로서,
제1항의 단백질 nog1의 발현을 저해하는 물질을 수용체 벼 B 내로 도입하여 유전자전환 벼 B를 얻는 단계를 포함하고;
유전자전환 벼 B는 수용체 벼 B와 비교하여 감소된 수확량, 감소된 낟알 갯수, 또는 감소된 수확량 및 감소된 낟알 갯수를 갖는 방법
제8항에 있어서,
"단백질 nog1의 발현을 저해하는 물질"은 특이적 DNA 분자, 특이적 DNA 분자를 함유하는 발현 카세트, 또는 특이적 DNA 분자를 함유하는 재조합 플라스미드이고;
특이적 DNA 분자는 센스 단편(sense fragment), 안티센스 단편, 및 그 사이에 위치된 스페이서(spacer) 단편을 포함하고;
센스 단편은 서열 목록 내의 서열 1의 5' 단부(end)로부터 155번째 위치 내지 522번째 위치에 나타낸 DNA 분자의 역 상보체(reverse complement)이고;
안티센스 단편은 서열 목록 내의 서열 1의 5' 단부로부터 161번째 위치 내지 522번째 위치에 나타낸 DNA 분자인 것을 특징으로 하는 방법.
유전자전환 벼 C를 경작하는 방법으로서,
제1항의 단백질 nog1의 발현을 증가시키는 물질을 수용체 벼 C 내로 도입하여 유전자전환 벼 C를 얻는 단계를 포함하고;
유전자전환 벼 C는 수용체 벼 C와 비교하여 증가된 수확량, 증가된 낟알 갯수, 또는 증가된 수확량 및 증가된 낟알 갯수를 갖는 방법.
벼 육종(rice breeding)을 위한 방법으로서,
벼 육종을 위한 방법은 벼 내의 제1항의 단백질 nog1의 양을 증가시킴으로써, 벼 수확량, 낟알 갯수, 또는 둘 다를 증가시키는 단계를 포함하는 방법.
벼 육종(rice breeding)을 위한 방법으로서,
벼 육종을 위한 방법은 벼 내의 제1항의 단백질 nog1의 양을 감소시킴으로써, 벼 수확량, 낟알 갯수, 또는 둘 다를 감소시키는 단계를 포함하는 벼 육종을 위한 방법.
제6항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 수확량은 벼당 수확량인 것을 특징으로 하는 방법.
제6항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 낟알 갯수는 주경의 낟알 갯수, 평균 낟알 갯수, 또는 둘 다인 것을 특징으로 하는 방법.
특이적 DNA 분자, 특이적 DNA 분자를 함유하는 발현 카세트, 또는 특이적 DNA 분자를 함유하는 재조합 플라스미드로서,
특이적 DNA 분자는 센스 단편, 안티센스 단편, 및 그 사이에 위치하는 스페이서 단편을 포함하고;
센스 단편은 서열 목록 내의 서열 1의 5' 단부로부터 155번째 위치 내지 522번째 위치에 나타낸 DNA 분자의 역 상보체이고;
안티센스 단편은 서열 목록 내의 서열 1의 5' 단부로부터 161번째 위치 내지 522번째 위치에 나타낸 DNA 분자인 재조합 플라스미드.