CN109810181A - 梨转录因子PyHY5及其重组表达载体和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了梨转录因子PyHY5及其重组表达载体的应用。一种分离自‘红早酥’梨具有促进梨果皮花青苷生物合成功能的转录因子PyHY5基因，其核苷酸序列为SEQ ID No.1所示，其编码的氨基酸序列为序列表SEQ ID No.2所示。通过农杆菌介导遗传转化方法将转录因子PyHY5与PyMYB114共转化草莓和梨果实，经生物学功能验证，表明本发明克隆的PyHY5基因与其辅助因子PyMYB114共同作用促进梨果皮花青苷转运的功能。PyHY5新功能的发现，为促进梨果皮花青苷积累的分子育种提供新的基因资源，为实施绿色农业提供新的遗传资源，该遗传资源的开发利用有利于降低农业成本和实现环境友好。

Description

梨转录因子PyHY5及其重组表达载体和应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，涉及梨转录因子PyHY5及其重组表达载体和应用，具体 涉及从‘红早酥’梨中分离、克隆得到一个参与梨果皮花青苷生物合成相关的bZIP家族成员 PyHY5基因及其应用。

背景技术

植物组织的茎、叶、花、果呈现出一系列从红色到紫色各种鲜艳的色彩，这种鲜艳的颜色 与花青苷的积累相关。花青苷是水溶性色素，它在植物抗病性和预防紫外线辐射中起重要作用 (Bieza et al.，2001)，并且通常被认为具有抗氧化能力(Veeriah et al.,2006)，预防人类的神 经系统和心血管疾病，癌症和糖尿病方面有重要的作用(Konczak etal.,2004)。

众所周知，花青苷生物合成由一系列的结构基因编码关键酶催化完成的(Holtonet al.，1995； Davie et al.,2003)，R2R3MYB，bHLH和WD40蛋白形成转录调控复合体共同调控花青苷的 合成被广泛的研究(Ramsay et al.,2005)。这些MBW复合体通过结合类黄酮代谢通路的结构 基因的启动子区域，促进类黄酮代谢物的形成(Borevitz et al.,2000)和花青苷的形成(Dare et al.,2008；Gonzalez et al.,2008)。这种调控模式首先在模式植物拟南芥中报道(Zhang et al.,2003； Rowan et al.,2009)。随后，在园艺作物苹果(Espley et al.,2007；Lin-Wang et al.,2010；Xie et al., 2012)，葡萄(Hichri etal.,2010)，杨梅(Liu et al.,2013)等物种也有报道转录因子MYB，bHLH 和WD40彼此协调的促进花青苷的积累。

另外，转录因子通过与MBW复合物的相互作用影响花色素苷的生物合成。例如，bZIP 家族转录因子HY5在植物生长和发育中起多方面的作用(An et al.,2017)。在拟南芥中,HY5 通过诱导转录因子MYB75/PAP1的转录激活来调节花色素苷的生物合成(Shin etal.,2013)。 Wang et al.(2016)报道，microRNA858a和HY5对MYBL2的抑制导致拟南芥中花青苷生物 合成代谢通路的激活。An et al.(2017,2018)陆续报道MdHY5调节花青素的生物合成， MdbZIP44通过调节ABA促进苹果中花青素积累。SQUAMOSA MADS box VmTDR4和MADSbox基因PyMADS18分别参与调控越橘和梨果实中花色素苷积累(Jaakola et al.,2010；Wuet al., 2013a)。在苹果中，MdCOP1通过与MdMYB1相互作用来调节果实色泽(Li et al.,2012)。在 桃中，PpNAC1可以激活PpMYB10.1的表达并导致花青苷的生物合成(Zhou etal.,2015)。在 梨中，PyERF3可以控制花青素的生物合成(Yao et al.,2017)。对于花青苷转运的调控机制， Hu et al.(2016)报道荔枝中LcGST4被转录因子LcMYB1激活；在苹果中，Hu et al.(2017) 表明MdMYB1通过调节MdVHA-B1和MdVHA-B2表达调节花青苷积累。在红皮梨的研究中， 至今仍未见转录因子调控花青苷转运相关基因GST的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种促进花青苷转运的转录因子PyHY5基因。

本发明的另一目的是提供该基因的应用。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

一种分离自‘红早酥’梨具有促进花青苷生物合成和转运功能的转录因子PyHY5基因，属于 bZIP家族成员，其核苷酸序列为SEQ ID No.1所示，包含492bp的开放阅读框；编码164个 氨基酸，其编码的氨基酸序列为序列表SEQ ID No.2所示，等电点为9.34，分子量为17.90kDa。

含有本发明所述PyHY5基因的重组表达载体。

所述的重组表达载体，优选以pSAK277为出发载体，所述PyHY5基因的插入位点为EcoR I和Xba I之间。

含有本发明所述PyHY5基因的宿主菌。

克隆本发明所述PyHY5基因cDNA序列的引物对，上游引物PyHY5-F1序列如SEQ IDNo.3 所示，下游引物PyHY5-R1序列如SEQ ID No.4所示。

本发明所述的本发明所述的重组表达载体促进梨果皮花青苷转运的应用。本发明所述 PyHY5基因与PyMYB114通过蛋白互作结合PyGSTf12的启动子，促进梨果皮花青苷转运的应 用。

本发明所述的PyHY5基因联合PyMYB114基因或者PyMYB10基因在促进梨果皮花青苷转运 中的应用；所述的PyMYB114基因核苷酸序列如SEQ ID No.5所示,其氨基酸序列如SEQ ID No.6所示，所述的PyMYB10基因核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，其氨基酸序列如SEQ ID No.8所示。

本发明所述的重组表达载体促进梨果皮花青苷转运的应用。

所述的含PyHY5基因的重组载体联合含PyMYB114基因的重组载体中在促进梨果皮花青苷 转运中的应用。

有益效果

与现有技术相比，本发明具有以下优点和效果：

1.PyHY5基因在促进梨果实花青苷转运的应用，为促进梨果皮花青苷的积累的分子育种提 供新的基因资源，为实施绿色农业提供新的遗传资源，该遗传资源的开发利用有利于降低农业 成本和实现环境友好。

2.通过农杆菌介导瞬时转化方法将转录因子PyHY5与辅助因子PyMYB114共转化草莓和 梨果实花青苷大量积累，并经生物学功能验证，表明本发明克隆PyHY5与辅助因子PyMYB114 通过蛋白互作促进梨果皮花青苷转运的功能。

附图说明

图1为本发明PyHY5(A图),PyMYB114(B图)、PyMYB10(C图)和PyGSTF12基因(D 图)在‘红早酥’及其绿色芽变别的茎，叶，花和果四个组织的表达模式图。'红早酥'及其绿色芽变的花采集大蕾期，'红早酥'及其绿色芽变的茎，叶和果实(fruit_a)是花后20天采集，fruit_b 是'红早酥'及其绿色芽变花后60天果实。

图2为本发明PyHY5与其它转录因子形成调控复合体共转化草莓促进花青苷的积累。

A.'YW5AF7'草莓花青苷着色的表型图。a和b.pSAK277(空载)；c和d.PyMYB10；e和f. PyMYB114；g和h.PyHY5；i和j PyMYB10+PyHY5；k和l.PyMYB114+PyHY5.B.通过色差仪测量 草莓花青苷积累附近色素积累，a*/b*的比值表示色素变化。误差线是六次检测的平均值。C. 通过超高效液相色谱测量花色苷组分和含量的变化。小写字母显示差异显着(P<0.05)。花青 素含量表示为三次重复的平均值，误差线表示±SD。Cy 3-ara：矢车菊素3-阿拉伯糖苷，Pe 3-glu： 芍药素3-葡萄糖苷。

图3为本发明PyHY5与其它转录因子形成调控复合体共转化促进梨果皮花青苷积累。

其中：A.注射接近成熟期‘早酥梨’果实的着色的表型图。a.pSAK277(Emptyvector)；b.PyMYB10； c.PyMYB114；d.PyHY5；e.PyMYB10+PyHY5；f.PyMYB114+PyHY5.Ba.通过色差仪在梨果实的 着色区域检测色素的变化，a*/b*的比值从负值转为正值表示烟草叶片的颜色由绿色变为红色。 误差线是测量6个着色区域比值的平均值。Bb.对梨果实总花色苷含量的测定。C.花青苷生物 合成和转运相关基因的RT-qPCR分析。a.PyDFR在不同瞬时转化梨组合中的表达模式；b. PyANS在不同瞬时转化梨组合中的表达模式；c.PyUFGT在不同瞬时转化梨组合中的表达模 式；d.PyGSTf12在不同瞬时转化梨组合中的表达模式。

图4通过酵母双杂交(Y2H)，双分子荧光互补(BIFC)和双荧光素酶测定验证转录因子之间 的相互作用。A.I-V代表PyMYB114的不同氨基酸残基。B.验证PyMYB114和PyHY5的相互作用位点。C.I-V代表PyMYB10的不同氨基酸残基。D.验证PyMYB10和PyHY5的互作 位点。E.通过双分子荧光互补试验鉴定PyMYB114和PyHY5的相互作用。a.BiFC(nYCE:: PyMYB114和nYNE::PyHY5)和mRFP::C(DAPI)(蓝色)渗透的表皮细胞的共定位分析；b. BiFC(nYCE::PyMYB114和nYNE::PyHY5)和绿色荧光蛋白(GFP)(绿色)；c.明场图像； d.叠加图像BiFC(nYCE::PyMYB10和nYNE::PyHY5)(蓝色)和绿色。放大倍数，40μm； G.双荧光素酶报告系统检测PyHY5对PyMYB114或PyMYB10启动子的激活作用。花色素苷 生物合成途径相关基因的启动子活性表示为萤火虫荧光素酶(LUC)与海肾荧光素酶(REN) 活性的比率，误差线代表三次生物学重复SE。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明做出详细的描述。根据以下的描述和这些实施例，本领域技 术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明 做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。

实施例1本发明‘红早酥’及其绿色芽变不同组织和不同发育时期花青苷含量的变化

‘红早酥’在不同组织中总量花青素含量差异显着。在花后20天，‘红早酥’在幼叶含量3.26mg. g-1FW，幼果略低于叶片，花瓣和幼茎最低。在果实发育期间，‘红早酥’果实的总花青苷含量 在果实膨大期(60DAFB)下降至相对较低的水平，直至果实成熟期(120DAFB)。在20DFAB， 最高值是2.49mg.g-1FW，最低值为0.86mg.g-1FW。‘红早酥’的绿色突变体花青苷含量一直 较低，在不同组织和发育阶段仅略有变化。‘红早酥’的红色组织总花青素含量显着高于绿色组 织。因此，我们选择20DAFB的花，茎，叶子和幼果，60DAFB果实进一步RNA-seq分析。

实施例2本发明‘红早酥’及其绿色芽变不同组织中PyHY5基因的表达模式分析

通过对RNA-seq数据进行分析，筛选出PyHY5基因在‘红早酥’的所有红色组织的表达量 显著高于其绿色芽变，除此之外，还有花青苷代谢相关结构基因PyGSTf12，PyMYB114(Yao et al.，2017)，PyMYB10(Zhai et al.，2015)在红色组织中的表达水平始终高于绿色组织(图1)。 RT-qPCR分析PyGSTf12所用的正向引物是5’-GGTGATGGTTTGCCTTTTGG-3’(SEQID NO. 15),反向引物是5’-AACTCGGGTCGCTTGTGCT-3’(SEQ ID NO.16)；PyHY5所用的正向引物是5’-GGGCCATCATAAGGTACTACGC-3’(SEQ ID NO.9)，反向引物是 5’-CACCAAATGCCCCAGTTTAGC-3’(SEQ ID NO.10)；PyMYB114基因的正向引物是 5’-GCAGACAGAGGTGGTTGAACT-3’(SEQ ID NO.11)，反向引物是： 5’-TGTATCATGCAACATGGCCTTCC-3’(SEQ ID NO.12)；PyMYB114基因的正向引物是5’-TGTGAGAAAAGGTGCCTGGAC-3’(SEQ ID NO.13)，反向引物是：5’-CCTGTTTAAGCCTGCTTTGTATG-3’(SEQ ID NO.14)。

实施例3本发明‘红早酥’中PyHY5基因的克隆和重组载体的构建

从‘红早酥’梨果皮中提取RNA，经反转录得到的第一链cDNA用于扩增PyHY5基因全长。 RNA提取使用Plant Total RNA Isolation Kit Plus(Foregene，RE-05022)，按照该试剂盒提供的 操作说明书操作。第一链cDNA的合成用First Script Strand cDNASynthesis SuperMix (Transgene，AE301-02)反转录试剂盒(按照该试剂盒提供的说明书操作)。扩增基因引物对 为PyHY5-F1：5’-CGCTCTAGAACTAGTggatccATGCAAGAGCAGGCGACG-3’(SEQ ID No.3)；PyHY5-R1:5’-GTCGACGGTATCGATaagcttTCAATCCGCATTTGCACTACC-3’(SEQID No.4)。超保真DNA聚合酶Super-Fidelity DNA Polymerase(P505-d1)购自诺唯赞生 物科技公司。扩增的反应体系为50μL中包括200ng cDNA，2×Phanta Max Buffer 25μL，10 mM dNTP 1μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase(1U/μl)1μL，10μM 2μL上述引 物，加ddH₂O至50μL。PCR反应在eppendorf扩增仪上按以下程序完成：95℃，预变性3分 钟，95℃变性15秒，60℃退火15秒，72℃延伸90秒,35个热循环，72℃延伸5分钟，4℃保存。产生一条单一PCR条带产物。

PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测后，用AxyGEN小量胶回收试剂盒(购自爱思进 生物技术杭州有限公司，中国)回收DNA片段，步骤参照使用说明。回收纯化的DNA溶液与双酶切(EcoRI/XbaI)的线性pSAK277载体进行连接反应，重组酶II OneStep Cloning Kit(货号：C112-01)购自诺唯赞生物科技公司，并按说明书步骤操作。连接反应体 系总体积是10μL，其中包括2μL的5×CE II Buffer，50～200ng线性化克隆载体，50～200ng 插入片段扩增产物，1μLII。37℃连接30min。待反应完成后，立即将反应放置于冰 水浴中冷却5min，反应产物可直接进行转化。转化采用热击法(参照《分子克隆实验手册》 第三版，科学出版社，2002)转化大肠杆菌DH5α，在含有50mg/L壮观霉素的LB固体平板 中筛选阳性克隆，挑取5个阳性克隆测序(由上海英骏生物技术有限公司完成)。测序结果表 明，PyHY5基因全长为492bp，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，BLAST的结果表明该基 因与MdHY5的序列相似度达到96％，文献报道在苹果中，MdHY5通过CBF依赖或者CBF 独立通路正向调控冷害，本发明证明PyHY5与PyMYB114通过蛋白互作激活PyGSTf12启动 子序列，促进梨果实花青苷积累的新的功能应用。

辅助因子PyMYB114克隆的模板是‘红早酥’梨果皮cDNA,PCR扩增的正向引物序列是： 5’-ACTAGTGGATCCAAAgaattcATGAGGAAGGGTGCCTGG-3’(SEQ ID NO.17)；反向引物 序列是5’-CAGGACTCTAGAAGTACTtctagaCTAAATCTTAGTTATCTCTTCTTCTAGATTCCA -3’(SEQ IDNO.18)。PyMYB10克隆的模板是‘红早酥’梨果皮cDNA，PCR扩增的正向引物 序列：5‘-cgcggtggcggccgcggatccATGGAGGGATATAACGTTAACTTG-3’(SEQ ID NO.19),反向引 物序列：5‘-gggccccccctcgag tctagaCTATTCTTCTTTTGAATGATTCCAA-3’(SEQ ID NO.20)。 PCR扩增的产物通过1％琼脂糖凝胶电泳检测后，用AxyGEN小量胶回收试剂盒(购自爱思 进生物技术杭州有限公司，中国)回收DNA片段，回收纯化的DNA溶液与双酶切(EcoRI/XhoI) 的线性pSAK277载体进行连接反应，重组酶II One Step Cloning Kit(货号： C112-01)购自诺唯赞生物科技公司，并按说明书步骤操作。连接反应体系总体积是10μL， 其中包括2μL的5×CE II Buffer，50～200ng线性化克隆载体，50～200ng插入片段扩增产物， 1μLII。37℃连接30min。待反应完成后，立即将反应放置于冰水浴中冷却5min，反 应产物可直接进行转化。转化采用热击法(参照《分子克隆实验手册》第三版，科学出版社，2002)转化大肠杆菌DH5α，在含有50mg/L壮观霉素的LB固体平板中筛选阳性克隆，挑取 5个阳性克隆测序(由上海英骏生物技术有限公司完成)。测序结果表明，PyMYB114基因全长 为687bp，其核苷酸序列为SEQ ID NO.5所示，构建重组载体命名为pSAK277-PyMYB114；PyMYB10基因全长为735bp，其核苷酸序列为SEQ ID NO.7所示，构建重组载体命名为pSAK277-PyMYB10；应用冻融法将上述重组载体导入到农杆菌GV3101中。

实施例4本发明PyHY5基因与其它的共作用因子PyMYB114或PyMYB10共转化导致草莓花 托花青苷积累

构建的重组载体通过农杆菌介导瞬时转化黄色草莓‘Yellow wonder’5AF7(YW5AF7)果实 (花后2周)。结果表明，单独转化一个转录因子并不能观察到花青苷含量的积累，而需要共 同转化两个转录因子PyHY5和PyMYB114/PyMYB10才能观察到花青苷在草莓中积累(图2A)。 花青苷积累的草莓通过色差仪和分光光度计检测色素含量(图2B，C)，结果与表型图一致。 因此，PyHY5与其它的辅助转录因子PyMYB114/PyMYB10共转化可以促进烟草叶片花青苷的 大量合成。

实施例5本发明PyHY5基因与其它转录因子PyMYB114/PyMYB10共转化导致梨果皮花青苷积 累

选取接近成熟期的‘早酥梨’为试验材料，采用农杆菌介导的转化将重组载体注射进入梨果 皮。结果表明，空载，单独注射PyMYB114,PyHY5没有色素沉积，PyMYB10有少量花青苷积 累，而共同侵染转化PyHY5与PyMYB114/PyMYB10在梨果皮注射区域有较多花青苷的积累(图 3A)。此外，色差仪(Minolta chromameter，Japan)测定共转化PyHY5与PyMYB114/PyMYB10 着色区域的a*/b*的比值显著高于单独注射或者空载(P<0.01)(图3B)。当检测总花青素含 量时，PyHY5和PyMYB10的共转化高于PyHY5和PyMYB114(P<0.05)，并且它们高于单独 注射和空载(图3Bb)。我们进一步对花色苷生物合成和转运相关基因的表达水平进行RT-qPCR 分析。与空载体(pSAK277)相比，PyHY5和PyMYB114/PyMYB10的过表达显着上调PyGST f12，PyUFGT和PyDFR表达，PyMYB10或PyHY5和PyMYB114可以显着激活PyANS的表达，但只有PyMYB10可以在很大程度上激活PyDFR，PyANS表达(图3C)。这些结果表明本发 明PyHY5基因参与梨果皮花青苷生物合成的调控。

实施例6酵母双杂交和双分子荧光互补验证PyHY5和PyMYB114之间的互作

为了验证PyHY5和PyMYB114/PyMYB10是否存在互作，酵母双杂交和双分子荧光互补试 验进行验证，PyMYB114CDS全长序列和C-或N-端残基氨基酸序列分别克隆，并插入到pGBKT7载体，类似的构建了PyMYB10CDS全长序列和C-或N-端残基氨基酸序列的重组载 体，分别验证自激活活性。同时克隆了PyHY5的CDS全长序列插入pGADT7载体目的是检 测与PyMYB114/PyMYB10是否存在蛋白互作。首先共转化PyHY5与PyMYB114在二缺 SD-Trp-Leu的培养基上生长，再把转化子转移到四缺SD-Trp-Leu-His-Ade的培养基上筛选， 结果表明，PyMYB114CDS全长的氨基酸序列(V)和C-端160个氨基酸残基(169-229)(IV)表现 出很强的转录激活活性，N-端氨基端残基MYB114^1-93(I)和MYB114^1-160(II)和C-端氨基酸残 基MYB114^136-229(III)不存在转录激活活性。共同转化酵母时，C-端93氨基酸残基(III)与 PyHY5不但能在在二缺SD-Trp-Leu的培养基上生长，而且能在四缺SD-Trp-Leu-His-Ade培养 基上生长，这说明PyMYB114与PyHY5之间互作的位点在C-端氨基残基(III)存在互作位点(图 4A，B)。然而，PyHY5与PyMYB10之间并不存在互作(图4C,D)。对于BIFC分析，PyMYB114 与PyHY5存在互作，而不能与PyMYB10互作(图4E，F)，这些结果与酵母双杂交的结果一致。 此外，PyHY5对PyMYB114，PyMYB10的启动子序列的激活作用进行分析，表明PyHY5对 PyMYB10启动子比PyMYB114具有更强的激活作用(图4G)。这表明PyMYB114和PyMYB10 分别与PyHY5之间的相互作用模式不同。

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序列表

<110> 南京农业大学

<120> 梨转录因子PyHY5及其重组表达载体和应用

<160> 20

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 492

<212> DNA

<213> ‘红早酥’梨(Pyrus spp)

<400> 1

atgcaagagc aggcgacgag ctccctcgct gcgagctctc tgccttccag cagcgaaagg 60

tcttccagct ccgcatttca tcttgaagtt aaagaaggca tggaaagtga tgaggagatc 120

agaagagtgc cggagatcgg cggcgaatcg gcgggagcgt cggcttccgg cctggaaaac 180

ggctcgttgg ccggtccaga ccgggtccaa gcggctggtg agagtcaaag aaagagagga 240

agaaatccag cagacaagga aagcaagcgg ctgaagaggt tgttgaggaa cagagtttca 300

gcacagctag caagggagag gaagaaggca tatttgaatg atttggaagt gagagtcaaa 360

gaattggagc agaagaattc tgagcttgat gagaggcttt ccactttgca gaatgagaat 420

cagatgcttc gacaaatatt gaagaacaca acagcaaccc ggagaggagc gggtggtagt 480

gcaaatgcgg at 492

<210> 2

<211> 164

<212> PRT

<213> ‘红早酥’梨(Pyrus spp)

<400> 2

Met Gln Glu Gln Ala Thr Ser Ser Leu Ala Ala Ser Ser Leu Pro Ser

1 5 10 15

Ser Ser Glu Arg Ser Ser Ser Ser Ala Phe His Leu Glu Val Lys Glu

20 25 30

Gly Met Glu Ser Asp Glu Glu Ile Arg Arg Val Pro Glu Ile Gly Gly

35 40 45

Glu Ser Ala Gly Ala Ser Ala Ser Gly Leu Glu Asn Gly Ser Leu Ala

50 55 60

Gly Pro Asp Arg Val Gln Ala Ala Gly Glu Ser Gln Arg Lys Arg Gly

65 70 75 80

Arg Asn Pro Ala Asp Lys Glu Ser Lys Arg Leu Lys Arg Leu Leu Arg

85 90 95

Asn Arg Val Ser Ala Gln Leu Ala Arg Glu Arg Lys Lys Ala Tyr Leu

100 105 110

Asn Asp Leu Glu Val Arg Val Lys Glu Leu Glu Gln Lys Asn Ser Glu

115 120 125

Leu Asp Glu Arg Leu Ser Thr Leu Gln Asn Glu Asn Gln Met Leu Arg

130 135 140

Gln Ile Leu Lys Asn Thr Thr Ala Thr Arg Arg Gly Ala Gly Gly Ser

145 150 155 160

Ala Asn Ala Asp

<210> 3

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgctctagaa ctagtggatc catgcaagag caggcgacg 39

<210> 4

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gtcgacggta tcgataagct ttcaatccgc atttgcacta cc 42

<210> 5

<211> 687

<212> DNA

<213> ‘红早酥’梨(Pyrus spp)

<400> 5

atgaggaagg gtgcctggac tcaacaggaa gatgatattc tgaggcagta cgttgaaaag 60

catggagatg gaaagtggca ccaggttcct cgcgaaacag gtctaaacag atgcaggaaa 120

agctgcagac agaggtggtt gaactatttg aagccgaatc tcaagagcgg agatttcaca 180

gaggatgaaa tagatctaat ccatagactt cagaaacttt tgggaaacag gtggtcaata 240

attgctggaa gactcccagg aagaacagca ggcaaggtaa aaaattattg gaatagcaag 300

caacgaaagg agttggaata tatgaaggat aaatccaaag aaagaacaaa agccacatcc 360

gtcataagac ctcaaccacg gagagctaga gttgcaattt ttcaatctga agagaactgt 420

agcaggttat tacagacatc atcaccacct acagaaaacg ctattgattc atggaaggcc 480

atgttgcatg atacagacaa tgttgatgga acaccatttt ctagtttagg gttaggggaa 540

gacctcttca caaacttttg ggttgaagat attgcacagt cgacaatggt aggcatgaat 600

tctgctgatg aagggttaca catgagtggc aacttttcct ttagagagaa cttttggaat 660

ctagaagaag agataactaa gatttag 687

<210> 6

<211> 228

<212> PRT

<213> ‘红早酥’梨(Pyrus spp)

<400> 6

Met Arg Lys Gly Ala Trp Thr Gln Gln Glu Asp Asp Ile Leu Arg Gln

1 5 10 15

Tyr Val Glu Lys His Gly Asp Gly Lys Trp His Gln Val Pro Arg Glu

20 25 30

Thr Gly Leu Asn Arg Cys Arg Lys Ser Cys Arg Gln Arg Trp Leu Asn

35 40 45

Tyr Leu Lys Pro Asn Leu Lys Ser Gly Asp Phe Thr Glu Asp Glu Ile

50 55 60

Asp Leu Ile His Arg Leu Gln Lys Leu Leu Gly Asn Arg Trp Ser Ile

65 70 75 80

Ile Ala Gly Arg Leu Pro Gly Arg Thr Ala Gly Lys Val Lys Asn Tyr

85 90 95

Trp Asn Ser Lys Gln Arg Lys Glu Leu Glu Tyr Met Lys Asp Lys Ser

100 105 110

Lys Glu Arg Thr Lys Ala Thr Ser Val Ile Arg Pro Gln Pro Arg Arg

115 120 125

Ala Arg Val Ala Ile Phe Gln Ser Glu Glu Asn Cys Ser Arg Leu Leu

130 135 140

Gln Thr Ser Ser Pro Pro Thr Glu Asn Ala Ile Asp Ser Trp Lys Ala

145 150 155 160

Met Leu His Asp Thr Asp Asn Val Asp Gly Thr Pro Phe Ser Ser Leu

165 170 175

Gly Leu Gly Glu Asp Leu Phe Thr Asn Phe Trp Val Glu Asp Ile Ala

180 185 190

Gln Ser Thr Met Val Gly Met Asn Ser Ala Asp Glu Gly Leu His Met

195 200 205

Ser Gly Asn Phe Ser Phe Arg Glu Asn Phe Trp Asn Leu Glu Glu Glu

210 215 220

Ile Thr Lys Ile

225

<210> 7

<211> 735

<212> DNA

<213> ‘红早酥’梨(Pyrus spp)

<400> 7

atggagggat ataacgttaa cttgagtgtg agaaaaggtg cctggactcg agaggaagac 60

aatcttctca ggcagtgcat tgagattcat ggagagggaa agtggaacca agtttcatac 120

aaagcaggct taaacaggtg caggaagagc tgcagacaaa gatggttaaa ctatctgaag 180

ccaaatatca agagaggaga ctttaaagag gatgaagtag atcttatact tagacttcac 240

aggcttttgg gaaacaggtg gtcattgatt gctagaagac ttccaggaag aacagcgaat 300

gatgtgaaaa attattggaa cactcgattg cggatcgatt ctcgcatgaa aacgttgaaa 360

aataaatctc aagaaacgag aaagaccaat gtgataagac ctcagcccca aaaattcatc 420

aaaagttcat attacttaag cagtaaagaa ccaattctag aacatattca atcagcagaa 480

gatttaagta cgccatcaca aacgtcgtcg tcaacaaaga acggaaatga ttggtgggag 540

accttgttcg aaggcgagga tacttttgaa agggctgcat gtcccagcat tgagttagag 600

gaagaactct tcacaacttt ttggtttgat gatcgactgt cggcaagatc atgtgccaat 660

tttcctgaag aaggacaaag tagaagtgaa ttctccttta gcatggacct ttggaatcat 720

tcaaaagaag aatag 735

<210> 8

<211> 244

<212> PRT

<213> ‘红早酥’梨(Pyrus spp)

<400> 8

Met Glu Gly Tyr Asn Val Asn Leu Ser Val Arg Lys Gly Ala Trp Thr

1 5 10 15

Arg Glu Glu Asp Asn Leu Leu Arg Gln Cys Ile Glu Ile His Gly Glu

20 25 30

Gly Lys Trp Asn Gln Val Ser Tyr Lys Ala Gly Leu Asn Arg Cys Arg

35 40 45

Lys Ser Cys Arg Gln Arg Trp Leu Asn Tyr Leu Lys Pro Asn Ile Lys

50 55 60

Arg Gly Asp Phe Lys Glu Asp Glu Val Asp Leu Ile Leu Arg Leu His

65 70 75 80

Arg Leu Leu Gly Asn Arg Trp Ser Leu Ile Ala Arg Arg Leu Pro Gly

85 90 95

Arg Thr Ala Asn Asp Val Lys Asn Tyr Trp Asn Thr Arg Leu Arg Ile

100 105 110

Asp Ser Arg Met Lys Thr Leu Lys Asn Lys Ser Gln Glu Thr Arg Lys

115 120 125

Thr Asn Val Ile Arg Pro Gln Pro Gln Lys Phe Ile Lys Ser Ser Tyr

130 135 140

Tyr Leu Ser Ser Lys Glu Pro Ile Leu Glu His Ile Gln Ser Ala Glu

145 150 155 160

Asp Leu Ser Thr Pro Ser Gln Thr Ser Ser Ser Thr Lys Asn Gly Asn

165 170 175

Asp Trp Trp Glu Thr Leu Phe Glu Gly Glu Asp Thr Phe Glu Arg Ala

180 185 190

Ala Cys Pro Ser Ile Glu Leu Glu Glu Glu Leu Phe Thr Thr Phe Trp

195 200 205

Phe Asp Asp Arg Leu Ser Ala Arg Ser Cys Ala Asn Phe Pro Glu Glu

210 215 220

Gly Gln Ser Arg Ser Glu Phe Ser Phe Ser Met Asp Leu Trp Asn His

225 230 235 240

Ser Lys Glu Glu

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序类(Artificial Sequence)

<400> 9

gggccatcat aaggtactac gc 22

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序类(Artificial Sequence)

<400> 10

caccaaatgc cccagtttag c 21

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序类(Artificial Sequence)

<400> 11

gcagacagag gtggttgaac t 21

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序类(Artificial Sequence)

<400> 12

tgtatcatgc aacatggcct tcc 23

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序类(Artificial Sequence)

<400> 13

tgtgagaaaa ggtgcctgga c 21

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序类(Artificial Sequence)

<400> 14

cctgtttaag cctgctttgt atg 23

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序类(Artificial Sequence)

<400> 15

ggtgatggtt tgccttttgg 20

<210> 16

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序类(Artificial Sequence)

<400> 16

aactcgggtc gcttgtgct 19

<210> 17

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序类(Artificial Sequence)

<400> 17

actagtggat ccaaagaatt catgaggaag ggtgcctgg 39

<210> 18

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序类(Artificial Sequence)

<400> 18

caggactcta gaagtacttc tagactaaat cttagttatc tcttcttcta gattcca 57

<210> 19

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序类(Artificial Sequence)

<400> 19

cgcggtggcg gccgcggatc catggaggga tataacgtta acttg 45

<210> 20

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序类(Artificial Sequence)

<400> 20

gggccccccc tcgagtctag actattcttc ttttgaatga ttccaa 46

Claims (10)

1.一种分离自‘红早酥’梨以复合体的形式促进梨果皮花青苷转运的转录因子PyHY5基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.权利要求1所述的转录因子PyHY5基因编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

3.含有权利要求1所述基因的重组表达载体。

4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于以pSAK277为出发载体，将权利要求1所述基因的插入EcoR I和Xbal I位点之间所得。

5.含有权利要求1所述基因的宿主菌。

6.克隆权利要求1所述基因cDNA序列的引物对，其特征在于上游引物PyHY5-F1序列如SEQ ID No.3所示，下游引物PyHY5-R1序列如SEQ ID No.4所示。

7.权利要求1所述的PyHY5基因在促进梨果皮花青苷转运中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用,其特征在于权利要求1所述的PyHY5基因联合PyMYB114基因或者PyMYB10基因在促进梨果皮花青苷转运中的应用；所述的PyMYB114基因核苷酸序列如SEQ ID No.5所示,其氨基酸序列如SEQ ID No.6所示，所述的PyMYB10基因核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，其氨基酸序列如SEQ ID No.8所示。

9.权利要求3所述的重组表达载体在促进梨果皮花青苷转运中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用,其特征在于权利要求3所述的含PyHY5基因的重组载体联合含PyMYB114基因的重组载体中在促进梨果皮花青苷转运中的应用。