CN111733165A - 一种促进花青苷合成的PyWRKY26基因及其重组表达载体与应用 - Google Patents

Abstract

一种促进花青苷合成的WRKY基因及其重组表达载体与应用，WRKY基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。WRKY基因在促进梨果皮色泽花青苷合成的应用，为促进梨果皮花青苷的积累的分子育种提供新的基因资源，为实施绿色农业提供新的遗传资源，该遗传资源的开发利用有利于降低农业成本和实现环境友好。

Description

一种促进花青苷合成的PyWRKY26基因及其重组表达载体与 应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，涉及促进花青苷合成的PyWRKY26基因及其重组表达载体的构建与应用，具体涉及从梨中分离、克隆得到一个参与梨果皮花青苷生物合成相关的WRKY家族成员 PyWRKY26基因及其应用。

背景技术

梨(Pyrus L.)是世界上最常见和最受欢迎的水果之一，红梨因其美丽的外观和丰富的花青素而深受消费者喜爱(Wu et al.，2013)。在植物组织中，花青素被广泛发现为具有多种生理功能的重要黄酮类化合物，有助于授粉，种子传播和抵抗恶劣的环境条件(Winkel-Shirley,2001)。此外，花青素具有显著的抗氧化活性，对人类健康具有潜在益处，如降低癌症，炎症和冠状动脉硬化的风险(Butelli et.al,2008；Sun et al, 2014)。

众所周知，花青素生物合成受到关键结构基因和转录因子的调控，包括7种酶基因：苯丙氨酸解氨酶 (PAL)，查尔酮合成酶(CHS)，查尔酮异构酶(CHI)，氟萘酮3-羟化酶(F3H)，二氢氟维醇-4-还原酶(DFR)，花色素合成酶/无色花青素双加氧酶(ANS/LDOX)，UDP-葡萄糖：类黄酮3-O-葡糖基转移酶(UFGT)。此外，生物合成的花青素被转运到液泡储存器中依赖于已经报道了的花青素转运的三种机制：谷胱甘肽S-转移酶(GST)介导的转运，膜转运和囊泡运输(Gomez et al.,2011；Zhao and Dixon, 2009)。有证据表明，GST作为花青素的载体，可以通过ABC跨膜转运蛋白(Marrs et.al,1995)将花青素从细胞质中调动到液泡膜中；据报道，液泡膜上存在大量的转运蛋白和通道，如苹果酸转运蛋白(TDT)；交配型色素转运(ABC转运蛋白)，这些转运蛋白的活性直接或间接依赖于焦磷酸盐激发的液泡膜质子泵产生的质子梯度(Kim et al.,2013)。

通过形成MBW转录复合物，MYB，bHLH和WD40蛋白可以调节结构基因(Holton andCornish, 1995)。MYBs作为调节花青素生物合成的关键因子已被广泛研究。据报道，苹中的MdMYB10， MdMYB1，MdMYB110a；草莓中的FaMYB10，杨梅中的MrMYB1；梨中的TFs PyMYB10，PyMYB114等，通过形成MBW转录复合物(Espley et al，2007；Li et al，2012；Kadomura-Ishikawa et al,2015；Yao et.al,2017) 来协同调控花青素的生物合成。

除MBW复合物外，其他转录因子，如NAC，ERF，HY5，BBX22和WRKY20(Zhou et al.,2105；Wang et al.,2016；Alessandra Amato.et al,2016)等可以通过间接或直接结合MBW复合物来调节花青素的生物合成。最近，有几篇报道表明WRKY蛋白与花青素生物合成的调节有明显的相关性，例如，矮牵牛中的 WRKY TF PhPH3通过在MBW复合体下游发挥作用导致花瓣颜色的变化，Amato等人还证明VvWRKY26，即葡萄的Ph Ph3同源基因，诱导黄酮类化合物的积累(Alessandra Amato.et al,2016)；在苹果中， MdWRKY40是诱导花色素苷生物合成中的关键调节剂(An et al，2019)，在梨中，Yang等证明了WRKY 家族与红皮梨中的花青素生物合成有关(Yang et.al.,2105)。然而，WRKYs是否通过与红梨中的TFs PyMYB114，PyMYB10和PybHLH3相互作用而参与花青素生物合成尚不清楚，有待进一步研究。

发明内容

本发明的目的在于提供一种促进花青苷合成PyWRKY基因及其重组表达载体与应用。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种促进花青苷合成的PyWRKY26基因，所述促进花青苷合成的PyWRKY26基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种由权利要求1所述的促进花青苷合成的PyWRKY26基因编码的蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种含有权利要求1所述的促进花青苷合成的PyWRKY26基因的宿主菌。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种克隆所述的促进花青苷合成的 PyWRKY26基因的引物对，上游引物PyWRKY26-F1序列如SEQ ID No.3所示，下游引物PyWRKY26-R1序列如SEQ ID No.4所示。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：所述的促进花青苷合成的PyWRKY26 基因在促进梨果皮花青苷合成中的应用。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：促进花青苷合成的PyWRKY26基因在促进梨果皮中花青苷合成中的应用，所述的促进花青苷合成的PyWRKY26基因联合PyMYB114基因、 PyMYB10基因和PybHLH3基因在促进梨果皮中花青苷合成中的应用；所述的PybHLH3基因核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，其编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNo.6所示，克隆PybHLH3基因的引物对，上游引物PybHLH3-F1序列如SEQ ID No.7所示，下游引物PybHLH3-R1序列如SEQ ID No.8所示。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种含有权利要求1所述的促进花青苷合成的PyWRKY26基因的重组表达载体。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：所述的促进花青苷合成的PyWRKY26 基因的重组表达载体，以pSAK277为出发载体，将权利要求1所述的促进花青苷合成的PyWRKY26基因插入EcoR I和Xbal I位点之间所得。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：所述的促进花青苷合成的PyWRKY26 基因的重组表达载体在促进梨果皮中花青苷合成中的应用。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：所述的应用，其特征在于：促进花青苷合成的PyWRKY26基因的重组表达载体联合含PybHLH3基因的重组载体在梨果皮中花青苷合成中的应用。

由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有的优点是：

1.PyWRKY26基因在促进梨果皮中花青苷合成的应用，为促进梨果皮中花青苷的积累的分子育种提供新的基因资源，为实施绿色农业提供新的遗传资源，该遗传资源的开发利用有利于降低农业成本和实现环境友好。

2.本发明将转录因子PyWRKY26与辅助因子PyMYB114基因；PyMYB10基因和PybHLH3共转化草莓果实和烟草叶片导致草莓果实和烟草叶片花青苷大量积累，并经生物学功能验证，表明本发明克隆 PyWRKY26与辅助因子PyMYB114基因，PyMYB10基因和PybHLH3联合促进梨果皮中花青苷合成转运的功能。

附图说明

图1.A.基因WRKYs在红茄及其绿色突变体的不同发育阶段的基因转录本丰度。R1，R2，R3表示红茄梨在果实发育的40，55，85天；G1，G2，G3表示红茄梨的绿色突变体在40，55，85天。B.对基因AtWRKY4(At1g13960.1)，PhPh3(AMR43368)，FvWRKY44(XM_004302784.1)，NtWRKY2 (AB063576)，PtWRKY(XM_002326290.1)，PyWRKY26(Pbr013092.1)，PyWRKY12(PrWRKY12) 和AtWRKY6(At3g58710)进行序列比对。黑色，红色和蓝色显示相同，具有保守域相似的氨基酸残基。 WRKY-DNA结构域以β2，β3和β4正方形显示。C.在系统发育树中分析了不同物种的WRKY基因。通过Mega 7软件采用相邻连接法对C端WRKY域进行序列比对分析。D.梨中WRKYs基因的染色体定位。

图2.A.在花后30、60和90天收集的红茄梨和金政1号梨的外观图和花青苷含量的测定。B.通过 RT-qPCR分析花青素代谢相关的结构基因和调节基因的表达水平。在P<0.05的水平上用小写字母表示出显著差异。在P<0.01的水平上用大写字母显示出极显著差异。标记三个生物学重复的误差线。

图3为本发明PyWRKY26与其它转录因子形成调控复合体共转化促进烟草叶片中花青苷积累。

其中：A.注射后5天的烟草叶外观：a，pSAK277；b，PyMYB10；c，PyMYB114；d，PybHLH3； e，PyWRKY31；f，PyWRKY26；g，PyMYB10+PybHLH3；h，PyMYB114+PybHLH3；i，PyMYB114 +PyWRKY31；j，PyMYB114+PyWRKY26；k，PyMYB10+PyMYB114+PybHLH3；l，PyMYB114+PybHLH3+PyWRKY31；m，PyMYB114+PybHLH3+PyWRKY26；n，PyMYB10+PyMYB114+ PybHLH3+PyWRKY31；o，PyMYB10+PyMYB114+PybHLH3+PyWRKY26。B.颜色差异显示为L*， a*和b*的值。在P<0.05的水平上用小写字母表示显著差异。在P<0.01的水平上用大写字母显示极显著性差异。图中标记六个生物学重复的误差线。C.测定烟草叶中总花色苷含量。

图4为本发明PyWRKY26与其它转录因子形成调控复合体共转化促进草莓果实中花青苷积累。

其中：A为注射5天后出现的草莓表型，a，pSAK277；b，PyMYB10；c，PyMYB114；d，PybHLH3； e，PyWRKY31；f，PyWRKY26；g，PyMYB10+PybHLH3；h，PyMYB114+PybHLH3；i，PyMYB114+ PyWRKY31；j，PYMYB114+PyYMYR26；10PyMYB114+PybHLH3+PyWRKY31；m，PyMYB114+ PybHLH3+PyWRKY26；n，PyMYB10+PyMYB114+PybHLH3+PyWRKY31；o，PyMYB10+PyMYB114 +PybHLH3+PyWRKY26。B.用L*，a*和b*的值显示颜色差异。小写字母表示在P<0.05的水平上有显著性差异，大写字母表示在P<0.01的水平上极显著差异。标记六个生物学重复的误差线。(C)总花色苷含量的测量。标记有三个生物学重复的误差线。(d-i)RT-qPCR分析基因FvDFR，FvANS，FvUFGT， FvGST，FvABC转运蛋白和FvAVP的表达水平。用小写字母表示在P<0.05的水平上有显著差异。在P<0.01 水平用大写字母显示出极显著性差异。误差线显示平均值的标准误差(n＝3)

图5双荧光素酶报告基因测定法验证PyMYB10，PyMYB114，PybHLH3和PyWRKY26共转化激活了 PyDFR,PyANS,PyUFGT,PyGST,PyABC转运蛋白和PyAVP1/2启动子的活性。LUC/REN值用于表达启动子激活活性。误差线代表三个生物学重复的误差。

图6PyWRKY26与PybHLH3的体内相互作用。A.双萤光素酶报告系统验证PybHLH3和PyWRKY26 共转化活性。B.NLuc，CLuc和NLuc/CLuc构建体的模型。C.在幼嫩的烟叶中进行萤火虫萤光素酶互补分析。标记六个生物学重复的误差线。**，P<0.01。D.基因PyWRKY26与PybHLH3相互作用的验证。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。

请参阅图1-6。须知，本说明书所附图式所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。同时，本说明书中所引用的如“上”、“下”、“左”、“右”、“中间”及“一”等的用语，亦仅为便于叙述的明了，而非用以限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容下，当亦视为本发明可实施的范畴。

实施例1：本发明通过转录组数据和生物信息学分析筛选候选WRKY基因

Yang等研究报道，通过RT-qPCR分析在红皮梨中与花青素生物合成有关的WRKY家族的基因信息。为了鉴定WRKY基因在控制红梨花色素苷生物合成转运中的功能，通过红茄梨及其绿色突变体的转录组数据分别筛选和分析了花后40d,55d,85d天的WRKYs的66个差异表达基因(图1的A)。此外，使用 Mega 7软件构建系统发育树。结果表明，基因Pbr013092.1(命名为PyWRKY26)与已经报道的花青素相关基因，如TFs AtWRKY4，FvWRKY44，NtWRKY2，Ph Ph3，PtWRKY1和AtWRKY6具有高度同源性和最相似的预测蛋白质序列(图1的B，图1的C),在此基础上结合染色体定位分析，最终确定了位于Chr 3 和Chr 5的PyWRKY26(Pbr13092.1)基因为候选基因。

实施例2：评估梨中PyWRKY26与花青素积累和其他调节花青素生物合成的因素的相关性

为了确认PyWRKY26与花色苷和花色苷相关的TF的相关性，在不同发育阶段测定了红皮梨红茄和绿皮梨金政1号果皮中花青素含量。结果表明，红茄梨的花色苷含量随果实发育而增加，并且高于金政1号梨(图2的A)。此外，发现在红茄梨中基因PyDFR，PyANS，PyUFGT，PyMYB10，PyMYB114，PybHLH3， PyWRKY26，PyWRKY31，PyGST的表达水平远远高于金政1号(PyABC转运蛋白，PyAVP1和PyAVP2除外)(图2的B)。

实施例2：本发明红茄梨中PyWRKY26基因的克隆和重组载体的构建

1、从红茄梨中提取RNA：红茄梨的总RNA的提取采用Plant Total RNA IsolationKit Plus(Foregene，RE-05022)试剂盒，按照该试剂盒提供的操作说明书操作，具体为：取500mg冷冻干燥后的红茄梨果皮置于研钵中，加入液氮充分研磨至细粉末；吸取500μLBuffer PSL1于2mL离心管中，加入10μLβ-巯基乙醇，混匀；用液氮遇冷的蓝色枪头刮取磨好的适量(约50mg)粉末转入Buffer PSL1中，漩涡震荡混匀；室温静置5min后加入100μLBufferPS，轻柔混匀；将所有液体转移至DNA-Cleaning Column中，12000rpm 离心2min后去除过滤柱，保留收集管内上清液；小心转移上清液300mL至新的2mL离心管中，加入450mLBuffer PSL2，轻柔混匀；取500μL混合液转移至RNA-only Column中，12000rpm离心1min后弃掉废液；向RNA-only Column中加入500μLBuffer PRW1，离心1min后弃掉废液；加入700μL无水乙醇，离心1min 后弃掉废液；向RNA-only Column中加入700μL Buffer PRW2，12000rpm离心1min，弃掉废液，并重复一次此步骤；12000rpm离心2min，弃掉收集管；将RNA-only Column转移至新的2mL离心管中，向膜中央滴入60μL于65℃预热的RNase-FreeddH2O，室温放置2min，12000rpm离心1min后收集RNA。取2μL 的RNA跑琼脂糖凝胶电泳，根据条带亮度估算RNA的浓度，并于-80℃冰箱保存备用。

2、第一链cDNA的合成采用Prime Script TM RT Master Mix(Takara)反转录试剂盒(按照该试剂盒提供的说明书操作)。反转录体系为10μL：5×Prime Script RT MasterMix 2μL，total RNA 3μL，RNase-Free ddH2O 5μL。反应体条件为37℃，15min；85℃，5s；4℃，∞。得到的cDNA可放置-20℃冰箱保存。经反转录得到的第一链cDNA用于扩增PyWRKY26基因编码区全长。扩增基因引物对为：

-3’(SEQ ID No.6)；PyWRKY26-F1：5’-actagtggatccaaagaattcATGGCCTCCTCTTCAGGGAG

-3’(SEQ ID No.7)；PyWRKY26-R1:5’-tcattaaagcaggactctagaTCAGCACAGCAATGATTCAAAAA-3’(SEQ ID No.8)。超保真DNA聚合酶

Super-Fidelity DNA Polymerase(P505-d1)购自诺唯赞生物科技公司。扩增的反应体系为50μL中包括200ng cDNA，2×Phanta Max Buffer 25μL，10mM dNTP 1μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase(1U/μl)1μL，10μM 2μL上述引物，加ddH₂O至50μL。PCR反应在 eppendorf扩增仪上按以下程序完成：95℃，预变性3分钟，95℃变性15秒，60℃退火15秒，72℃延伸 90秒,35个热循环，72℃延伸5分钟，4℃保存。产生一条单一PCR条带产物。

PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测后，用AxyGEN小量胶回收试剂盒(购自爱思进生物技术杭州有限公司，中国)回收DNA片段，步骤参照使用说明书。回收纯化的DNA溶液与双酶切(EcoRI/XbaI) 的线性pSAK277载体进行连接反应，重组酶

II OneStep Cloning Kit(货号：C112-01)购自诺唯赞生物科技公司，并按说明书步骤操作。连接反应体系总体积是10μL，其中包括2μL的5×CE II Buffer，50～200ng线性化克隆载体，50～200ng插入片段扩增产物，1μL

II。37℃连接30min。待反应完成后，立即将反应放置于冰水浴中冷却5min，反应产物可直接进行转化。转化采用热击法(参照《分子克隆实验手册》第三版，科学出版社，2002)转化大肠杆菌DH5α，在含有50mg/L壮观霉素的 LB固体平板中筛选阳性克隆，挑取5个阳性克隆测序(由上海英骏生物技术有限公司完成)。测序结果表明，PyWRKY31基因编码区全长为1821bp，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，PyWRKY26基因编码区全长为1752bp，其核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示，本发明证明PyWRKY26与辅助因子PybHLH3联合促进红皮梨中花青苷积累的新的功能应用。

辅助因子PybHLH3克隆的模板是茄梨cDNA，PCR扩增的正向引物序列是PybHLH3-F1：5’- actagtggatccaaagaattcATGGCTGCACCGCCGCCA-3’(SEQ ID NO.11)；反向引物序列是PybHLH3-R1:5’- tcattaaagcaggactctagaTTAAGAGTCAGATTGGGGTATAATTTG-3’(SEQ IDNO.12)，扩增的反应体系为50 μL中包括200ng cDNA，2×Phanta Max Buffer 25μL，10mMdNTP 1μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase(1U/μl)1μL，10μM 2μL上述引物，加ddH₂O至50μL。PCR反应在eppendorf扩增仪上按以下程序完成：95℃，预变性3分钟，95℃变性15秒，60℃退火15秒，72℃延伸90秒,35个热循环，72℃延伸5分钟，4℃保存。PCR扩增的产物通过1％琼脂糖凝胶电泳检测后，用AxyGEN小量胶回收试剂盒 (购自爱思进生物技术杭州有限公司，中国)回收DNA片段，回收纯化的DNA溶液与双酶切(EcoRI/XbaI) 的线性pSAK277载体进行连接反应，重组酶

II One Step Cloning Kit(货号：C112-01)购自诺唯赞生物科技公司，并按说明书步骤操作。连接反应体系总体积是10μL，其中包括2μL的5×CE II Buffer，50～200ng线性化克隆载体，50～200ng插入片段扩增产物，1μL

II。37℃连接30min。待反应完成后，立即将反应放置于冰水浴中冷却5min，反应产物可直接进行转化。转化采用热击法(参照《分子克隆实验手册》第三版，科学出版社，2002)转化大肠杆菌DH5α，在含有50mg/L壮观霉素的 LB固体平板中筛选阳性克隆，挑取5个阳性克隆测序(由上海英骏生物技术有限公司完成)。测序结果表明，PybHLH3编码区基因全长为2010bp，其核苷酸序列为SEQ ID NO.9所示，构建重组载体命名为 pSAK277-PybHLH3；应用冻融法将上述重组载体导入到农杆菌GV3101中。

实施例3：本发明WRKY26基因与其它的共作用因子PyMYB10,PyMYB114以及PybHLH3共转化导致烟草叶片花青苷积累

促进花青苷合成的PyWRKY26基因联合PyMYB10,PyMYB114以及PybHLH3基因在促进烟草叶片中花青苷合成中的应用；所述的PyMYB10基因核苷酸序列如SEQ ID No.13所示，其编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.14所示，所述的PyMYB114基因核苷酸序列如SEQ IDNo.15所示，其编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.16所示；所述的PybHLH3基因核苷酸序列如SEQ ID No.9所示，其编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.10所示。

通过瞬时转化烟叶来验证PyWRKY26在花色苷合成中的功能。如图3的A所示，注射空载体pSAK277 作为阴性对照，当PyWRKY 26单独与PyMYB114转化时未观察到色素沉着，在PyMYB114或PyMYB10与 PybHLH3共转化后观察到少量色素沉着。当PyWRKY26与PyMYB114，PyMYB10和PybHLH3共转化时，色素沉着大大增强。此外，用色差计分析了烟叶中的花色苷含量，L*，a*，b*值的变化与预期一致(图3 的B)。当PyWRKY26参与共转化时，烟草中的花色苷含量显着高于仅PyMYB114，PyMYB10和PybHLH3 共转化(图3的C)(P<0.01)。以上结果表明PyWRKY26与PyMYB10，PyMYB114和PybHLH3的共转化可以显着促进花青素的合成。

实施例4：本发明PyWRKY26基因与其它的共作用因子PyMYB10,PyMYB114以及PybHLH3共转化导致草莓中花青苷积累

促进花青苷合成的PyWRKY26基因联合PyMYB10,PyMYB114以及PybHLH3基因在促进烟草叶片中花青苷合成中的应用；所述的PyMYB10基因核苷酸序列如SEQ ID No.13所示，其编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.14所示，所述的PyMYB114基因核苷酸序列如SEQ IDNo.15所示，其编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.16所示；所述的PybHLH3基因核苷酸序列如SEQ ID No.9所示，其编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.10所示。

为了进一步鉴定PyWRKY26在花色苷合成中的功能，在草莓容器中进行了瞬时转化。如图4的A所示，将pSAK277计数为空载体，未观察到色素沉着。变化模式与烟叶相似，PyMYB114+PyWRKY26共转化，未观察到色素沉着。当PyMYB10+PybHLH3或PyMYB114+PybHLH3共转化时，可以观察到一些色素沉着。当共注射PyMYB114，PyMYB10和PybHLH3时，可以观察到更深的颜色变化。同时，当将三个TF PyMYB114，PyMYB10和PybHLH3与PyWRKY26共注射时，花色苷的积累大大增加。此外，L*，a*和 b*值的变化还受到草莓果实外观颜色变化的影响(图4的B)。当将PyWRKY26与PyMYB114，PyMYB10 和PybHLH3共注入时，草莓中的总花色苷含量显着高于仅PyMYB114，PyMYB10和PybHLH3的共转化(图 4的C)(P<0.01)。总体而言，PyWRKY26与PyMYB10，PyMYB114和PybHLH3的共转化可显着增强草莓中花色苷的生物合成。

实施例5：RT-qPCR分析草莓果实中花色苷生物合成和液泡运输相关基因的表达水平

为了研究PyWRKY26如何调节花色苷代谢，通过RT-qPCR分析评估了草莓果实中花色苷生物合成和运输相关的六个结构基因。FvDFR，FvANS，FvUFGT先前已被报道用于控制花色苷的生物合成。其他三个基因，FvGST，FvABC转运蛋白，FvAVP被认为是参与花色苷转运的关键基因。如图4的D-G所示， PyWRKY26与PyMYB10，PyMYB114和PybHLH3的共转化显着增强了FvDFR，FvANS，FvUFGT和FvGST 基因的表达水平。与单独的pSAK277相比，当草莓果实中的四个TF共转化时，FvAVP和FvABC转运蛋白的基因表达被显着抑制(图4的H和4I)。RT-qPCR分析表明，在草莓果实中，四个TFs，PyMYB10， PyMYB114，PybHLH3和PyWRKY26的共转化可通过上调FvDFR，FvANS，FvUFGT和FvGST基因下调 FvAVP和FvABC转运蛋白的基因表达来促进花色苷的合成和转运。

实施例6：通过双荧光素酶报告系统验证转录调节复合物的相互作用

使用双荧光素酶报告系统来验证我们的候选转录因子对花青苷代谢相关基因(包括PyDFR，PyANS， PyUFGT，PyGST，PyABC转运蛋白和PyAVP1/2)在烟草中的相互作用。结果表明，与PybHLH3共转化的PyMYB10和PyMYB114可以激活这些启动子的活性，另外的TFPyWRKY26可以显着增强PyDFR，PyANS， PyUFGT和PyGST启动子的活性。此外，与pSAK277相比，当PyMYB114，PyMYB10，PybHLH3和PyWRKY26 共同转化时，PyABC转运蛋白和PyAVP1/2启动子的反式活性没有明显激活(图5的E-G)。这些结果表明，PyWRKY26通过与PyMYB10+PyMYB114+PybHLH3配合物协同调节花色苷的积累。

实施例7：验证PybHLH3与PyWRKY26的相互作用

为了进一步探索TFs PyMYB114，PybHLH3，PyWRKY26的作用模式，克隆了PyMYB114的上游2Kb 启动子，并通过双荧光素酶报告系统分析法在烟叶中进行了分析。如图6的A所示，与PyWRKY26和 PybHLH3的共转化对PyMYB114的启动子序列具有比包括PyWRKY31在内的其他因素更强的激活作用。为了进一步确定PybHLH3与PyWRKY26的相互作用，进行了基于烟草的完整荧光素酶互补测定。PybHLH3 插入了萤光素荧光素酶(NLuc)的N端区域，而PyWRKY26连接到萤光素荧光素酶(CLuc)的C端区域 (图6的B)。NLuc-PybHLH3和CLuc-PyWRKY26构建体的共表达显示出最强的恢复强烈荧光素酶活性的能力(P<0.01)。同时，对于任何对照组，均未观察到明显的荧光素酶活性(图6的C)。

然后采用Y2H试验进一步验证PyWRKY26与PybHLH3的相互作用。PyWRKY26和PybHLH3的全长序列分别插入pGBKT7和pGADT7中。结果表明，在AH109酵母细胞中共转化的PyWRKY26和PybHLH3 可以在SD-Trp-Leu和SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade培养基上观察到正常生长(图6的D)。最重要的是，该结果表明PyWRKY26在体内与PybHLH3有相互作用。

参考文献

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以上所述者仅为用以解释本发明之较佳实施例，并非企图具以对本发明做任何形式上之限制，是以，凡有在相同之发明精神下所作有关本发明之任何修饰或变更，皆仍应包括在本发明意图保护之范畴。

序列表

<110> 合肥工业大学

<120> 一种促进花青苷合成的PyWRKY26基因及其重组表达载体与应用

<140> 2019113859463

<141> 2019-12-29

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1752

<212> DNA

<213> '红茄'梨

<400> 1

atggcctcct cttcagggag cttagaaacc tcagcaaact cacacccagc agccttcact 60

ttctcaacgc acccattcat gaccaactcc ttctccgacc tcttagaagc cggcacagat 120

gagtactcga acccacctag atacatcggc cagggcgggc tatcggatcg aattgcagag 180

cgtactgggt ccggcgtacc caaattcaag tccctaccgc cgccctcact gcccatttct 240

cctccctcta tatctccatc ttcctacttt gctatcccac ctggattgag cccagctgag 300

cttcttgact ctcctgttct cttaaacgct tcaaacattc ttccatctcc aactactgga 360

agctttgcag ctcgtggggc cttcaattgg aagaacaacc aacagaacgt aaaacaggag 420

agcaagaacc actcagactt ctctttccaa acccaagcaa gacctcccat ttcttcatca 480

tcgtcaatgt ttcaatcctc aaacacctca attcaaacta cacaagagca ggcatggaac 540

tctcaagaac tcccaaagca agaatatggt tctgttcaga ccttgtcatc tgaattgacc 600

accaaaactc tccaaagtaa tgctccggcg aatggcggtt tcaaccagca atctcagacc 660

ttgagcagga agtcggatga tggtttcaat tggagaaaat atggtcaaaa acaagtgaag 720

ggaagtgaaa atcccagaag ctattacaag tgcacttacc ctaattgccc aactaagaaa 780

aaagtagaga ggtcattgga tggacaaatc actgagattg tttacaaggg caatcacaac 840

catcccaagc cacagaaccc tagaagatca tcatcaaatt ctcatgcaat tcatgctttc 900

aatcccacca acaccaatga aatcccagat caaacttatg ctaatcatgg caattcacaa 960

atggattcca ttggaactcc tgagcattca tcgatatcga tcggggacga tgattttgag 1020

cagagctctc agaggagcaa gtcaggagga ggggaggagt ttgatgaaga tgaacctaat 1080

gcaaaaagat ggaaaaatga agctgatcgt aatgaagaaa tttcagcacc tgggagtaga 1140

acagtgagag agcctagagt tgtagttcag acaactagtg acattgatat tctagatgat 1200

ggatacagat ggaggaagta cggtcagaaa gtggtaaaag gcaacccaaa tccaaggagc 1260

tactacaagt gcacaaatcc aggatgtcca gtgagaaagc atgttgagag agcttctcac 1320

gatcttagag cagtgatcac aacctatgaa gggaagcaca accacgacgt ccctgccgct 1380

cgtggcagcg gcaggccann nnnnnnnnca acccacgacg tccctgccgc ccggggcagc 1440

ggcagccatg ctgctgtcaa taggcctata ccaaacaaca acaacaattt agcttcagca 1500

atgaggccta taactcacca cactaacaat tctgctaata ccaactctct tcaaaacttg 1560

aggcaaccaa catcagaagg gcaagctccc tttagcctag agatgttgca gagcccggga 1620

agttacggat tcgtggggtt cgacggaaac tccttgggat catacatgaa ccaaacacag 1680

cttagtgaca tattttctaa agccaaggaa gagccaaggg atgatgcatt ttttgaatca 1740

ttgctgtgct ga 1752

<210> 2

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<212> PRT

<213> '红茄'梨

<400> 2

Met Ala Ser Ser Ser Gly Ser Leu Glu Thr Ser Ala Asn Ser His Pro

1 5 10 15

Ala Ala Phe Thr Phe Ser Thr His Pro Phe Met Thr Asn Ser Phe Ser

20 25 30

Asp Leu Leu Glu Ala Gly Thr Asp Glu Tyr Ser Asn Pro Pro Arg Tyr

35 40 45

Ile Gly Gln Gly Gly Leu Ser Asp Arg Ile Ala Glu Arg Thr Gly Ser

50 55 60

Gly Val Pro Lys Phe Lys Ser Leu Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ile Ser

65 70 75 80

Pro Pro Ser Ile Ser Pro Ser Ser Tyr Phe Ala Ile Pro Pro Gly Leu

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Ser Pro Ala Glu Leu Leu Asp Ser Pro Val Leu Leu Asn Ala Ser Asn

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Ile Leu Pro Ser Pro Thr Thr Gly Ser Phe Ala Ala Arg Gly Ala Phe

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Asn Trp Lys Asn Asn Gln Gln Asn Val Lys Gln Glu Ser Lys Asn His

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Ser Asp Phe Ser Phe Gln Thr Gln Ala Arg Pro Pro Ile Ser Ser Ser

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Ser Ser Met Phe Gln Ser Ser Asn Thr Ser Ile Gln Thr Thr Gln Glu

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Gln Ala Trp Asn Ser Gln Glu Leu Pro Lys Gln Glu Tyr Gly Ser Val

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Gln Thr Leu Ser Ser Glu Leu Thr Thr Lys Thr Leu Gln Ser Asn Ala

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Pro Ala Asn Gly Gly Phe Asn Gln Gln Ser Gln Thr Leu Ser Arg Lys

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Ser Asp Asp Gly Phe Asn Trp Arg Lys Tyr Gly Gln Lys Gln Val Lys

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Gly Ser Glu Asn Pro Arg Ser Tyr Tyr Lys Cys Thr Tyr Pro Asn Cys

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Pro Thr Lys Lys Lys Val Glu Arg Ser Leu Asp Gly Gln Ile Thr Glu

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Ile Val Tyr Lys Gly Asn His Asn His Pro Lys Pro Gln Asn Pro Arg

275 280 285

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Thr Asn Glu Ile Pro Asp Gln Thr Tyr Ala Asn His Gly Asn Ser Gln

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Met Asp Ser Ile Gly Thr Pro Glu His Ser Ser Ile Ser Ile Gly Asp

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Asp Asp Phe Glu Gln Ser Ser Gln Arg Ser Lys Ser Gly Gly Gly Glu

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Glu Phe Asp Glu Asp Glu Pro Asn Ala Lys Arg Trp Lys Asn Glu Ala

355 360 365

Asp Arg Asn Glu Glu Ile Ser Ala Pro Gly Ser Arg Thr Val Arg Glu

370 375 380

Pro Arg Val Val Val Gln Thr Thr Ser Asp Ile Asp Ile Leu Asp Asp

385 390 395 400

Gly Tyr Arg Trp Arg Lys Tyr Gly Gln Lys Val Val Lys Gly Asn Pro

405 410 415

Asn Pro Arg Ser Tyr Tyr Lys Cys Thr Asn Pro Gly Cys Pro Val Arg

420 425 430

Lys His Val Glu Arg Ala Ser His Asp Leu Arg Ala Val Ile Thr Thr

435 440 445

Tyr Glu Gly Lys His Asn His Asp Val Pro Ala Ala Arg Gly Ser Gly

450 455 460

Arg Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Thr His Asp Val Pro Ala Ala Arg Gly Ser

465 470 475 480

Gly Ser His Ala Ala Val Asn Arg Pro Ile Pro Asn Asn Asn Asn Asn

485 490 495

Leu Ala Ser Ala Met Arg Pro Ile Thr His His Thr Asn Asn Ser Ala

500 505 510

Asn Thr Asn Ser Leu Gln Asn Leu Arg Gln Pro Thr Ser Glu Gly Gln

515 520 525

Ala Pro Phe Ser Leu Glu Met Leu Gln Ser Pro Gly Ser Tyr Gly Phe

530 535 540

Val Gly Phe Asp Gly Asn Ser Leu Gly Ser Tyr Met Asn Gln Thr Gln

545 550 555 560

Leu Ser Asp Ile Phe Ser Lys Ala Lys Glu Glu Pro Arg Asp Asp Ala

565 570 575

Phe Phe Glu Ser Leu Leu Cys

580

<210> 3

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

actagtggat ccaaagaatt catggcctcc tcttcaggga g 41

<210> 4

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tcattaaagc aggactctag atcagcacag caatgattca aaaa 44

<210> 5

<211> 2010

<212> DNA

<213> '红茄'梨

<400> 5

atggctgcac cgccgccaag cagcagccgc ctccgaggta tgttgcaggc ctcagtccaa 60

tatgtccaat ggacttacag tctcttctgg caaatctgtc cccaacaagg gatcttagta 120

tggtcagatg ggtactataa tggagccatc aagacgagga agacggtgca accaatggaa 180

gtgagtgccg aggaggcatc tctccagagg agccagcaac tcagagaact ctacgactct 240

ttgtccgctg gagagacaaa ccagccccca gcacgccgcc cttgcgcttc cttgtccccg 300

gaggacttaa ccgaatccga atggttctac ttgatgtgtg tctcgttctc ctttcccccc 360

ggcgtcgggt tgccagggaa agcatacgca aggaggcagc atgtatggct caccggtgca 420

aacgaggtcg atagcaaaac cttttccaga gctattttgg caaagagtgc tcgcatacag 480

accgtggtgt gcattcctct tctagatggc gtcgtagaat ttggcaccac agagagggtt 540

ccagaagacc acgccttagt cgaacacgtc aaaaccttct tcgttgacca ccaccaccct 600

ccgccaccaa aacccgccct ctccgagcac tccacatcca accccgccac ctcatccgat 660

cacccacatt tccactctcc gcaccttctc cagaccatgt gcaccaaccc tcctctcaac 720

gccgcccaag aagacgaaga ggacgaagaa gaagatgata atcaggagga ggacgacgga 780

ggagacgagt cggactccga agccgaaacg ggtcgcaatg gtggagccgt tgttcccgcc 840

gcaaaccctc ctcaggtttt ggccgcggta gccgagccaa gcgagctcat gcaactcgag 900

atgtccgaag acatccggct gggctccccg gacgatgcct caaataactt ggactctgat 960

ttccacttgt tagctgtgag acccctaact ttagaggagt tgacacatga tgacgacaca 1020

cattactcgg agacggtctc caccatactg cagggacaag cgactcggtg gacggattca 1080

tcgtccacca actacacagc ttgcttgact caatcggctt tcgccaagtg gtcaagccgg 1140

gttgatcacc acttcctcat gccggttgag ggcacatccc aatggctctt gaaatatatt 1200

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tccctagtgc cttttgtgac aaaaatggac aaggcttcga tattagggga cacaatcgag 1440

tatgtgaagc aactgcgtaa caaaattcag gatctcgagg cacgtaacat gctgatggag 1500

gaagatcaac gatcgagatc atccggggaa atgcaaaggt ccagtagttg taaagagttg 1560

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aagttgagga ttgtggaggg aagtggcggt gtcgccattg gtaaggctaa agtaatggag 1680

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tgcccgtata gagaagggtt attgcttgat gtgatgcaaa cacttaggga gctaagaatt 1860

gagaccacgg tggtccagtc ctcattgaat aacggattct tcgtagctga actaagagcc 1920

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aatcaaatta taccccaatc tgactcttaa 2010

<210> 6

<211> 669

<212> PRT

<213> '红茄'梨

<400> 6

Met Ala Ala Pro Pro Pro Ser Ser Ser Arg Leu Arg Gly Met Leu Gln

1 5 10 15

Ala Ser Val Gln Tyr Val Gln Trp Thr Tyr Ser Leu Phe Trp Gln Ile

20 25 30

Cys Pro Gln Gln Gly Ile Leu Val Trp Ser Asp Gly Tyr Tyr Asn Gly

35 40 45

Ala Ile Lys Thr Arg Lys Thr Val Gln Pro Met Glu Val Ser Ala Glu

50 55 60

Glu Ala Ser Leu Gln Arg Ser Gln Gln Leu Arg Glu Leu Tyr Asp Ser

65 70 75 80

Leu Ser Ala Gly Glu Thr Asn Gln Pro Pro Ala Arg Arg Pro Cys Ala

85 90 95

Ser Leu Ser Pro Glu Asp Leu Thr Glu Ser Glu Trp Phe Tyr Leu Met

100 105 110

Cys Val Ser Phe Ser Phe Pro Pro Gly Val Gly Leu Pro Gly Lys Ala

115 120 125

Tyr Ala Arg Arg Gln His Val Trp Leu Thr Gly Ala Asn Glu Val Asp

130 135 140

Ser Lys Thr Phe Ser Arg Ala Ile Leu Ala Lys Ser Ala Arg Ile Gln

145 150 155 160

Thr Val Val Cys Ile Pro Leu Leu Asp Gly Val Val Glu Phe Gly Thr

165 170 175

Thr Glu Arg Val Pro Glu Asp His Ala Leu Val Glu His Val Lys Thr

180 185 190

Phe Phe Val Asp His His His Pro Pro Pro Pro Lys Pro Ala Leu Ser

195 200 205

Glu His Ser Thr Ser Asn Pro Ala Thr Ser Ser Asp His Pro His Phe

210 215 220

His Ser Pro His Leu Leu Gln Thr Met Cys Thr Asn Pro Pro Leu Asn

225 230 235 240

Ala Ala Gln Glu Asp Glu Glu Asp Glu Glu Glu Asp Asp Asn Gln Glu

245 250 255

Glu Asp Asp Gly Gly Asp Glu Ser Asp Ser Glu Ala Glu Thr Gly Arg

260 265 270

Asn Gly Gly Ala Val Val Pro Ala Ala Asn Pro Pro Gln Val Leu Ala

275 280 285

Ala Val Ala Glu Pro Ser Glu Leu Met Gln Leu Glu Met Ser Glu Asp

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Ile Arg Leu Gly Ser Pro Asp Asp Ala Ser Asn Asn Leu Asp Ser Asp

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Phe His Leu Leu Ala Val Arg Pro Leu Thr Leu Glu Glu Leu Thr His

325 330 335

Asp Asp Asp Thr His Tyr Ser Glu Thr Val Ser Thr Ile Leu Gln Gly

340 345 350

Gln Ala Thr Arg Trp Thr Asp Ser Ser Ser Thr Asn Tyr Thr Ala Cys

355 360 365

Leu Thr Gln Ser Ala Phe Ala Lys Trp Ser Ser Arg Val Asp His His

370 375 380

Phe Leu Met Pro Val Glu Gly Thr Ser Gln Trp Leu Leu Lys Tyr Ile

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Leu Phe Ser Val Pro Phe Leu His Ser Lys Tyr Arg Asp Glu Asn Ser

405 410 415

Pro Lys Ser Gln Glu Gly Glu Gly Ser Thr Arg Leu Arg Lys Gly Thr

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Pro Gln Asp Glu Leu Ser Ala Asn His Val Leu Ala Glu Arg Arg Arg

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Arg Glu Lys Leu Asn Glu Arg Phe Ile Ile Leu Arg Ser Leu Val Pro

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Phe Val Thr Lys Met Asp Lys Ala Ser Ile Leu Gly Asp Thr Ile Glu

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Tyr Val Lys Gln Leu Arg Asn Lys Ile Gln Asp Leu Glu Ala Arg Asn

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Met Leu Met Glu Glu Asp Gln Arg Ser Arg Ser Ser Gly Glu Met Gln

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Arg Ser Ser Ser Cys Lys Glu Leu Arg Ser Gly Leu Thr Val Val Glu

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Arg Thr Gln Gly Gly Pro Pro Gly Ser Asp Lys Arg Lys Leu Arg Ile

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Val Glu Gly Ser Gly Gly Val Ala Ile Gly Lys Ala Lys Val Met Glu

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Asp Ser Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Gln Pro Glu Pro Ser

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Pro Thr Pro Met Val Thr Gly Thr Ser Leu Glu Val Ser Ile Ile Glu

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Ser Asp Gly Leu Leu Glu Leu Gln Cys Pro Tyr Arg Glu Gly Leu Leu

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Lys Val Lys Asp Asn Val Ser Gly Lys Lys Val Ser Ile Thr Glu Val

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<212> DNA

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<400> 7

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

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<212> DNA

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<400> 9

atggagggat ataacgttaa cttgagtgtg agaaaaggtg cctggactcg agaggaagac 60

aatcttctca ggcagtgcat tgagattcat ggagagggaa agtggaacca ggtttcatac 120

aaagcaggct taaacaggtg caggaagagc tgcagacaaa gatggttaaa ctatctgaag 180

ccaaatatca agagaggaga ctttaaagag gatgaagtag atcttatact tagacttcac 240

aggcttttgg gaaacaggtg gtcattgatt gctagaagac ttccaggaag aacagcgaat 300

gatgtgaaaa attattggaa cactcgattg gggatcgatt ctcgcatgaa aacgttgaaa 360

aataaatctc aagaaacgag aaagaccaat gtgataagac ctcagcccca aaaattcatc 420

aaaagttcat attacttaag cagtaaagaa ccaattctag aacatattca atcagcagaa 480

gatttaagta cgccatcaca aacgtcgtcg tcaacaaaga acggaaatga ttggtgggag 540

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gaagaacttt tcacaacttt ttggtttgat gatcgactgt cggcaagatc atgtgccaat 660

tttcctgaag aaggacaaag tagaagtgaa ttctccttta gcatggacct ttggaatcat 720

tcaaaagaag aatag 735

<210> 10

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<213> '红早酥'梨

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Met Glu Gly Tyr Asn Val Asn Leu Ser Val Arg Lys Gly Ala Trp Thr

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Arg Glu Glu Asp Asn Leu Leu Arg Gln Cys Ile Glu Ile His Gly Glu

20 25 30

Gly Lys Trp Asn Gln Val Ser Tyr Lys Ala Gly Leu Asn Arg Cys Arg

35 40 45

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50 55 60

Arg Gly Asp Phe Lys Glu Asp Glu Val Asp Leu Ile Leu Arg Leu His

65 70 75 80

Arg Leu Leu Gly Asn Arg Trp Ser Leu Ile Ala Arg Arg Leu Pro Gly

85 90 95

Arg Thr Ala Asn Asp Val Lys Asn Tyr Trp Asn Thr Arg Leu Gly Ile

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Thr Asn Val Ile Arg Pro Gln Pro Gln Lys Phe Ile Lys Ser Ser Tyr

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Tyr Leu Ser Ser Lys Glu Pro Ile Leu Glu His Ile Gln Ser Ala Glu

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Asp Leu Ser Thr Pro Ser Gln Thr Ser Ser Ser Thr Lys Asn Gly Asn

165 170 175

Asp Trp Trp Glu Thr Leu Phe Glu Gly Glu Asp Thr Phe Glu Arg Ala

180 185 190

Ala Cys Pro Ser Ile Glu Leu Glu Glu Glu Leu Phe Thr Thr Phe Trp

195 200 205

Phe Asp Asp Arg Leu Ser Ala Arg Ser Cys Ala Asn Phe Pro Glu Glu

210 215 220

Gly Gln Ser Arg Ser Glu Phe Ser Phe Ser Met Asp Leu Trp Asn His

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Ser Lys Glu Glu

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<211> 480

<212> DNA

<213> '红早酥'梨

<400> 11

atgaggaagg gtgcctggac tcaacaggaa gatgatattc tgaggcagtg cgttgaaaag 60

catggagatg gaaagtggca ccaggttcct cgcgaaacag gtctaaacag atgcaggaaa 120

agctgcagac agaggtggtt gaactatttg aagccgaatc tcaagagcgg agatttcaca 180

gaggacgaaa tagatctaat ccatagactt cagaaacttt tgggaaacag gcaagtccct 240

ttatttgaaa gcgctattga ttcatggaag accatgttgc atgatacaga caatgttgat 300

ggaacaccat tttctagttt agggttaggg gaagacctct tcacaaactt ttgggttgaa 360

gatattgcac aatcgacaat ggtaggcatg aattctgctg atgaagggtt acacatgagt 420

ggcaactttt cttttagaga gaacctttgg aatctagaag aagagataac taagatttag 480

<210> 12

<211> 159

<212> PRT

<213> '红早酥'梨

<400> 12

Met Arg Lys Gly Ala Trp Thr Gln Gln Glu Asp Asp Ile Leu Arg Gln

1 5 10 15

Cys Val Glu Lys His Gly Asp Gly Lys Trp His Gln Val Pro Arg Glu

20 25 30

Thr Gly Leu Asn Arg Cys Arg Lys Ser Cys Arg Gln Arg Trp Leu Asn

35 40 45

Tyr Leu Lys Pro Asn Leu Lys Ser Gly Asp Phe Thr Glu Asp Glu Ile

50 55 60

Asp Leu Ile His Arg Leu Gln Lys Leu Leu Gly Asn Arg Gln Val Pro

65 70 75 80

Leu Phe Glu Ser Ala Ile Asp Ser Trp Lys Thr Met Leu His Asp Thr

85 90 95

Asp Asn Val Asp Gly Thr Pro Phe Ser Ser Leu Gly Leu Gly Glu Asp

100 105 110

Leu Phe Thr Asn Phe Trp Val Glu Asp Ile Ala Gln Ser Thr Met Val

115 120 125

Gly Met Asn Ser Ala Asp Glu Gly Leu His Met Ser Gly Asn Phe Ser

130 135 140

Phe Arg Glu Asn Leu Trp Asn Leu Glu Glu Glu Ile Thr Lys Ile

145 150 155

Claims (10)

1.一种促进花青苷合成的PyWRKY26基因，其特征在于：所述促进花青苷合成的PyWRKY26基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.一种由权利要求1所述的促进花青苷合成的PyWRKY26基因编码的蛋白，其特征在于：所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

3.一种含有权利要求1所述的促进花青苷合成的PyWRKY26基因的宿主菌。

4.一种克隆权利要求1所述的促进花青苷合成的PyWRKY26基因的引物对，其特征在于：上游引物PyWRKY26-F1序列如SEQ ID No.3所示，下游引物PyWRKY26-R1序列如SEQ ID No.4所示。

5.权利要求1所述的促进花青苷合成的PyWRKY26基因在促进梨果皮花青苷合成中的应用。

6.根据权利要求5所述的促进花青苷合成的PyWRKY26基因在促进梨果皮中花青苷合成中的应用，其特征在于：所述的促进花青苷合成的PyWRKY26基因结合PyMYB114基因、PyMYB10基因和PybHLH3基因在促进梨果皮中花青苷合成中的应用；所述的PybHLH3基因核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，其编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示，克隆PybHLH3基因的引物对，上游引物PybHLH3-F1序列如SEQ ID No.7所示，下游引物PybHLH3-R1序列如SEQ ID No.8所示。

7.一种含有权利要求1所述的促进花青苷合成的PyWRKY26基因的重组表达载体。

8.根据权利要求7所述的促进花青苷合成的PyWRKY26基因的重组表达载体，其特征在于：以pSAK277为出发载体，将权利要求1所述的促进花青苷合成的PyWRKY26基因插入EcoRI和Xbal I位点之间所得。

9.权利要求7所述的促进花青苷合成的PyWRKY26基因的重组表达载体在促进梨果皮中花青苷合成中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：促进花青苷合成的PyWRKY26基因的重组表达载体联合含PybHLH3基因的重组载体在梨果皮中花青苷合成中的应用。

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