CN107142276B

CN107142276B - 一种在作物种子胚乳合成花青素的转基因育种方法

Info

Publication number: CN107142276B
Application number: CN201710368951.8A
Authority: CN
Inventors: 刘耀光; 祝钦泷; 余穗泽; 曾栋昌
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2017-05-23
Filing date: 2017-05-23
Publication date: 2020-11-13
Anticipated expiration: 2037-05-23
Also published as: CN107142276A

Abstract

本发明公开了一种在作物种子胚乳合成花青素的转基因育种方法。本发明通过在作物中转入包含6个表达结构蛋白的基因和2个表达转录因子的基因的基因组合，获得种子胚乳为紫色的、合成花青素的转基因作物；6个结构蛋白为CHS、CHI、F3H、F3’H、DFR和ANS；2个转录因子为转录因子Pl和转录因子Lc。本发明是基于发明人发现2个调节基因和6个结构基因是在胚乳中高水平合成花青素所必需的，得到的研究成果。本发明首次在作物水稻的胚乳中实现了花青素的合成，并获得了无筛选标记的转基因“紫米”产品，可以直接用于食用，也可以作为原材料用于生产花青素的原料。本发明对于新的功能性作物育种具有重要的指导意义和生产应用价值。

Description

一种在作物种子胚乳合成花青素的转基因育种方法

技术领域

本发明涉及基因工程领域，特别涉及一种在作物种子胚乳合成花青素的转基因育种方法。

背景技术

花青素(Anthocyanins)属于酚类化合物中的类黄酮(Flavonoid)植物营养素，是一种水溶性色素，广泛存在于植物的花、叶和果实中，赋予了植物鲜艳的色彩。花青素具有强的抗氧化活性，对心血管疾病、糖尿病和一些慢性疾病具有较好预防作用，对人们的健康具有重要的促进作用。同时，花青素也是一种天然的色素，在食品、保健品、医药用品、化妆品、食品添加剂等领域具有广阔的应用价值。食物来源中，花青素主要在有色水果和有色蔬菜中，如葡萄、紫椰菜等，而在粮食作物中含量较少。天然的有色类粮食谷物，其花青素等色素是存在于谷物的种皮中。当有色谷物进行精加工去除种皮时，作为主要食用部分的胚乳是白色的且不含花青素。

黑米在东南亚各国是一种传统的重要营养保健食品，其主要营养物质是种皮中的花青素。传统食用的黑米都是糙米，其口感和蒸煮特性都较差，而去掉种皮变成精米后，又失去了种皮含有的花青素等营养成分。因此，如能在胚乳中产生花青素，则可以解决上述问题，增加稻米(精米)营养价值，这也是功能型水稻基因工程育种的主要目标之一。

花青素的生物合成与调控涉及到多个基因，包括结构基因(编码各类酶，催化形成花青素的基础结构)、修饰基因(编码糖基转移酶等，对花青素结构进行稳定加工)、转运蛋白(负责把花青素运到液泡储存)以及调控它们的器官特异和时空特异表达的调节基因。其中的调节基因主要是3个转录因子基因，它们的时空特异表达的MYB、bHLH和WD40蛋白因子形成三因子复合体(简称MBW)，可以激活上述的结构基因、修饰蛋白基因、和转运蛋白基因，以完成花青素的合成、修饰、和运转。本发明的研究发现，在白米水稻品种中，由于涉及花青素的生物合成的结构基因和调节基因大多是突变失去功能的或在胚乳不表达(或很低水平表达)的(见图1)，因此传统杂交育种方法不能实现花青素在胚乳的合成。而普通基因工程方法导入少数相关基因，如只导入在水稻胚乳表达的花青素调节基因，或只导入在水稻胚乳表达的几个花青素结构基因被证明是无效的，不能够构建花青素合成、修饰、和运转的完整途径，只能合成部分黄酮类中间产物，不能产生花青素(Shin et al.,2006；Ogo et al.,2013)。因此，采用多基因代谢工程的方法，导入在水稻胚乳特异表达的花青素合成途径完整的调节基因和结构基因，通过外源转基因表达以及激活内源基因的表达，共同作用才有可能在胚乳中实现花青素的合成。这相比较于已报道的在胚乳产生β-类胡萝卜素的“黄金大米”、在胚乳合成虾青素的“虾青素大米”(专利公开号：CN105907780A)、以及以胚乳作为生物反应器生产具有生物活性的“人血清蛋白米”，在胚乳中合成花青素需要更多的不同功能的基因及其组合，难度更大，因此目前还没有在水稻胚乳中生产花青素的报告。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种在作物种子胚乳合成花青素的转基因育种方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种在作物种子胚乳合成花青素的转基因育种方法，包括如下步骤：在作物中转入包含6个表达结构蛋白的基因和2个表达转录因子的基因构成的基因组合，获得种子胚乳为紫色的、合成花青素的转基因作物；

其中，所述的结构蛋白的基因为查尔酮合成酶基因(CHS)、查尔酮异构酶基因(CHI)、黄烷酮-3-羟化酶基因(F3H)、类烷酮-3-羟化酶基因(F3’H)、二羟黄酮醇4-还原酶基因(DFR)和花青素合成酶基因(ANS)；

所述的转录因子的基因为分别编码MYB蛋白的Pl基因和编码bHLH蛋白的Lc基因。

所述作物为水稻、玉米、小麦、高粱、大麦等；优选为水稻；更优选为水稻品种中花11号。

所述的表达结构蛋白的基因包括作物胚乳表达启动子、编码结构蛋白的基因和终止子。

所述的表达转录因子的基因包括作物胚乳表达启动子、编码转录因子的基因和终止子。

所述的作物胚乳表达启动子优选为胚乳储存蛋白基因的启动子；更优选为水稻胚乳储存蛋白基因启动子ensP1～ensP8，其中，ensP1～ensP8的序列分别如GenBankNo.EU264107、GenBank No.AY427569、GenBank No.AY427571、GenBank No.AY427575、GenBank No.EU264106、GenBank No.D63901、GenBank No.AY427572和GenBankNo.AY427574所示。

表达所述的查尔酮合成酶的基因优选包含水稻胚乳储存蛋白基因启动子ensP8、如SEQ ID NO.1所示的编码查尔酮合成酶的基因和Tmas终止子。Tmas终止子是甘露碱合成酶终止子，序列如GenBank No.DQ005465所示。

表达所述的查尔酮异构酶的基因优选包含水稻胚乳储存蛋白基因启动子ensP4、如SEQ ID NO.2所示的编码查尔酮异构酶的基因和Tocs终止子。Tocs终止子是章鱼碱合成酶终止子，序列如GenBank No.DQ005461所示。

表达所述的黄烷酮-3-羟化酶的基因优选包含水稻胚乳储存蛋白基因启动子ensP3、如SEQ ID NO.3所示的编码黄烷酮-3-羟化酶的基因和T35s终止子。T35s终止子是CaMV 35S终止子，序列如GenBank No.AF234296.1所示。

表达所述的类烷酮-3-羟化酶的基因优选包含水稻胚乳储存蛋白基因启动子ensP7、如SEQ ID NO.4所示的编码类烷酮-3-羟化酶的基因和Trbc终止子。Trbc终止子是核糖体小亚基终止子，序列如GenBank No.DQ005473所示。

表达所述的二羟黄酮醇4-还原酶的基因优选包含水稻胚乳储存蛋白基因启动子ensP5、如SEQ ID NO.5所示的编码二羟黄酮醇4-还原酶的基因和Tags终止子。Tags终止子是农杆碱合成酶终止子，序列如GenBank No.DQ005453所示。

表达所述的花青素合成酶的基因优选包含水稻胚乳储存蛋白基因启动子ensP6、如SEQ ID NO.6所示的编码花青素合成酶的基因和Tnos终止子。Tnos终止子是胭脂碱合成酶终止子，序列如GenBank No.DQ005463所示。

表达所述的MYB蛋白的基因优选包含水稻胚乳储存蛋白基因启动子ensP1、编码玉米转录因子ZmPl的基因和Tmas终止子。所述的编码玉米转录因子ZmPl的基因如GenBankNo.NM_001112415所示。

表达所述的bHLH蛋白的基因优选包含水稻胚乳储存蛋白基因启动子ensP2、编码玉米转录因子ZmLc的基因和Tmas终止子。所述的编码玉米转录因子ZmLc的基因如GenBankNo.NM_001111869所示。

所述的在作物种子胚乳合成花青素的转基因育种方法，优选包括如下步骤：

(1)克隆在胚乳完成花青素合成途径必需的全部6个结构基因(CHS、CHI、F3H、F3’H、DFR和ANS)和2个调节基因(Pl和Lc)，并将这8个基因分别与作物胚乳表达启动子融合，分别构建基因表达盒；

(2)将步骤(1)得到的8个基因表达盒构建到一个植物转化载体上，获得含CHS、CHI、F3H、F3’H、DFR、ANS、Pl和Lc的多基因转化载体；

(3)将得到的多基因转化载体转化育种作物，获得种子胚乳为紫色的、合成花青素的、优选为无筛选标记的转基因作物。

所述的在作物种子胚乳合成花青素的转基因育种方法，还包括如下步骤：为了获得可以剔除筛选标记基因的转化植物，将标记基因/标记删除基因的无筛选标记(Marker-free)结构构建到步骤(2)得到的多基因转化载体，获得含所述10个基因的、能在转基因植株中自动删除筛选标记的多基因转化载体。

所述的标记基因包括潮霉素HPT标记基因等。

所述的标记删除基因包括Cre标记删除基因等。

所述的将得到的多基因转化载体转化育种作物可通过常规的作物转化方法得到，如使用农杆菌介导的转化方法，转化育种作物的愈伤组织，筛选，得到转基因作物。

一种胚乳为紫色的作物种子，通过上述转基因育种方法得到。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

虽然植物花青素合成代谢涉及的基因网络大体上已经被阐明，但在本发明之前，在白米水稻中导入那些基因是在胚乳中构建花青素合成途径所必需是不清楚的。本发明通过研究，发现2个调节基因和6个结构基因是在胚乳中高水平合成花青素所必需的。本发明进而利用多基因遗传工程方法，首次在作物水稻的胚乳中实现了花青素的合成，并获得了无筛选标记的转基因“紫米”产品，可以直接用于食用，也可以作为原材料用于生产花青素的原料。本发明对于新的功能性作物育种具有重要的指导意义和生产应用价值。另外，本发明可以实现在作物种子胚乳合成积累有用的活性物质或营养物质(如花青素)，因此本发明对重要的、复杂生物合成途径和重要农艺性状的多基因遗传工程操作提供了技术方法，具有重要的应用价值。

附图说明

图1是转基因作物种子胚乳中重建的花青素合成途径图；其中，图A是发明人先前的未发表研究成果图，在白米水稻品种中，编码bHLH和MYB转录因子的调节基因是功能缺失突变基因或在胚乳不表达，而内源OsWD40基因是功能型，因此需要转化导入外源相应基因ZmPl和ZmLc才能表达出转录因子复合体MBW；在内源结构基因中，编码DFR的基因为功能缺失突变，其它的在胚乳不表达或低水平表达；图B指示由导入的外源基因和被重建的MBW复合体激活的内源基因构成的花青素合成、修饰、和运转途径，黑色粗大箭头代表导入外源转基因表达后的酶催化反应，灰色粗大箭头代表由重建的转录因子复合体激活表达内源基因的酶催化反应，黑色细线小箭头代表内源功能基因在胚乳中低水平表达的酶催化反应，带×的虚线箭头代表内源功能基因在胚乳中不表达或内源基因功能缺失突变而不存在的酶催化反应，下划线指示的是5个绝对必要的外源基因及其表达的蛋白，其余的3个外源结构基因具有增强相应的酶催化反应的作用。

图2是多基因组装过程中(经7轮组装)产生的含有不同数目的目的基因的载体质粒的酶切检测结果图和多基因载体pYLTAC380MF-10G的结构示意图；其中，图A为Not I酶切检测结果图，图B为含8个花青素合成基因(SsCHS、SsCHI、SsF3H、SsF3’H、SsDFR、SsANS、ZmPl和ZmLc)和2个基因(HPT标记基因/Cre标记删除基因)的Marker-free结构的pYLTAC380MF-10G的结构示意图；1个基因，1G；2个基因，2G；如此类推。

图3是对导入pYLTAC380MF-10G的水稻转化体基因组DNA的8个外源基因片段的PCR检测结果图；CK+为多基因载体pYLTAC380MF-10G质粒；WT为野生型对照基因组DNA。

图4是以RT-PCR对pYLTAC380MF-10G水稻转化体的授粉后20天发育种子的8个外源基因的表达检测结果图。

图5是转pYLTAC380MF-10G水稻转化体的标记删除检测的原理示意图(A)与T1、T2代转化体标记删除的PCR检测结果图(B)及标记删除的测序鉴定结果图(C)。

图6是合成花青素的pYLTAC380MF-10G转化水稻后的表型图；其中，图A为糙米和精米的表型图，图B为糙米横切面的表型图；野生型为受体品种中花11。

图7是HPLC检测pYLTAC380MF-10G转化水稻种子的花青素鉴定结果图；其中，图A为不同花青素的标准样品的色谱图，图B为pYLTAC380MF-10G转化水稻株系#3种子的色谱图，图C为野生型(中花11)胚乳的色谱图，图D为定量分析结果图。

图8是半定量RT-PCR检测转化水稻和野生型种子(授粉后7天和14天)的内源基因和外源基因的表达结果图；其中，黑色粗体是外源表达的基因；灰色粗体是内源激活表达的基因；虚线方框表示完全无表达的内源基因，小写字母是功能缺失突变基因。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规分子生物学方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

表1实施例中各个名称引物对应的核苷酸序列

实施例1

本发明通过研究发现，要想在作物胚乳中合成花青素，必需要同时导入6个结构基因(CHS、CHI、F3H、F3’H、DFR和ANS)和2个调节基因(Pl和Lc)的组合来一起实现(图1)。根据以上研究基础，本实施例建立了一种在水稻胚乳中生产花青素的转基因育种方法，具体包括以下步骤：

S1.8个必需基因表达盒的构建：

S1.1.8个必需基因(SsCHS、SsCHI、SsF3H、SsF3’H、SsDFR、SsANS、ZmPl和ZmLc)编码区的克隆：根据CHS、CHI、F3H、F3’H、DFR、ANS这6个基因DNA序列高度保守特性，直接用RT-PCR方法，分别通过引物对P1/P2、P3/P4、P5/P6、P7/P8、P9/P10、P11/P12从彩叶草(Solenostemon scutellarioides(L.)Codd)叶片的cDNA中扩增得到SsCHS编码区、SsCHI编码区、SsF3H编码区、SsF3’H编码区、SsDFR编码区、SsANS编码区，将获得的6个基因编码区分别克隆到质粒载体pUC18上，测序获得如SEQ ID NO.1～6所示的DNA序列(依次对应前述6个基因编码区)；根据玉米ZmPl基因cDNA序列(GenBank No.NM_001112415)和玉米ZmLc基因cDNA序列(GenBank No.NM_001111869)，直接用RT-PCR方法，分别通过引物对P13/P14、P15/P16从紫色玉米叶片cDNA中扩增ZmPl编码区和ZmLc编码区，克隆到质粒载体pUC18，测序确定，序列分别如GenBank No.NM_001112415和GenBank No.NM_001111869所示。

S1.2.花青素合成必需的8个基因表达盒在多基因供给载体上的构建：

ZmPl基因表达盒pYL322d1-ZmPl构建：用引物Pd1-1/Pd1-2反向扩增多基因供给载体I(即pYLVS，见Lin et al.,2003,Efficient linking and transfer of multiplegenes by a multigene assembly and transformation vector system.Proc Natl AcadSci.,100:5962-5967；ZL02134869.3，多基因载体的构建方法与应用。下同)，获得载体骨架片段a；以抽提的水稻日本晴的基因组DNA为模板(下同)，用引物FensP1/RensP1扩增约2.3kb的水稻胚乳特异启动子(GenBank No.EU264107)，命名为ensP1(endosperm specificpromoter)，作为片段b；用引物F-Pl/R-Pl扩增ZmPl基因，作为片段c；参考质粒pSAT3(GenBank No.DQ005465)的甘露碱合成酶终止子(manopine synthase terminator)序列(简称Tmas终止子)，直接合成片段d(其中5’端具有与片段c的3’端重叠的序列CACGGCCGAGCAGCTTGTGTAG，3’端具有与载体骨架片段a的5’端重叠的序列GTCGACATGTACAAGCTTAGC)。每个片段两侧，分别带有20～25bp的重叠序列(引物表里的下划线，下同)，利用Gibson组装的原理(Gibson,2011,Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments. MethodsEnzymol.,498:349-361.下同)，按质粒载体多片段一步组装的方法(Zhu et al.,2014,Robust multi-type plasmid modifications based on isothermal in vitrorecombination.Gene,548:39-42.下同)，获得含3.5kb的ZmPl基因表达盒(图2中两个Not I位点之间)的多基因供给载体，命名为pYL322d1-ZmPl(用于第1轮组装)。

ZmLc基因表达盒pYL322d2-ZmLc构建：用引物Pd2-1/Pd2-2反向扩增多基因供给载体II(即pYLSV,见Lin et al.,2003；ZL02134869.3。下同)，获得载体骨架片段a；以水稻日本晴基因组DNA为模板，用引物FensP2/RensP2扩增约2.3kb的水稻胚乳特异启动子序列(GenBank No.AY427569)，命名为ensP2，作为片段b；用引物F-Lc/R-Lc扩增ZmLc基因，作为片段c；参考质粒pSAT3(GenBank No.DQ005465)的甘露碱合成酶终止子Tmas序列，直接合成片段d(其5’端具有与片段c的3’端重叠的序列CGCAAAGCTATAGGGAAGCGGTGA，3’端具有与载体骨架片段a的5’端重叠的序列GTCGACATGTACAAGCTTGC)。每个片段两侧，分别带有20～25bp的同源序列，利用Gibson组装的原理，按质粒载体多片段一步组装的方法，获得含4.5kb的ZmLc基因表达盒(图2中两个Not I位点之间)的多基因供给载体，命名为pYL322d1-ZmLc(用于第2轮组装)。

SsF3H基因表达盒pYL322d1-SsF3H构建：用引物Pd1-1/Pd1-2反向扩增多基因供给载体I(Lin et al.,2003；ZL02134869.3)，获得载体骨架片段a；以水稻日本晴基因组DNA为模板，用引物FensP3/RensP3扩增约1.5kb的水稻胚乳特异启动子序列(GenBankNo.AY427571)，命名为ensP3，作为片段b；用引物F-F3H/R-F3H扩增SsF3H基因，作为片段c；用引物F-T35S/R-T35S从质粒pCAMBIA1300(CAMBIA公司，GenBank No.AF234296.1)扩增CaMV 35S终止子T35s作为片段d。每个片段两侧，分别带有20～25bp的同源序列，利用Gibson组装的原理，按质粒载体多片段一步组装的方法，获得含2.8kb的SsF3H基因表达盒的多基因供给载体pYL322d1-SsF3H(用于第3轮组装)。

SsCHI基因表达盒pYL322d2-SsCHI构建：用引物Pd2-1/Pd2-2反向扩增多基因供给载体II(Lin et al.,2003；ZL02134869.3)，获得载体骨架片段a；以水稻日本晴基因组DNA为模板，用引物FensP4/RensP4扩增约1kb的水稻胚乳特异启动子序列(GenBankNo.AY427575)，命名为ensP4，作为片段b；用引物F-CHI/R-CHI扩增SsCHI基因，作为片段c；参考质粒pSAT1(GenBank No.DQ005461)章鱼碱合成酶终止子(OCS terminator)，简称Tocs终止子，直接合成Tocs序列作为片段d(其5’端具有与片段c的3’端重叠的序列GGACTTGCTGAAGCAGACATGA，3’端具有与载体骨架片段a的5’端重叠的序列GTCGACATGTACAAGCTTGC)。每个片段两侧，分别带有20～25bp的同源序列，利用Gibson组装的原理，按质粒载体多片段一步组装的方法，获得含3.7kb的SsCHI基因表达盒的多基因供给载体pYL322d1-SsCHI。

SsDFR基因表达盒构建进入pYL322d2-SsCHI获得pYL322d2-SsCHI/SsDFR:以水稻日本晴基因组DNA为模板，用引物FensP5/RensP5扩增约2.3kb的水稻胚乳特异启动子(GenBank No.EU264106)，命名为ensP5，作为片段a；用引物F-DFR/R-DFR扩增SsDFR基因，作为片段b；参考质粒pSAT7(GenBank No.DQ005453)直接合成农杆碱合成酶终止子(agropinesynthase terminator)，简称Tags终止子，再用引物F-Tags/R-Tags扩增作为片段c。上述3个片段间具有20～25bp的同源序列，混合上述片段作为模板，用引物F-DFR-A/R-DFR-A做重叠PCR扩增，直接拼接成2.5kb的ensP5-SsDFR-Tags表达盒，两侧加Asc I酶切位点；最终用Asc I酶切连入pYL322d2-SsCHI载体的相同位点，获得具有两个基因表达盒的多基因供给载体pYL322d2-SsCHI/SsDFR(用于第4轮组装)。

SsANS基因表达盒pYL322d1-SsANS构建：用引物Pd1-1/Pd1-2反向扩增多基因供给载体I(pYLVS，见Lin et al.,2003；ZL02134869.3)，获得载体骨架片段a；以水稻日本晴基因组DNA为模板，用引物FensP6/RensP6扩增0.64kb的水稻胚乳特异启动子(GenBankNo.D63901)，命名为ensP6，作为片段b；用引物F-ANS/R-ANS扩增SsANS基因，作为片段c；参考质粒pSAT2(GenBank No.DQ005463)对应序列，直接合成胭脂碱合成酶终止子(nopalinesynthase terminator)，简称Tnos终止子，作为片段d(其5’端具有与片段c的3’端重叠的序列CCAAACGAGGATGAATCTAATTAA，3’端具有与载体骨架片段a的5’端重叠的序列GTCGACATGTACAAGCTTAGC)。每个片段两侧，分别带有20～25bp的同源序列，利用Gibson组装的原理，按质粒载体多片段一步组装的方法，获得含2.0kb的SsANS基因表达盒的多基因供给载体pYL322d1-SsANS(用于第5轮组装)。

SsF3’H基因表达盒pYL322d2-SsF3’H构建：用引物Pd2-1/Pd2-2反向扩增多基因供给载体II(Lin et al.,2003；ZL02134869.3)，获得载体骨架片段a；用引物FensP7/RensP7、水稻日本晴基因组DNA为模板，扩增约0.8kb的水稻胚乳特异启动子序列(GenBankNo.AY427572)，命名为ensP7，作为片段b；用引物F-F3’H/R-F3’H扩增SsF3’H基因，作为片段c；参考质粒pSAT6(GenBank No.DQ005473)对应序列，直接合成核糖体小亚基终止子(rubisco small subunit terminator)，简称Trbc终止子，作为片段d(其5’端具有与片段c的3’端重叠的序列CATGTTTATGAAGCT CAAGCTTGA，3’端具有与载体骨架片段a的5’端重叠的序列CGAGCTAGCGGCCGCAT GCATCGAT)。每个片段两侧，分别带有20～25bp的同源序列，利用Gibson组装的原理，按质粒载体多片段一步组装的方法，获得含3.3kb的SsF3’H基因表达盒的多基因供给载体pYL322d1-SsF3’H。

SsCHS基因表达盒构建进入pYL322d2-SsF3’H获得pYL322d2-SsF3’H/SsCHS:以水稻日本晴基因组DNA为模板，用引物FensP8/RensP8扩增0.9kb的水稻胚乳特异启动子序列(GenBank No.AY427574)，命名为ensP8，作为片段a；用引物F-CHS/R-CHS扩增SsCHS基因，作为片段b；参考质粒pSAT3(GenBank No.DQ005465)的甘露碱合成酶终止子Tmas序列，直接合成，再用引物F-Tmas/R-Tmas扩增作为片段c作为片段c。上述片段间具有20～25bp的同源序列，混合上述片段作为模板，用引物F-CHS-A/R-CHS-A做重叠PCR方式扩增，直接拼接成2.4kb的ensP8-SsCHS-Tmas表达盒，两侧加Asc I酶切位点；最终用Asc I酶切连入pYL322d2-SsCHS载体的相同位点，获得具有两个基因表达盒的多基因供给载体pYL322d2-SsF3’H/SsCHS(用于第6轮组装)。

S1.3.含2个基因的Marker-free结构构建：

用引物F-322-S/R-322-B反向扩增质粒pCAMBIA1300，获得的两端具有Sac I和BamH I位点的pBR322复制子，与直接商业合成的含Gateway重组位点片段Sac I/attP1/NotI/loxP/Asc I/Fse I/Hind III/loxP/attP2/BamH I(序列如下)，用Sac I和BamH I双酶切后连接，获得中间载体MF-1；用引物F-HPT-A/R-HPT-A从质粒pCAMBIA1300直接扩增获得两端具有Asc I位点的2.1kb的抗潮霉素基因HPT的表达盒，Asc I单酶切连接入中间载体MF-1的相同位点，获得中间载体MF-2；以水稻中花11基因组DNA为模板，用引物F-V4/R-V4直接PCR扩增水稻花药特异表达基因(基因号Os04g0604000)启动子PV4作为片段a、参考Cre酶基因序列(GenBank No.DQ340306)直接合成Cre基因，以其为模板，再用引物F-Cre/R-Cre直接PCR扩增，获得片段b，参考质粒pSAT2(GenBank No.DQ005463)对应序列、合成Tnos终止子，用引物F-nos/R-nos进行PCR，获得片段c，上述片段具有20～25bp同源序列，混合上述片段作为模板，用引物F-MF-F/R-MF-H做重叠PCR直接拼接出两侧具有Fse I和Hind III位点的约3.2kb的Cre标记删除基因表达盒；用Fse I和Hind III双酶切Cre标记删除基因表达盒、连接进入相同位点的中间载体MF-2，获得含HPT标记基因和Cre标记删除基因的Marker-free结构载体MF-HPT-Cre(用于第7轮组装)。

合成的含Gateway重组位点的片段序列：

ATCACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGAA

GTCATAACTTCGTATAGCA TACATTATACGAAGTTAT

AT

ATC

ATAACTTCGTATAGCATACATTATAC GAAGTTATGACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTGGT

(方框表示酶切位点，下划线为对应位点)。

S2.水稻胚乳特异合成花青素的多基因载体pYLTAC380MF-10G的组装：多基因载体系统是由1个基于可转化人工染色体(TAC)的接受载体质粒pYLTAC747和2个装载基因的供给载体I质粒pYLVS和供给载体II质粒pYLSV组成，利用Cre/loxP位点特异重组方法，使不同的供给载体交替地和接受载体进行2轮以上的基因组装，构建多基因载体(Lin et al.,2003；ZL02134869.3)。

S2.1.ZmPl基因表达盒的组装(第1轮)：将供给载体pYL322d1-ZmPl质粒与接受载体TAC质粒混合，用Bio-red GenePulser Xcell电激仪(参数为Voltage：1600V，Charge：fast，voltage booster resistance：200Ω，capacitance：25μF)转化表达Cre酶的大肠杆菌菌株NS3529(Lin et al.,2003)感受态细胞，在卡拉霉素(25mg/L)和氯霉素(15mg/L)的双抗LB平板(下同)上筛选转化子，利用NS3529内源表达的Cre酶，实现供给载体质粒重组和供给载体骨架的删除。洗下双抗平板上的混合菌落混抽质粒，再用I-SceI酶切消除未重组的质粒后，转化不含Cre基因的大肠杆菌DH10B，在卡拉霉素平板上鉴定获得含1个基因的TAC载体质粒，命名为pYLTAC380GW-1G。

S2.2.ZmLc基因表达盒的组装(第2轮)：将供给载体pYL322d2-ZmLc质粒与步骤S2.1构建的含ZmPl基因表达盒的接受载体pYLTAC380GW-1G质粒混合，电激转化NS3529感受态细胞，在卡拉霉素(25mg/L)和氨苄霉素(70mg/L)双抗LB平板(下同)上筛选转化子，利用NS3529内源表达的Cre酶，实现供给载体质粒重组和供给载体骨架的删除。洗下双抗平板上的混合菌落混抽质粒，再用PI-SceI酶切切断未重组质粒后，转化大肠杆菌DH10B，在卡拉霉素平板上鉴定获得含2个基因的载体pYLTAC380GW-2G。

S2.3.SsF3H基因表达盒的组装(第3轮)：将供给载体pYL322d1-SsF3H质粒与步骤S2.2获得的含2个目的基因的接受载体pYLTAC380GW-2G质粒混合，共同电激转化表达Cre酶的大肠杆菌菌株NS3529感受态细胞，在卡拉霉素和氯霉素双抗平板上筛选转化子，利用NS3529内源表达的Cre酶，实现供给载体质粒重组和其骨架的删除，洗下双抗平板上的混合菌落混抽质粒，再用I-SceI酶切消除未重组质粒后，转化DH10B，在卡拉霉素平板上鉴定获得含3个基因的载体pYLTAC380GW-3G。

S2.4.SsCHI基因表达盒和SsDFR基因表达盒的双基因组装(第4轮)：将含SsCHI基因和SsDFR基因的供给载体pYL322d2-SsCHI/SsDFR质粒与步骤S2.3获得的含3个基因的接受载体pYLTAC380GW-3G质粒混合，电激转化NS3529感受态细胞，在卡拉霉素和氨苄霉素双抗平板上筛选转化子，利用NS3529内源表达的Cre酶，实现供给载体质粒重组和其骨架的删除。洗下双抗平板上的混合菌落混抽质粒，再用PI-SceI酶切消除未重组质粒后，转化大肠杆菌DH10B感受态细胞，在卡拉霉素平板上鉴定获得含花青素合成必需的5个基因的多基因载体pYLTAC380GW-5G。

S2.5.SsANS基因表达盒的组装(第5轮)：将供给载体pYL322d1-SsANS质粒与步骤S2.4获得的含5个目的基因的接受载体pYLTAC380GW-5G质粒混合，电激转化表达Cre酶的大肠杆菌菌株NS3529感受态细胞，在卡拉霉素和氯霉素双抗平板上筛选转化子，利用NS3529内源表达的Cre酶，实现供给载体质粒重组和供给载体骨架的删除。洗下双抗平板上的混合菌落混抽质粒，再用I-SceI酶切消除未重组的质粒后，转化不含Cre基因的大肠杆菌DH10B，在卡拉霉素平板上鉴定获得含6个基因的多基因载体pYLTAC380GW-6G。

S2.6.SsF3’H基因表达盒和SsCHS基因表达盒的双基因组装(第6轮)：将含SsF3’H基因和SsCHS基因的供给载体pYL322d2-SsF3’H/SsCHS质粒与步骤S2.5获得的含6个基因的接受载体pYLTAC380GW-6G质粒混合，电激转化NS3529感受态细胞，在卡拉霉素和氨苄霉素双抗平板上筛选转化子，利用NS3529内源表达的Cre酶，实现供给载体质粒重组和其骨架的删除。洗下双抗平板上的混合菌落混抽质粒，再用PI-SceI酶切消除未重组质粒后，转化DH10B，在卡拉霉素平板上鉴定获得含花青素合成必需的8个基因的多基因载体pYLTAC380GW-8G。

S2.7.Marker-free结构载体的组装(第7轮)：

将含HPT标记基因和Cre标记删除基因的pBR322-HPT-Cre质粒与步骤S2.6获得的含8个花青素合成必需基因的接受载体pYLTAC380GW-8G质粒混合，加入Gateway反应的BP混合酶，25℃反应5小时，再直接电激转化DH10B感受态细胞，在卡拉霉素，在卡拉霉素平板上鉴定获得含10个基因的多基因载体pYLTAC380MF-10G(图2)。

S3.多基因载体pYLTAC380MF-10G的水稻转化与检测

水稻的遗传转化：把多基因载体pYLTAC380MF-10G质粒转入农杆菌EHA105，用于转化水稻胚愈伤组织。将水稻品种中花11未成熟种子或成熟种子，在25℃黑暗条件下诱导愈伤组织(Nishimura et al.2006,A protocol for Agrobacterium-mediatedtransformation in rice.Nat Protoc.，1:2796-2802。下同)。用适量的转有多基因载体质粒的农杆菌悬浮于加有100μmol/L乙酰丁香酮的侵染液培养基中，28℃震荡培养(200rpm，0.5h)，用分光光度计调OD550值为0.3～0.4，即可用于愈伤组织的浸染。挑选颜色新鲜呈淡黄色、生长旺盛的颗粒状胚性愈伤组织，和农杆菌菌液混合，浸泡20min，吸干菌液后转到共培养培养基(2N6-AS培养基)(Nishimura，et al.,2006)，暗培养3天后，转移到含50mg/L潮霉素的筛选培养基(N6D-S培养基)(Nishimura，et al.,2006)上，每2周继一次代，继代2次。抗性筛选后，把带有绿点的抗性愈伤转到有分化培养基上，分化出转化苗，获得转化植株。

S3.1.转化植株基因组PCR检测：对获得的T0代植株叶片，用SDS法抽提基因组DNA作为模板，用引物F-SsCHS/R-SsCHS、F-SsCHI/R-SsCHI、F-SsF3H/R-SsF3H、F-SsF3’H/R-SsF3’H、F-SsDFR/R-SsDFR、F-SsANS/R-SsANS、F-ZmPl/R-ZmPl和F-ZmLc/R-ZmLc分别PCR扩增，检测外源SsCHS(约398bp)、SsCHI(约336bp)、SsF3H(约529bp)、SsF3’H(约403bp)、SsDFR(约466bp)、SsANS(约400bp)、ZmPl(497bp)和ZmLc(约485bp)八个基因。所用扩增程序：94℃预变性4min；94℃变性30sec，58℃褪火30sec，72℃延伸30sec，共30个循环；最后72℃再延伸5min。结果显示，野生型(WT)对照都不能扩出外源基因，转基因植株都能扩出上述8个基因(图3)。

S3.2.转基因植株T1种子的RT-PCR检测：把转基因植株的T1代授粉后20天呈现紫色的发育种子，液氮条件下研磨成粉，再用Trizol方法抽提种子的总RNA，用MMV逆转录试剂盒，oligDT引物反转录为cDNA作为模板，用与S3.1.相同的检测引物分别进行外源SsCHS、SsCHI、SsF3H、SsF3’H、SsDFR、SsANS、ZmPl和ZmLc的RT-PCR检测，用引物F-Actin1/R-Actin1扩增水稻内源Actin 1基因(约480bp)作为内参。除Actin 1引物外，其余基因检测引物和扩增条件同S3.1.的检测条件，只是PCR循环数改为25个循环。结果显示，对照野生型种子不能扩出外源基因，紫色的转基因种子能扩增出特异的正确条带，外源基因在种子中均能表达(图4)。

S3.3.转基因植株标记删除鉴定：

对获得的T1代植株叶片，用SDS法抽提基因组DNA作为模板，用PCR扩增方法，检测标记基因删除情况。用引物Fm1、R1、R2同时进行三引物PCR扩增；其中R1位于HPT基因编码区内测，与Fm1扩增产物约550bp；Fm1和R2位于两个loxP位点外侧，当没发生片段删除时距离约5.4kb，在30sec延伸条件下是不能扩增出目标片段的，而只有当发生片段删除时，才能扩增约300bp的小片段。所用引物请见表1，所用扩增程序：94℃预变性4min；94℃变性30sec，58℃褪火30sec，72℃延伸30sec，共30个循环；最后72℃再延伸5min。结果显示，T1代植株大多发生了预期的部分标记删除，T2代植株能获得预期的标记基因删除纯合体；对300bp的PCR产物直接测序，结果表明该片段序列与预期的标记删除后产生的序列完全一致，证明获得了无标记(Marker-free)的转基因植株(图5)。

实施例2

转基因水稻胚乳中花青素的外观和高效液相色谱检测：

转基因水稻胚乳中花青素的观察：在导入上述8个基因的转基因水稻种子糙米比野生型糙米颜色明显加深，加工成精米(去除种皮)后，其整个种子呈现出深的紫黑色；其不同横切面观察，显示整个胚乳内部也为紫黑色(胚为正常黄白色)，表明花青素特异在转基因水稻的胚乳合成(图6)。

转基因水稻种子花青素的提取与高效液相色谱(HPLC)鉴定：取转基因材料和野生型对照的水稻种子各0.1g，研磨成粉末，加入1毫升酸化甲醇(甲醇：水：HCl＝85:12:3)，在4℃，黑暗条件下提取8h；12000g，4℃离心15min，收集并用直径为0.45mm的Millipore滤头过滤上清液作为样品。使用HP1200-DAD高效液相色谱系统(AgilentTechnologies,Waldbronn,Germany)对样品在520nm(mAU520)对花青素进行分析。色谱条件为使用NUCLEODURH C18色谱柱(250mm×4.60mm)(Pretech Instruments,Sollentuna,Sweden)，柱温为40℃，流动相流速为1mL/min，流动相包括溶液A(1.6％甲酸甲醇溶液)与溶液B(1.6％甲酸水溶液)两种。洗脱程序为:0-5min时，15％A和85％B；5-10min时，20％A和80％B；10-28min时，28％A和72％B；28-32min时，40％A和60％B；32-40mi时，0％A和100％B；花青素HPLC纯标样矢车菊-3-O-葡萄糖苷(Cyanidin 3-O-glucoside，C3G)、芍药色素-3-O-葡萄糖苷(Peonidin 3-O-glucoside，P3G)、天竺葵-3-O-葡萄糖苷(Pelargonidin 3-O-glucoside,Pel3G)和矢车菊-3，5,-二葡萄糖苷(Cyanidin-3,5-diglucoside，C35G)购自Sigma公司，并作为对照。绘制花青素标样C3G和P3G标准曲线对水稻种子样本中花青素做定量分析。结果显示，转基因水稻种子具有与花青素标样C3G和P3G相同的特征峰，表明在转基因水稻种子中成功合成了C3G和P3G两种花青素，总含量可达1mg/g(图7)。

实施例3

转基因水稻和野生型种子(授粉后7天和14天)的内源基因和外源基因的半定量RT-PCR表达检测：

转基因植株T3代种子的半定量RT-PCR检测：把转基因植株和野生型对照授粉后7天和14天的种子，液氮条件下研磨成粉，再用Trizol方法抽提种子的总RNA，用MMV逆转录试剂盒，oligDT引物反转录为cDNA模板，用与实施例1步骤S3.1.和S3.2.相同的引物对8个外源基因SsCHS、SsCHI、SsF3H、SsF3’H、SsDFR、SsANS、ZmPl和ZmLc和水稻内源Actin 1基因(内参)进行半定量RT-PCR检测；用引物F-OsC1/R-OsC1、F-OsB1/R-OsB1、F-OsB2/R-OsB2、F-OsRc/R-OsRc、F-OsWD40/R-OsWD40、F-OsCHS/R-OsCHS、F-OsCHI/R-OsCHI、F-OsF3H/R-OsF3H、F-OsF3’H/R-OsF3’H、F-OsDFR/R-OsDFR、F-OsANS/R-OsANS、F-Os3GT/R-Os3GT、F-OsA3’MT/R-OsA3’MT、F-OsGSTU/R-OsGSTU、F-OsMRP15/R-OsMRP15和F-OsAnP/R-OsAnP对16个相关内源基因OsC1、OsB1、OsB2、OsRc、OsWD40、OsCHS、OsCHI、OsF3H、OsF3’H、OsDFR、OsANS、Os3GT、OsA3’MT、OsGSTU、OsMRP15和OsAnP分别进行半定量RT-PCR检测；扩增条件同实施例1步骤S3.1，只是PCR循环数改为22个循环。结果显示(图8)，外源基因只在转基因种子中强表达；内源基因在野生型种子中大多不表达或表达极低，在转基因植株中外源调节基因只能激活部分结构基因，激活修饰基因和转运基因表达；当外源基因与外源基因激活的内源基因共同表达时，才能在胚乳中实现花青素的合成。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 华南农业大学

<120> 一种在作物种子胚乳合成花青素的转基因育种方法

<130> 2

<160> 134

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1173

<212> DNA

<213> Solenostemonscutellarioides (L.) Codd

<400> 1

atggtgaccg tggaggacat ccgccgggct caacgggccg agggtccggc caccgtcttg 60

gcgattggca cctccacccc ctccaactgc gtcgaccaga gcacctatcc tgactactac 120

ttccgtatca ctaacagcga gcataagact gatctcaagg aaaaattcaa gcgcatgtgc 180

gagaaatccg tgataagaaa acgctacatg cacctgacgg aggagttcct gaaggagaat 240

ccgaacatga cggcgtacat ggcgccgtcg ctggacgcgc ggcaggacat cgtggtggta 300

gaggtgccga agctggggaa agaggcggcg cagaaggcca tcaaggaatg ggggcagccc 360

aaatccaaga tcacccacct agttttctgc accaccagcg gcgtagacat gccaggcgcc 420

gactaccagc tcaccaagtt gctcggcctg cgcccctccg tcaagcggtt catgatgtac 480

cagcagggct gcttcgccgg cggcactgtc ctccgcatgg ccaaggattt ggccgagaac 540

aacgccggcg ctagggtttt ggtcgtctgc tccgagatca ccgccgtcgc tttccgcggc 600

cccagcgata gtcatctcga cagcctggta ggccaggctc tgttcggcga cggagcggca 660

gccgtgatcg taggctccga ccccgtagtt ggggtggagc ggcctctctt ccagctcgtc 720

tcggcggcgc agacgattct gcccgacagc gacggcgcga tcgacgggca cttgcgagaa 780

gtggggctga ccttccatct cctgaaagat gtaccgggcc taatctcgaa gaacatcgag 840

aaaagcttga aggaggcatt tgggcctttg gggattacgg attggaattc ggttttctgg 900

attgcgcatc ccggcgggcc cgcgatatta gatcaggtgg aggcgaagct gcgcctgacg 960

ccggagaaac tacggtccac gcgccacgtg ttgagtgagt acggcaacat gtcgagtgcg 1020

tgcgtgctgt ttatattgga tgagatgagg aagacgtccg ccaaggaggg gctgaactcc 1080

accggagagg ggctggattg gggggtgctc ttcggcttcg ggccgggcct cacggtggag 1140

acggtggtgc ttcacagtgt tcctcttaat taa 1173

<210> 2

<211> 657

<212> DNA

<213> Solenostemon scutellarioides (L.) Codd

<400> 2

atgtctacac cgccgtctgt cagcgaaatt caagtggaat ccgtagtgtt tccgccggcg 60

gtgaagccac cgggctccga taagacgttg ttccttggtg gcgcagggga aagagggttg 120

gagatagaag gaaagttcgt caagttcacg gccattggtg tttacttgga gggaagctcc 180

gtcgcagcgc tcgccgttaa gtggaagggc aagacagccg acgaattggc cgactccaac 240

gacttcatcg ccgaaatcat cactggacca tttgagaaat tgacgaaggt gacgatgata 300

ctgccattaa cggggcagca atactcagag aaagtagcag aaaactgcac tgcttattgg 360

aaagcagttg gaaaatacac tgaagcagag agtgaagcaa tcgagaaatt tcttcaaatc 420

ttcaaagatg agacctttcc acctagagca tcaatcctct tcactcaatc accaaccggc 480

tcactcacaa ttgccttccc caaggatggt tctgttccag agcaggggaa ggctgtgata 540

cagaacaaac tgctagcaga ggcgatcctc gagtcgatca tcgggaagca cggcgtgccc 600

cctacagcaa ggaagagctt ggctacaagg gtatcggact tgctgaagca gacatga 657

<210> 3

<211> 1092

<212> DNA

<213> Solenostemon scutellarioides (L.) Codd

<400> 3

atggctcttc taggaattga cgagaggtcc ctccacccca agttcatcag agacgaagat 60

gagaggccta aggtggccta cgaccaattc agcaacgaca ttccagtgat atcgctggcc 120

gggatcgacg acgagagcgg tggcaggagg gcggaggtgt gccgccggat agtggcgacg 180

tgtgaggatt ggggtatttt ccaggtggtg gatcatgggg tggagtcgac ggtggtggaa 240

aaaatgaata gtttagctcg agaattcttc gcattgccct ctcacgacaa gcttcggttt 300

gatatgtctg gcggtaagaa gggtggtttc atcgtctcca gtcaccttca gggagaagca 360

gtgcaagact ggcgcgaaat cgtgacatat ttctcatatc cggtggcgga gcgggactac 420

tcgaggtggc cggacaagcc ggaggggtgg cggcgcgtga cggaggcgta cagtgcgcag 480

ctgatggggt tggcgtgcag attgctgggg atattatcag aggcgatggg tcttgaaaag 540

gaggcactgt cgaaagcttg cgtggatatg gatcagaaaa tagtggtgaa cttctacccg 600

aaatgcccgc aacccgacct caccttgggt ttgaagcggc acacggatcc gggtctgatc 660

actctccttc tccaagatca agtggggggg ctccaggcga cccgggacgg cgggaagacg 720

tggatcacgg ttcaacccgt ggagggggct tttgtggtca atcttggtga ctttggccac 780

tacctgagca atgggaggtt caagaacgca gaccatcaag cagtggtgaa ctcaaaaagc 840

agcagattat cgatagcaac gttccaaaac ccggcgccca atgcgaaggt gtatccactg 900

aggatgaggg aaggggagac ggcgttgatg gaggaggcga ttacattctc ggagatgtac 960

aagaggaaga tggccaagga tcttgagctt gcacggatca agaagctcgc cagccagaac 1020

cacaagaaga agcttctaga acctcaaaac actactaccg gtcttaagca catgaacatg 1080

aatctcgctt ga 1092

<210> 4

<211> 1524

<212> DNA

<213> Solenostemon scutellarioides (L.) Codd

<400> 4

atggctgcca tcatcgcatg cactttcgtt ttagggttca tcgttcactt tttcttccga 60

acacggcagg gccggcggct gcctccgggg cctaggccgt ggccgattct tggaaacctt 120

ccgcagctag ggcggaagcc ccaccaatcg atggcggcct tggcccaggt tcatggcccc 180

ctgatgcatc tgaagatggg gtttgtgcat gttgtggtgg ctgcctccgc tagcgtggcg 240

gagcagttgt tgaaggagca cgacaccaat ttcttgagcc ggccgccgaa ctccggcgcc 300

gagcacgttg cttacaacta ccacgatttg gtttttgcgc cgtacggccc gcggtggcgg 360

ctgcttagga aggtttgtgc cgtccacctc ttctccgcca aagccttgga tgacttccgc 420

catgttagac agggagaggt gggaaacttg attcatagtg tagcaagtgt gggagaaaag 480

cacgtgagta taggccaaat ggtgcacgtg tgcgctacaa acgcaatatc gcgcgtgatg 540

ttagggcggc gcgtgttagg ccacggcgaa ggtggcgaga cggcggcgga ggatttcaag 600

tcgatggtgg aggaactgat ggagctggcc ggagtattca acatcggcga tttcattccg 660

ccgctcaagg ggttggactt gcagggagtg gtggtaaaga tgaagaaact gcatcagcgt 720

ttcgacgatt tcttcggcgc tatccttgat gagcaccaga tccacggctc tgatggccaa 780

gccgatttac tcagcacgtt gatttctctg aaagacgtcg acgacagtgg tgagggagga 840

aagctcaccg acattgaaat caaagccctg ctcttgaatt tattcacggc aggaactgat 900

acaacagcta gtaccgtgga gtgggccata gcggaactcc tccgcaaccc taacatcatg 960

agtcgagctc aaaacgagct cgactcgata gtaggcaagg accggctcgt taccgaatcg 1020

gatctagctc aattgacatt cctccaagcc ataatcaagg agaactttcg cctccatcct 1080

tccaccccac tctccctacc aagaatcgct aaagaaaact gcgagatcaa cggctacttc 1140

attcctaaag attccacgct tctcgtcaac gtgtgggcca tctctcgcga tccgaatgta 1200

tgggcagatc cactggagtt tcggcccgaa cgattcttga gtggcgggga gaggccgaat 1260

gctgatgtga gaggaaatga tttcgagttg attccgtttg gggcgggccg tagaatttgt 1320

gcgggaatga gtttaggaat acgaatggtg cagctgttgg ttgcttcttt gattcatgca 1380

tttgatttcg aattggctga tgggaagtcg ggccgagatc ttaacatgga ggaggcttat 1440

gggttgacgt tgcaacgggc cgagccgttg gtggttcggg ccaggcctag gttggcccga 1500

catgtttatg aagctcaagc ttga 1524

<210> 5

<211> 1101

<212> DNA

<213> Solenostemon scutellarioides (L.) Codd

<400> 5

atgtctccgg cgccccctcc agccaccacc gtatgcgtta ccggagcgtc cggcttcatc 60

gggtcatggc tagtcatgag acttcttgaa cggggttaca ttgttcgtgc aactgttcgt 120

gatcctgaga acttgaagaa ggttaaacac ctaacggagt tgccaagagc cgataccaac 180

ttgacactgt ggaaagcaga tatgaacaca gaggggagct acgatgaagc tgtccaaggt 240

tgtattgggg tgtttcacat ggccacgccc atggatttcg agtcggacga ccctgagaat 300

gaagtgatca aacctacagt tgatggaatg atgagcataa tgagatcatg tgccaaagcc 360

aagactgtga agaaactgat attcacaaac tcagctggga ctttgaatgt tgaggaacac 420

cagaaaccag tctacgacga aacgaattgg agtgatctgg atttcatata ctccaagaaa 480

atgactggat ggatgtattt cgtgtcgaag atcttagctg agaaagcagc aatggaagca 540

gctaaacagg ataacatcaa cttcatcagc atcataccac cagtggtggt tggtccattc 600

ttcatgccca cattcccacc tagtttaatc acagctctct cccccattac agggaatgat 660

gctcactact ctatcataaa gcaaggacaa tttgtccatg tagatgatct ctgtgaggct 720

catatattcc tgtttgaaca ccctaaagca gaagggagat acatatgttc ctcacatgat 780

gcaaccattt acgatatagc agatatgctg agagaaaaat ggccggaata tcacatccca 840

actcagtttg aaggtattga caaggacata cccgtggtga gattctcctc caagaaattg 900

gtggaaatgg ggttttcatt caagtactcc ttggaggaca tgtttagaga agccattgat 960

agctgcagag agaaggggtt tctgccgttt gatactcaaa tccacaacaa tggagaaaat 1020

aaagaatcca ttttgagttc ccaggaaaag cattccaaca tcactgacaa tcaagaaaaa 1080

gagttgcttc caaattctta a 1101

<210> 6

<211> 1101

<212> DNA

<213> Solenostemon scutellarioides (L.) Codd

<400> 6

atggttgcta caatagctcc aagcccgcgg gtggaggagc tggcccgaag ggggctggac 60

acaatcccaa aagactatat tcggcccgaa gaagagttga aaagcatcgg cgacattttc 120

gcagaagaaa agagcatcga cgggccggag gtgccgacga tcgatcttgc agagatcgat 180

tcatcagacg aggaaaggcg gaggaaatgc cacgacgagc tgaaaaaggc cgccgaggac 240

tggggggtga tgtacgtgat caaccatggt ataccggagg agctcatcag ccgcgtcaag 300

gccgccggga aggagttttt cgagctgccg gtggaggaga aggagaagca cgccaacgac 360

caggcggcgg ggaacgtgca gggctacggc agcaagctgg cgaacaacgc cagtgggcag 420

ctggagtggg aggactattt cttccactgt gtttttccgg aggagaagag ggagttgtcg 480

atttggccgc aaaatccacc tgattatata ccggcaacta gcgagtatgc aaaacagctg 540

cgaggcctaa caaccaagat actatcagtc ctatcactcg ggctgggatt ggaagaaggc 600

agactagaga aagaagttgg tggcatggag gatctaatcc tccaaatgaa aataaacttc 660

tacccgaaat gccctcagcc ggagctcgcc ctcggcgtcg aagcccatac cgatgttagt 720

gctctcacct tcatcctcca caacatggtc cccggcctcc agctcttcta cgagggcaaa 780

tgggtcactg caaaatgcgt gcccaactcc atcatcatgc acgtcggcga caccatcgag 840

attctgagca acggcaaata caagagcatt ctgcacaggg gtctcgtcaa caaggagaag 900

gtcaggattt cttgggcggt tttctgtgag ccgcccaagg agaaaatcgt cctccagcca 960

ctaccggaga ccgtctccga ggcagagccg ctgcgcttcc cgccgcgtac gtttgctcag 1020

catctcaagc acaagctatt taggaagagt gacactgagg ttgacgagaa gaagaagcca 1080

aacgaggatg aatctaatta a 1101

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P1

<400> 7

atggtgaccg tggaggacat cc 22

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P2

<400> 8

ttaattaaga ggaacactgt g 21

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P3

<400> 9

atgtctacac cgccgtctgt c 21

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P4

<400> 10

tcatgtctgc ttcagcaagt cc 22

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P5

<400> 11

atggctcttc taggaattga c 21

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P6

<400> 12

tcaagcgaga ttcatgttc 19

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P7

<400> 13

aatggctgcc atcatcgcat gc 22

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P8

<400> 14

tcaagcttga gcttcataaa catg 24

<210> 15

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P9

<400> 15

atgtctccgg cgccccctcc agccac 26

<210> 16

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P10

<400> 16

ccttaagaat ttggaagcaa ctc 23

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P11

<400> 17

atggttgcta caatagctcc 20

<210> 18

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P12

<400> 18

ttaattagat tcatcctcgt ttgg 24

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P13

<400> 19

atgggcagga gggcgtgctg 20

<210> 20

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P14

<400> 20

ctacacaagc tgctcggccg tg 22

<210> 21

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P15

<400> 21

atggcgcttt cagcttcccg agttc 25

<210> 22

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P16

<400> 22

tcaccgcttc cctatagctt tgcga 25

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Pd1-1

<400> 23

tcgacatgta caagcttagc 20

<210> 24

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Pd1-2

<400> 24

gtaggcgcgc ctctcgagct ag 22

<210> 25

<211> 53

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> FensP1

<400> 25

ctagctcgag aggcgcgcct acgttcaaga tttatttttg gtatttaatt tac 53

<210> 26

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> RensP1

<400> 26

gcagcacgcc ctcctgccca tagttattca cttagtttcc cactgctc 48

<210> 27

<211> 46

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> F-Pl

<400> 27

gcagtgggaa actaagtgaa taactatggg caggagggcg tgctgc 46

<210> 28

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> R-Pl

<400> 28

gccaacatgg gagtccaaga ttctacacaa gctgctcggc cgtg 44

<210> 29

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Pd2-1

<400> 29

cgagctagcg gccgcatgca t 21

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Pd2-2

<400> 30

gtcgacatgt acaagcttgc 20

<210> 31

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> FensP2

<400> 31

gaacgggaag ctgaaagcgc catagctatt tgtacttgct tatgg 45

<210> 32

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> RensP2

<400> 32

atgcatgcgg ccgctagctc gtcacctcac ttccgcccat gacc 44

<210> 33

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> F-Lc

<400> 33

tcgtcgacat gtacaagctt atcaccgctt ccctatagct ttgcgaag 48

<210> 34

<211> 46

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> R-Lc

<400> 34

ttccataagc aagtacaaat agctatggcg ctttcagctt cccgag 46

<210> 35

<211> 43

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> FensP3

<400> 35

ctagctcgag aggcgcgcct actacagggt tccttgcgtg aag 43

<210> 36

<211> 43

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> RensP3

<400> 36

gtcaattcct agaagagcca tagctatttg aggatgttat tgg 43

<210> 37

<211> 43

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> F-F3H

<400> 37

ccaataacat cctcaaatag ctatggctct tctaggaatt gac 43

<210> 38

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> R-F3H

<400> 38

gagactggtg atttttgcgg actcaagcga gattcatgtt catg 44

<210> 39

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> F-T35S

<400> 39

catgaacatg aatctcgctt gagtccgcaa aaatcaccag tc 42

<210> 40

<211> 43

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> R-T35S

<400> 40

gctaagcttg tacatgtcga cgtcactgga ttttggtttt agg 43

<210> 41

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> FensP4

<400> 41

gacagacggc ggtgtagaca tgctatttat tgaaaggata atgg 44

<210> 42

<211> 47

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> RensP4

<400> 42

atgcatgcgg ccgctagctc ggagaaaaga agatttgctg accccac 47

<210> 43

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> F-CHI

<400> 43

catgtcgagg ctcagcagga tcatgtctgc ttcagcaagt cc 42

<210> 44

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> R-CHI

<400> 44

ccattatcct ttcaataaat agcatgtcta caccgccgtc tgtc 44

<210> 45

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> FensP5

<400> 45

aaactatttt tatgtatgca ag 22

<210> 46

<211> 51

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> RensP5

<400> 46

gctggagggg gcgccggaga catgagctct ttttatgagc tgcaaacaca c 51

<210> 47

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> F-DFR

<400> 47

ttgcagctca taaaaagagc tcatgtctcc ggcgccccct ccagc 45

<210> 48

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> R-DFR

<400> 48

ggtctgtcca tccacctaga ttaagaattt ggaagcaact c 41

<210> 49

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> F-Tags

<400> 49

gagttgcttc caaattctta atctaggtgg atggacagac cc 42

<210> 50

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> R-Tags

<400> 50

tcatcatcaa tattataata aaaatatcca 30

<210> 51

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> F-DFR-A

<400> 51

aaataaggcg cgccaaacta tttttatgta tgcaagagtc ag 42

<210> 52

<211> 53

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> R-DFR-A

<400> 52

aaataaggcg cgcctcatca tcaatattat aataaaaata tccattaaac acg 53

<210> 53

<211> 47

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> FensP6

<400> 53

ctagctcgag aggcgcgcct acccttctac atcggcttag gtgtagc 47

<210> 54

<211> 49

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> RensP6

<400> 54

gcttggagct attgtagcaa ccattataat atttgaattg tggtgaagg 49

<210> 55

<211> 49

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> F-ANS

<400> 55

ccttcaccac aattcaaata ttataatggt tgctacaata gctccaagc 49

<210> 56

<211> 47

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> R-ANS

<400> 56

gccaaatgtt tgaacgatcg ggattaatta gattcatcct cgtttgg 47

<210> 57

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> FensP7

<400> 57

gcaagcttgt acatgtcgac actggataat tataatatca gt 42

<210> 58

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> RensP7

<400> 58

tgcatgcgat gatggcagcc attgctgatt ctacaatact agtg 44

<210> 59

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> F-F3'H

<400> 59

cactagtatt gtagaatcag caatggctgc catcatcgca tgca 44

<210> 60

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> R-F3'H

<400> 60

agtagccatc gggcttatga tcaagcttga gcttcataaa catg 44

<210> 61

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> FensP8

<400> 61

gatcttttaa ccgtgctacg c 21

<210> 62

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> RensP8

<400> 62

ggatgtcctc cacggtcacc atggctatgt gatggatgct agag 44

<210> 63

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> F-CHS

<400> 63

ctctagcatc catcacatag ccatggtgac cgtggaggac atcc 44

<210> 64

<211> 46

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> R-CHS

<400> 64

gccaacatgg gagtccaaga ttttaattaa gaggaacact gtgaag 46

<210> 65

<211> 46

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> F-Tmas

<400> 65

cttcacagtg ttcctcttaa ttaaaatctt ggactcccat gttggc 46

<210> 66

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> R-Tmas

<400> 66

gcggccgcga tctgataatt tatttgaaaa ttc 33

<210> 67

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> F-CHS-A

<400> 67

aatattggcg cgccgatctt ttaaccgtgc tacgctgggt t 41

<210> 68

<211> 55

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> R-CHS-A

<400> 68

aatattggcg cgcccatgcg gccgcgatct gataatttat ttgaaaattc ataag 55

<210> 69

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> F-322-S

<400> 69

aatttagagc tctggcgggt gtcggggcgc agccatg 37

<210> 70

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> R-322-B

<400> 70

aatttaggat ccgagttcgt cttgttataa ttagc 35

<210> 71

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> F-HPT-A

<400> 71

aattaaggcg cgcctaattc gggggatctg gattttagta ctgg 44

<210> 72

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> R-HPT-A

<400> 72

aattaaggcg cgccgcggtt tgcgtattgg ctagagcagc ttgc 44

<210> 73

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> F-V4

<400> 73

gttgcagtag gatagaggtg gc 22

<210> 74

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> R-V4

<400> 74

gtacggtcag taaattggac atgcttgatg ttgtgaaaga gcctttcc 48

<210> 75

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> F-Cre

<400> 75

ggaaaggctc tttcacaaca tcaagcatgt ccaatttact gaccgtac 48

<210> 76

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> R-Cre

<400> 76

ccaaatgttt gaacgatcgg gactaatcgc catcttccag cagg 44

<210> 77

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> F-nos

<400> 77

cctgctggaa gatggcgatt agtcccgatc gttcaaacat ttgg 44

<210> 78

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> R-nos

<400> 78

cccgatctag taacatagat 20

<210> 79

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> F-MF-F

<400> 79

aattaaggcc ggcccccgat ctagtaacat agatgacacc 40

<210> 80

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> R-MF-H

<400> 80

aattaaaagc ttgttgcagt aggatagagg tggctcggta tg 42

<210> 81

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> F-SsCHS

<400> 81

agaatccgaa catgacggcg tac 23

<210> 82

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> R-SsCHS

<400> 82

gcctaccagg ctgtcgagat gac 23

<210> 83

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> F-SsCHI

<400> 83

gccattggtg tttacttgga ggg 23

<210> 84

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> R-SsCHI

<400> 84

gagtgagccg gttggtgatt gag 23

<210> 85

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> F-SsF3H

<400> 85

cggtttgata tgtctggcgg taa 23

<210> 86

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> R-SsF3H

<400> 86

ctgcttgatg gtctgcgttc ttg 23

<210> 87

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> F-SsF3'H

<400> 87

gcagggagtg gtggtaaaga tga 23

<210> 88

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> R-SsF3'H

<400> 88

ggaaggatgg aggcgaaagt tctcc 25

<210> 89

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> F-SsDFR

<400> 89

gaaaccagtc tacgacgaaa cga 23

<210> 90

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> R-SsDFR

<400> 90

ggagaatctc accacgggta tgt 23

<210> 91

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> F-SsANS

<400> 91

gacgaggaaa ggcggaggaa atg 23

<210> 92

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> R-SsANS

<400> 92

ccagcccgag tgataggact gat 23

<210> 93

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> F-ZmPl

<400> 93

gcgaaggcaa atggagggag gtg 23

<210> 94

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> R-ZmPl

<400> 94

catcatcatt ggcgtcggcg tct 23

<210> 95

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> F-ZmLc

<400> 95

gacgggagca gcacaggaaa tga 23

<210> 96

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> R-ZmLc

<400> 96

ggctcttgat ggcgtcgaac act 23

<210> 97

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> F-Actin1

<400> 97

caacacccct gctatgtacg 20

<210> 98

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> R-Actin1

<400> 98

atcaccagag tccaacacaa 20

<210> 99

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Fm1

<400> 99

aattaattcc taggccacca tgttg 25

<210> 100

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> R1

<400> 100

gtctggaccg atggctgtgt ag 22

<210> 101

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> R2

<400> 101

ccatactctt tgctatccta c 21

<210> 102

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> F-OsC1

<400> 102

ctactggaac agcacgctca 20

<210> 103

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> R-OsC1

<400> 103

ctcacgtcgt ccatccagtc 20

<210> 104

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> F-OsB1

<400> 104

caaggaggtt ctcctcgagc tg 22

<210> 105

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> R-OsB1

<400> 105

tagctttccg gagagcttct g 21

<210> 106

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> F-OsB2

<400> 106

ggcgtgcttg agctgggaac c 21

<210> 107

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> R-OsB2

<400> 107

gtcgcctagc tcgtcttctc c 21

<210> 108

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> F-OsRc

<400> 108

ccatgtgctg aaagagagga g 21

<210> 109

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> R-OsRc

<400> 109

cgatgatgga cacctgcacc ac 22

<210> 110

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> F-OsWD40

<400> 110

ggacaaggag cattccacca 20

<210> 111

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> R-OsWD40

<400> 111

tctctgcacc ggcatcatac 20

<210> 112

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> F-OsCHS

<400> 112

gaggtacatg cacctgacgg ag 22

<210> 113

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> R-OsCHS

<400> 113

ccctgctggt acatcatgag 20

<210> 114

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> F-OsCHI

<400> 114

cagtactcgg acaaggtgac 20

<210> 115

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> R-OsCHI

<400> 115

ggattccgcc ttcaggagct g 21

<210> 116

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> F-OsF3H

<400> 116

agggtggcgt acaaccagtt c 21

<210> 117

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> R-OsF3H

<400> 117

ggacttcacc gggtacgaga ag 22

<210> 118

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> F-OsF3'H

<400> 118

atcaaggaga cgtttcggct tc 22

<210> 119

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> R-OsF3'H

<400> 119

tggcagtcat cagtgtgacc at 22

<210> 120

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> F-OsDFR

<400> 120

gcccactact cgatcctgaa 20

<210> 121

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> R-OsDFR

<400> 121

cagcgtgtac ctgaacctga 20

<210> 122

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> F-OsANS

<400> 122

tgacggatgt ggagctgaga 20

<210> 123

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> R-OsANS

<400> 123

tgtatgacgc cccactcctc 20

<210> 124

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> F-Os3GT

<400> 124

gcgaccagag gacgaacg 18

<210> 125

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> R-Os3GT

<400> 125

gattatctcg acgaacttgg 20

<210> 126

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> F-OsA3'MT

<400> 126

gtggtggtgg agtgcgtgct gc 22

<210> 127

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> R-OsA3'MT

<400> 127

catcagccag cagcaaacga c 21

<210> 128

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> F-OsGSTU

<400> 128

gggcctgcga gaacctcaac g 21

<210> 129

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> R-OsGSTU

<400> 129

aaccttgcat gcatgttcac c 21

<210> 130

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> F-OsMRP15

<400> 130

gagacgatgc cgtatcttag ttc 23

<210> 131

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> R-OsMRP15

<400> 131

tttgtggcac tatcatctca tc 22

<210> 132

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> F-OsAnp

<400> 132

ctcgtgctcg ccttcagcga c 21

<210> 133

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> R-OsAnp

<400> 133

cccacttgtg cacacgagct g 21

<210> 134

<211> 175

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 含Gateway重组位点的片段序列

<400> 134

gagctcatca caagtttgta caaaaaagca ggctgaagcg gcgccgtcat aacttcgtat 60

agcatacatt atacgaagtt atggcgcgcc atggccggcc atcaagctta taacttcgta 120

tagcatacat tatacgaagt tatgacccag ctttcttgta caaagtggtg gatcc 175

Claims

1.一种在作物种子胚乳合成花青素的转基因育种方法，其特征在于包括如下步骤：在作物中转入包含6个表达结构蛋白的基因和2个表达转录因子的基因的基因组合，获得种子胚乳为紫色的、合成花青素的转基因作物；

其中，所述的结构蛋白为CHS、CHI、F3H、F3’H、DFR和ANS；

所述的转录因子为转录因子Pl和转录因子Lc；

表达所述的CHS的基因包含水稻胚乳储存蛋白基因启动子ensP8、如SEQ ID NO.1所示的编码查尔酮合成酶的基因和Tmas终止子；

表达所述的CHI的基因包含水稻胚乳储存蛋白基因启动子ensP4、如SEQ ID NO.2所示的编码查尔酮异构酶的基因和Tocs终止子；

表达所述的F3H的基因包含水稻胚乳储存蛋白基因启动子ensP3、如SEQ ID NO.3所示的编码黄烷酮-3-羟化酶的基因和T35s终止子；

表达所述的F3’H的基因包含水稻胚乳储存蛋白基因启动子ensP7、如SEQ ID NO.4所示的编码类烷酮-3-羟化酶的基因和Trbc终止子；

表达所述的DFR的基因包含水稻胚乳储存蛋白基因启动子ensP5、如SEQ ID NO.5所示的编码二羟黄酮醇4-还原酶的基因和Tags终止子；

表达所述的ANS的基因包含水稻胚乳储存蛋白基因启动子ensP6、如SEQ ID NO.6所示的编码花青素合成酶的基因和Tnos终止子；

表达所述的转录因子Pl的基因包含水稻胚乳储存蛋白基因启动子ensP1、编码玉米转录因子ZmPl的基因和Tmas终止子；

表达所述的转录因子Lc的基因包含水稻胚乳储存蛋白基因启动子ensP2、编码玉米转录因子ZmLc的基因和Tmas终止子组成

其中，ensP1～ensP8启动子的序列分别如GenBank No. EU264107、GenBank No.AY427569、GenBank No. AY427571、GenBank No. AY427575、GenBank No. EU264106、GenBank No. D63901、GenBank No. AY427572和GenBank No. AY427574所示；

Tmas终止子的序列如GenBank No.DQ005465所示；

Tocs终止子的序列如GenBank No.DQ005461所示；

T35s终止子的序列如GenBank No.AF234296.1所示；

Trbc终止子的序列如GenBank No.DQ005473所示；

Tags终止子的序列如GenBank No.DQ005453所示；

Tnos终止子的序列如GenBank No.DQ005463所示；

编码玉米转录因子ZmPl的基因如GenBank No. NM_001112415所示；

编码玉米转录因子ZmLc的基因如GenBank No. NM_001111869所示；

所述作物为水稻。

2.根据权利要求1所述的在作物种子胚乳合成花青素的转基因育种方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）克隆在胚乳完成花青素合成途径必需的全部6个结构基因和2个调节基因，并将这8个基因分别与作物胚乳表达启动子融合，分别构建基因表达盒；

（2）将步骤（1）得到的8个基因表达盒构建到一个植物转化载体上，获得含CHS、CHI、 F3H、F3’H、DFR、ANS、Pl和Lc的多基因转化载体；

（3）将得到的多基因转化载体转化育种作物，获得种子胚乳为紫色的、合成花青素的转基因作物。

3.根据权利要求2所述的在作物种子胚乳合成花青素的转基因育种方法，其特征在于还包括如下步骤：为了获得可以剔除筛选标记基因的转化植物，将标记基因和标记删除基因的无筛选标记结构构建到步骤（2）得到的多基因转化载体，获得含10个基因的、能在转基因植株中自动删除筛选标记的多基因转化载体。

4.根据权利要求3所述的在作物种子胚乳合成花青素的转基因育种方法，其特征在于：

所述的标记基因包括抗潮霉素标记基因HPT；

所述的标记删除基因包括Cre标记删除基因。

5.根据权利要求4所述的在作物种子胚乳合成花青素的转基因育种方法，其特征在于：所述的将得到的多基因转化载体转化育种作物是通过使用农杆菌介导的转化方法，转化育种作物的愈伤组织，筛选，得到转基因作物。