CN102477092B - 控制花青素含量的蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents
控制花青素含量的蛋白及其编码基因与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了控制花青素含量的蛋白及其编码基因与应用。本发明公开了一种水稻查尔酮异构酶及其编码基因与应用。该蛋白，是如下1)或2)的蛋白质：1)由序列表中的SEQ ID №.2的氨基酸残基序列组成的蛋白质；2)将序列表中的SEQ ID №.2氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有SEQ ID №.2的氨基酸残基序列相同活性的蛋白质。本发明水稻查尔酮异构酶基因，既可以作为分子标志基因辅助水稻育种，更对了解稻壳的合理利用具有重要的价值。
Description
技术领域
本发明涉及控制花青素含量的蛋白及其编码基因与应用。
背景技术
黄酮类化合物泛指两个具有酚羟基的苯环(A-与B-环)通过中央三碳原子相互连结而成的一大类次生代谢物。自然界中存在着6000种以上的黄酮类化合物，这些化合物的种类和数量在不同种类的植物中分布是不相同的，同时还受到植物的发育阶段和生长条件下的影响。黄酮类化合物广泛存在于植物界中，是植物体内最主要的色素化合物，它们使植物的叶子、花及果实呈现红色、蓝色和紫色等各种颜色，这些绚丽的颜色可以吸引受粉者，使植物得以受粉，并且有利于种子的传播。除了使植物的各组织和器官呈现不同的颜色外，黄酮类化合物还有多种多样的植物生理活性，包括使植物免受紫外线的伤害，调节生长素的极性运输，在花粉萌发过程中介导信号传递，参与植物的抗病等等。作为膳食中必不可少的组分，黄酮类化合物具有诸多有利于人类健康的特性，如抗氧化，抗肿瘤等。同时，黄酮类化合物的成分和含量还会影响食物的品质和口感，例如在葡萄中花色素和单宁的含量决定着葡萄酒的颜色、质量。
由于黄酮类化合物合成途径的基因突变可以导致植物某器官颜色的变化，并且这种颜色的变化在大多数情况下不影响植物的生长发育，所以长期以来这类基因在生产和遗传学研究中一直作为标记基因。到目前为止，大量的关于种子和其他器官颜色变化的突变体得到了分离和鉴定，通过对这些突变体的研究并辅以生化分析手段，黄酮类化合物合成过程已得到详细的阐述。大部分的化合物都是由苹果酸辅酶A(malonyl-CoA)和肉桂酰辅酶A(p-coumaroyl-CoA)经过一系列酶促反应合成的。这些途径中涉及的酶包括查尔酮合成酶(chalcone synthase，CHS)，查尔酮异构酶(chalcone isomerase，CHI)，黄酮羟化酶等。CHI是黄酮类化合物合成途径中的第二个酶。研究者们首先在大豆中纯化出CHI并在双子叶中对该酶及其编码基因进行深入的研究，如在豆科中研究酶的生化性质和三维结构，在牵牛花中研究其基因的启动子，在拟南芥中分析该基因突变体表型。研究表明该基因的表达变化会引起植物某些器官中黄酮类化合物含量和成分的差异，并导致颜色的改变。水稻中的CHI基因已经通过同源序列比对被确定，但迄今为止还没有CHI基因的突变体被分离和鉴定。
黄酮类化合物是一种良好的活性氧自由基的清除剂，对不同种类的氧自由基，不同结构的黄酮化合物可以达到不同的清除效果。黄酮类化合物分布于大部分的绿色植物中，在日常生活的食物中也很丰富。在新兴的功能性食品中有很大一部分是和抗衰老、清除体内过多的氧自由基有关的，所以黄酮类化合物是有希望在其中发挥作用的生物活性因子。
水稻金黄颖突变体是一种成熟时稻壳和茎秆都呈现棕黄色的水稻突变体，长期以来作为标志基因应用于遗传学研究。水稻中已报道有四个不同的金黄颖突变体，其中三个已被定位于不同的染色体(http://www.gramene.org/db/mutant)。
稻壳是碾米厂的加工副产品，约占稻谷总产量的20％，目前全世界年产稻壳6千万吨以上。长期以来，国内外对稻壳的综合利用进行了广泛的研究，获得了许多可利用的途径，但真正能够形成规模生产、大量消耗稻壳的利用途径并不多。很多地方把稻壳视为废弃物，资源浪费和环境污染。因此研究解决稻壳的合理利用意义重大。
发明内容
本发明的目的是提供一种控制花青素含量的蛋白及其编码基因和应用。
本发明提供的控制花青素含量的蛋白(GH-1)，来源于水稻，是如下1)或2)的蛋白质：
1)由序列表中的SEQ ID №.2的氨基酸残基序列组成的蛋白质；
2)将序列表中的SEQ ID №.2氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有SEQ ID №.2的氨基酸残基序列相同活性的蛋白质。
序列表中序列2由233个氨基酸残基组成。
为了便于GH-1的纯化，可在由序列2的氨基酸残基序列组成的蛋白质的氨基端或羧基端连接上如表1所示的标签。
表1标签的序列
| 标签 | 残基 | 序列 |
| Poly-Arg | 5-6(通常为5个) | RRRRR |
| Poly-His | 2-10(通常为6个) | HHHHHH |
| FLAG | 8 | DYKDDDDK |
| Strep-tag II | 8 | WSHPQFEK |
| c-myc | 10 | EQKLISEEDL |
上述(b)中的GH-1可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的GH-1的编码基因可通过将序列表中序列1或3所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
编码上述控制花青素含量的蛋白(GH-1)的编码基因(GH-1)也属于本发明的保护范围。
所述控制花青素含量的蛋白的cDNA基因可为如下1)或2)或3)或4)的DNA分子：
1)序列表中SEQ ID №.1的DNA序列；
2)编码序列表中SEQ ID №.2蛋白质序列的多核苷酸；
3)与序列表中SEQ ID №.1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；
4)在严格条件下可与序列表中序列2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
序列表中的序列1由702个碱基组成，其开放阅读框架(ORF)为自5′末端第1-702位核苷酸。
所述控制花青素含量的蛋白的基因组基因可为如下1)或2)或3)或4)的DNA分子：
1)序列表中SEQ ID №.3的DNA序列；
2)编码序列表中SEQ ID №.2蛋白质序列的多核苷酸；
3)与序列表中SEQ ID №.3限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；
4)在严格条件下可与序列表中序列1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
序列表中的序列3由956个碱基组成，自5′末端第1-93位核苷酸为第一个外显子，第191-355位核苷酸为第二个外显子，第432-657位核苷酸为第三个外显子，第739-956位核苷酸为第四个外显子。
上述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃条件下杂交并洗膜。
含有以上任一所述基因的重组载体也属于本发明的保护范围，如重组表达载体。
可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。
所述植物表达载体包括双元农杆菌载体(如pBI121、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA3301、pCAMBIA1301-UbiN、pCAMBIA1300等)和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。
使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子、组成型启动子或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin)、胁迫诱导型启动子Rd29A等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
含有以上任一所述基因(LcP5CS1)的表达盒、转基因细胞系及重组菌均属于本发明的保护范围。
扩增上述基因的全长或任一片段的引物对也属于本发明的保护范围之内。
所述蛋白、所述基因、所述重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌中的任意一种均可应用于培育颖壳中花青素含量提高转基因水稻。
利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将编码所述蛋白的基因导入植物细胞，可获得抗盐、耐旱性增强的转基因细胞系及转基因植株。携带有所述基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。
本发明水稻查尔酮异构酶基因，既可以作为分子标志基因辅助水稻育种，更对了解稻壳的合理利用具有重要的价值。本发明的基因和蛋白基本控制稻壳中花青素含量，花青素具有增强人体抗氧化能力，抵抗自由基，降低心血管的疾病发病率等功效，因此提高花青素含量可以增加水稻的营养价值，从而使水稻生产有更高的经济效益。
附图说明
图1为突变体与野生型种子和茎秆表型，左为野生型(wt)，右为突变体。
图2为水稻突变体gh-1与野生型植株的稻壳组分；total fiavonoid为总黄酮含量，anthocyanin为花青素含量，lignin为木质素总量。左为野生型，右为突变体。
图3为GH-1基因的定位及互补表达载体的构建，图中，A.GH-1基因位点被定位到水稻3号染色体短臂上的分子标记S5和S6之间；B.GH-1基因的结构。黑色实心框代表外显子，外显子之间的白框代表内含子。该基因有四个外显子和三个内含子。箭头标示的是突变位点，该处有片段插入；C.互补表达载体的构建。pCGH，互补表达载体，包括GH-1基因上游3005bp和下游3360bp；pCGHC，互补表达载体对照，与pCGH相比少了5’端序列、外显子及部分3’端序列；D.PCR扩增产物电泳的结果证实了gh-1突变体中GH-1基因部位确实有片段插入。左起第一泳道为ZF802基因组DNA用引物对54F和54R扩增出的片段的大小，第四泳道为gh-1基因组DNA用引物对54F和54R扩增出的片段。第二和第三泳道为分子标记，其中第二泳道各条带大小分别为100bp，250bp，500bp，750bp，1000bp，2000bp，3000bp，4000bp，5000bp。
图4为野生型日本晴(Nip)和转pGHOX植株GH-1基因表达量。
图5为日本晴和转基因pGHOX植株的颖壳中总黄酮含量及花青素含量。
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。
实施例1、控制花青素含量的蛋白GH-1及其编码基因的获得
1、水稻金黄颖突变体gh-1的表型分析
水稻金黄颖突变体gh-1(国际水稻研究所International Rice Research Institute，GrameneAccession：GR：0060365)是ZF802(WT)(中国水稻研究所国家水稻数据中心保藏，登记编号GS01003-1989)的近等位基因系。与对照ZF802相比，金黄颖表型为从抽穗期开始，其颖壳呈现出棕红色，到成熟时，稻壳和茎秆都呈现棕红色(图1)。突变体表型在正常的栽培条件下不影响水稻的正常的生长发育。图1中左上为对照ZF802的种子，浅黄色；右上为金黄颖突变体gh-1的穗子，红棕色；左下为对照ZF802的茎秆，为浅黄色；右下为金黄颖突变体gh-1的茎秆，为棕黄色。
2、水稻金黄颖突变体gh-1的总黄酮及花青素含量分析
取成熟期的金黄颖突变体gh-1及其对照ZF802(野生型)的颖壳，相同条件下粉碎机粉碎，用于总黄酮(total flavonoid)含量、花青素(anthocyanin)含量及木质素(lignin)总量的测定。总黄酮含量及花青素含量的测定参照Li等(2006)的方法(Li，F.et al.(2006).Cloning of a cDNA encoding the Saussurea medusa chalcone isomerase and itsexpression in transgenic tobacco.Plant Physiology and Biochemistry，44，455-461)，木质素总量的测定参照Kirk和Obst(1988)的方法(Kirk，T.K.，and Obst，J.R.(1988).Lignindetermination.Methods Enzymol.161，87-101)，每个样品重复三次，取平均值比较突变体总黄酮含量、花青素含量及木质素总量相对于野生型的变化。金黄颖突变体gh-1及其对照ZF802的总黄酮含量、花青素含量及木质素总量的测定结果如图2所示，表明金黄颖突变体gh-1总黄酮含量与对照ZF802相比增加了2倍，花青素含量略有下降，而木质素总量与对照ZF802相比无明显差别。说明金黄颖表型和总黄酮含量和花青素含量直接相关。
3、水稻金黄颖突变体gh-1的遗传分析
水稻金黄颖突变体gh-1和粳型野生型材料(Japonica)春江06(购自中国水稻研究所)，二品种杂交得F1代，F1代自交产生F2代，对F2代种子进行表型鉴定，春江06和gh-1分别作为正、负对照，F2代种子的表型鉴定结果如表2所示，表明水稻金黄颖这一性状符合单基因控制遗传规律。表2中，正常株数是指具有春江06表型的株数，金黄颖gh-1株数是指具有gh-1表型的株数。
表2水稻金黄颖突变体gh-1的遗传分析
| 组合 | 正常株数 | 金黄颖gh-1株数 | 总株数 | 分离比 |
| 金黄颖gh-1/春江06 | 183 | 57 | 240 | 3.21∶1 |
4、图位克隆GH-1的基因组基因
为了克隆GH-1基因，我们将用纯合的突变体金黄颖突变体gh-1和春江06进行杂交，获得的F1代自交得到F2群体，对其中180个F2隐性个体(具有金黄颖表型的F2代个体)进行GH-1基因的初步定位。应用STS分子标记，利用PCR的方法，我们发现位于第3染色体上的STS标记S1、S2、S3和S4与突变位点在位置上具有明显的连锁性。突变位点和S2之间的交换单株，绝大多数在突变位点和S1之间也进行交换，而突变位点和S3之间的交换单株，绝大多数包含在突变位点和S4之间的交换单株中。同时突变位点和S3之间的交换单株与突变位点和S2之间的交换单株不同，因此推断突变基因可能位于标记S2和标记S3之间的区域。在此基础上，我们进一步扩大突变体gh-1和春江06的杂交组合，获得了包含960株突变单株的F2分离群体用于GH-1精细定位。参照已经完成的水稻基因组序列(http://www.tigr.org/tdb/e2k1/osa1/和http://btn.genomics.org.cn)，对粳稻和籼稻的序列进行比较，利用序列差异发展了11个新的STS分子标记(表3，图3)。最终将GH-1精细定位于BAC克隆AC104433标记S5和S6之间，这两个标记之间的物理距离约为50kb。利用水稻基因组注解数据库RiceGAAS(http://ricegaas.dna.affrc.go.jp/rgadb)分析表明，50kb区域内共有27个基因，包括一个查尔酮异构酶基因，我们将其作为候选基因，通过DNA序列测定进行了突变体和野生型序列比较。结果表明，该基因的编码区(ORF)没有发生突变，而在起始密码子上游12bp处有序列插入。我们利用GH-1基因5’部位的引物对54F：5-TCCTCCAGGTACACGCCGAT-3及54R：5-TGTCACCACCACAACTATTC-3扩增ZF802及gh-1突变体的基因组DNA，在ZF802基因组DNA中扩增出约450bp的条带，而在gh-1基因组DNA中扩增出的条带约有7kb，测序发现在gh-1基因组DNA中扩增出的7kb条带其两端序列与GH-1基因序列一致，中间序列是外源片段，与逆转座子Dasheng同源，证实了gh-1突变体中GH-1基因部位确实有片段插入(图3中D)。因此，我们将查尔酮异构酶基因确定为目标基因，命名为GH-1。利用水稻基因组注解数据库RiceGAAS信息表明，该基因从起始密码子到终止密码子的基因组全长为956bp，共有4个外显子，3个内含子，mRNA的全长为702bp，共编码233个氨基酸。该基因的完整的ORF序列为序列表中序列1所示的序列，即本发明的控制花青素含量的蛋白基因序列。
表3本研究新创制的STS标记
5.控制花青素含量的蛋白GH-1基因全长ORF的获得
水稻ZF802叶片总RNA提取采用Bioteke公司RNA提取试剂盒(Bioteke，RP1201)按照说明书操作。以Oligo(dt)-18为引物，以所提取的总RNA为模板进行反转录合成第一链cDNA。以此cDNA为模板，primer 1(5’-TTTCTTGGATAGTTAGTTGC-3’)和primer 2(5’-ACAAGAAGTGTAGGAGGAGC-3’)，进行PCR扩增反应，反应条件如下：
反应体积50μl，其中含有：模板(cDNA)5μl(5ng)，引物正向引物、反向引物终浓度各0.2μM，dNTP 终浓度各200μM，Taq DNA聚合酶2.5U，10×Taq DNA聚合酶缓冲液5μl，用双蒸水补足至50μl体积。
反应温度、时间：94℃，变性5分钟；然后94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸45秒，扩增30个循环；最后在72℃下延伸8分钟。
扩增产物为3’有碱基A的3’突出粘端片段，用Biomed胶回收试剂盒(Biomed，28706)按产品说明书进行纯化，然后与3’有碱基T的线性pMD19-T(Takara，D101)在室温下下连接20分钟，使用2mm电极杯，2500V转化大肠杆菌DH5α，转化物在含氨苄青霉素的LB平板培养基上生长，挑选克隆，提取质粒，使用AbI PRISM 3700DNA分析仪(Perkin-Elmer/Applied Biosystem)测序，获得如序列表中序列1所示的GH-1的cDNA的ORF，其全长702bp，其编码的氨基酸序列为序列表中序列2所示的序列。
GH-1基因956bp的获得方法和其序列获得方法：
水稻ZF802叶片基因组DNA提取采用Tiangen公司DNA提取试剂盒(TIANGEN，DP321)按照说明书操作。以获得的DNA为模板，用primer1(5’-TTTCTTGGATAGTTAGTTGC-3’)和primer 2(5’-ACAAGAAGTGTAGGAGGAGC-3’)进行PCR扩增反应，反应条件如下：
反应体积50μl，其中含有：模板(基因组DNA)1μl(1ug)，引物正向引物、反向引物终浓度各0.2μM，dNTP终浓度各200μM，Taq DNA聚合酶2.5U，10×Taq DNA聚合酶缓冲液5μl，用双蒸水补足至50μl体积。
反应温度、时间：94℃，变性5分钟；然后94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸60秒，扩增30个循环；最后在72℃下延伸8分钟。
扩增产物为3’有碱基A的3’突出粘端片段，用Biomed胶回收试剂盒(Biomed，28706)按产品说明书进行纯化，然后与3’有碱基T的线性pBM19-T载体(Biomed，A1360)在室温下下连接20分钟，使用2mm电极杯，2500V转化大肠杆菌DH5α，转化物在含氨苄青霉素的LB平板培养基上生长，挑选克隆，提取质粒，使用AbI PRISM3700DNA分析仪(Perkin-Elmer/Applied Biosystem)测序，获得如序列表中序列3所示的GH-1的基因全长956bp。序列3中，自5′末端第1-93位核苷酸为第一个外显子，第191-355位核苷酸为第二个外显子，第432-657位核苷酸为第三个外显子，第739-956位核苷酸为第四个外显子。
实施例2、金黄颖突变体gh-1表型的互补实验
1、互补载体pCGH及互补对照载体pCGHC的构建
利用PstI和BamHI双酶切BAC OsJNBa0017N05(购自中科院上海国家基因研究中心，编号OsJNBa0017N05)，获得包含有GH-1的起始密码子ATG上游的3005个碱基和终止密码子TGA后的3360个碱基的全长序列的DNA片段(7996bp)，克隆到pCAMBIA1300(DingGuo，MCV033)的PstI和BamHI识别位点间，即构建成了互补表达载体pCGH。将构建好的互补载体pCGH用KpnI酶切，去除GH-1基因的启动子区、外显子及部分3’端序列，保留3’端的部分调控区，即构建成了互补对照载体pCGHC(图3中C)。
2、pCGH和pCGHC转化株系的获得及其表型鉴定
两载体pCGH和pCGHC通过电击的方法分别转入农杆菌(AgroBacteriumtumefaciens)株系EHA105(北京亚平宁生物)中，利用农杆菌的介导法分别将pCGH和pCGHC转入金黄颖突变体gh-1与春江06杂交群体的自交F3代隐性个体(具有金黄颖表型的个体)。转化的具体方法是将该F3代隐性个体幼胚灭菌后切出，接种到诱导愈伤组织的培养基中。培养1周后，挑选生长旺盛，颜色浅黄，比较松散的胚性愈伤组织，用作转化的受体。用含有pCGH和pCGHC质粒的EHA105菌株分别侵染水稻愈伤组织，在黑暗处25℃培养3天后，在含有50mg/L潮霉素的选择培养基上筛选抗性愈伤组织和转基因植株。将潮霉素抗性植株在阴凉处练苗，7天后移栽到水田，观察转基因植株的表型恢复情况。结果表明互补载体pCGH能恢复金黄颖表型为野生型表型，而互补对照载体pCGHC不能恢复金黄颖表型。功能互补实验表明GH-1控制金黄颖突变体gh-1表型。
实施例3、GH-1基因的过表达验证试验
一、过表达载体pGHOX的构建
按照实施例1中步骤5的方法获得GH-1的ORF，用Sal I和Xba I双酶切该载体得到约700bp的片段，然后将此片段连入过表达载体pCam13OX的Sal I和Xba I识别位点间，即构建成了过表达载体pGHOX。
pCam130X的构建方法如下：
用引物对35S-F：(5’-AAGCTTCCCAGATTAGCCTTTTCAAT-3’)和35S-R：(5’-CTGCAGTCCCCCGTGTTCTCTCCAA-3’)PCR扩增质粒pBI121(DingGuo，MCV032)得到约850bp的组成型CaMV35S启动子片段，将该片段用Pst I和Hind III双酶切然后连入载体pCAMBIA1300(DingGuo，MCV033)的Pst I和Hind III识别位点间，构成中间载体pCam13OXM。用EcoR I和Sac I双酶切质粒pBI121，将得到的片段连入中间载体pCam13OXM的EcoR I和Sac I识别位点间，最终得到过表达载体pCam13OX。
通过电击的方法将载体pGHOX转入农杆菌(AgroBacterium tumefaciens)株系EHA105中，利用农杆菌的介导法将其转入粳型野生型材料日本晴(中国农科院作物科学研究所水稻种质资源中心保藏，库编号I1A13071)中。转化方法同实施例2。
转pGHOX植株GH-1表达量的定量检测：
取转基因植株及野生型材料日本晴的抽穗期叶片，提取总RNA，采用Bioteke公司RNA提取试剂盒(Bioteke，RP1201)按照说明书操作。以Oligo(dt)-18为引物，以所提取的总RNA为模板进行反转录合成第一链cDNA。通过semi-qPCR扩增反应比较转基因植株及野生型材料日本晴的抽穗期叶片cDNA中GH-1基因的表达量，以水稻Ubiquitin基因的表达量做参照。扩增GH-1基因用引物对primer 3(5’-TCACCGTCGCGTTCTCCAAG-3’) 和 primer 4(5’-ATTCCGCCTTCAGGAGCTGC-3’)，扩增Ubiquitin基因用引物对primer 5(5′-CAAGATGATCTGCCGCAAATGC-3’) 和 primer 6(5′-TTTAACCAGTCCATGAACCCG-3’)，PCR扩增反应条件如下：
反应体积20μl，其中含有：模板(cDNA)1μl(25ng)，正向引物、反向引物终浓度各0.2μM，dNTP终浓度各200μM，Taq DNA聚合酶1U，10×Taq DNA聚合酶缓冲液2μl，用双蒸水补足至20μl体积。
反应温度、时间：94℃，变性5分钟；然后94℃变性25秒，58℃退火25秒，72℃延伸25秒，扩增若干个循环；最后在72℃下延伸5分钟。
扩增循环数：GH-1基因30个循环；Ubiquitin基因25个循环。
结果显示以水稻Ubiquitin基因的表达量做参照，pGHOX植株中GH-1基因的表达明显上调，确实达到了过表达的效果。结果如图4所示，图4中上为GH-1基因的表达量，下为对照Ubiquitin基因的表达量；左为野生型材料日本晴(Nip)的抽穗期叶片cDNA，右为转基因植株的抽穗期叶片cDNA。
得到的转基因植株营养生长阶段和生殖生长阶段皆与野生型无差别，取成熟期的pGHOX转基因植株及其对照日本晴的颖壳，相同条件下粉碎机粉碎，用于总黄酮含量、花青素含量的测定，测定方法同实施例1。转pGHOX植株及其对照日本晴的颖壳中总黄酮含量及花青素含量的测定结果如图5所示，表明转基因植株的颖壳中总黄酮含量与对照日本晴相比无明显变化，而花青素含量增加了30％，说明增强的GH-1表达能显著增加颖壳中的花青素含量。图5为日本晴和转基因pGHOX植株的颖壳中总黄酮含量及花青素含量。图5中total flavonoid为总黄酮含量，anthocyanin为花青素含量。左为野生型日本晴(Nip)，右为转pGHOX植株pGHOX。
Claims (3)
1.由序列表中的SEQ ID №.2的氨基酸残基序列组成的蛋白质在培育颖壳中花青素含量增加的转基因水稻中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：序列表中的SEQ ID №.2的氨基酸残基序列组成的蛋白质的cDNA基因的核苷酸序列是下列核苷酸序列之一：
1)序列表中SEQ ID №.1的DNA序列；
2)编码序列表中SEQ ID №.2蛋白质序列的多核苷酸。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：序列表中的SEQ ID №.2的氨基酸残基序列组成的蛋白质的基因组基因的核苷酸序列是下列核苷酸序列之一：
1)序列表中SEQ ID №.3的DNA序列；
2)编码序列表中SEQ ID №.2蛋白质序列的多核苷酸。
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