CN114134158A - 一种紫心甘薯IbDRM基因及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种紫心甘薯IbDRM基因及其应用。本发明以紫心甘薯品系“A5”为实验材料，克隆了IbbHLH2的启动子序列，通过酵母单杂交文库筛选实验，获得了IbbHLH2基因的上游调控因子IbDRM。运用酵母单杂交回转实验和双荧光素酶报告系统检测证实，IbbHLH2启动子与上游调控因子IbDRM之间存在相互作用。通过酵母双杂交和双分子荧光互补实验，研究了调控因子之间的相互作用，结果显示，IbDRM与IbEBF2、IbERF73存在相互作用。本发明在理论上可以丰富和深化植物花色素苷生物合成分子调控的基础理论，还可望为提高紫心甘薯块根中色素含量的栽培措施提供新的思路和线索。

Description

一种紫心甘薯IbDRM基因及其应用
技术领域
本发明涉及植物遗传与变异的分子机制领域，具体涉及一种紫心甘薯IbDRM基因及其应用。
背景技术
由于植物花色素苷的分子量较小，其化学结构的解析相对容易，同时不同的代谢产物可呈现不同的颜色，因此植物花色素苷合成的调控机制和信号传递过程已成为研究植物基因表达与调控以及基因与环境相互作用的理想系统。目前，对于植物的花、果、茎、叶等地上部分花色素苷合成以及环境信号因子影响的分子机制有了一定的认识，尤其是光照对花色素苷合成的调控机制及信号传导过程已比较清楚。然而，对于非依光型或无法直接接受光照的植物根、块根或块茎中花色素苷合成调控机制及信号传递过程却不甚明了。
紫心甘薯因其块根中的薯肉富含花青素呈紫色而得名，是一种特用型甘薯品种类型。以紫心甘薯作为试验材料，研究植物地下器官花色素苷生物合成调控机制具有明显的特色和优势：1)紫色甘薯块根中的花青素含量很高，而茎和叶中的含量较低，有的株系甚至仅在块根专一性地积累花青素。2)紫心甘薯的根或块根生长于土壤中，处于完全遮光状态，但其根或块根内部却能大量积累花青素，其花青素积累部位具有一定的特殊性。3)在紫心甘薯中已发现块根色素含量和分布不同的多个品系，资源颇为丰富。4)虽然不同品种紫色甘薯块根中的花青素含量主要是由其基因型所决定，但研究发现栽培条件对其也有一定影响。
紫心甘薯作为花色素苷合成和积累部位特殊及具有重要开发价值的植物资源，用其进行非依光型及植物地下部分花色素苷合成的调控机制研究，在理论上可以丰富和深化植物花色素苷生物合成分子调控的基础理论；在应用上可以为紫心甘薯高花色素苷品种选育提供新的遗传标记，为其分子育种筛选出合适的操作元件或改造靶标，同时还可望为提高紫心甘薯块根中色素含量的栽培措施提供新的思路和线索。
在紫心甘薯中克隆获得了转录因子IbbHLH2的基因序列，IbbHLH2基因能够调控花色素苷合成途径中关键酶基因的表达，进而影响紫心甘薯中花色素苷的积累。进一步研究表明不同甘薯品种(系)及其根发育时期中，IbbHLH2基因的表达与花色素苷的合成积累是完全同步的，说明IbbHLH2是紫心甘薯花色素苷合成代谢中的关键转录调控因子。由于植物花色素苷的分子量较小，其化学结构的解析相对容易，同时不同的代谢产物可呈现不同的颜色，因此植物花色素苷合成的调控机制和信号传递过程已成为研究植物基因表达与调控以及基因与环境相互作用的理想系统。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于筛选紫心甘薯IbbHLH2表达的上游调控因子以及研究上游调控因子之间的相互作用。
为了解决上述技术问题，本发明首先用Trizol法从甘薯块根提取RNA，用SMART技术逆转录合成双链的cDNA，构建紫心甘薯酵母单杂交cDNA文库。
进一步的，以紫心甘薯块根DNA为模板，用TaKaRa高保真酶
Figure BDA0003416804200000021
Max DNAPolymerase扩增两端带有不同酶切位点末端的IbbHLH2的启动子DNA片段，并将启动子IbbHLH2构建到pAbAi载体中，扩增IbbHLH2的启动子DNA片段的PCR引物对的具体序列如下所示：
PIbbHLH2-F：5'-TCCTAGCCAAGAAGAGTGGAGAGA-3'和
PIbbHLH2-R：5'-TCTCATACCACCACACCCTAGTGG-3'。
构建的pAbAi-PIbbHLH2诱饵载体经过自激活检测后，确定其自激活AbA最低抑制浓度为300ng/mL。
本发明其次将诱饵菌株制成Y1HGold感受态细胞，把文库质粒转入pAbAi-PIbbHLH2感受态细胞中，通过酵母单杂交筛库对结合蛋白进行筛选，筛选得到了紫心甘薯IbbHLH2基因表达的上游调控因子为IbDRM。
因此，本发明的第一个目的是提供一种紫心甘薯IbDRM基因，其核苷酸序列如SEQID NO.2所示。
本发明的第二个目的是提供一种上述的紫心甘薯IbDRM基因的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明的第三个目的是提供一种含有上述的紫心甘薯IbDRM基因的重组载体或重组菌。
本发明的第四个目的是提供一种含有上述的紫心甘薯IbDRM基因的转基因细胞系或表达盒。
本发明的第五个目的是提供一种上述的紫心甘薯IbDRM基因的扩增引物，该扩增引物的具体序列如下所示：
IbDRM-F：5'-ATGGTTTTGATTGATAGGAGTTGGG-3'和
IbDRM-R：5'-TTAACGGTGCTTGGATCTTGTTT-3'。
本发明的第六个目的是提供上述的紫心甘薯IbDRM基因在促进甘薯IbbHLH2转录因子表达中的应用。
本发明的第七个目的是提供上述的紫心甘薯IbDRM基因在促进甘薯花色素苷生物合成中的应用。
本发明的第八个目的是提供上述的紫心甘薯IbDRM基因在甘薯色素性状分子定向育种中应用。优选的，是在甘薯高花色素苷品种选育中的应用。
进一步的，所述的紫心甘薯IbDRM基因与甘薯花色素苷合成调控因子IbEBF2、IbERF73存在相互作用，以促进甘薯花色素苷生物合成。
本发明人通过酵母单杂交的方法从cDNA文库中筛选出促进IbbHLH2表达的上游调控因子包括IbEBF2、IbERF10和IbDRM，但是不同上游调控因子的作用位点不同。IbbHLH2启动子分成四段，第二和第三段具有控制不住的自激活活性，其中IbEBF2和IbDRM作用位点在第一段(位于启动子的前面)，而IbERF10作用位点在第四段(位于启动子的后面)。
进一步的，为了进一步验证筛选出来的上游调控因子IbDRM与启动子IbbHLH2结合，将IbDRM构建到pGADT7酵母重组表达载体，选择载体中EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ作为目的片段插入的酶切位点，合成引物序列见表2。将pGADT7-IbDRM酵母重组表达载体质粒与pAbAi-PIbbHLH2诱饵载体共同转化Y1HGold酵母中进行酵母单杂交实验，结果发现：阳性对照p53AbAi+AD53转化的菌株在SD/-Leu/AbA培养基上能够生长，而阴性对照pAbAi-PIbbHLH2+pGADT7空载转化的菌株不能在SD/-Leu/AbA培养基上生长。说明该酵母单杂交实验能够有效检测蛋白是否结合在启动子上。而pAbAi-PIbbHLH2+pGADT7-IbDRM在SD/-Leu/AbA培养基上能够生长(图1)，说明IbDRM蛋白能结合在启动子IbbHLH2上。
进一步的，为了验证启动子IbbHLH2与其上游转录因子IbDRM的相互作用，本发明将IbDRM构建到过表达载体pGreenII 0029 62-SK上，将PIbbHLH2插入到载体pGreenII0800-LUC荧光素酶的前端作为报告质粒，选择pGreenII 0029 62-SK载体中Sac I和Xho I及pGreenII 0800-LUC载体中的Kpn I和Nco I作为插入目的片段的酶切位点，构建载体引物序列见表2。将测序成功的重组菌液提取质粒后与PIbbHLH2+pGreenII 0800LUC重组质粒共同转入拟南芥原生质体中。结果显示IbDRM能够提高IbbHLH2启动子的活性(图2)，说明IbDRM能够促进IbbHLH2的表达。
进一步的，为了明确上游调控因子IbDRM的功能，本文构建了IbDRM与绿色荧光蛋白(GFP)的融合蛋白，对IbDRM的作用场所进行定位。通过构建亚细胞定位表达载体，选择载体中BamH Ⅰ和Hind Ⅱ作为目的片段插入的酶切位点，设计包含起始密码子不包含终止密码子的特定引物，合成引物序列见见表2。瞬时转化拟南芥原生质体后，利用激光共聚焦显微镜观察亚细胞定位情况，pCambia1300-GFP作为阳性对照。空载中的GFP蛋白能够在拟南芥原生质体的各个结构中表达，IbDRM蛋白在细胞核和细胞质中表达(图3)。
此外，本发明人通过酵母单杂交的方法成功从cDNA文库中筛选出启动子IbbHLH2的上游调控因子IbEBF2和启动子IbWD40的上游调控因子IbERF73。所述上游调控因子IbEBF2的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。所述上游调控因子IbERF73的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
进一步的研究了IbDRM与IbEBF2和IbERF73的相互作用，将IbDRM、IbEBF2和IbERF73与pGBKT-7载体连接进行毒性检测，观察pGBKT-7-上游调控因子载体与pGBKT-7空载载体在SD/-Trp培养基上单克隆菌落的生长情况，结果显示实验组和对照组单克隆菌落在数量和大小上无明显差异(图4)，说明pGBKT-7-上游调控因子载体对酵母没有毒性。
运用酵母双杂交检测上游调控因子之间的相互作用，将具有自激活活性的上游调控因子IbEBF2、IbERF73与pGADT-7连接构建重组载体，将IbDRM的与pGBKT-7连接构建重组载体，进行酵母双杂交实验检测其相互作用，结果显示，IbDRM与IbEBF2和IbERF73存在相互作用(图5)。
进一步的，本发明运用双分子荧光互补实验对酵母双杂交检测结果进行验证，以检测上述IbDRM与IbEBF2和IbERF73蛋白在植物细胞中是否存在相互作用。将IbEBF2和IbERF73与EYFP蛋白N端融合，IbDRM与EYFP蛋白C端融合，然后将带EYFP蛋白N端的融合质粒和带EYFP蛋白C端的融合质粒共转化到拟南芥原生质体中进行表达。
GFP荧光蛋白在拟南芥原生质体里面呈现组成型表达，在整个原生质体中都有表达，IbEBF2/IbERF73-nYFP+cYFP和nYFP+IbDRM-cYFP分别转到拟南芥原生质体中都没有检测到荧光信号，说明这4个蛋白与空载并没有相互作用，而共转到拟南芥原生质体后能够检测到明显的荧光信号，IbEBF2/IbERF73-nYFP+IbDRM-cYFP荧光信号在细胞质内(图6和图7)，说明在细胞质中IbEBF2和IbERF73蛋白与IbDRM蛋白可发生相互作用。
本发明的有益效果在于：通过酵母单杂交文库筛选实验，对启动子IbbHLH2的上游调控因子的筛选中成功获得了其上游调控因子IbDRM。通过酵母双杂交和双分子荧光互补实验，对参与紫心甘薯花色素苷合成的调控因子的相互作用和基因表达特进行了研究与分析，结果显示，IbDRM与IbEBF2和IbERF73存在相互作用。此发明结果在理论上可以丰富和深化植物花色素苷生物合成分子调控的基础理论；在应用上可以为紫心甘薯高花色素苷品种选育提供新的遗传标记，为其分子育种筛选出合适的操作元件或改造靶标，同时还可望为提高紫心甘薯块根中色素含量的栽培措施提供新的思路和线索。
附图说明
图1为IbbHLH2启动子与其上游调控因子IbDRM回转验证结果。阳性对照为p53AbAi+AD-53，阴性对照为PIbbHLH2-pAbAi+AD，阳性菌落(PIbbHLH2-pAbAi+IbDRM-AD)说明相应上游调控因子蛋白(IbDRM)能结合在IbbHLH2启动子上，AD：pGADT7。
图2为IbbHLH2启动子与其上游调控因子IbDRM的相互作用。
图3为IbDRM在拟南芥原生质体的亚细胞定位(标尺20μm)。A：绿色荧光图；B：叶绿体自发荧光；C：明场图；D：叠加图。
图4为上游调控因子的毒性检测。对照为pGBKT-7，BK：pGBKT-7。
图5为酵母双杂交检测上游调控因子的相互作用。阳性对照为AD-T+BK-53，阴性对照为AD-T+BK-Lam，阳性菌株(AD-IbEBF2+BK-IbDRM)和(AD-IbERF73+BK-IbDRM)说明IbDRM与IbEBF2和IbERF73之间存在相互作用，AD：pGADT-7，BK：pGBKT-7。
图6为双分子荧光互补实验检测IbDRM与IbEBF2在拟南芥原生质体的相互作用(标尺20μm)。A：绿色荧光图；B：叶绿体自发荧光；C：明场图；D：叠加图。
图7为双分子荧光互补实验检测IbDRM与IbERF73在拟南芥原生质体的相互作用(标尺20μm)。A：绿色荧光图；B：叶绿体自发荧光；C：明场图；D：叠加图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，下述实施例中试验方法如无特殊说明，均为常规试验方法，下述实施例中所述的实验试剂及耗材如无特殊说明，均来自常规生化试剂公司。
实施例1：构建紫心甘薯酵母单杂交cDNA文库
(1)用Trizol法从紫心甘薯(品系A5)块根提取RNA，用SMART技术逆转录合成双链的cDNA。
(2)扩增得到的cDNA要用TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit进行纯化处理，使dH2O溶出。
(3)对用限制性内切酶SfiI酶切后cDNA进行过柱处理，再经过PCI/CI净化处理，最终使ddH2O溶出。
(4)将pGADT7-SfiI vector(clontech,货号630490)与适量过柱后cDNA用DNAligation Kit连接。纯化精制连接液，得到初级cDNA文库。
(5)通过电转化的方法将少量初级文库连接液转入感受态细胞E.coli HST08；鉴定正确后，取适量的菌液涂布在含Amp抗性的LB平板上，37℃培养12h；通过平板上生长的菌落个数，计算初级文库库容。
(6)将扩增菌落进行过夜培养，然后进行质粒提取，得到文库质粒。
实施例2：构建pAbAi-PIbbHLH2诱饵载体
(1)以紫心甘薯块根DNA为模板，用TaKaRa高保真酶
Figure BDA0003416804200000081
Max DNAPolymerase扩增两端带有不同酶切位点末端的IbbHLH2的启动子DNA片段，扩增IbbHLH2的启动子DNA片段的PCR引物对的序列为PIbbHLH2-F：5'-TCCTAGCCAAGAAGAGTGGAGAGA-3'和PIbbHLH2-R：5'-TCTCATACCACCACACCCTAGTGG-3'。反应体系(20μL)如下：
Figure BDA0003416804200000091
PCR反应条件为：
Figure BDA0003416804200000092
(2)将启动子IbbHLH2(序列如SEQ ID NO.3所示)构建到pAbAi载体(柯蕾生物科技有限公司，货号kl-zl-0879)，步骤为：使用TaKaRa限制性内切酶QuickCutTM Hind III和QuickCutTM SmaⅠ对pAbAi质粒进行双酶切，合成引物序列见表2中的Pb2F/Pb2R，反应条件为37℃，酶切3h以上，反应体系如下：
Figure BDA0003416804200000093
Figure BDA0003416804200000101
经电泳检测正确的酶切产物进行切胶回收。
使用Clon Express II One Step Cloning Kit试剂盒(Vazyme)将目的片段和表达载体进行连接，反应条件为37℃，连接30min。反应体系如下：
Figure BDA0003416804200000102
(3)连接产物用于后续转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。
大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备(CaCl2法)：
(1)接种大肠杆菌DH5α到5mL的LB液体培养基中，在37℃下220rpm振荡培养过夜。
(2)转移过夜培养的2mL菌液到100mL的LB液体培养基中，继续振荡培养至OD600到0.5左右，冰上放置30min。
(3)取1mL菌液到到新的1.5mL离心管中，4℃，4000rpm离心10min，用移液枪吸走上清液。
(4)用移液枪吸取1mL预冷的0.1M CaCl2悬浮沉淀，轻吹混匀，冰上放置30min。
(5)4℃，4000rpm离心10min，用移液枪吸走上清液，用移液枪吸取0.2mL预冷的0.1M CaCl2悬浮沉淀，冰上放置5h即可用于转化。
连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞：
(1)取上述制备的大肠杆菌DH5α感受态细胞100μL到新的1.5mL离心管，于超净工作台中加入10μL的DNA连接产物，轻弹混匀后在冰上放置30min。
(2)将转化产物于42℃水浴锅中热激90s，取出立刻至于冰上5min。
(3)加入1mL不含抗性的LB液体培养基，37℃下180rpm振荡培养60～90min。
(4)室温5000rpm离心4min，在无菌条件下用移液枪吸走900μL上清液，轻吹重悬剩余200μL液体。
(5)将菌液均匀涂布于含有Amp的LB固体培养基中，放置30min晾干。
(6)37℃培养箱倒置培养12～16h。
阳性克隆的筛选与测序鉴定：
从培养皿上用无菌小枪头挑取抗性单菌落于含抗性的LB液体培养基中，37℃，220rpm振荡培养4h，取2μL上述菌液作为模板进行菌落PCR检测。取PCR反应中扩增得到与目的片段大小一致的阳性菌种的菌液200μL，送至上海生工生物有限公司进行测序。测序正确的菌液中加入20％的灭菌甘油于1.5mL离心管中，于-80℃冰箱保存。
实施例3：pAbAi-PIbbHLH2诱饵菌株自激活检测
将pAbAi-PIbbHLH2诱饵质粒转化Y1H酵母菌，得到诱饵菌株。采用自激活试验测试抑制诱饵菌株的最低AbA浓度，观察它们在SD/-Ura固体培养基上的生长情况，诱饵菌株自激活检测及最低AbA浓度的确定方法如下：
(1)AbA母液的配制：1mL无水乙醇溶解1mg AbA，配制成1mg/mL的AbA母液，于4℃下避光保存。
(2)从Y1H[pAbAi-prey]和Y1H[p53AbAi]的培养皿中挑取较大的单克隆菌落，用10μL的0.9％NaCl溶液重悬菌液，将重悬溶液稀释成10-1、10-2和10-3浓度梯度。
(3)吸取10μL重悬菌液点在SD/-Ura，SD/-Ura/AbA(100ng/mL～1000ng/mL)培养基上。
(4)若在某一浓度下菌落Y1H[pAbAi-prey]不生长，而对照组Y1H[p53AbAi]正常生长，则此浓度为抑制该重组酵母菌株的最低AbA浓度，可用于后续实验。
注：pAbAi-prey即为pAbAi-PIbbHLH2。
经检测，确定pAbAi-PIbbHLH2诱饵菌株的自激活AbA最低抑制浓度为300ng/mL。
实施例4：酵母单杂交文库筛选
酵母单杂交文库筛选方法按照Clontech公司Matchmaker Gold Yeast One-Hybrid Library Screening System说明书进行。酵母单杂交文库筛选方法如下：
(1)取25μL Yeastmaker Carrier DNA于95℃水浴5min使其变性，快速置于冰上数分钟，待温度降至4℃(重复一次)。
(2)在已经预冷的10mL离心管中依次加入：2.5mL PEG/LiAc，25μL变性的Yeastmaker Carrier DNA，15μg文库质粒(实施例1得到)，600μL Y1HGold感受态细胞(含诱饵表达载体pAbAi-PIbbHLH2)，涡旋混匀。
(3)将离心管置于30℃水浴锅中水浴45min，期间每隔15min轻轻倒混数次。
(4)加入160μL DMSO，轻柔混匀。
(5)在42℃水浴中温浴20min，期间每隔10min轻轻倒混数次。
(6)12000rpm离心30s，收集菌液，弃上清，加入8mL 0.9％NaCl溶液，重悬菌体。
(7)吸取200μL转化后的酵母菌液，均匀涂布于SD/-Leu、SD/-Leu/AbA培养皿上，AbA浓度为抑制自激活最低浓度(即300ng/mL)。
(8)30℃培养箱中倒置培养48～96h。
挑取单菌落进行菌落PCR鉴定，鉴定方法参考实施例2，选用通用引物pGADT7F/R对菌液进行PCR检测，pGADT7F/R引物序列见表1，选取电泳后较亮且条带单一的样品送上海生工生物有限公司测序，测序的结果在NCBI数据库进行BLAST，对测序结果进行分析。
表1主要载体通用引物
Figure BDA0003416804200000131
通过酵母单杂交的方法筛选得到了紫心甘薯IbbHLH2基因表达的上游调控因子为IbDRM，该上游调控因子IbDRM的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。并设计了上游调控因子IbDRM的扩增引物为IbDRM-F：5'-ATGGTTTTGATTGATAGGAGTTGGG-3'和IbDRM-R：5'-TTAACGGTGCTTGGATCTTGTTT-3'。
实施例5：上游调控因子IbDRM与启动子IbbHLH2结合的验证
将IbDRM构建到pGADT7酵母重组表达载体(上海联迈生物工程有限公司，货号LM-1639)，选择载体中EcoRⅠ和BamHⅠ作为目的片段插入的酶切位点，合成引物序列见表2中的IbDRM-ADF/IbDRM-ADR，构建方法参考实施例2。将pGADT7-IbDRM酵母重组表达载体质粒与pAbAi-PIbbHLH2诱饵载体共同转化Y1HGold单杂交酵母菌株中进行酵母单杂交实验。
酵母单杂交文库筛选方法按照Clontech公司Matchmaker Gold Yeast One-Hybrid Library Screening System说明书进行。酵母单杂交文库筛选方法如下：
(1)取25μL Yeastmaker Carrier DNA于95℃水浴5min使其变性，快速置于冰上数分钟，待温度降至4℃(重复一次)。
(2)在已经预冷的10mL离心管中依次加入：2.5mL PEG/LiAc，25μL变性的Yeastmaker Carrier DNA，15μg文库质粒，600μL Y1HGold感受态细胞，涡旋混匀。
(3)将离心管置于30℃水浴锅中水浴45min，期间每隔15min轻轻倒混数次。
(4)加入160μL DMSO，轻柔混匀。
(5)在42℃水浴中温浴20min，期间每隔10min轻轻倒混数次。
(6)12000rpm离心30s，收集菌液，弃上清，加入8mL 0.9％NaCl溶液，重悬菌体。
(7)吸取200μL转化后的酵母菌液，均匀涂布于SD/-Leu、SD/-Leu/AbA培养皿上，AbA浓度为抑制自激活最低浓度(即300ng/mL)。
(8)30℃培养箱中倒置培养48～96h。
挑取单菌落进行菌落PCR鉴定，选用通用引物pGADT7F/R(序列见表1)，选取电泳后较亮且条带单一的样品送上海生工生物有限公司测序，测序的结果在NCBI数据库进行BLAST，对测序结果进行分析。
结果发现：阳性对照p53AbAi+AD-53(即在pAbAi载体插入阳性对照53基因序列(Gene ID:2768677)得到p53AbAi，在pGADT7载体插入阳性对照53基因序列得到AD-53，构建方法参考实施例2)转化的菌株能够在SD/-Leu/AbA培养基上生长；而阴性对照pAbAi-PIbbHLH2+pGADT7空载转化的菌株不能在SD/-Leu/AbA培养基上生长；说明该酵母单杂交实验能够有效检测蛋白是否结合在启动子上。pAbAi-PIbbHLH2+pGADT7-IbDRM能够在SD/-Leu/AbA培养基上生长(图1)，说明IbDRM蛋白能结合在启动子IbbHLH2上。
实施例6：双荧光素酶报告系统载体的构建
将上游调控因子IbDRM的基因序列构建到过表达载体pGreenII 0029 62-SK(上海钦城生物科技有限公司，货号QCP0465)上，称之为效应质粒，将PIbbHLH2插入到载体pGreenII 0800-LUC(柯蕾生物科技有限公司，货号kl-zl-0808)荧光素酶的前端作为报告质粒。选择pGreenII 0029 62-SK载体中Sac I和Xho I及pGreenII 0800-LUC载体中的KpnI和Nco I作为插入目的片段的酶切位点，构建载体引物序列见表2中的IbPM1-0800F/IbPM1-0800R以及IbDRM-62-SKF/IbDRM-62-SKR，构建方法参考实施例2。
实施例7：拟南芥原生质体的制备及转化
1、拟南芥原生质体的制备步骤如下：
(1)配制酶解液于55℃水浴锅中预热。
(2)选择四周后抽苔前的野生型拟南芥叶片，将叶片下表皮撕掉后迅速放入酶解液中。
(3)25℃，50rpm避光振荡酶解50min，至叶肉细胞酶解完全，可在显微镜下观察原生质体的形态，当细胞较圆、透亮时状态比较好。
(4)用等体积的W5溶液稀释酶液，轻轻混匀，用清水洗干净75μm的尼龙网布，然后将其用W5溶液浸湿后过滤原生质体。
W5溶液的配制(100mL)：
Figure BDA0003416804200000161
(5)800rpm离心2min，尽量吸去上清，用1mL W5溶液重悬原生质体(重复此步骤三次)。
(6)将原生质体重悬于1mL W5溶液中，然后冰上放置30min备用。
2、拟南芥原生质体的转化步骤如下：
(1)2mL EP管中加入10～20μg的目的质粒(实施例6构建的IbDRM-pGreenII002962-SK重组质粒和PIbbHLH2-pGreenII 0800-LUC重组质粒)，加入100μL的拟南芥原生质体，轻轻混匀，加完后立即放冰上。
(2)加入110μL PEG/CaCl2，轻弹离心管使之混匀，室温孵育10min。
(3)在冰上加入220μL W5溶液，颠倒离心管使其混匀，冰上放置1min。
(4)再次向离心管加440μL W5溶液，轻轻颠倒，冰上放置1min。
(5)最后向离心管加880μL W5溶液，颠倒混匀，冰上放置1min。
(6)4℃800rpm离心3min，吸去上清。
(7)原生质体用500μL W5溶液重悬，22℃黑暗条件下培养16～20h。
实施例8：双荧光素酶报告系统的检测
使用Dual-
Figure BDA0003416804200000171
Reporter Assay(Promega)检测LUC和REN两种荧光素酶活性，具体步骤如下：
(1)100μL 1×PLB裂解液的制备：20μL 5×Passive Lysis Buffer加水至100μL。10mL LAR II的制备：吸取10mL冰上融化的Luciferase Assay Buffer II加入到Luciferase Assay Substrate中，轻轻摇晃使之溶解(-20℃可放置一个月，–70℃可放置一年)。100μL Stop&
Figure BDA0003416804200000172
Reagent的制备：吸取100μL Stop&
Figure BDA0003416804200000173
Buffer，加入2μL 50×Stop&
Figure BDA0003416804200000174
Substrate，可稍微涡旋使其混匀(在-20℃可放置15d)。
(2)取实施例7转化后的拟南芥原生质体溶液，4℃，13200rpm离心90s，除去W5溶液。
(3)加入100μL 1×PLB裂解液，轻轻吹打混匀后转移至24孔板中，置于水平摇床，室温低速晃动15min。
(4)收集裂解液，转移至1.5mL离心管中，4℃13200rpm离心10min，取上清液60μL置冰上待测荧光素酶。
(5)避光条件下，在黑色的96孔酶标板中加入100μL LAR II，然后加入20μL细胞裂解液，用枪头轻轻混匀2～3次，避免产生气泡。
(6)放入酶标仪中检测LUC的酶活性，并记录数据。
(7)取出96孔板，在同一孔中加入100μL Stop&
Figure BDA0003416804200000181
Reagent，用枪头轻轻混匀2～3次，整个操作过程要避免强光照射。
(8)放入酶标仪中检测REN的酶活性并记录数据。
(9)实验重复3次，取平均值，通过对比不同样品的LUC/REN的比值，检测转录因子对启动子的激活作用。
结果显示：IbDRM能够提高IbbHLH2启动子的活性(图2)，说明IbDRM能够促进IbbHLH2的表达。
实施例9：明确上游调控因子IbDRM的功能
构建了IbDRM与绿色荧光蛋白(GFP)的融合蛋白，对IbDRM的作用场所进行定位。将上游调控因子IbDRM的基因序列构建到亚细胞定位表达载体pCambia1300(上海联迈生物工程有限公司，货号LM1375)上，选择pCambia1300载体中BamH Ⅰ和Hind Ⅱ作为目的片段插入的酶切位点，设计包含起始密码子不包含终止密码子的特定引物，合成引物序列见表2中的IbDRM-1300F/IbDRM-1300R，构建方法参考实施例2。然后将IbDRM-pCambia1300瞬时转化拟南芥原生质体后，利用激光共聚焦显微镜观察亚细胞定位情况，以pCambia1300-GFP作为阳性对照。空载中的GFP蛋白能够在拟南芥原生质体的各个结构中表达，IbDRM蛋白在细胞核和细胞质中表达(图3)。
表2构建载体使用引物序列(下划线为酶切位点)
Figure BDA0003416804200000191
实施例10：IbDRM与IbEBF2和IbERF73的相互作用研究
1、毒性检测
将上游调控因子IbDRM与IbEBF2和IbERF73分别与pGBKT-7载体(上海联迈生物工程有限公司，货号LM-8123)连接，构建pGBKT-7-上游调控因子载体(即pGBKT-7-IbEBF2、pGBKT-7-IbDRM和pGBKT-7-IbERF73)，选择载体中EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ作为目的片段插入的酶切位点，合成引物序列见表2中的IbDRM-BDF/IbDRM-BDR，构建方法参考实施例2。以pGBKT-7空载载体作为对照组，将pGBKT-7-上游调控因子载体和pGBKT-7空载载体分别转化Y2H酵母菌，将转化后的菌液均匀涂布在SD/-Trp培养基上生长，进行毒性检测，观察pGBKT-7-上游调控因子载体与pGBKT-7空载载体在SD/-Trp培养基上单克隆菌落的生长情况，结果显示实验组和对照组单克隆菌落在数量和大小上无明显差异(图4)，说明pGBKT-7-上游调控因子载体对酵母菌没有毒性。
2、酵母双杂交检测IbDRM与IbEBF2和IbERF73之间的相互作用
运用酵母双杂交检测上游调控因子IbDRM与IbEBF2和IbERF73之间的相互作用，将具有自激活活性的上游转录调控因子IbEBF2和IbERF73与pGADT-7连接构建重组载体(pGADT7-IbEBF2和pGADT7-IbERF73)，将IbDRM的与pGBKT-7连接构建重组载体(pGBKT7-IbDRM)，以pGADT7+pGBKT7-53(AD-T+BK-53，即在pGBKT7插入阳性对照53基因序列Gene ID:2768677得到pGBKT7-53)作为阳性对照，以pGADT7+pGBKT7-Lam(AD-T+BK-Lam)作为阴性对照，进行酵母双杂交实验检测其相互作用，具体步骤为：
(1)酵母感受态细胞的制备
使用Yeastmaker Yeast Transformation System 2进行酵母感受态细胞的制备，具体步骤如下：
①将Y2HGold酵母菌株在YPDA固体培养基上划线活化，30℃倒置培养3d。
②从YPDA固体培养基中挑取单菌落于30mL液体YPDA培养基中，30℃、220rpm振荡培养8～12h，使其OD600达到1.4～1.5之间。
③吸取酵母菌液接种于100mL的液体YPDA培养基中，调OD600至0.1～0.2之间，30℃250rpm培养2～3h，使其OD600达到0.5。
④将上述菌液用2个50mL离心管分装，室温下5000rpm离心5min后弃上清。
⑤加入25mL无菌水重悬菌体，5000rpm离心5min后弃上清，重复该步骤两次。
⑥加入600μL 1.1×TE/LiAc重悬菌体，置于冰上备用。
(1)Y2HGold酵母转化
酵母转化参照Yeastmaker Yeast Transformation System 2进行，具体步骤如下：
①取5μL Yeastmaker Carrier DNA于95℃水浴5min使其变性，快速置于冰上数分钟，待温度降至4℃(重复一次)。
②在已预冷的1.5mL离心管中依次加入：500μL PEG/LiAc(50μL TE，50μL LiAc和400μL PEG4000)，5μL变性的Yeastmaker Carrier DNA，100ng重组融合表达质粒，50μLY2HGold感受态细胞，涡旋混匀，置于30℃恒温培养箱中孵化30min(期间每隔10min轻轻倒混数次)。
③加入20μL DMSO，轻柔混匀，置于42℃水浴中15min(期间每隔5min轻轻倒混数次)。
④12000rpm离心30s，弃上清，加入0.9％NaCl溶液1mL，重悬菌体。
⑤吸取200μL转化后的酵母菌液，涂布于SD/-Trp培养皿上。
⑥30℃培养箱中倒置培养48～96h。
结果显示，IbDRM与IbEBF2和IbERF73之间存在相互作用(图5)。
3、双分子荧光互补实验检测IbDRM与IbEBF2之间的相互作用
运用双分子荧光互补实验对酵母双杂交检测结果进行验证，以检测上述蛋白在植物细胞中是否存在相互作用。以pSAT6-cEYFP-C1(上海海吉浩格生物科技有限公司，HH-ZW-006)作为融合载体，将IbEBF2、IbERF73与EYFP蛋白N端融合，IbDRM与EYFP蛋白C端融合，合成引物序列见表2中的EBF2-nYFP-F/EBF2-nYFP-R、ERF73-nYFP-F/ERF73-nYFP-R、DRM-cYFP-F/DRM-cYFP-R，然后将带EYFP蛋白N端的融合质粒和带EYFP蛋白C端的融合质粒共转化到拟南芥原生质体中进行表达。
GFP荧光蛋白在拟南芥原生质体里面呈现组成型表达，在整个原生质体中都有表达，IbEBF2/IbERF73-nYFP+cYFP和nYFP+IbDRM-cYF分别转到拟南芥原生质体中都没有检测到荧光信号，说明这4个蛋白与空载并没有相互作用，而共转到拟南芥原生质体后能够检测到明显的荧光信号，IbEBF2/IbERF73-nYFP+IbDRM-cYFP荧光信号在细胞质内(图6和图7)，说明在细胞质中IbEBF2和IbERF73蛋白与IbDRM蛋白可发生相互作用。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 广东省科学院南繁种业研究所
<120> 一种紫心甘薯IbDRM基因及其应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 117
<212> PRT
<213> 甘薯(Ipomoea batatas)
<400> 1
Met Val Leu Ile Asp Arg Ser Trp Asp Asp Val Arg Arg His Val Asp
1 5 10 15
Gln Gly Phe Asp Lys Leu Arg Ala Gln Thr Val Thr Val Lys Thr Asn
20 25 30
Ser Gly Val Gly Glu Gly Ser Ser Lys Phe Gln Arg Ser Leu Ser Met
35 40 45
Pro Val Ser Pro Val Gly Pro Met Thr Pro Thr Thr Pro Ser Pro Thr
50 55 60
Gly Ala Arg Lys Asp Asn Val Trp Arg Ser Val Phe Asn Pro Gly Ser
65 70 75 80
Asn Leu Ala Thr Lys Asn Ile Gly Ala Gln Val Phe Asp Lys Pro Lys
85 90 95
Asn Thr Asn Ser Pro Thr Val Tyr Asp Trp Leu Tyr Ser Gly Glu Thr
100 105 110
Arg Ser Lys His Arg
115
<210> 2
<211> 354
<212> DNA
<213> 甘薯(Ipomoea batatas)
<400> 2
atggttttga ttgataggag ttgggatgat gttcgtagac atgtagatca aggttttgac 60
aagcttcgcg cgcagacagt tactgtcaaa acaaattctg gggttggaga aggatccagc 120
aagttccaga gatcgttgtc gatgccggtc agccctgtag gtccgatgac accaaccacg 180
ccgtcgccca cgggggcgcg taaagataac gtgtggagga gcgttttcaa ccccggcagc 240
aacctcgcca ccaagaacat cggcgcccag gttttcgaca agcctaagaa taccaactcc 300
cctactgttt atgactggct atacagtggt gaaacaagat ccaagcaccg ttaa 354
<210> 3
<211> 1021
<212> DNA
<213> 甘薯(Ipomoea batatas)
<400> 3
cggccgcttt attggtgaag ggtaagacaa gaatttgtag ccacgcataa cttataatct 60
taagtatgat gatcatattt tattcattaa gctactcttt ttggagtaac catatcatgt 120
ttgtctaatt tttcatttaa tagctagaga gaatatttaa agatcataaa tttgattttt 180
gtcaaaattt tcttagtcga tagctgcaca aaattttctt agtgtagttt acctctgcag 240
tgtggtctgc aagttgttac atattaataa aatttattca aataaactct cagataataa 300
aatggggttt cttataaaaa aaataaaaat taaaaataaa ctataggaac agaaaatagg 360
catactcttg ataaataaga gatgatgaag aattgaagac ctcttgtgcg cagagtgcac 420
aagtaagcga tgaaaacttg aagacagata aggcaactta caatttacct ctactagaaa 480
ttcttaggta gtatgtggtt ctgaacgttt agaattaatt agagttgtcg catggtagct 540
tgatcaattg gtcacatgtg tgaagtttgg aagaagaaat caaggatcga gtctcatcag 600
tggcaatgta ggagcaaccc cttaaagtga gggggtcctt gtgcctggtt tagtccactg 660
aggctcaaat ccacccccat ccaccccata tgaaggtgaa accgggtgtc actaaatcac 720
aagtctttga cagaagaatt aaatagagct gaaaaaccta actaaattta taataaacaa 780
aaaaaaaaaa gtgacactag tatagtaata tgatacacgt gggacacata aaaggcaagg 840
acaaaaacct aatcttgaat tctcctattt tgtcgtctct ttcccagtcc caatacccga 900
ccggttgaca ccaaccagtc aaaatccaac tccccgacaa acaaataaat tcaaccttaa 960
cccctctccg gtctgcaact cttaatttca tatgtaaacc actctgtctc acatctttcc 1020
c 1021
<210> 4
<211> 286
<212> PRT
<213> 甘薯(Ipomoea batatas)
<400> 4
Met Ala Ser Ser Asp Gln Thr Val Leu Gln Ile Ser Ser Pro Ser Ser
1 5 10 15
Thr Thr Leu Ser Ala Arg Val His Pro Leu Val Ile Phe Asn Ile Cys
20 25 30
Asp Cys Phe Val Arg Arg Pro Asp Gln Ala Glu Arg Val Ile Gly Thr
35 40 45
Leu Leu Gly Ser Val Leu Pro Asp Gly Thr Val Asp Ile Arg Asn Ser
50 55 60
Tyr Ala Val Pro His Asn Glu Ser Gln Asp Gln Val Ala Leu Asp Ile
65 70 75 80
Asp Tyr His His Asn Met Leu Ala Ser His Gln Lys Val Asn Pro Lys
85 90 95
Glu Val Ile Val Gly Trp Phe Ser Thr Gly Phe Gly Val Ser Gly Gly
100 105 110
Ser Ala Leu Ile His Asp Phe Tyr Thr Arg Glu Val Thr Asn Pro Ile
115 120 125
His Leu Thr Val Asp Thr Gly Phe Thr Asn Gly Glu Ala Thr Ile Lys
130 135 140
Ala Phe Ile Ser Val Asn Leu Ser Leu Gly Asp Gln Pro Leu Ala Ala
145 150 155 160
Gln Phe Gln Glu Ile Pro Leu Asp Leu Arg Met Ile Glu Ala Glu Arg
165 170 175
Val Gly Phe Asp Met Leu Lys Thr Thr Val Val Asp Lys Leu Pro Asn
180 185 190
Asp Leu Glu Gly Met Glu Ala Ser Met Glu Arg Leu Leu Ala Leu Ile
195 200 205
Asn Asp Val His Lys His Val Asp Asp Val Val Glu Gly Arg Val Pro
210 215 220
Ala Asp Asn Asn Leu Gly Arg Leu Ile Ser Glu Thr Val Asn Ser Ile
225 230 235 240
Pro Lys Leu Ser Pro Gln Glu Phe Asp Lys Leu Val Asn Asp Ser Leu
245 250 255
Gln Asp Gln Leu Leu Leu Leu Tyr Leu Ser Ser Ile Thr Arg Thr Gln
260 265 270
Leu Ser Leu Ala Glu Lys Leu Asn Thr Ala Ala Gln Ile Leu
275 280 285
<210> 5
<211> 861
<212> DNA
<213> 甘薯(Ipomoea batatas)
<400> 5
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gctagggttc acccgctggt gattttcaac atctgcgact gctttgtccg gcgacccgac 120
caagccgagc gcgtcattgg tacgcttctc ggatccgtct tacccgacgg caccgtcgat 180
attcgcaact cctatgccgt tcctcacaac gagtcccaag atcaggttgc tttggatatt 240
gattatcatc ataacatgtt ggcatcccat cagaaagtga atcctaagga agtcattgtt 300
ggatggtttt ccactgggtt tggagtttca ggcggtagcg ctctaatcca tgatttttac 360
actagagaag ttacaaatcc tatccatttg actgttgaca ctggattcac aaatggggag 420
gctaccatca aagcttttat ttctgtgaat ttgtcacttg gggatcaacc tcttgctgca 480
cagttccaag aaattccatt ggacttgcga atgattgaag ctgagcgggt tggatttgat 540
atgctgaaga caacagtggt tgacaaactt ccaaatgacc tagaaggaat ggaggcatca 600
atggagagat tacttgctct gatcaatgat gttcacaaac atgttgatga tgttgtggaa 660
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ccaaaactat caccacaaga atttgataag cttgtgaatg acagtcttca ggatcaattg 780
ctcctactat atttgtcgag catcacaaga acacaactca gcttggctga aaagttgaac 840
actgctgctc agatcctgta a 861
<210> 6
<211> 271
<212> PRT
<213> 甘薯(Ipomoea batatas)
<400> 6
Met Cys Gly Gly Ala Ile Ile Ser Asp Ile Lys Pro Pro Val Arg Thr
1 5 10 15
Ser Arg Arg Leu Thr Ser Glu Leu Leu Trp Gly Ser Ala Asp Arg Ser
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Ser Ala Gly Gly Lys Lys Lys Lys Asn Phe Ala Gly Ser Tyr Tyr Ser
35 40 45
Gly Gly Leu Arg Ser Ala Ala Phe Asp Leu Asp Asn Glu Phe Glu Ala
50 55 60
Asp Phe Gln Asp Phe Asn Asp Tyr Asp Asp Asp Glu Gly Val Glu Leu
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Asp Val Lys Pro Phe Pro Phe Gly Leu Ser Ser Gly Phe Ser Ser Asp
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Ser Lys Asp Phe Asp Gln Ser Met Lys Arg Lys Arg Lys Asn Gln Tyr
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Arg Gly Ile Arg Gln Arg Pro Trp Gly Lys Trp Arg Leu Lys Ser Val
115 120 125
Ile Arg Val Lys Val Leu Glu Ser Gly Glu Leu Ser Thr Leu Leu Lys
130 135 140
Lys Leu Arg Glu Pro Met Ile Leu Arg Leu Gly Gly Ser Glu Ala Thr
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Lys Leu Ser Ile Ser Leu Leu Lys Leu Lys Gln Asn Arg Leu Gly Ala
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Pro Ser Arg Ile His Gly Arg Trp Phe Leu Arg Arg Ile Asn Leu Met
180 185 190
Arg Val Thr Trp Thr Ile Ala Ile Met Ile Leu Val Phe Trp Asn Lys
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Asn Arg Gln Asn Cys Thr Ile Pro Trp Glu Ile Trp Asp Cys Tyr Leu
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Val Met Gln Thr Phe Ile Ser Phe Trp Trp Lys Gln Phe Leu Gly Leu
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<212> DNA
<213> 甘薯(Ipomoea batatas)
<400> 7
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atagctatta tgatcctatg agtgttttgg aacaaaaacc gccagtgaaa ctgtacgatt 660
ccgtgggaga tatgggactg ctatctggtg atgcaaacct ttatttcatt ctgatggtgg 720
aagcaattcc ttggactgta ttgagcatgg ttcgaggact ccagagatat cctctgctct 780
gtcggctggt gttgaagctg atgagattca gttcattcag gaaaccaacc cacaaaagaa 840
actga 845

Claims (10)

1.一种紫心甘薯IbDRM基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.权利要求1所述的紫心甘薯IbDRM基因的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.含有权利要求1所述的紫心甘薯IbDRM基因的重组载体或重组菌。
4.含有权利要求1所述的紫心甘薯IbDRM基因的转基因细胞系或表达盒。
5.一种权利要求1所述的紫心甘薯IbDRM基因的扩增引物，其特征在于，所述的扩增引物为IbDRM-F：5'-ATGGTTTTGATTGATAGGAGTTGGG-3'和IbDRM-R：5'-TTAACGGTGCTTGGATCTTGTTT-3'。
6.权利要求1所述的紫心甘薯IbDRM基因在促进甘薯IbbHLH2转录因子表达中的应用。
7.权利要求1所述的紫心甘薯IbDRM基因在促进甘薯花色素苷生物合成中的应用。
8.权利要求1所述的紫心甘薯IbDRM基因在甘薯色素性状分子定向育种中应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，是在甘薯高花色素苷品种选育中的应用。
10.根据权利要求7-9任一项所述的应用，其特征在于，所述的紫心甘薯IbDRM基因与甘薯花色素苷合成调控因子IbEBF2、IbERF73存在相互作用，以促进甘薯花色素苷生物合成。
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