CN109679966B

CN109679966B - AcMYB123和AcbHLH42基因在调控猕猴桃果肉花青素合成中的应用

Info

Publication number: CN109679966B
Application number: CN201910040576.3A
Authority: CN
Inventors: 刘永胜; 唐维; 王梨嬛; 杨瑛
Original assignee: Anhui Agricultural University AHAU
Current assignee: Benli High Efficiency Ecological Agriculture Comprehensive Development Jiangsu Co ltd
Priority date: 2019-01-16
Filing date: 2019-01-16
Publication date: 2020-09-11
Anticipated expiration: 2039-01-16
Also published as: CN109679966A

Abstract

本发明公开了AcMYB123和AcbHLH42基因在调控猕猴桃果肉花青素合成中的应用，涉及植物分子基因工程技术领域，本发明中的AcMYB123基因具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，AcbHLH42基因具有如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。本发明的有益效果在于：获得红阳猕猴桃花青素合成代谢调控的候选基因，在此基础上构建重组质粒，利用生物化学与分子生物学以及转基因技术手段探讨猕猴桃果实花青素积累的分子调控机理，为优良猕猴桃品种的选育提供新的技术途径。

Description

AcMYB123和AcbHLH42基因在调控猕猴桃果肉花青素合成中的应用

技术领域

本发明涉及植物分子遗传与基因工程技术领域，具体涉及AcMYB123和AcbHLH42基因在调控猕猴桃果肉花青素合成中的应用。

背景技术

猕猴桃果实富含多种营养成分，包括维生素、类黄酮/花青素、类胡萝卜素、氨基酸、矿质元素等，被誉为“Vc之王”、“水果之王”。猕猴桃已作为高价值农作物在世界各地广泛栽培。而中国是猕猴桃原产地，世界猕猴桃的分布中心，有着丰富的种质资源。中华猕猴桃红阳(Actinidia chinensis Planch.)是第一个商业化栽培的红肉(因富含花青素)猕猴桃品种。因其口感好、营养丰富、果肉红色，深受消费者喜爱，商业价值远高于普通猕猴桃品种。

花青素的富集是红阳猕猴桃果肉呈现红色的原因，花青素是水溶性的植物色素，赋予花瓣和果实鲜艳的颜色，吸引动物授粉和种子传播。花青素属于黄酮类化合物，具很强的抗氧化能力。在植物抵御生物胁迫(病原体入侵)和非生物胁迫时(低温、紫外损伤、缺氮)，花青素能消耗超氧离子减少氧化损伤；在动物体内花青素可以起到抗肿瘤、预防心血管疾病，提高免疫力的作用。可见，研究猕猴桃果实花青素合成积累的调控机制具有重要的理论和实际意义。

发明内容

本发明解决的技术问题在于提供AcMYB123和AcbHLH42基因在调控猕猴桃果肉花青素合成中的应用，从而调控果肉花青素的积累。

本发明是采用以下技术方案解决上述技术问题的：

AcMYB123和AcbHLH42基因在调控猕猴桃果肉花青素合成中的应用，所述AcMYB123基因具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，所述AcbHLH42基因具有如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

优选的，所述AcbHLH42基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述AcbHLH42基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

优选的，所述AcMYB123和AcbHLH42基因均分离自红阳猕猴桃内外果肉。

优选的，所述AcMYB123和AcbHLH42基因的真核重组质粒为pHB-AcMYB123/AcbHLH42。

优选的，所述pHB-AcMYB123/AcbHLH42重组质粒为双基因重组质粒，将AcMYB123与AcbHLH42全长基因分别构建在过表达载体的pHB载体的MCS区域与原Bar区。

优选的，所述AcMYB123基因和所述AcbHLH42基因在调控猕猴桃果肉花青素合成中的应用，包括以下步骤：

(1)构建双基因重组质粒pHB-AcMYB123/AcbHLH42；

(2)经PCR酶切验证正确后形成35S::AcMYB123+35S::AcbHLH42，并转化农杆菌；

(3)采用瞬时或农杆菌介导的稳定转化法，将双基因重组质粒pHB-AcMYB123/AcbHLH42导入猕猴桃、烟草或拟南芥中。

优选的，所述双基因重组质粒pHB-AcMYB123/AcbHLH42质粒的构建方法为将AcMYB123与AcbHLH42全长基因分别构建在过表达载体的pHB载体的MCS区域与原Bar区。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明中AcMYB123和AcbHLH42基因能相互作用形成复合体，共同激活花青素合成途径中的关键酶基因AcANS和AcF3GT1的表达，从而调控猕猴桃花青素的积累；

(2)本发明利用红阳猕猴桃内、外果肉差异积累花青素的特点，从内、外果肉差异基因表达成功获得红阳猕猴桃花青素合成代谢调控的候选基因，在此基础上构建重组质粒，利用生物化学与分子生物学以及转基因技术手段探讨猕猴桃果实花青素积累的分子调控机理，为优良猕猴桃品种的选育提供新的技术途径；

(3)本发明的制备过程中所需材料易于获得，且制备方法简单。

附图说明

图1为农杆菌瞬时表达本氏烟叶片的GUS染色图；

图2为农杆菌瞬时表达本氏烟叶片的GUS酶活测定；其中(a)为AcF3GT1启动子，(b)为AcANS启动子；

图3为GUS激活实验将AcF3GT1与AcANS启动子代替原本pBI121载体上35S启动子的重组质粒(p AcF3GT1/pAcANS::GUS)示意图；

图4为AcMYB123和AcbHLH42的BiFC互作结果图，其中YFP为黄色荧光；DAPI为将细胞核染成蓝色；叶绿体为红色自发荧光，标尺为10μm；

图5为AcMYB123和AcbHLH42的Co-IP结果图；

图6为RNAi真核重组质粒(pTCK303-AcMYB123/AcbHLH42-RNAi)的示意图；

图7为双基因过表达真核重组质粒(pHB-AcMYB123/AcbHLH42)的示意图；

图8为过表达真核重组质粒pHB-AcMYB123的示意图；

图9为过表达真核重组质粒pHB-AcbHLH42的示意图；

图10为注射20天后RNAi技术抑制红阳猕猴桃果肉花青素的红阳果实表型图；

图11为RNAi技术抑制红阳猕猴桃果肉花青素积累的结果图，其中(b)为总花青素含量；(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)为通过qRT-PCR分别分析AcMYB123，AcbHLH42，AcF3GT1，AcANS，AcF3GT1，AcANS，AcF3GT1，AcANS在红阳内果肉中的相对表达水平，横坐标中R为RNAi组，Co为注射空载体的对照组；

图12为注射双基因表达载体的软枣猕猴桃‘宝贝星’的果肉颜色变化图，其中(i)为注射双基因表达载体的果实；(ii)为只注射空载体的果实，比例尺为0.5cm；

图13为注射双基因表达载体的软枣猕猴桃果肉中花青素含量的测定结果图；横坐标中OE为实验组，Co为注射空载体的对照组；

图14为注射双基因表达载体的软枣猕猴桃果肉中AcMYB123、AcbHLH42、AcF3GT1、AcANS的相对表达水平，其中(c)为AcMYB123，(d)为AcbHLH42，(e)为AcF3GT1，(f)为AcANS；

图15为烟草中共表达AcMYB123和AcbHLH42增强花青素积累的结果图，其中(i)和(ii)为在烟草叶片不同区域注射空载体、35S::AcMYB123、35S::AcbHLH42、35S::AcMYB123+35S::AcbHLH42的烟草颜色变化图；(iii为)对应(i)中20倍明场显微镜下的叶肉细胞图；(iv)为对应(i)中花青素提取液图；

图16为注射区域总花青素含量测定结果图；

图17为注射区域AcMYB123，AcbHLH42，Nt3GT1，NtANS的相对表达水平；其中(c)为AcMYB123，(d)为AcbHLH42，(e)为Nt3GT1，(f)为NtANS；

图18为萌发8天的野生型(WT)、稳定转化单基因35S::AcMYB123、转化单基因35S::AcbHLH42和杂交双基因35S::AcMYB123×35S::AcbHLH42；比例尺1mm；

图19为半定量检测转基因植株基因表达图，其中AtActin2为内参基因；

图20为拟南芥中稳定共转化AcMYB123和AcbHLH42增强花青素积累；其中(b)为总花青素测量测定图，(d)、(e)为qRT-PCR检测转基因拟南芥下游基因AtUF3GT和AtANS相对表达量的结果图。

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，如Sambrook,Russell的分子克隆，实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

下述实施例中所用的试验材料和试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1基因的克隆及GUS激活实验

1.1实验材料

本实施例中所采用的植物材料为生长6周野生型本氏烟(Nicotianabenthamiana)。

1.2载体与菌株

本实施例中采用的载体为植物过表达载体：pHB vector、pBI121vector及

-Blunt Simple；

pHB vector：多克隆位点前面是烟草花叶病毒2×CaMV35S启动子，该载体携带农杆菌转移的T-DNA区域，区域内带有用于筛选转基因植物Bar基因和潮霉素抗性基因(Hyg)；

pBI121vector：携带烟草花叶病毒CaMV35S启动子，β-葡糖醛酸酶基因(GUS)，携带农杆菌转移的T-DNA区域，该区域带具有用于筛选转基因植物的抗卡钠霉素NPTII基因；

pEASY-blunt Simple Cloning Kit，该载体全长3830bp，可与pfuPCR产物直接相连，无多克隆位点，Amp&Kana抗性，可进行蓝白斑筛选，适用于平末端克隆；

大肠杆菌(Escherichia coil)DH5ɑ、根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens)GV3101：均购自北京全式金生物技术有限公司。

1.3试剂

植物RNA提取试剂盒V1.2含DNase I：购自BIOFIT公司；

HiFiScript Quick gDNA Removal cDNA Kit快速去基因组cDNA第一链合成试剂盒、

Max DNA Polymerase(TaKaRa)、

II One Step Cloning Kit(Vazyme)、Trans2K Plus DNA Marker、2×Taq Master Mix、Trans1-T1Phage ResistantChemically Competent Cell化学感受态细胞、T4DNA Ligase、

-blunt SimpleCloning Kit：购自北京全式金生物技术有限公司；

Gel Extraction Kit快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、2×Taq Master Mix、Plasmid Mini Kit快速质粒小提试剂盒：购自北京康为世纪公司；

M&S BASAL MEDIUM w/VITAMINS、X-gluc粉末：购自西美杰公司；

琼脂糖、DMSO、氨苄青霉素(Ampicillin，Amp)、硫酸卡那霉素(Kanamycin，Kan)、利福平(Rifampin,Rif)、壮观霉素(Spectinomycin，Sep)MES、乙酰丁香酮(Acetosyringone)购自Sigma公司；

常用限制性内切酶：购自Fermentas公司；

0.45μm滤器、蛋白胨和酵母提取物：购自OXOID公司。

主要实验溶液的配制：

培养大肠杆菌100mL LB培养基：酵母粉0.5g，胰蛋白胨1g，NaCl 1g，若固体再加1.2g琼脂，NaOH调pH至7.0，高温高压灭菌；

培养农杆菌100mL YEP培养基：酵母粉1g，胰蛋白胨1g，NaCl 0.5g，若固体再加1.2g琼脂，NaOH调pH至7.0，高温高压灭菌；

扩大培养农杆菌100mL YEB培养基：酵母粉0.1g，胰蛋白胨0.5g，蔗糖0.5g，牛肉浸膏0.5g，NaOH调pH至7.0，高温高压灭菌；

100mL注射烟草MS培养基：0.44g MS粉容于100mL ddH₂O 100mL 0.5M MES：21.32gMES固体溶于100mL ddH₂O，用0.45μm滤器过滤灭菌后分装保存于-20℃；

乙酰丁香酮ACE：粉剂，用70％乙醇溶解，配制成10mg/mL的水溶液，-20℃保存备用；

100mL注射烟草农杆菌恢复培养液悬浮液MMAi：MS液体培养基99mL，MES1mL，ACE100μL；

100mL 1M Tris·HCl(pH 8.0)：80mL水中溶解12.1l g Tris碱，HCl调pH至8.0，ddH₂O定容至100mL；

100mL 0.5M EDTA(pH 8.0)：80mL水中溶解18.61g EDTA·2H₂O，NaOH(约2.5g)调节pH至8.0，ddH₂O定容至100mL；

GUS染色液：100mmol/L pH7.0磷酸钠缓冲液，0.5mg/mL X-gluc(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷酸环己胺盐)，1％TritonX-100，1％DMSO，10mmol/L EDTA，-20℃保存；

1000×氨苄青霉素：溶解1g氨苄青霉素钠盐到10mL ddH₂O中，用0.45μm滤器过滤灭菌后分装保存于-20℃；

1000×卡那霉素：溶解1g卡那霉素于10mL ddH₂O中，用0.45μm滤器过滤灭菌后分装，保存于-20℃；

500×利福平：溶解0.5g利福平于10mL甲醇中，分装保存于-20℃；

1000×壮观霉素：溶解0.3g壮观霉素于10mL水中，0.45μm滤器抽滤灭菌后分装，保存于﹣20℃。

PCR引物由华大基因合成；其余试剂均为进口分装或国产分析纯产品。

1.4实验方法

1.4.1猕猴桃内外果肉总RNA的提取

中华猕猴桃红阳果实取自于安徽省合肥市安徽农业大学农翠园内五年生树，其内外果肉总RNA提取参照BIOFIT公司植物RNA提取试剂盒V1.2含DNase I说明书。

1.4.2引物设计

根据中华猕猴桃红阳基因组数据库(http://bioinfo.bti.cornell.edu/cgi-bin/kiwi/home.cgi)预测到的基因序列，Gene ID为Ach24g242211.1和Ach17g348381.2，使用Primer 5.0软件设计引物，并且添加检验酶切位点，引物序列如下：

AcbHLH42oF:5'-aagcttATGGCGGCTCCCCCTA-3'；

AcbHLH42oR：5'-ggatccTTGCCACATCAAAT TATTAAA-3'；

AcMYB123oF：5'-ggatc cATGGGGAGGAGTCCGTG-3'；

AcMYB123oR：5'-gagctcCTAAGGCCATTCCTCACAAT-3'。

1.4.3PrimeSTAR PCR扩增体系及条件

20μL反应体系Template cDNA1.0μL；5×PrimeSTAR 10μL；Forward and ReversePrimer(10μM)0.5μL；DMSO 0.5μL ddH₂O 7.5μL。反应条件：预变性95℃4min；变性98℃15sec；退火55℃15sec；延伸72℃20sec(扩增效率10sec/1kb)；循环数30cycles；充分延伸72℃10min；4℃保存。

1.4.4载体构建

选用中间克隆载体pEASY-blunt Simple Cloning Kit和同源重组

II One Step Cloning Kit，根据最终载体上酶切位点的搭配程度采取不同的构建方式。

胶回收纯化PCR产物：将PCR产物琼脂糖凝胶电泳后割胶回收，将其纯化产物送华大基因公司测序验证。回收纯化步骤参考康为世纪速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒：PCR产物连接pEASY-blunt Simple，转化大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞，Amp&Kana LB固体培养基筛选，得到的单克隆质粒经普通PCR与酶切双验证后送华大基因公司测序。

PCR产物连接pEASY-blunt Simple体系及连接条件：2.5μL PCR产物，0.5μLpEASY-blunt Simple，混合产物25℃保温20min；转化Trans1-T1：将连接产物加入预冷的30μL Trans1-T1感受态细胞中，冰上放置30min，42℃水浴热激30sec，立刻放置冰上，加入LB液体培养基，摇床恢复培养1h，4000rpm离心，弃掉多余培养基，涂Amp&Kana LB固体平板蓝白斑筛选；

同源重组法直接连接最终载体，反应体系：ddH₂O up to 20μL，5×CE II Buffer4μL，线性化最终载体50-200ng，目的基因PCR回收产物50-200ng，Exnase II 2μL，充分混匀37℃孵育30min。连接产物可以直接转化大肠杆菌，方法同上。

普通PCR验证：以筛选的单克隆菌落为模板，20μL反应体系：模板1μL，2×TaqMaster Mix 10μL(扩增效率1kb/30sec)，上下游引物(10μm)各0.3μL，ddH₂O 8.7μL；反应条件：预变性94℃2min，变性94℃30sec，退火60℃30sec，延伸72℃15sec，循环次数30cycles，充分延伸72℃2min，12℃保存；双酶切验证：将PCR验证正确的单克隆菌落于Amp&Kana LB液体培养基37℃摇床培养过夜，提取质粒方法参照Plasmid Mini Kit快速质粒小提试剂盒，用对应的限制性内切酶双酶切验证，琼脂糖电泳显示切出目的基因片段。胶回收转录因子目的基因片段，用T4DNA Ligase按一定比例与相同酶切粘性末端的pHB载体相连；结构基因AcANS和AcF3GT1克隆其启动子PCR产物纯化后与pBI121载体相连，连接产物转化大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞，用Kana抗性LB固体培养基平板筛选，得到单克隆PCR与酶切双验证后转化根瘤农杆菌GV3101感受态细胞。

酶切体系及反应条件：80μL反应体系，克隆载体质粒与最终空载体质粒40μL，10×buffer8μL，内切酶各2μL，ddH₂O 30μL，37℃保温40min；

胶回收产物连接体系及反应条件：20μL反应体系，10×T4DNA Ligase buffer 2μL，T4DNA Ligase 1μL，目的基因回收产物7μL，载体回收产物10μL，25℃保温20min；

转化根瘤农杆菌GV3101：

(1)100μL感受态细胞，冰上解冻；

(2)各加10重组质粒，轻轻混匀，冰浴30min；

(3)液氮中速冻5min，37℃水浴5min，然后加入1mL YEP培养基，28℃摇床培养4h；

(4)4,000rpm离心5min去多余培养基区适量菌液涂在含Kan&Rif的YEP固体平板培养基上，28℃培养36h。

1.4.5农杆菌注射侵染本氏烟瞬时表达及GUS染色

(1)划线活化农杆菌，挑单菌落于Kan&Rif YEP液体培养基28℃摇床培养12h；

(2)按1:100比例将活化的菌液接于YEB液体培养基中28℃扩大培养4-6h，直至OD600吸光值达到0.6-0.8；

(3)4000rpm离心5min，弃上清；用1/4体积MMAi重悬浮液轻轻悬浮菌体，25℃低转速摇床培养1h；

(4)之后将pAcF3GT1::GUS和pAcANS::GUS分别与过表达35S::AcMYB123和35S::AcbHLH42、等体积相互排列组合混合均匀；正对照为pBI121空载体，都于冰上放置备用；

(5)选取培养6周的本氏烟叶片，将不同组合的菌液以针孔渗透法注射进烟草叶片中；3d之后将针孔附近1cm的烟草叶片用圆形打孔器打下；

(6)用GUS染色液37℃孵育24h；

(7)将已染色的叶片用乙醇梯度浓度洗脱，将叶片中的叶绿素漂洗干净。

1.5实验结果

如图1所示，pAcF3GT1::GUS+35S::AcMYB123+35S::AcbHLH42叶片经染色呈蓝色，pAcF3GT1::GUS、pAcF3GT1::GUS+35S::AcMYB123和pAcF3GT1::GUS+35S::AcbHLH42叶片经染色均不产生蓝色，pAcANS::GUS单独注射便可产生自激活，酶活结果如图2所示，pAcANS::GUS+35S::AcMYB123+35S::AcbHLH42的组合酶活明显高于pAcANS::GUS、pAcANS::GUS+35S::AcMYB123和pAcANS::GUS+35S::AcbHLH42的酶活。图3为GUS激活实验将AcF3GT1与AcANS启动子代替原本pBI121载体上35S启动子的重组质粒(pAcF3GT1/pAcANS::GUS)示意图。

实施例2AcMYB123与AcbHLH42的蛋白之间的相互作用

2.1实验材料

植物材料为生长6周野生型本氏烟(Nicotiana benthamiana)。

2.2载体与菌株

本实施例中采用的载体为植物双分子荧光载体：pSPYNE vector和pSPYCE vector及免疫共沉淀Co-IP载体：pBTEX-HA vector和pBTEX-FLAG vector，大肠杆菌(Escherichiacoil)DH5ɑ，根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)GV3101。

2.3试剂

纤维素酶Cellulase R-10、离析酶Macerozyme R-10：购自Yakult公司；

0.025％DAPI：购自BOSTER公司；

金牌超量无内毒素质粒大提试剂盒GoldHi EndoFree Plasmid Maxi Kit，SDS-PAGE Gel Kit购自康为世纪生物科技有限公司；

PVDF、ClarityTM Western ECL Substrate：购自BIO-RAD公司；

ɑ-HA(Sigma-Aldrich)、ɑ-HA琼脂糖微球affinity matrix：购自Sigma公司；

烟草原生质体的制备酶解母液：1L StockI：NaH₂PO₄·2H₂O 1.5g，CaCl₂·2H₂O 9g，KNO₃25g，NH₄NO₃ 2.5g，(NH4)₂SO₄ 1.3g，ddH₂O定容；1L Stock II：1％EDTA铁钠盐；1L StockIII：CuSO₄·7H₂O 12.5mg，CoCl₂·6H₂O 12.5mg，ddH₂O定容；100mL Stock IV：KI 7.5mg，MnSO₄·H₂O 100mg，ZnSO₄·7H₂O 20mg，H₃BO₃ 30mg，Na₂MoO₄·2H₂O 2.5mg，MgSO₄ 2.5g，ddH₂O定容；100mL Stock V：Thianine HCl 100mg，Nicotinic Acid 10mg，Pyridoxine HCl10mg，m-Inositol 1g，Xylose 2.5g；

烟草原生质体的制备酶解液：Stock I 100mL；Stock II 5mL，Stock III 2mL，Stock IV 10mL，Stock V 10mL，蔗糖136.8g，cellulase R10 3g，macerozyme R10 1.5g，20mM MES pH 5.7，BSA 1％；500mL W5wash buffer：NaCl 4.5g，葡萄糖0.5g，CaCl₂·2H₂O9.2g，KCl 0.2g，ddH₂O定容；5mL PEG solution buffer：PEG 4000 4g，H₂O 1.5mL，mannitolbuffer 1.25mL，Ca(NO₃)₂buffer 0.5mL，ddH₂O定容；10mL WI solution buffer：mannitolbuffer 0.25mL，MES buffer 0.2mL，KCl buffer 0.4mL，ddH₂O 3.15mL 5mL MMG solutionbuffer：mannitol buffer 2.5mL，MgCl₂buffer 0.5mL，MES buffer 0.1mL，ddH₂O定容；100mL R250考马斯亮蓝染液：考马斯亮蓝R250 0.25g，溶解于10mL冰乙酸，甲醇50mL，ddH₂O定容；脱色液：乙醇50mL，冰醋酸100mL，ddH₂O 300mL；5mL 1×SDS-PAGE loading buffer：250mM Tris-HCl(pH 6.8)；10％(w/v)SDS；0.5％(w/v)溴酚蓝；50％(v/v)甘油；5％(v/v)mMβ-巯基乙醇；1L 5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液：Tris 15.1g，甘氨酸94g，SDS 5g，ddH₂O定容；1L转膜缓冲液：Tris 3.03g，甘氨酸14.4g，SDS1g，甲醇200mL，ddH₂O定容；1L TBST buffer：NaCl 8.8g，1M Tris-HCl(pH8.0)20mL，TritonX-100 0.5mL，ddH₂O定容；植物蛋白提取buffer：50mM Tris-HCl(pH 7.5),150mM NaCl,5mM EDTA,2mM DTT,10％glycerol,1％polyvinylpolypyrolidone(PVPP),1mM PMSF；免疫共沉淀washing buffer：50mM Tris-HCl(pH 7.5),250mM NaCl,5mM EDTA,10％glycerol,1mM PMSF；其余试剂同实施例1。

2.4实验方法

2.4.1植物BiFC载体的构建

设计AcMYB123与AcbHLH42基因的双分子荧光互补BiFC载体引物，运用同源重组方法将目的基因全长分别构建在pSPYNE vector和pSPYCE vector上形成重组质粒pSPYNE-AcMYB123与pSPYCE-AcbHLH42。

2.4.2无内毒素质粒大提

将BiFC重组质粒转入大肠杆菌Trans1-T1后，将验证正确的单克隆种于150mL液体培养基过夜培养，大量提取无内毒素质粒，方法参照康为世纪金牌超量无内毒素质粒大提试剂盒。

2.4.3本氏烟叶片原生质体的制备

(1)将配好的原生质体酶解液吸取一些在培养皿中，将其覆盖住培养皿底部，取生长6周左右的健康本氏烟叶片，去除叶脉部分，将叶片切成不等的片状用金刚砂轻轻磨去叶片背面的表层，被磨面朝下平铺于置于原生质体酶解液上，使其与酶解液充分接触，28℃，避光酶解8h；

(2)酶解结束后，用200目尼龙膜过滤，置于15mL干净离心管中用，在原生质体液中上方轻轻盖上1mL的W5buffer，水平离心100rpm，2min；

(3)吸取原生质层与W5层交汇处悬浮的原生质体，置于干净的2mL离心管中预冷的加入15mL W5缓冲液重悬原生质体，冰上暗置1.5-2h。

2.4.4高纯质粒转化本氏烟原生质体

(1)分别取质量良好的原生质体200μL分装到2mL的圆底离心管中，加入等量组合质粒1μg/μL 20-40μg。其中实验组pSPYNE-AcMYB123与pSPYCE-AcbHLH42；负对照组：pSPYNE-AcMYB123与pSPYCE、pSPYNE与pSPYCE-AcbHLH42、pSPYNE与pSPYCE；

(2)加220μL PEG solusion buffer，迅速轻轻混匀，室温静置5min，加1mLW5buffer，轻轻混匀，100rpm离心1min，去上清，并重复该步骤一次；

(3)加1mL WI solusion buffer重悬原生质体，25℃暗孵育6-12h。

2.4.5原生质体转化后的固定及染色

(1)将孵育后的原生质体转化液于室温，100rpm离心2min，除上清后加入5倍体积的0.5％的戊二醛固定液，轻轻混匀，室温放置20min；

(2)离心移除上清，用5倍体积的W5buffer洗2次；

(3)加入5倍体积的0.025％DAPI染液，轻轻颠倒混匀，室温放置30min；

(4)离心移除上清，再用5倍体积的W5buffer洗2次；

(5)最后移去上清，剩余大约100-200μL原生质体溶液；取适量原生质体在LeicaTCS SPII激光共聚焦显微镜60×油镜，观察荧光。激发通道分别为435nm(蓝/DAPI)、515nm(黄色/YFP)和680nm(红色/叶绿素)。

2.4.6植物Co-IP载体的构建

设计AcMYB123与AcbHLH42基因的免疫共沉淀Co-IP载体引物，运用同源重组方法将目的基因全长分别构建在pBTEX-HA vector和pBTEX-FLAG vector上形成重组质粒pBTEX-AcMYB123-FLAG与pBTEX-AcbHLH42-HA，将验证正确的重组质粒转化农杆菌GV3101中。

2.4.7注射本氏烟并提取蛋白的western blot

将转化的农杆菌GV3101按照针孔渗透法注射本氏烟中，25℃培养3d后取针孔附近叶片，-70℃备用。

SDS-page电泳及western blot配制蛋白胶：方法参照康为世纪SDS-PAGE Gel Kit胶制备试剂盒。准备样品，上样：往蛋白样品中加入等体积的2×SDS上样缓冲液后，在沸水浴中处理8min，往电泳装置中加入1×SDS PAGE电泳缓冲液后，上样后开始电泳，当溴酚蓝指示带达到分离胶低端时，停止电泳，卸下胶；转膜、封闭与显影：将胶分离下，在转膜缓冲液中平衡15min，取适当大小的PVDF膜，在甲醇中浸泡40sec后，转入干净的ddH₂O中5min，再转入在转膜buffer中平衡15min，同时滤纸和海绵也需放入转膜buffer中平衡。按照负极-海绵-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-海绵-正极顺序安装转膜夹层，100V电压电泳1h完成转膜；转膜结束后，将PVDF膜取出，用5％的脱脂奶粉同TBST buffer配成封闭液，将膜全部浸入封闭液，室温封闭过夜；将膜取出后，用TBST buffer清洗3次每次10min(水平摇床)，加入封闭液稀释的一抗，室温孵育2h；将膜取出，再用TBST buffer缓冲液，漂洗3次，每次10min；加入用封闭液稀释的二抗，室温孵育1h；将膜取出，再用TBST buffer缓冲液，漂洗3次，每次10min(水平摇床)；将清洗干净的膜正面朝上用Clarity^TMWestern ECL Substrate显影成像。

2.4.8免疫共沉淀Co-IP

(1)液氮研磨适量取样叶片，加入植物蛋白提取液，提取同时表达带有FLAG的AcMYB123和带有HA标签的AcbHLH42总蛋白，其中负对照为带有FLAG标签的GFP，将提取液和研磨叶片充分混合，经过4℃12,000rpm离心，取上清，直到没有沉淀产生，测定不同样品中的总蛋白浓度；

(2)取相应偶联抗体ɑ-HA的琼脂糖微球affinity matrix，加入1mL免疫共沉淀漂洗液，5000rpm离心3min，多重复几遍，加入上一步总蛋白液，4℃低温颠倒孵育2h；

(3)取出孵育后样品，4℃5000rpm离心3min，再加入1mL免疫共沉淀漂洗液，5000rpm离心3min，多重复几次后，加入适量2×SDS PAGE loading buffer，沸水浴8min后，上样进行蛋白电泳及western blot分析。

2.5实验结果

2.5.1BiFC

将转化质粒的本氏烟原生质体在激光共聚焦显微镜60×油镜下观察，如图4所示，YFP为黄色荧光；DAPI为将细胞核染成蓝色；叶绿体为红色自发荧光，标尺为10μm；发现实验组pSPYNE-AcMYB123与pSPYCE-AcbHLH42会在原生质体的细胞核中产生黄色荧光；负对照组：pSPYNE-AcMYB123与pSPYCE、pSPYNE与pSPYCE-AcbHLH42、pSPYNE与pSPYCE都不会产生荧光，初步证明AcMYB123与AcbHLH42蛋白有相互作用。

2.5.2Co-IP

将AcbHLH42-HA与AcMYB123-FLAG或GFP-FLAG通过农杆菌介导法共同瞬时表达本氏烟草叶片，提取农杆菌浸润区域叶片提取总蛋白。将总蛋白通过偶联琼脂糖微球(affinity matrix)过滤，经western blot，分别与ɑ-HA抗体和ɑ-FLAG抗体杂交得到如图5。结果显示：input泳道与所对应标签偶联的抗体杂交，均可显示目的片段；经ɑ-HA affinitymatrix过滤的实验组(AcbHLH42-HA与AcMYB123-FLAG)，HA与FLAG抗体均可杂出对应条带如图5所示，综上结果可以说明AcMYB123与AcbHLH42之间确实存在相互作用。

实施例3瞬时转化烟草、猕猴桃

3.1实验材料

植物材料为生长6周野生型普通烟草(Nicotiana tabacum)；中华猕猴桃‘红阳’70DAA左右(内果肉还没开始合成花青素之前)未采摘的果实。

3.2载体、菌株与试剂

3.3实验方法

3.3.1猕猴桃RNAi载体构建

根据AcMYB123与AcbHLH42全长序列，避开该基因家族可能重叠的序列区域，设计该目的基因RNAi干扰引物，片段大小在400bp-500bp之间，将其构建在过表达载体pTCK303上，将目的基因的两个相同的片段分别加在MCS1与MCS2上形成发卡结构，再将整个发卡结构酶切构建在植物过表达载体pHB上。PCR酶切验证正确之后形成35S::AcMYB123-RNAi和35S::AcbHLH42-RNAi，转化农杆菌GV3101，图6为RNAi真核重组质粒(pTCK303-AcMYB123/AcbHLH42-RNAi)的示意图。

3.3.2猕猴桃双基因过表达载体构建

将AcMYB123与AcbHLH42全长基因分别构建在过表达载体的pHB vector的MCS区域与原Bar区，形成一个双基因表达载体。PCR酶切验证正确之后形成35S::AcMYB123+35S::AcbHLH42，转化农杆菌GV3101，图7为双基因过表达真核重组质粒(pHB-AcMYB123/AcbHLH42)的示意图。

3.3.3基因沉默‘红阳’

本实验采用烟草瞬时表达的方法，将活化好的农杆菌，将实验组：35S::AcMYB123-RNAi、35S::AcbHLH42-RNAi与负对照组：pHB注射约400μL，70DAA时期左右的活体‘红阳’中，至少重复3个独立果实，注射20-30d后采集样品，观察其内部颜色变化并区分内外果肉于-80℃贮藏。分别提取实验组及对照组果实内外果肉总RNA，反转呈cDNA一链，并以其为模板，通过qRT-PCR检测其干扰基因的表达情况，以及下游目的基因的表达。

3.3.4瞬时表达烟草

同样采用烟草瞬时表达法，将实验组以及负对照组35S::AcMYB123，35S::AcbHLH42与pHB注射进生长6周的的本氏烟叶片中，5-7d观察其表型，并将注射针孔附近的叶片取下并于-70℃贮藏。取分别实验组及对照组叶片总RNA，反转呈cDNA一链，并以其为模板，通过qRT-PCR检测其过表达基因的表达情况，以及下游目的基因的表达。图8为过表达真核重组质粒pHB-AcMYB123的示意图；图9为过表达真核重组质粒pHB-AcbHLH42的示意图。

3.3.5瞬时表达软枣猕猴桃

将双基因表达载体35S::AcMYB123+35S::AcbHLH42采用烟草瞬时表达法，注射100DAA软枣猕猴桃‘宝贝星’5-7d观察其表型，将果肉-70℃贮藏。取分别实验组及对照组pHB空载体叶片总RNA，反转呈cDNA一链，并以其为模板，通过qRT-PCR检测其过表达基因的表达情况。

3.4实验结果

3.4.1基因沉默‘红阳’果实

如图10和图11所示，5S::AcMYB123-RNAi、35S::AcbHLH42-RNAi和阴性对照空载体pHB农杆菌70DAA左右‘红阳’猕猴桃果实；注射20-30d后取样观察，发现注射侵染了35S::AcMYB123-RNAi和35S::AcbHLH42-RNAi的实验组与阴性对照组相比果实中柱的红色花青素的积累明显受到抑制。

3.4.2同时过表达‘宝贝星’

如图12、图13和图14所示，将携带35S::AcMYB123+35S::AcbHLH42双基因表达载体的农杆菌GV3101，注射100DAA的软枣猕猴桃‘宝贝星’，5-7d后观察发现，注射双基因表达载体的果实原本绿色的果肉明显变红，而只注射空载体的果实颜色仍然为绿色。

3.4.3瞬时过表达烟草叶片

将构建的双基因表达载体35S::AcMYB123+35S::AcbHLH42、35S::AcMYB123、5S::AcbHLH42和空载体pHB，分别注射生长6周的烟草叶片，5-7d便可以观察到叶片积累花青素的表型。如图15(i)和图15(ii)所示其中注射双基因的针孔浸润区域叶片颜色明显变红，而只分别注射单基因或空载体的区域，叶片颜色依然为绿色。将注射针孔附近的叶片剪下在显微镜20×明场下观察发现：没有注射的区域与只注射单基因的区域烟草的叶片细胞呈绿色，而注射双基因过表达的叶片细胞则呈现红色如图15(iii)所示。如图15(iv)所示，将实验组与对照组叶片用液氮研磨提取花青素，可以发现对照组的提取液体呈蓝绿色而实验组则呈淡红色。如图16和图17所示，基因表达量也增长明显，且花青素含量显著提升。

实施例4稳定转化拟南芥

4.1实验材料

植物材料为处于开花期野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana，Columbia)。

4.2载体、菌株与试剂

同实施例1。

4.3实验方法

活化OD＝0.8的35S::AcMYB123和35S::AcbHLH42，运用浸花法，浸泡侵染处于开花期的野生型拟南芥30sec，黑暗培养12h后，在正常条件下继续培养，直到种子成熟。收到的种子在basta抗性的1/2MS培养基上进行筛选，直到纯合。将纯合的两种转基因拟南芥35S::AcMYB123为母本，35S::AcbHLH42父本，进行杂交。得到的双基因表达拟南芥种子，在1/2MS的培养基上萌发，观察表型。取分别实验组(双基因表达)及对照组(单基因表达及野生型)叶片总RNA，反转呈cDNA一链，并以其为模板，通过qRT-PCR检测其过表达基因的表达情况，以及下游目的基因的表达。

4.4实验结果

如图18、图19和图20所示，经过阳性鉴定的稳定转化的纯合拟南芥35S::AcMYB123和35S::AcbHLH42，经过杂交得到双基因共同过表达的杂交系，通过对萌发8d的幼苗进行观察发现，双基因幼苗较单基因和野生型相比，叶片变紫的概率显著提升。

以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅限于上述实施例，与本发明构思无差异的各种工艺方案均在本发明的保护范围内。

序列表

<110> 安徽农业大学

<120> AcMYB123和AcbHLH42基因在调控猕猴桃果肉花青素合成中的应用

<130> 100

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 801

<212> DNA

<213> Actinidia chinensis Planch.

<400> 1

atggggagga gtccgtgctg ctccaaggaa ggactcatca gaggagcatg gactgccgtg 60

gaagatagaa cacttacagc ttatattaaa gctcatggag aaggcaaatg gagaaacctc 120

cccaagagag cgggtttgaa gagatgtggc aagagttgta gactgagatg gttgaattat 180

cttagaccag acatcaagag aggaaacata tcccatgagg aggaggaact catcgtaaga 240

ctccataagc ttcttggaaa cagatggtct ttaatagctg gaaggcttcc aggacgaaca 300

gacaatgaaa tcaagaatta ctggaatact actttgggaa agaaaatcag accgcaaacc 360

tctcgagagt catccaaaaa caatctgaca aggaaatcca aaggaaaaca gccagtcatc 420

ccaccaccac catcggcaat ccgaaccaag gccgttaggt gcgcaaaact cctggcccca 480

gcaaagtctc ctccaactcc tggccctctc tttctcaacc aaccagtgga aaagtcattc 540

gcagtacttg aagaaaatca aagccagatc tccaaaaatc ctctgctgtg tgtggaaaat 600

tctcatggaa cagaaccatt agaattcagc tttcatgatc aatttcacca caacaatggt 660

ttgtgcttgg agggtctgga tgatcacgac atggtgttca aggactggac agcgagtcat 720

gagtttcttg aggttgaggg caattgcact ttggatctag aatctttggc ttccttgctt 780

gattgtgagg aatggcctta g 801

<210> 2

<211> 2070

<212> DNA

<213> Actinidia chinensis Planch.

<400> 2

atggcggctc cccctagtac caggctgcaa ggcatgttac agacggcggt gcaatcggtg 60

caatggactt atagcctctt ctggcagttg tgtcctcaac aaggaatctt agtatgggga 120

gatgggtatt acaatggagc aatcaagaca aggaagacag tattaccaat agaggtcagc 180

gcggaggagg cgtctctcca aagaagccag cagctgagag aactatatga ttctctctct 240

gctggcgagt ccaatcagcc aacaaggcgg ccttgtgccg ctttgtcccc ggaggacttg 300

acggagtccg agtggttcta cctcatgtgt gtctccttct ctttccctcc cggtgttgga 360

ttaccaggaa aagcatacgc gaagaggcag catgtttggc ttaccggagc gaacgaggtc 420

gatagcaaag tcttttcgag agccattctt gccaagagtg ctcgtgttca gactgtagtg 480

tgtattcctc tactagatgg agttgttgag cttggtaata cagaaagggt acaagaagat 540

attggtttca ttcaccaagt caagtccttc tttattgatc accaccctcc tccaccgccc 600

aagccagccc tctccgagca ctccacctcc aacctggcca cctcctccgt ccacccccgc 660

ttccactccc ctccactccc cctcacgtat gcccccctcg accccccact catcgccaac 720

caaatccaca tggaagaaga acaagaacaa gaacaagaag aagatgacga tgacgacgat 780

gacgatgacg acgaagaaga agccgagtca gactcggaag cccacaccgg gctcaacagc 840

gaggcccaga accctcgcgt ggaccatgtg gctcgtgcag cggccgagcc aagcgagcta 900

atgcagctcg agatgtcaga agatatccgg ctcgggtcac ccgatgacgg gtcgaataac 960

atggacccgg attttcagtt gatggtggcg agccaaggtg gcaacccggc ggatcagcag 1020

cagcgagttg actcgtttag ggccgagtct actcgccggt gggccctatt gcaggaccct 1080

ttgggcagga gtctccaagc acctacttca ggtgggactg gactagatga attaacgcaa 1140

gacgacacgc actactctca aactgtctcg accattctcc agcaccaatc aaaccggtgg 1200

ttggagtcct catcatcgtc cgccgccggc tgcctcatgt actcctccca atcgtcattc 1260

tccaagtggc cgctccgacc ctccgaccac caccaccaag ccgacgccac ctctcagtgc 1320

ctactcaaat acatcctctt caccgttccc ttcctccact ccaagtaccg cgacgacaac 1380

aactccccca aatccgccac cgctgccgac tccgcctccc gcttccgcaa gccgacgccg 1440

caggacgagc tctcggccaa tcacgtcctc gccgagcgac gccgccgcga gaagctcaac 1500

gagcgcttca tcattctcag atctctagtc cctttcgtca ccaaaatgga caaggcctcg 1560

attctggggg acacgatcga gtacgtgaag caattgcgca aaaatattca agatctcgag 1620

gctagggcac gtcagatcga aatcgatcaa cgatccagat cgtcggggga cccgcagagg 1680

agcggcgcaa aggcggcgac ggacaagagg aaattgagga tcgtggaggc gagcggaggg 1740

gcgaagggga aggcggtgga ttccgtggcg gtggcaactc caccgcctcc ggcgccgccg 1800

cagccggtgg ctggagtggg tgtgcaggtg caggtgtcga taatcgagag cgacgcgttg 1860

gttgagctgc agtgcacgca tagggagggg ttgttgctgg acgtgatggt ggtgctccgg 1920

gaccatcggg tggaggtcac cgccgtgcaa tcttcgttga ccaatggggt atttgtggcc 1980

gagttgaggg caaaggtgaa agaaaacgta aatggaaaga agccaagtat tgtggaagta 2040

aagagagcaa tacaccaaat cataccctag 2070

<210> 3

<211> 266

<212> PRT

<213> Actinidia chinensis Planch.

<400> 3

Met Gly Arg Ser Pro Cys Cys Ser Lys Glu Gly Leu Ile Arg Gly Ala

1 5 10 15

Trp Thr Ala Val Glu Asp Arg Thr Leu Thr Ala Tyr Ile Lys Ala His

20 25 30

Gly Glu Gly Lys Trp Arg Asn Leu Pro Lys Arg Ala Gly Leu Lys Arg

35 40 45

Cys Gly Lys Ser Cys Arg Leu Arg Trp Leu Asn Tyr Leu Arg Pro Asp

50 55 60

Ile Lys Arg Gly Asn Ile Ser His Glu Glu Glu Glu Leu Ile Val Arg

65 70 75 80

Leu His Lys Leu Leu Gly Asn Arg Trp Ser Leu Ile Ala Gly Arg Leu

85 90 95

Pro Gly Arg Thr Asp Asn Glu Ile Lys Asn Tyr Trp Asn Thr Thr Leu

100 105 110

Gly Lys Lys Ile Arg Pro Gln Thr Ser Arg Glu Ser Ser Lys Asn Asn

115 120 125

Leu Thr Arg Lys Ser Lys Gly Lys Gln Pro Val Ile Pro Pro Pro Pro

130 135 140

Ser Ala Ile Arg Thr Lys Ala Val Arg Cys Ala Lys Leu Leu Ala Pro

145 150 155 160

Ala Lys Ser Pro Pro Thr Pro Gly Pro Leu Phe Leu Asn Gln Pro Val

165 170 175

Glu Lys Ser Phe Ala Val Leu Glu Glu Asn Gln Ser Gln Ile Ser Lys

180 185 190

Asn Pro Leu Leu Cys Val Glu Asn Ser His Gly Thr Glu Pro Leu Glu

195 200 205

Phe Ser Phe His Asp Gln Phe His His Asn Asn Gly Leu Cys Leu Glu

210 215 220

Gly Leu Asp Asp His Asp Met Val Phe Lys Asp Trp Thr Ala Ser His

225 230 235 240

Glu Phe Leu Glu Val Glu Gly Asn Cys Thr Leu Asp Leu Glu Ser Leu

245 250 255

Ala Ser Leu Leu Asp Cys Glu Glu Trp Pro

260 265

<210> 4

<211> 689

<212> PRT

<213> Actinidia chinensis Planch.

<400> 4

Met Ala Ala Pro Pro Ser Thr Arg Leu Gln Gly Met Leu Gln Thr Ala

1 5 10 15

Val Gln Ser Val Gln Trp Thr Tyr Ser Leu Phe Trp Gln Leu Cys Pro

20 25 30

Gln Gln Gly Ile Leu Val Trp Gly Asp Gly Tyr Tyr Asn Gly Ala Ile

35 40 45

Lys Thr Arg Lys Thr Val Leu Pro Ile Glu Val Ser Ala Glu Glu Ala

50 55 60

Ser Leu Gln Arg Ser Gln Gln Leu Arg Glu Leu Tyr Asp Ser Leu Ser

65 70 75 80

Ala Gly Glu Ser Asn Gln Pro Thr Arg Arg Pro Cys Ala Ala Leu Ser

85 90 95

Pro Glu Asp Leu Thr Glu Ser Glu Trp Phe Tyr Leu Met Cys Val Ser

100 105 110

Phe Ser Phe Pro Pro Gly Val Gly Leu Pro Gly Lys Ala Tyr Ala Lys

115 120 125

Arg Gln His Val Trp Leu Thr Gly Ala Asn Glu Val Asp Ser Lys Val

130 135 140

Phe Ser Arg Ala Ile Leu Ala Lys Ser Ala Arg Val Gln Thr Val Val

145 150 155 160

Cys Ile Pro Leu Leu Asp Gly Val Val Glu Leu Gly Asn Thr Glu Arg

165 170 175

Val Gln Glu Asp Ile Gly Phe Ile His Gln Val Lys Ser Phe Phe Ile

180 185 190

Asp His His Pro Pro Pro Pro Pro Lys Pro Ala Leu Ser Glu His Ser

195 200 205

Thr Ser Asn Leu Ala Thr Pro Ser Val His Pro Arg Phe His Ser Pro

210 215 220

Pro Leu Pro Leu Thr Tyr Ala Pro Leu Asp Pro Pro Leu Ile Ala Asn

225 230 235 240

Gln Ile His Met Glu Glu Glu Gln Glu Gln Glu Gln Glu Glu Asp Asp

245 250 255

Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Glu Glu Glu Ala Glu Ser Asp Ser

260 265 270

Glu Ala His Thr Gly Leu Asn Ser Glu Ala Gln Asn Pro Arg Val Asp

275 280 285

His Val Ala Arg Ala Ala Ala Glu Pro Ser Glu Leu Met Gln Leu Glu

290 295 300

Met Ser Glu Asp Ile Arg Leu Gly Ser Pro Asp Asp Gly Ser Asn Asn

305 310 315 320

Met Asp Pro Asp Phe Gln Leu Met Val Ala Ser Gln Gly Gly Asn Pro

325 330 335

Ala Asp Gln Gln Gln Arg Val Asp Ser Phe Arg Ala Glu Ser Thr Arg

340 345 350

Arg Trp Ala Leu Leu Gln Asp Pro Leu Gly Arg Ser Leu Gln Ala Pro

355 360 365

Thr Ser Gly Gly Thr Gly Leu Asp Glu Leu Thr Gln Asp Asp Thr His

370 375 380

Tyr Ser Gln Thr Val Ser Thr Ile Leu Gln His Gln Ser Asn Arg Trp

385 390 395 400

Leu Glu Ser Ser Ser Ser Ser Ala Ala Gly Cys Leu Met Tyr Ser Ser

405 410 415

Gln Ser Ser Phe Ser Lys Trp Pro Leu Arg Pro Ser Asp His His His

420 425 430

Gln Ala Asp Ala Thr Ser Gln Cys Leu Leu Lys Tyr Ile Leu Phe Thr

435 440 445

Val Pro Phe Leu His Ser Lys Tyr Arg Asp Asp Asn Asn Ser Pro Lys

450 455 460

Ser Ala Thr Ala Ala Asp Ser Ala Ser Arg Phe Arg Lys Pro Thr Pro

465 470 475 480

Gln Asp Glu Leu Ser Ala Asn His Val Leu Ala Glu Arg Arg Arg Arg

485 490 495

Glu Lys Leu Asn Glu Arg Phe Ile Ile Leu Arg Ser Leu Val Pro Phe

500 505 510

Val Thr Lys Met Asp Lys Ala Ser Ile Leu Gly Asp Thr Ile Glu Tyr

515 520 525

Val Lys Gln Leu Arg Lys Asn Ile Gln Asp Leu Glu Ala Arg Ala Arg

530 535 540

Gln Ile Glu Ile Asp Gln Arg Ser Arg Ser Ser Gly Asp Pro Gln Arg

545 550 555 560

Ser Gly Ala Lys Ala Ala Thr Asp Lys Arg Lys Leu Arg Ile Val Glu

565 570 575

Ala Ser Gly Gly Ala Lys Gly Lys Ala Val Asp Ser Val Ala Val Ala

580 585 590

Thr Pro Pro Pro Pro Ala Pro Pro Gln Pro Val Ala Gly Val Gly Val

595 600 605

Gln Val Gln Val Ser Ile Ile Glu Ser Asp Ala Leu Val Glu Leu Gln

610 615 620

Cys Thr His Arg Glu Gly Leu Leu Leu Asp Val Met Val Val Leu Arg

625 630 635 640

Asp His Arg Val Glu Val Thr Ala Val Gln Ser Ser Leu Thr Asn Gly

645 650 655

Val Phe Val Ala Glu Leu Arg Ala Lys Val Lys Glu Asn Val Asn Gly

660 665 670

Lys Lys Pro Ser Ile Val Glu Val Lys Arg Ala Ile His Gln Ile Ile

675 680 685

Pro

Claims

1.AcMYB123和AcbHLH42基因在调控猕猴桃果肉花青素合成中的应用，所述AcMYB123基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述AcbHLH42基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2.根据权利要求1所述的AcMYB123和AcbHLH42基因在调控猕猴桃果肉花青素合成中的应用，其特征在于：通过构建AcMYB123和AcbHLH42基因的真核重组质粒pHB-AcMYB123-AcbHLH42来调控猕猴桃果肉花青素的合成。

3.根据权利要求2所述的AcMYB123和AcbHLH42基因在调控猕猴桃果肉花青素合成中的应用，其特征在于：所述pHB-AcMYB123-AcbHLH42重组质粒为双基因重组质粒，其将AcMYB123与AcbHLH42全长基因分别构建在过表达载体的pHB载体的MCS区域与原Bar区。

4.根据权利要求1所述的AcMYB123和AcbHLH42基因在调控猕猴桃果肉花青素合成中的应用，其特征在于：包括以下步骤：

(1)构建双基因重组质粒pHB-AcMYB123-AcbHLH42；

(3)采用瞬时或农杆菌介导的稳定转化法，将双基因重组质粒pHB-AcMYB123-AcbHLH42导入猕猴桃中。

5.根据权利要求4所述的AcMYB123和AcbHLH42基因在调控猕猴桃果肉花青素合成中的应用，其特征在于：所述双基因重组质粒pHB-AcMYB123-AcbHLH42质粒的构建方法为将AcMYB123与AcbHLH42全长基因分别构建在过表达载体的pHB载体的MCS区域与原Bar区。

6.AcMYB123和AcbHLH42基因在调控烟草或拟南芥花青素合成中的应用，所述AcMYB123基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述AcbHLH42基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。