CN101280006B - 一种与植物耐缺铁相关的蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种与植物耐缺铁相关的蛋白及其编码基因与应用。该蛋白，是如下1)或2)的蛋白质：1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列表中序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且能提高植物耐缺铁性的由1)衍生的蛋白质。实验证明，转入MxYSL5的拟南芥植株耐缺铁性明显提高，为进一步研究植物体内铁元素运输利用机制提供理论依据。

Description

一种与植物耐缺铁相关的蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种与植物耐缺铁相关的蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

高等植物为了适应缺铁胁迫，在长期进化过程中逐渐形成了两种铁吸收机理：机理I和机理II，机理I涉及的植物主要包括非禾本科植物，机理II涉及的植物主要包括禾本科植物(Marschner H.1994.

V.，Strategies of plants for acquisitionof iron.Plant Soil，165，261～274 Mori，S.1999.Iron acquisition by plants.Curr.Opin.Plant Biol.2，250～253.)。在缺铁胁迫条件下，机理I植物在Fe³⁺还原酶的作用下将Fe³⁺还原为Fe²⁺，然后再由质膜上的Fe²⁺转运蛋白将Fe²⁺转入根表皮细胞中；机理II植物通过向根系分泌麦根酸类物质(MAs)与根系表面的Fe³⁺形成MAs-Fe³⁺螯合物，然后由类黄色条纹蛋白YSL(Yellow Stripel-Like)将MAs-Fe³⁺螯合物直接转入根表皮细胞。

虽然非禾本科植物与禾本科植物具有不同的铁吸收机理，但它们可能分享相似的体内铁运输和分配机制。由于游离的铁离子具有不稳定性并且对细胞具有毒害作用，植物体内的铁必须与其他螯合物形成复合物才能被运输和分配。在植物的木质部中，铁主要以柠檬酸与Fe³⁺结合的形式被运输；在蓖麻幼苗的韧皮部中，铁可能以铁转运体ITP与Fe³⁺结合的形式被运输；更多的研究认为尼克烟酰胺(NA)是植物体内重要的金属离子鏊合物(Callahan，D.L.，Baker，A.J.，Kolev，S.D.and Wedd，A.G.(2006)Metal ion ligands in hyperaccumulating plants.J.Biol.Inorg.Chem.11，2-12.)，NA不仅在机理II植物中作为脱氧麦根酸类物质(MAs)的合成前体(HiguchiK，Nishizawa NK，Romheld V，Marschner H，Mori S.Absence of nicotianaminesynthase activity in the tomato mutant‘chloronerva’.J Plant Nutr 1996；19：1235-1239.)，并且在不产生也不分泌MAs的机理I植物中也大量存在，NA可与多种金属离子结合(yon Wirén N，Klair S，Bansal S，Briat JF，Khodr H，Shioiri T，Leigh，RA，Hider RC.(1999).Nicotianamine chelates both Fe(III)and Fe(II)Implications formetal transport in plants.Plant physiol.119：1107-1114.)。在植物的根及地上部分中，NA的含量从每克植物鲜重20nmol到50nmol不等，在木质部中的浓度可达20uM，在韧皮部中的浓度则高达130uM。NA参与铁在植物体内运输过程的证据主要来自西红柿的NA合成酶(Nas)缺失突变体chlorosis(chl)和转化Naat基因的转基因烟草，由于NA的缺失，这两种植物皆出现明显的脉间失绿现象(interveinal chlorosis)，且这种缺铁表型不能通过大量供铁得以恢复，但喷施NA可使植株表型恢复正常(Ling HQ，Koch G，Baumlein H，Ganal MW.(1999)Map-based cloning ofchloronerva，a gene involved in iron uptake of higher plants encoding nicotianaminesynthase.Proc Natl Acad Sci USA 1999；96：7098-7103.)。由于NA在韧皮部大量存在且能与Fe²⁺稳定结合，则韧皮部中的NA可能作为穿梭物质(shuttle)，通过鏊合ITP-Fe³⁺中的铁形成NA-Fe²⁺复合物，并通过跨膜运输蛋白完成铁在韧皮部的装载与卸载(Kruger C.，Berkowitz O.，Stephan U.W.& Hell R.(2002)A metalbinding memberof the late embryogenesis abundant protein family transports iron in the phloem ofRicinus communis L.Journal of Biological Chemistry 277，25062-25069.)。有关NA-Fe^{2 +}运输蛋白的认识开始于玉米ZmYS1基因的发现和功能研究(Curie，C.，Panaviene，Z.，Loulergue，C.，Dellaporta，S.L.，Briat，J.-F.and Walker，E.L.2001.Maize yellow stripe 1encodes a membrane protein directly involved in Fe(III)uptake.Nature，409，346-349.)。在机理II植物玉米中克隆到ZmYS1基因之后，人们惊喜地发现在机理I植物拟南芥中也有8个YS1-Like(YSL)基因存在，玉米ZmYS1蛋白负责根部MAs-Fe³⁺复合物的跨膜吸收(Schaaf G，Ludewig U，Erenoglu BE，Mori S，Kitahara T，yon Wiren N.ZmYS1 functions as a proton-coupled symporter for phytosiderophore-andnicotianamine-chelated metals.J Biol Chem 2004；279：9091-9096.)，机理I植物中负责根部Fe²⁺跨膜吸收的是IRT蛋白，那么YSL在机理I植物中发挥什么作用呢？由于NA与MAs在结构上极为相似，并能与多种金属稳定结合，人们开始关注YSL除了在机理II植物根部吸收MAs-Fe³⁺复合物外，是否还在高等植物体内运输NA-Fe²⁺复合物。玉米ZmYS1和水稻OsYSL2异源表达后都能运输NA-Fe²⁺复合物(Roberts LA，Pierson AJ，Panaviene Z，Walker EL.(2004)Yellow Stripel.Expanded Roles for theMaize Iron-Phytosiderophore Transporterl.Plant Physiol；135：112-120；Koike，S.，Inoue，H.，Mizuno，D.，Takahashi，M.，Nakanishi，H.，Mori，S.and Nishizawa，N.K.2004.OsYSL2 is a rice metal-nicotianamine transporter that is regulated by iron and expressedin the phloem.Plant J.39，415-424)，OsYSL2在韧皮部中大量表达，在发育的种子中也有表达，推测NA-Fe²⁺复合物在体内的长距离运输和向种子器官的卸载需要OsYSL2的参与。在机理I植物中，拟南芥的AtYSL1和AtYSL2在木质部中表达量最大，因为发育的种子主要靠韧皮部运输营养物质，YLS1基因敲除突变体种子中Fe和NA含量的减少可能解释为YLS1基因的缺失造成Fe²⁺-NA复合物从木质部到韧皮部的卸载受阻。能富集Ni的菥蓂中也发现5个TcYSL基因，TcYSL3和TcYSL7蛋白主要定位于韧皮部中，TcYSL3能在酵母中运输Fe²⁺-NA和Ni²⁺-NA。有关YSL参与铁运输的更直接的证据是拟南芥AtYSL1和AtYSL3基因双敲除突变体(ysl1ysl3double knockout mutants)(Brian M.Waters2，Heng-Hsuan Chu，Raymond J.DiDonato3，Louis A.Roberts4，Robynn B.Eisley，Brett Lahner，David E.Salt，and Elsbeth L.Walker^*.2006.Mutations in Arabidopsis Yellow Stripe-Like1 and Yellow Stripe-Like3Reveal Their Roles in Metal Ion Homeostasis and Loading of Metal Ions in SeedsPhysiol.，Plant Physiology.141，1446-1458)，双敲除突变体体内铁含量降低，植株表现为脉间失绿及胚和花粉不能正常发育，通过叶片喷施铁或重新将AtYSL3基因转入双突变体中可部分恢复以上缺铁表型。以上结果说明，在机理I植物和机理II植物中，YSL基因可能参与NA-Fe²⁺在体内的运输。

大部分果树属于木本植物，其体内矿质元素的运输包括短距离运输和长距离运输两种运输方式。从根部吸收的矿质营养能否准确、有效地运输并分配到植物地上各个器官和组织，对整个植株的生长及果实的产量都极为重要，因而在果树中展开与铁运输相关的YSL基因的研究显得极有意义，目前还没有从木本植物中克隆到YSL基因的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种与植物耐缺铁相关的蛋白及其编码基因。

本发明所提供的与植物耐缺铁相关的蛋白，名称为MxYSL5，来源于苹果属小金海棠(Malus xiaojinensis)，是如下1)或2)的蛋白质：

1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2)将序列表中序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐缺铁相关的由1)衍生的蛋白质。

序列表中的序列1由733个氨基酸残基组成。为了使1)中的MxYSL5便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

               表1.标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述2)中的MxYSL5可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述2)中的MxYSL5的编码基因可通过将序列表中序列2的自5′末端第51-2249位碱基所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

上述与植物耐缺铁相关蛋白的cDNA基因也属于本发明的保护范围。

与植物耐缺铁相关蛋白的cDNA基因具体可为如下1)-4)中任一所述的基因：

1)其编码序列是序列表中序列2的自5′末端第51-2249位脱氧核糖核苷酸；

2)其核苷酸序列是序列表中的序列2；

3)在严格条件下可与序列表中序列2限定的DNA序列杂交且编码上述与植物耐缺铁相关蛋白的DNA分子；

4)与1)的基因具有90％以上的同源性，且编码上述与植物耐缺铁相关蛋白的DNA分子。

所述步骤4)中的基因，与1)的基因最好有95％以上的同源性。

序列表中的序列2由2354个碱基组成，其开放阅读框架(ORF)为自5′末端第51-2249位碱基，编码氨基酸序列是序列表中序列1的MxYsL5。

上述严格条件可为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

扩增上述MxYSL5基因全长或任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

含有上述与植物耐缺铁相关蛋白编码基因的重组载体、转基因细胞系和重组菌也属于本发明的保护范围。

可用现有的植物表达载体构建含有MxYSL5基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pBI121、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表达载体。携带有本发明与植物耐缺铁相关蛋白编码基因MxYsL5的植物表达载体可通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到植物细胞或组织中。被转化的宿主植物可以是拟南芥等双子叶植物。

使用MxYSL5基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛生素基因Ubiquitin启动子(pUbi)等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

所述重组表达载体具体为可在pCW-1301的多克隆位点间插入序列表中序列2的自5′末端第51-2249位脱氧核苷酸得到的正义重组表达载体pCW-35sMxYSL5和反义重组表达载体pCW-antiMxYSL5；所述pCW-1301是用EcoRI和HindIII分别双酶切pCAMBIA1301和PWM101，连接PWM101酶切后的小片段和pCAMBIA3301酶切后的大片段，即得到pCW-1301。

本发明的另一个目的是提供一种培育耐缺铁的转基因植物的方法。

本发明所提供的耐缺铁的转基因植物的方法，是将上述与植物耐缺铁相关蛋白的编码基因MxYSL5导入植物中，得到耐缺铁的转基因植物。

所述植物可为双子叶植物，如拟南芥。

本发明构建了MxYSL5的表达载体，并将其转入野生型拟南芥植株中，结果表明，转入MxYSL5的拟南芥植株耐缺铁性明显提高，说明MxYSL5是与植物耐缺铁相关的蛋白，MxYSL5蛋白及其编码基因可用于提高植物的耐缺铁性，为进一步研究植物体内铁元素运输利用机制提供理论依据。

附图说明

图1为MxYSL5基因的PCR扩增产物结果

图2为MxYSL5基因的Southern blot杂交结果

图3为不同铁处理水平下MxYSL5基因在小金海棠不同器官中的半定量RT-PCR结果

图4为不同铁处理水平下MxYSL5基因在小金海棠不同器官中的Northern杂交结果

图5为MxYSL5基因瞬时表达载体PEZS-MxYSL5的酶切鉴定结果

图6为MxYSL5基因的亚细胞定位检测结果

图7为正义重组表达载体pCW-35sMxYSL5和反义重组表达载体pCW-antiMxYSL的构建过程图

图8为正义重组表达载体pCW-35sMxYSL5和反义重组表达载体pCW-antiMxYSL5的酶切鉴定结果

图9为转入正义重组表达载体pCW-35sMxYSL5和转入反义重组表达载体pCW-antiMxYSL5的根癌农杆菌的菌落PCR检测结果

图10为转基因拟南芥的PCR鉴定结果

图11为转基因拟南芥的Northern blot检测结果

图12为转基因拟南芥在缺铁培养基、正常供铁培养基和过量铁培养基上培养2周后的表型

图13为转基因拟南芥中Fe、Mn、Cu和Zn金属含量的测定

图14为重组表达质粒pCW1301的构建过程图

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物合成及测序工作均由上海生工生物技术服务有限公司完成。

限制性内切酶PstI、KpnI、EcoRI、HindIII、XbaI、DraI及Pfu酶均购自大连宝生物工程有限公司，pBS-T-Vector Kit购自天为时代生物公司，BD SMART^TM RACEcDNA Amplification Kit购自Clontech公司，地高辛杂交检测试剂盒购自北京美莱博医学科技有限公司。

Amp抗生素、Tris饱和酚、水饱和酚、DEPC、1200bp DNA Marker、琼脂糖、酵母提取物、胰蛋白胨均购自北京鼎国生物技术有限公司。

实施例1、与植物耐缺铁相关的蛋白MxYSL5及其编码基因的获得

一、MxYSL5基因中间片段的获得

以小金海棠(Malus xiaojinensis)(国家苹果种质资源圃，编号为DGB0458)为实验材料，提取其叶片总RNA，将其反转录为cDNA。以此cDNA为模板，以F：5′-AARYTAACHTAYCCDAGYGG-3′和R：5′-TCRAAYGCBTTGTAGAABA-3′为引物，PCR扩增MxYSL基因的中间片段。反应混合物如下：

ddH<sub>2</sub>O	17.7μl
		10×PCR缓冲液	2.5μl

ddH<sub>2</sub>O	17.7μl
		dNTP Mixture(2.5mM)	2.0μl
Taq酶(5U/μl)	0.3μl
		F(10mM)	0.5μl
R(10mM)	0.5μl
		模板(反转录的cDNA)	1.5μl
Total	25μl

PCR反应条件：先95℃预变性3min；然后95℃变性30S；60℃退火1.5min，共30个循环；最后72℃延伸10min。

取10μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1A所示，其中，M为2000bp的DNA分子量标准，1为MxYSLS基因中间片段的PCR产物。结果表明得到1050bp的目的片段。切下目的条带，纯化回收后按照pBS-T-Vector Kit载体试剂盒(天为时代生物公司)说明书将PCR产物连接到pBS-T载体上，进行测序。经同源性比较分析后确定获得的1050bp片段即是MxYSL5基因的中间片段。

二、MxYSL5基因3’端序列的获得

以步骤一获得的cDNA序列为模板，在其3’端设计引物，进行PCR反应，扩增MxYSL5基因的3’端序列。Master Mix预混物体系如下：

预混物                体积(μL)

ddH₂O                 29μl

10×PCR缓冲液         4μl

dNTP混合物(2.5mM)     2.5μl

Taq酶(5U/μl)         0.5μl

总体积36μl，将上述Master Mix预混物平均分成4管，每管9μl，按照下表加入引物：

PCR反应条件：先95℃预变性3min；然后95℃变性15S；68℃退火6min，共30个循环；最后72℃延伸10min。

将第一轮PCR产物稀释1000倍，取1μL作为模板，以3P-5n(序列表中序列4)和UPM为引物，进行巢式PCR反应，PCR反应条件与第一轮相同。取10μL第二轮PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图lB所示，其中，M为2000bp的DNA分子量标准，2为样品组的PCR扩增结果，3和4分别为两个单引物对照组的PCR扩增结果。结果表明，两个单引物对照组都没有扩增出特异条带，只有样品组扩增得到约800bp的片段。

切下目的条带，纯化回收后按照pBS-T-Vector Kit载体试剂盒(天为时代生物公司)说明书将PCR产物连接到pBS-T载体上，进行测序。经同源性比较分析后确定获得的约800bp片段即是MxYSL5基因的3’端序列。

三、MxYSL5基因5’端序列的获得

以步骤一获得的cDNA序列为模板，在其5’端设计引物，进行PCR反应，扩增MxYSL5基因的5’端序列。Master Mix预混物体系如下：

预混物                  体积(μL)

ddH₂O                   33μl

10×PCR缓冲液           4μl

dNTP混合物(2.5mM)       2.5μl

Taq酶(5U/μl)           0.5μl

总体积36μl，将上述Master Mix预混物平均分成4管，每管9μl，按照下表加入引物：

PCR反应条件：先95℃预变性3min；然后95℃变性30S；68℃退火1min，共30个循环；最后72℃延伸10min。

将第一轮PCR产物稀释1000倍，取1μL作为模板，以5P-5n(序列表中序列6)和UPM为引物，进行巢式PCR反应，PCR反应条件与第一轮相同。取10μL第二轮PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1C所示，其中，M为2000bp的DNA分子量标准，2为样品组的PCR扩增结果，3和4分别为两个单引物对照组的PCR扩增结果。结果表明，两个单引物对照组都没有扩增出特异条带，只有样品组扩增得到约750bp的片段。

切下目的条带，纯化回收后按照pBS-T-Vector Kit载体试剂盒(天为时代生物公司)说明书将PCR产物连接到pBS-T载体上，进行测序。经同源性比较分析后确定获得的约750bp片段即是MxYSL5基因的5’端序列。

四、MxYSL5基因全长cDNA序列的获得

将上述PCR扩增获得的MxYSL5基因5’端序列、中间序列以及3’端序列进行同源性比较，利用DNAMAN等生物软件进行拼接校正，拼接出MxYSL5基因全长cDNA序列。根据拼接的MxYSL5基因全长cDNA序列设计引物F5和R5(序列表中序列7和序列8)，提取小金海棠叶片的总RNA，反转录为cDNA，利用RT-PCR方法扩增全长MxYSL5基因，用高保真Pfu酶替换Taq酶，PCR反应混合物如下：

10×PCR缓冲液	2.5μl
		dNTP Mixture(2.5mM)	2.0μl
引物F5(10mM)	0.5μl
		引物R5(10mM)	0.5μl
模板(反转录的cDNA)	1.5μl
		Pfu酶(5U/ul)	0.3μl
ddH<sub>2</sub>O	17.7μl
		Total	25μl

PCR反应条件：先94℃预变性3min；然后94℃50S，55℃1min，72℃3min，共35个循环；再72℃延伸10min，4℃保存。

PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1D所示，其中，M为2000bp的DNA分子量标准，1为MxYSL5基因全长cDNA序列的PCR产物。结果表明获得约2000-2400bp的条带。切下该目的条带，纯化回收后按照pBS-T-Vector Kit载体试剂盒(天为时代生物公司)说明书将PCR产物连接到pBS-T载体上，将获得重组表达载体命名为pBS-MxYSL5。对pBS-MxYSL5进行测序，测序结果表明，获得2354bp的条带，该2354bp的核苷酸片段即为MxYSL5，其核苷酸序列如序列表中序列2所示，其编码的氨基酸序列如序列表中序列1所示。

实施例2、Southern blot分析

CTAB法提取小金海棠的DNA，取20μg上述小金海棠的DNA用EcoRI、KpnI和PstI内切酶消化，1％琼脂糖凝胶40V电压条件下电泳5h，利用上述实施例1获得的MxYSL5基因开放阅读框cDNA作为探针进行杂交分析。杂交、洗膜和显色均按照Roche公司的DIG High Prime DNA/RNA Labeling and Detection Starter Kit I的步骤进行。

杂交结果如图2所示，其中E为EcoRI单酶切后的Southern blot结果，D为DraI单酶切后的Southern blot结果，P为PstI单酶切后的Southern blot结果。三种单酶切产物均有多处杂交信号，结果表明，小金海棠基因组中存在MxYSL5基因，并且MxYSL5基因在小金海棠基因组中是多拷贝的。

实施例3、小金海棠不同器官中MxYSL5基因的表达分析

分别提取过量供铁(320μM Fe-EDTA)、正常供铁(40μM Fe-EDTA)及低铁处理(4μM Fe-EDTA)0、3、6和9天的小金海棠幼根、茎、新叶(未展开叶)和成熟叶的总RNA，紫外分光光度计分别测定不同器官、不同处理的RNA的含量，取等质量的上述RNA，反转录成单链cDNA。以该单链cDNA为模板，先以肌动蛋白(ACTIN)基因作为内参，使用ACTIN引物Ats：5’-CTACAAAGTCATCGTCCAGACAT-3’和Atr5’-TGGGATGACATGGAGAAGATT-3’进行PCR扩增，根据琼脂糖凝胶电泳结果，调整不同处理模板的用量，使各个处理ACTIN的PCR扩增产物亮度一致。不同处理模板用量确定后，进行ACTIN与MxYSL5基因的扩增。每个处理的RT-PCR分析重复3次。PCR扩增MxYSL5基因所用的引物对如下：RT-5F(5’-GGCACTGCAACTGCTCA-3’)和RT-5R(5’-CGACTTGGCTCACAAACA-3’)。

结果表明，MxYSL5基因在根、茎、成熟叶和新叶中都有表达。低铁处理时，随着处理天数的增加，MxYSL5基因在茎和成熟叶中表达增强，在新叶中的表达增强。具体结果如图3A-D所示。其中，A为低铁处理时，MxYSL5基因在根的表达情况，B为低铁处理时，MxYSL5基因在茎的表达情况，C为低铁处理时，MxYSL5基因在成熟叶的表达情况，D为低铁处理时，MxYSL5基因在新叶的表达情况。且MxYSL5基因在各检测部位的表达量相当。

过量供铁时，随着处理天数的增加，MxYSL5基因在茎和成熟叶中表达增强，在新叶中的表达减弱。结果如图3E-H所示。其中，E为过量供铁时，MxYSL5基因在根的表达情况，F为过量供铁时，MxYSL5基因在茎的表达情况，G为过量供铁时，MxYSL5基因在成熟叶的表达情况，H为过量供铁时，MxYSL5基因在新叶的表达情况。

为了进一步验证半定量RT-PCR的结果，利用扩增全长MxYSL5基因的特异引物(下游引物在3′非翻译区)制备探针，进行mRNA的Northern blot杂交，杂交结果如图4所示。其中，1、2和3分别为过量供铁、正常供铁和低铁处理时，MxYSL5基因在根中的Northern blot杂交结果，4、5和6分别为过量供铁、正常供铁和低铁处理时，MxYSL5基因在茎中的Northern blot杂交结果，7、8和9分别为过量供铁、正常供铁和低铁处理时，MxYSL5基因在成熟叶中的Northern blot杂交结果，10、11和12分别为过量供铁、正常供铁和低铁处理时，MxYSL5基因在根中的Northern blot杂交结果。结果表明，Northern blot杂交结果与上述半定量RT-PCR结果基本一致。证明MxYSL5基因在表达上的确具有器官特异性，并且表达丰度受铁营养条件影响，推测MxYSL5基因参与了铁在植物体内的代谢作用；新叶中MxYSL5基因与众不同的表达模式说明在缺铁或过量铁胁迫时，新叶具有与植物体其他部位不完全相同的反应机制，但不论哪种反应机制肯定都需要MxYSL5基因的参与。

实施例4、MxYSL5基因的亚细胞定位

一、MxYSL5基因与GFP融合的瞬时表达载体的构建

使用引物对S5：5’-GGGAATTCGTAAGATGGGGGGTCTAGACAC-3’和R5：5’-GAGGATCCGAGCGAGCTTTACCAGCTATGA-3’PCR扩增MxYSL5基因全长序列(去除了终止密码子的MxYSL5开放阅读框)，并将其克隆进pMD18-T载体中，经XhoI和BamHI酶切后再克隆进PEZS-NL载体(购自全式金生物技术有限公司)中构建瞬时表达载体PEZS-MxYSL5。PEZS-MxYSL5转化大肠杆菌Top 10菌株，挑取阳性斑进行菌落PCR、酶切鉴定和测序验证，酶切鉴定结果如图5所示，其中，M为1kb的DNA分子量标准，1为瞬时表达载体PEZS-MxYSL5的酶切鉴定结果。对鉴定结果为阳性的菌斑摇菌，提取质粒。

二、采用基因枪法进行表达载体向洋葱表皮细胞的转化

1、待转化洋葱表皮的制备

在无菌条件下，撕下洋葱的内表皮，平铺于含有MS培养基的培养皿中，然后将培养皿用锡箔纸包好备用。

2、金粉悬浮液的制备

称取60mg金粉，放入1.5ml灭菌的离心管中，加入1ml无水乙醇，震荡1min，10000rpm离心10s；弃上清，再加入1ml无水乙醇，震荡1min，10000rpm离10s；弃上清，将金粉悬于1ml无菌水中，-20℃保存备用。

3、金粉-质粒DNA复合体的制备

吸取8.5μl上述步骤2制备的金粉悬浮液、3.5μl 0.1M亚硝胺、8.5μl 2.5MCaCl₂·2H₂O和5μl上述步骤一纯化的质粒DNA，将混合物在震荡器上振荡3min；10000rpm离心20s；弃上清，用无水乙醇漂洗3次；加入30μl无水乙醇悬浮备用。

4、轰击受体材料

选用一定压力的压力膜，与轰击膜一起在70％的无水乙醇中浸泡1-2小时，取出晒干；金属档板用70％的无水乙醇浸泡后在酒精灯上灭菌；取10μl上述步骤3制备好的金粉-质粒DNA复合体，均匀涂布于轰击膜的中间位置上，不要涂于整个膜上，涂布的面积与载体固体圈上的孔径范围一致；将膜晒干后，安装到发射装置上；将压力膜安装到气体加速器的下端；洋葱表皮细胞置于培养皿的中部，放入真空室内，取下培养皿盖；抽真空指针到26；放气于气体加速器上，直到管中压力达到可裂膜所能承受的压力时，可裂膜破开，气体冲到轰击膜上，载体向下运动，被金属档板挡住，而下面的金属颗粒却透过金属档板的网孔，射向靶细胞。

5、荧光观察

将培养皿用Parafilm封好，28℃培养18h，在荧光显微镜下观察绿色荧光的表达，具体结果如图6所示。其中，A1为明视场照片，A2为暗视场照片，结果表明，MxYSL5主要定位于质膜上，在液泡膜上也有微量的定位。

实施例5、MxYSL5基因转化拟南芥

一、35S：：MxYSL5正、反义重组表达载体的构建

将实施例1中用R5和F5扩增的MxYSL5基因全长连接到pBS-T载体上，得到重组质粒，将该重组质粒酶切后鉴定MxYSL5基因的插入方向。重组质粒在多克隆位点存在一个XhoI酶切位点，在基因内距离起始密码子ATG约456bp处也有一个XhoI酶切位点，因此用XhoI酶切后若切出1869bp大小的条带则为正向插入的重组质粒；若酶切后出现456bp大小的片段则为反向插入的重组质粒。

将质粒pCAMBIA1301(购自澳大利亚CAMBIA公司)和PWM101(张志云，张虎生，孙毅，梁爱华.双价抗虫基因植物表达载体的构建.西北植物学报，2004，24(8)：1402-1408)分别用EcoRI和HindIII进行双酶切，连接PWM101酶切后的小片段和pCAMBIA3301酶切后的大片段，即得到重组表达载体pCW-1301。

将鉴定好方向的正向和反向重组质粒用PstI和KpnI双酶切后分别和植物表达载体pCW-1301连接，将正向重组质粒和植物表达载体pCW-1301连接后构建的重组表达载体命名为pCW-35sMxYSL5，将反向重组质粒和植物表达载体pCW-1301连接后构建的重组表达载体命名为pCW-antiMxYSL5。载体构建过程如图7所示。

对重组表达载体pCW-35sMxYSL5和pCW-antiMxYSL5分别进行琼脂糖凝胶电泳检测，切下目的条带，转化大肠杆菌感受态细胞，提取质粒，用引物S5和R5进行PCR扩增，PstI和KpnI酶切PCR产物进行鉴定，具体结果如图8所示。其中，M为1kb的DNA分子量标准，1为pCW-35sMxYSL5的酶切结果，2为pCW-antiMxYSL5的酶切结果，3为空载体pCW-1301的酶切结果。结果表明，pCW-35sMxYSL5和pCW-antiMxYSL5分别为含有MxYSL5基因的正义和反义重组表达载体。

利用冻融法将含有MxYSL5基因的正、反义重组表达载体pCW-35sMxYSL5和pCW-antiMxYSL5导入根癌农杆菌GV3101中，挑取阳性克隆，用引物S5和R5进行菌落PCR鉴定，结果如图9所示。其中，M为2000bp的DNA分子量标准，1为pCW-35sMxYSL5的PCR结果，2为pCW-anti MxYSL5的PCR结果，3为MxYSL5的PCR结果，4为空载体pCW-1301的PCR结果。结果表明，植物表达载体已成功转入农杆菌中。

二、根癌农杆菌转化拟南芥

当拟南芥植株长至茎高3cm时，去除其顶生花序，以刺激叶生花序的生长。打顶5-7d后进行转化，此时叶生花序已长出，其下部的花已经有花粉的出现。转化前一天要浇透水，剪掉角果和已开的花。

分别将含有上述步骤一正义重组表达载体pCW-35sMxYSL5和反义重组表达载体pCW-antiMxYSL5的农杆菌接种于5mlYEB(含卡那霉素和利福平)液体培养基中，28℃培养24-36h，以1∶50的比例转接到200mlYEB培养基中，当OD₆₀₀值为1.2-1.6时6000rpm离心15min收集菌体，沉淀用适量渗透培养基(蔗糖5％，SilwetL-770.02％)充分悬浮至OD₆₀₀值为0.6-0.8。

将上述根癌农杆菌悬浮液倒在小烧杯中，将拟南芥的花浸入悬浮液中3-5min，保证莲座叶以上部分浸于悬浮液中，浸泡5min，可见植株上有一层薄膜。将浸泡好的拟南芥植株取出，避光横放16-24h，然后将其放正，绑住松散花芽。培育至结实，收获成熟种子(T₁代转基因种子)。

三、转基因纯合体的筛选及Northern blot杂交检测

将收获的T₁代转基因拟南芥种子播种于含30mg/L潮霉素、50mg/L氨苄青霉素的1/2MS培养基上，4℃春化2-3天，然后转至22℃培养。筛选真叶健康、根伸长至培养基中的植株为阳性植株。提取转基因拟南芥的基因组DNA并以其为模板，以F5和R5为引物，进行PCR扩增，扩增结果如图10所示。其中，M为2000bp的DNA分子量标准，S1-S10为转入正义重组表达载体的转基因拟南芥的PCR结果，A1-A10为转入反义重组表达载体的转基因拟南芥的PCR结果，+CK为转入重组表达载体pCW-35sMxYSL5的根癌农杆菌的PCR结果，WT为野生型拟南芥的PCR结果，V为转入植物表达载体pCW-1301的转基因拟南芥的PCR结果。结果共获得转入正义重组表达载体的T₁代转基因拟南芥植株21株，获得转入反义重组表达载体的T₁代转基因拟南芥植株18株。

将PCR检测结果为阳性的植株单株收种，得到T₂代转基因拟南芥种子，T₂代转基因拟南芥种子再经过相同的筛选，经卡方检验符合3∶1分离比的转基因植株单株收种得到T₃代转基因种子，T₃代转基因种子单株在筛选培养基上不发生分离的视为插入含有MxYSL5基因的正、反义重组表达载体的纯合株系。结果共获得转入含有MxYSL5基因的正、反义重组表达载体的纯合株系各10株。

提取转入正义重组表达载体的T₃代转基因拟南芥和野生型拟南芥col-0的总RNA，1.2％甲醛琼脂糖凝胶电泳后，在20×SSC中转膜。利用上述实施例1获得的MxYSL5基因开放阅读框cDNA作为探针，MxYSL5特异探针用dig-UTP标记，杂交和洗膜方法参见北京美莱博地高辛杂交检测试剂盒II，化学发光检测按照说明书用CDP^star进行，X光胶片显影。结果如图11所示。其中，S1-S10为转入正义重组表达载体的T₃代转基因拟南芥的Northern blot杂交结果，WT为野生型拟南芥的Northernblot杂交结果，V为转入植物表达载体pCW-1301的T₃代转基因拟南芥的Northern blot杂交结果。结果表明，各转基因株系中MxYSL5基因的表达水平有所不同，其中3#、4#和9#株系MxYSL5基因的表达水平较高。

实施例6、转基因拟南芥耐缺铁的功能研究

一、转基因拟南芥在低铁培养基、正常供铁培养基和过量铁培养基上生长的表型观察

选取上述实施例5获得的MxYSL5基因表达最强的3#、4#和9#转基因拟南芥种子和转入反义重组表达载体的T₃代转基因拟南芥种子，同时以野生型拟南芥和转入空载体pCW-1301的转基因拟南芥种子为对照，在1/2MS培养基上生长一周后，移入低铁培养基(4μM Fe-EDTA)、正常供铁培养基(40μM Fe-EDTA)和过量铁培养基(320μM Fe-EDTA)中进行培养并观察表型。2周后可以明显看到，在正常供铁培养基中，转入正义重组表达载体、反义重组表达载体和空载的转基因拟南芥和野生型拟南芥都能生长正常，且没有出现明显的表型上的差别，结果如图12A所示；而在低铁培养基中，转入正义重组表达载体的三株转基因拟南芥均表现出比转入其他载体的拟南芥和野生型拟南芥更耐缺铁的特征，低铁培养基培养一周后，野生型拟南芥、转入反义重组表达载体和转入空载体的拟南芥开始出现明显的叶片黄化现象，而三个转入正义重组表达载体的拟南芥则叶片生长正常，即使是在低铁培养基中培养两周后，转入正义重组表达载体的拟南芥的叶片也仅仅是新叶出现了轻微的黄化，结果如图12B所示；在过量铁培养基上培养两周后，转入反义重组表达载体、转入空载的拟南芥和野生型拟南芥的叶片都出现明显的坏死，而转入正义重组表达载体的拟南芥仅出现叶色发暗、生长缓慢的症状，结果如图12C所示。整个处理过程中没有观察到转入反义重组表达载体的拟南芥比野生型拟南芥不耐缺铁或过量铁的表型。

二、转基因拟南芥中金属含量的测定

选取上述实施例5获得的MxYSL5基因表达最强的3#、4#和9#转基因拟南芥和转入反义重组表达载体的T₃代转基因拟南芥，同时以野生型拟南芥和转入空载体pCW-1301的转基因拟南芥为对照，在1/2MS培养基上生长一周后，分别移入低铁培养基、正常供铁培养基和过量铁培养基中培养2周后，截取上述拟南芥的根和地上部分，经过灰化处理后用原子吸收法测定其中的Fe、Mn、Cu和Zn的含量。具体测定结果如图13所示。结果发现，任何处理情况下，根中各金属元素的含量总是明显高于地上部分，MxYSL5基因表达最强的3#、4#和9#转基因拟南芥植株地上部各种金属元素的含量总是高于野生型和转空载体的对照植株，是以上对照株的1.2-1.8倍；但是其根中各金属元素含量的升高却并不明显。转入反义重组表达载体的转基因拟南芥植株在表型上与野生型拟南芥没有差异，但是其体内金属元素含量、特别是Zn的含量却明显低于其他转基因拟南芥和野生型拟南芥。

                        序列表

Claims (9)

1.一种蛋白，是由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.权利要求1所述蛋白的编码基因。

3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述蛋白的cDNA基因为如下1)或2)所述的基因：

1)其编码序列是序列表中序列2的自5′末端第51位-2249位脱氧核糖核苷酸；

2)其核苷酸序列是序列表中的序列2。

4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体、转基因细胞系或重组菌。

5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体的出发载体为pCW-1301；

所述pCW-1301是用EcoR I和HindIII分别双酶切pCAMBIA1301和PWM101，连接PWM101酶切后的小片段和pCAMBIA3301酶切后的大片段，即得到pCW-1301。

6.一种培育耐缺铁的转基因植物的方法，是将权利要求2或3所述的编码基因转入植物中，得到耐缺铁提高的转基因植物。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：权利要求2或3所述的编码基因是通过权利要求4所述的重组表达载体导入植物中。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述植物为双子叶植物。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述植物为拟南芥。

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