CN101307099B - 与植物耐缺铁相关的蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种与植物耐缺铁相关的蛋白及其编码基因与应用。该蛋白，是如下1)或2)的蛋白质：1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列表中序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且能提高植物耐缺铁性的由1)衍生的蛋白质。实验证明，转入MxSAMS的拟南芥植株耐缺铁性明显提高，为进一步研究植物体内铁元素运输利用机制提供理论依据。

Description

与植物耐缺铁相关的蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及与植物耐缺铁相关的蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

高等植物为了适应缺铁胁迫，在长期进化过程中逐渐形成了两种铁吸收机理：机理I和机理II，机理I涉及的植物主要包括非禾本科植物，机理II涉及的植物主要包括禾本科植物，机理I和机理II涉及的植物中同时存在一种重要的铁素螯合物-尼克烟酰胺(NA)。由于铁元素的不稳定性和对细胞的毒害作用，植物体内的铁必须与螯合物形成复合物才能被运输和分配。在机理II植物中，NA是植物体内高铁载体-脱氧麦根酸类物质(MAs)的合成前体(Higuchi K，et al.Cloning of nicotianaminesynthase genes，novel genes involved in the biosynthesis of phytosiderophores.PlantPhysiol，1999，119(2)：471～480)；机理I植物不产生也不利用MAs，但它可能与Fe²⁺等二价金属离子结合并被YSL转运到或运出不同的细胞或器官，参与非特异金属离子的长距离转运(DiDonato Jr R.J.，et al.Arabidopsis yellow stripe-like2(YSL2)：ametal-regulated gene encoding a plasma membrane transporter of nicotianamine-metalcomplexes.Plant J.2004，39：403～414；Curie C，et al.A loss-of function mutatinn inAtYSL1 reveal its role in iron and nicotianamine seedloading.Plant J.2005，44：769～782)。在两种铁吸收机理植物中，存在同样的NA生物合成途径：即以L-蛋氨酸为底物，在S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)催化下合成S-腺苷甲硫氨酸(SAM)，SAM再在NA合成酶(Nas)的作用下合成NA。Nas已在多种植物，如：烟草、大麦中被克隆到，并已证明其积极响应缺铁胁迫(Inoue H，et al.Three rice nicotianaminesynthase genes，OsNAS1，OsNAS2，and OsNAS3 are expressed in cells involved inlong-distance transport of iron and differentially regulated by iron.Plant Journal.2003，36：3，366～381；Negishi T，et al.cDNA microarray analysis of gene expression duringFe-deficiency stress in barley suggests that polar transport of vesicles is implicated inphytosiderophore secretion in Fe-deficient barley roots.Plant Journal.30(1)：83-94)。作为NA合成的重要前体SAM，其合成的限速酶基因是否参与植物的缺铁应答，以及以何种方式响应便成为目前的研究目标。

苹果属小金海棠(Malus xiaojinensis)是一种铁高效基因型植物，现已通过2D技术检测到缺铁胁迫条件下，小金海棠根部铁元素表达模式发生变化的两个蛋白属于SAMS家族成员(郭函子.缺铁胁迫下小金海棠根特异蛋白的表达鉴定及MxSAMS基因克隆：[博士学位论文].北京：中国农业大学，2005)，同时通过差异筛选缺铁胁迫条件下构建的小金海棠消减cDNA文库也得到SAMS的EST片段(张玉刚，等.抑制性消减杂交分离苹果缺铁诱导的相关基因.园艺学报.2007，34(3)：555-560)；另外，在超表达AtSams1的烟草中，SAMS基因由于受到共抑制，转基因植株表现出明显的缺铁黄化症状。因此，可以推测SAMS基因与植物缺铁相关，可能参与植物体内铁的运输和利用过程。

S-腺苷甲硫氨酸合成酶(S-adenosylmethionine synthetase，SAMS EC 2.5.1.6)是植物代谢过程中的一个关键酶，能催化甲硫氨酸与ATP生物合成S-腺苷甲硫氨酸(SAM)。

SAM在植物体内参与多种代谢途径，是植物体内最重要的甲基供体之一，具有转甲基作用，许多生物合成过程都需要SAM提供甲基；SAM还参与DNA甲基化和叶绿素生物合成等途径。多胺类物质参与多种植物的生长发育过程，其中，生物胺(精胺和亚精胺)的合成需要SAM脱羧产物作为氨丙基供体。

1953年Cantoni首次从大鼠肝脏中提取得到SAM合成酶，该酶能催化底物L甲硫氨酸和ATP合成SAM。随后又有人从大肠杆菌和酵母中分离出SAM合成酶。S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)是生物体代谢过程中一种重要的化合物，它在动物及微生物中均存在，并较早在基因水平上得到研究；而在植物中该酶及其基因的研究则相对较迟，现已从拟南芥、康乃馨、矮牵牛、白杨、番茄、欧芹、水稻、豌豆及中华猕猴桃等植物中克隆到SAM合成酶的基因，其中，拟南芥菜和豌豆中各有两种SAMS基因(Mathur M，et al.Differential regulation of S-adenosylmethionine synthetaseisozymes by gibberellic acid in dwarf pea epicotyls.Biothim Biophys Acta.1993，1162(3)：283-290)，猕猴桃中有三种SAMS基因(Whittake DJ.Three cDNAs encodingS-adenosyl-L-methionine synthetase from Actinidia chinensis.Plant Physiol.1995，108(3)：1307-1308.)，而番茄中则至少有四种SAMS基因(Espartero et al.Differential accumulation of S-adenosylmethionine synthetase transcripts in response tosalt stress.Plant Mol Biol.1994，25(2)：217-27.)。植物中的SAMS由一个多基因家族所编码，因而存在多种类型的SAMS基因，它们共同调节着SAM的合成速率。每种植物中都可能有几个拷贝的SAMS基因存在，而且他们的表达方式也各不相同，在植物的生理代谢中发挥着不同的功能，有些SAMS基因是组成型表达，而有些却是受发育时期或/和环境因子所调节的。

发明内容

本发明的目的是提供一种与植物耐缺铁相关的蛋白及其编码基因。

本发明所提供的与植物耐缺铁相关的蛋白，名称为MxSAMS，来源于苹果属小金海棠(Malus xiaojinensis)，是如下1)或2)的蛋白质：

1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2)将序列表中序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐缺铁相关的由1)衍生的蛋白质。

序列表中的序列2由391个氨基酸残基组成。为了使1)中的MxSAMS便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1.标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述2)中的MxSAMS可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述2)中的MxSAMS的编码基因可通过将序列表中序列1的自5′末端第1-1173位碱基所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

上述与植物耐缺铁相关蛋白的cDNA基因也属于本发明的保护范围。

与植物耐缺铁相关蛋白的cDNA基因具体可为如下1)-4)中任一所述的基因：

1)其编码序列是序列表中序列1的自5′末端第1-1173位脱氧核糖核苷酸；

2)其核苷酸序列是序列表中的序列1；

3)在严格条件下可与序列表中序列1限定的DNA序列杂交且编码上述与植物耐缺铁相关蛋白的DNA分子；

4)与1)的基因具有95％以上的同源性，且编码上述与植物耐缺铁相关蛋白的DNA分子。

序列表中的序列1由1176个碱基组成，其开放阅读框架(ORF)为自5′末端第1-1173位碱基，编码氨基酸序列是序列表中序列2的MxSAMS。

上述严格条件可为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

扩增上述MxSAMS基因全长或任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

含有上述与植物耐缺铁相关蛋白编码基因的重组载体、转基因细胞系和重组菌也属于本发明的保护范围。

可用现有的植物表达载体构建含有MxSAMS基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pBI121、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表达载体。携带有本发明与植物耐缺铁相关蛋白编码基因MxSAMS的植物表达载体可通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到植物细胞或组织中。被转化的宿主植物可以是拟南芥等双子叶植物。

使用MxSAMS基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛生素基因Ubiquitin启动子(pUbi)等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

所述重组表达载体具体为可在pCW1301的多克隆位点间插入序列表中序列1的自5′末端第1-1173位脱氧核苷酸得到的正义重组表达载体pCW-35sMxSAMS和反义重组表达载体pCW-antiMxSAMS；所述pCW1301是用EcoRI和HindIII分别双酶切pCAMBIA1301和PWM101，连接PWM101酶切后的小片段和pCAMBIA1301酶切后的大片段，即得到pCW1301。

本发明的另一个目的是提供一种培育耐缺铁的转基因植物的方法。

本发明所提供的耐缺铁的转基因植物的方法，是将上述与植物耐缺铁相关蛋白的编码基因MxSAMS导入植物中，得到耐缺铁的转基因植物。

所述植物可为双子叶植物，如拟南芥。

本发明从缺铁处理的小金海棠差异筛选cDNA文库中分离出小金海棠的cDNA片段，结合RACE技术(Rapid Amplification cDNA ends，cDNA末端快速扩增技术)扩增得到小金海棠这一cDNA片段的3’末端和5’末端，然后将得到的小金海棠cDNA序列的3’末端和5’末端通过拼接，得到小金海棠MxSAMS基因的全长cDNA序列。通过构建MxSAMS的表达载体，并将其转入野生型拟南芥植株中，结果表明，转入MxSAMS的拟南芥植株耐缺铁性明显提高，说明MxSAMS是与植物耐缺铁相关的蛋白，MxSAMS蛋白及其编码基因可用于提高植物的耐缺铁性，为进一步研究植物体内铁元素运输利用机制提供理论依据。由于MxSAMS与大多数植物的SAM合成酶具有很高的同源性(90％)，因此推测本发明的MxSAMS可能与小金海棠中SAM的生物合成相关。

附图说明

图1为小金海棠根部总RNA的PCR扩增结果

图2为MxSAMS基因的5’RACE PCR扩增结果

图3为MxSAMS基因的3’RACE PCR扩增结果

图4为MxSAMS基因全长cDNA序列的PCR扩增结果

图5为MxSAMS基因的Southern blot杂交结果

图6a为缺铁条件下小金海棠新叶中MxSAMS基因的半定量RT-PCR结果

图6b为缺铁条件下小金海棠成熟叶中MxSAMS基因的半定量RT-PCR结果

图6c为缺铁条件下小金海棠根中MxSAMS基因的半定量RT-PCR结果

图7为正义重组表达载体pCW-35sMxSAMS的PCR鉴定结果

图8为反义重组表达载体pCW-antiMxSAMS的PCR鉴定结果

图9为转入正义重组表达载体pCW-35sMxSAMS和转入反义重组表达载体pCW-antiMxSAMS的根癌农杆菌的菌落PCR检测结果

图10为转入正义重组表达载体pCW-35sMxSAMS和转入反义重组表达载体pCW-antiMxSAMS的转基因拟南芥阳性苗的PCR检测结果

图11为转入正义重组表达载体pCW-35sMxSAMS的T₃代转基因拟南芥的Northernblot杂交结果

图12为转基因拟南芥在低铁培养基、缺铁培养基和正常供铁培养基上培养2周后的表型

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物合成及测序工作均由上海生工生物技术服务有限公司完成。

限制性内切酶PstI、KpnI、BamHI及Pfu酶均购自大连宝生物工程有限公司，pBS-T-Vector Kit购自天为时代生物公司，BD SMART^TM RACE cDNA Amplification Kit购自Clontech公司，P地高辛杂交检测试剂盒购自北京美莱博医学科技有限公司。

Amp抗生素、Tris饱和酚、水饱和酚、DEPC、1200bp DNA Marker、琼脂糖、酵母提取物、胰蛋白胨均购自北京鼎国生物技术有限公司。

实施例1、与植物耐缺铁相关的蛋白MxSAMS及其编码基因的获得

一、双链cDNA的合成

以小金海棠(Malus xiaojinensis)(国家苹果种质资源圃，编号为DGB0458)为实验材料，提取其根的总RNA，将提取得到的总RNA用50μl的DEPC水溶解，电泳检测。经甲醛变性凝胶电泳分析，结果如图1所示。从图中可以清晰地看到28SrRNA和18SrRNA两条带，且28SrRNA和18SrRNA含量之比大约为1∶1-2∶1。结果表明，提取得到的RNA是完整的，染色结果显示，提取得到的总RNA可以用来进行反转录。

以上述提取得到的根的总RNA为模板，将其反转录为cDNA。再以此cDNA为模板，以5’RACE CDS Primer(5F)：5′-ACACTGGGAACACCCTGAAG-3′和3’SMARTCDS Primer II A(3R)：5′-TCCAAACATGCCAAATTGAA-3′为引物，PCR扩增MxSAMS基因的

PCR反应条件：先95℃预变性1min；然后95℃变性15S；65℃退火30s，共30个循环；最后68℃延伸6min。1％琼脂糖凝胶电泳检测。

二、MxSAMS基因5’端序列的获得

以步骤一获得的双链cDNA序列为模板，在其5’端设计引物，进行PCR反应，扩增MxSAMS基因的5’端序列。Master Mix预混物体系如下：

总体积38.1μl，将上述Master Mix预混物平均分成4管，每管9μl，按照下表加入引物：

PCR反应条件：先95℃预变性3min；然后95℃变性15S；68℃退火6min，共30个循环；最后72℃延伸7min。

将第一轮PCR产物稀释1000倍，取1μL作为模板，以5F和5PR2(序列表中序列5)为引物，进行巢式PCR反应，PCR反应条件与第一轮相同。取10μL第二轮PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2所示，其中，M为2000bp的DNA分子量标准，1为样品组的PCR扩增结果，2和3分别为两个单引物对照组的PCR扩增结果，4为5PR2和5F双引物对照组的PCR扩增结果。结果表明，两个单引物对照组都没有扩增出特异条带，只有样品组扩增得到700bp的片段。

切下目的条带，纯化回收后按照pBS-T-Vector Kit载体试剂盒(天为时代生物公司)说明书将PCR产物连接到pBS-T载体上，进行测序。经同源性比较分析后确定获得的700bp片段即是MxSAMS基因的5’端序列。

三、MxSAMS基因3’端序列的获得

以步骤一获得的cDNA序列为模板，在其3’端设计引物，进行PCR反应，扩增MxSAMS基因的3’端序列。Master Mix预混物体系如下：

总体积38.1μl，将上述Master Mix预混物平均分成4管，按照下表加入引物：

PCR反应条件：先95℃预变性3min；然后95℃变性15S；68℃退火6min，共30个循环；最后72℃延伸10min。

将第一轮PCR产物稀释1000倍，取1μL作为模板，以3R和3RF2(序列表中序列7)为引物，进行巢式PCR反应，PCR反应条件与第一轮相同。取10μL第二轮PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3所示，其中，M为2000bp的DNA分子量标准，1为样品组的PCR扩增结果，2和3分别为两个单引物对照组的PCR扩增结果，4为3RF2和3R双引物对照组的PCR扩增结果。结果表明，两个单引物对照组都没有扩增出特异条带，只有样品组扩增得到1000bp的片段。

切下目的条带，纯化回收后按照pBS-T-Vector Kit载体试剂盒(天为时代生物公司)说明书将PCR产物连接到pBS-T载体上，进行测序。经同源性比较分析后确定获得的1000bp片段即是MxSAMS基因的3’端序列。

四、MxSAMS基因全长cDNA序列的获得

将上述PCR扩增获得的MxSAMS基因5’端序列以及3’端序列进行同源性比较，利用DNAMAN等生物软件进行拼接校正，拼接出MxSAMS基因全长cDNA序列。根据拼接的MxSAMS基因全长cDNA序列设计引物MSF和MSR(序列表中序列8和序列9)，提取小金海棠根的总RNA，反转录为cDNA，利用RT-PCR方法扩增全长MxSAMS基因，用高保真Pfu酶替换Taq酶，PCR反应混合物如下：

10×PCR缓冲液	2.5μl
		dNTP Mixture(2.5mM)	2.0μl
引物MSF(100ng/μl)	0.5μl
		引物MSR(100ng/μl)	0.5μl
模板(反转录的cDNA)	1.5μl
		Pfu酶(5U/μl)	0.3μl
ddH2O	17.7μl
		Total	25μl

PCR反应条件：先94℃预变性3min；然后94℃50S，55℃1min，72℃2min，共35个循环；再72℃延伸7min，4℃保存。

PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图4所示，其中，M为2000bp的DNA分子量标准，1为MxSAMS基因全长cDNA序列的PCR产物。结果表明获得约1500bp的条带。切下该目的条带，纯化回收后按照pBS-T-Vector Kit载体试剂盒(天为时代生物公司)说明书将PCR产物连接到pBS-T载体上，将获得重组表达载体命名为pBS-MxSAMS。对扩增得到的MxSAMS基因全长cDNA序列进行测序，测序结果表明，获得1500bp的条带，该1500bp的核苷酸片段即为MxSAMS，其核苷酸序列如序列表中序列1所示，其编码的氨基酸序列如序列表中序列2所示。

实施例2、Southern blot分析

CTAB法提取小金海棠的DNA，取20μg上述小金海棠的DNA用EcoRI和SphI内切酶消化，0.8％琼脂糖凝胶40V电压条件下电泳12h，利用上述实施例1获得的MxSAMS基因开放阅读框cDNA作为探针进行杂交分析。杂交、洗膜和显色均按照Roche公司的DIG High Prime DNA/RNA Labeling and Detection Starter Kit I的步骤进行。

杂交结果如图5所示，其中，S为Sph I酶切后的Southern blot结果，E为EcoRI酶切后的Southern blot结果。结果表明，两种单酶切产物均有单一的杂交信号，表明小金海棠基因组中存在MxSAMS基因，并且该基因在小金海棠基因组中是单拷贝的。

实施例3、缺铁胁迫条件下小金海棠不同器官中MxSAMS基因的表达分析

分别提取正常供铁(铁浓度为40μM Fe-EDTA)及低铁处理(铁浓度为4μMFe-EDTA)0、3、6和9天的小金海棠幼根、新叶(未展开叶)和成熟叶的总RNA，紫外分光光度计分别测定不同器官、不同处理的RNA的含量，取等质量的上述RNA，反转录成单链cDNA。以该单链cDNA为模板，先以肌动蛋白(ACTIN)引物(序列表中序列10和序列11)进行PCR扩增，根据琼脂糖凝胶电泳结果，调整不同处理模板的用量，使各个处理ACTIN的PCR扩增产物亮度一致。不同处理模板用量确定后，进行ACTIN与MxSAMS基因的扩增。每个处理的RT-PCR分析重复3次。PCR扩增MxSAMS基因所用的引物对为MSF和MSR。

结果表明，低铁处理时，MxSAMS基因在小金海棠的根和叶片中均有表达，具体结果如图6所示。其中，a为低铁处理时，MxSAMS基因在新叶中的表达情况，b为低铁处理时，MxSAMS基因在成熟叶中的表达情况，c为低铁处理时，MxSAMS基因在根中的表达情况。其中，MxSAMS基因在根部的表达最强，表达量依次为根＞成熟叶＞新叶；并且根、新叶和成熟叶中的MxSAMS均受缺铁胁迫诱导，随着缺铁时间的延长，MxSAMS基因的表达量也逐渐增强，但是表达增强的幅度有所不同，其中，新叶受缺铁诱导加强表达的幅度最大。

实施例4、MxSAMS基因转化拟南芥

一、35S::MxSAMS正、反义重组表达载体的构建

将实施例1中用MSF和MSR扩增的MxSAMS基因全长连接到pBS-T载体上，得到重组质粒，将该重组质粒酶切后鉴定MxSAMS基因的插入方向。重组质粒在多克隆位点存在一个HindIII酶切位点，在基因内距离起始密码子ATG约450bp处也有一个HindIII酶切位点，因此HindIII酶切后若切出450bp大小的条带则为正向插入的重组质粒；若酶切后出现750bp大小的片段则为反向插入的重组质粒。

将质粒pCAMBIA1301(购自澳大利亚CAMBIA公司)和PWM101(张志云，张虎生，孙毅，梁爱华.双价抗虫基因植物表达载体的构建.西北植物学报，2004，24(8)：1402-1408)分别用EcoR I和HindIII进行双酶切，连接PWM101酶切后的小片段和pCAMBIA3301酶切后的大片段，即得到重组表达载体pCW-1301。

将鉴定好方向的正向和反向重组质粒用PstI和KpnI双酶切后分别和植物表达载体pCW-1301连接，将正向重组质粒和植物表达载体pCW-1301连接后构建的重组表达载体命名为pCW-35sMxSAMS，将反向重组质粒和植物表达载体pCW-1301连接后构建的重组表达载体命名为pCW-antiMxSAMS。

对重组表达载体pCW-35sMxSAMS和pCW-antiMxSAMS分别进行琼脂糖凝胶电泳检测，切下目的条带，转化大肠杆菌感受态细胞，提取质粒，分别用引物MSF和MSR进行PCR扩增，PstI和KpnI酶切PCR产物进行鉴定，具体结果如图7和图8所示。图7中，M为2000bp的DNA分子量标准，1为重组表达载体pCW-35sMxSAMS的PCR结果，2为重组表达载体pCW-antiMxSAMS的PCR结果；图8中，M为15000bp的DNA分子量标准，1为重组表达载体pCW-35sMxSAMS的酶切结果，2为重组表达载体pCW-antiMxSAMS的酶切结果。结果表明，pCW-35sMxSAMS和pCW-antiMxSAMS分别为含有MxSAMS基因的正义和反义重组表达载体。

利用冻融法将含有MxSAMS基因的正、反义重组表达载体pCW-35sMxSAMS和pCW-antiMxSAMS导入根癌农杆菌GV3101中，挑取阳性克隆，用引物MSF和MSR进行菌落PCR鉴定，结果如图9所示。其中，M为10000bp的DNA分子量标准，CK为未转化的根癌农杆菌GV3101，3为pCW-35sMxSAMS转化农杆菌GV3101后的PCR结果，4为pCW-antiMxSAMS转化农杆菌GV3101后的PCR结果。结果表明，植物表达载体已成功转入农杆菌中。

二、根癌农杆菌转化拟南芥

当拟南芥植株长至茎高3cm时，去除其顶生花序，以刺激叶生花序的生长。打顶5-7d后进行转化，此时叶生花序已长出，其下部的花已经有花粉的出现。转化前一天要浇透水，剪掉角果和已开的花。

分别将含有上述步骤一正义重组表达载体pCW-35sMxSAMS和反义重组表达载体pCW-antiMxSAMS的农杆菌接种于5mlYEB(含卡那霉素和利福平)液体培养基中，28℃培养24-36h，以1∶50的比例转接到200mlYEB培养基中，当OD₆₀₀值为1.2-1.6时6000rpm离心15min收集菌体，沉淀用适量渗透培养基(蔗糖5％，SilwetL-770.02％)充分悬浮至OD₆₀₀值为0.6-0.8。

将上述根癌农杆菌悬浮液倒在小烧杯中，将拟南芥的花浸入悬浮液中3-5min，保证莲座叶以上部分浸于悬浮液中，浸泡5min，可见植株上有一层薄膜。将浸泡好的拟南芥植株取出，避光横放16-24h，然后将其放正，绑住松散花芽。培育至结实，收获成熟种子(T₁代转基因种子)。

三、转基因纯合体的筛选及Northern blot杂交检测

将收获的T₁代转基因拟南芥种子播种于含30mg/L潮霉素、50mg/L氨苄青霉素的1/2MS培养基上，4℃春化2-3天，然后转至22℃培养。筛选真叶健康、根伸长至培养基中的植株为阳性植株。提取转基因拟南芥的基因组DNA并以其为模板，以MSF和MSR为引物，进行PCR扩增，结果如图10所示。其中，M为1200bp的DNA分子量标准，1-6为转入正义重组表达载体pCW-35sMxSAMS的转基因拟南芥阳性苗的PCR检测结果，7-12为转入反义重组表达载体pCW-antiMxSAMS的转基因拟南芥阳性苗的PCR检测结果，CK+为重组表达载体pCW-35sMxSAMS的PCR结果，CK-为以双蒸水为模板的PCR结果。结果共获得转入正义重组表达载体的T₁代转基因拟南芥植株59株，获得转入反义重组表达载体的T₁代转基因拟南芥植株15株。

将PCR检测结果为阳性的植株单株收种，得到T₂代转基因拟南芥种子，T₂代转基因拟南芥种子再经过相同的筛选，经卡方检验符合3∶1分离比的转基因植株单株收种得到T₃代转基因种子，T₃代转基因种子单株在筛选培养基上不发生分离的视为插入含有MxSAMS基因的正、反义重组表达载体的纯合株系。结果共获得转入含有MxSAMS基因正义重组表达载体的纯合株系18株，获得转入含有MxSAMS基因反义重组表达载体的纯合株系5株。

随机选取6株转入正义重组表达载体的T₃代转基因拟南芥和野生型拟南芥col-0的总RNA，1.2％甲醛琼脂糖凝胶电泳后，在20×SSC中转膜。利用上述实施例1获得的MxSAMS基因开放阅读框cDNA作为探针，MxSAMS特异探针用dig-UTP标记，杂交和洗膜方法参见北京美莱博地高辛杂交检测试剂盒II，化学发光检测按照说明书用CDP^star进行，X光胶片显影。结果如图11所示。其中，1-6分别为转入正义重组表达载体的T₃代转基因拟南芥的Northern blot杂交结果，WT为野生型拟南芥的T₃代转基因拟南芥的Northern blot杂交结果。结果表明，各转基因株系中MxSAMS基因的表达水平有所不同，其中2#、3#和6#株系MxSAMS基因的表达水平较高。

实施例5、转基因拟南芥耐缺铁的功能研究

一、转基因拟南芥在缺铁培养基、低铁培养基和正常供铁培养基上生长的表型观察

选取上述实施例4获得的MxSAMS基因表达最强的2#、3#和6#转基因拟南芥种子和转入反义重组表达载体的T₃代转基因拟南芥种子，同时以野生型拟南芥和转入空载体pCW-1301的转基因拟南芥种子为对照，在1/2MS培养基上生长一周后，移入缺铁培养基(0μM Fe-EDTA+300μM ferrozine铁螯合剂)、低铁培养基(4μMFe-EDTA)和正常供铁培养基(40μM Fe-EDTA)中进行培养并观察表型。

2周后可以明显看到，在缺铁培养基和低铁培养基中，转入反义重组表达载体和空载体的转基因拟南芥以及野生型拟南芥均出现了叶片黄化现象，而且，转入反义重组表达载体的拟南芥黄化现象更为严重，同时还伴有根系稀疏、植株弱小等现象。具体的表型鉴定结果如图12所示。其中，图12D表示转入反义重组表达载体的转基因拟南芥的表型鉴定结果，图12B表示转入空载体的转基因拟南芥的表型鉴定结果，图12C表示野生型拟南芥的表型鉴定结果。而转入正义重组表达载体的转基因拟南芥在缺铁培养基和低铁培养基中均生长正常，根系明显发达，侧根增多、增长，并且植株生长量增大，叶片更肥厚，表现出比对照株更耐缺铁的特性。具体的表型鉴定结果如图12A所示。说明MxSAMS基因在铁的代谢过程中起到重要的作用。

而在正常供铁培养基上，转入正义重组表达载体、反义重组表达载体和空载体的转基因拟南芥以及野生型拟南芥均生长正常且一致。

二、转基因拟南芥中金属离子含量的测定

选取上述实施例4获得的MxSAMS基因表达最强的2#、3#和6#转基因拟南芥和转入反义重组表达载体的T₃代转基因拟南芥，同时以野生型拟南芥和转入空载体pCW-1301的转基因拟南芥为对照，在1/2MS培养基上生长一周后，分别移入缺铁培养基、低铁培养基和正常供铁培养基中培养2周后，截取上述拟南芥的幼叶和根，经过灰化处理后用原子吸收法测定其中的Fe、Mn、Cu和Zn的含量。结果发现，转入正义重组表达载体的拟南芥在不同浓度铁处理情况下，根和叶中的Fe、Mn、Cu、Zn的含量总是高于对照及转入反义重组表达载体的拟南芥植株，且叶中金属含量的提高尤为明显；根中各种金属含量总是明显高于地上部，但是不同株系之间根中金属含量并无明显差异；转入反义重组表达载体的拟南芥中除了Mn的含量比对照有所降低外，其它如Fe、Cu和Zn的含量与对照相比无明显差异。

序列表

<160>11

<210>1

<211>1176

<212>DNA

<213>苹果属小金海棠(Malus xiaojinensis)

<400>1

atggaagaca ccttcctgtt tacttcggag tccgtgaacg agggacaccc cgataaactc     60

tgtgatcaga tttctgatgc agttctcgac gcctgcctcg aacaagaccc cgacagcaaa    120

gttgcctgcg agacttgcac caagacgaac atggtcatgg tcttcggaga gattacaacc    180

acagccaaag tggactacga gaagattgtg cgcgatacct gccgtacaat tggatttgtt    240

tcagacaatg ttggtcttga tgctgacaac tgcaaggtct tggttaacat cgagcaacag    300

agccctgata tcgcgcaggg cgtccatggc cacttgacca agcggcctga ggagattggt    360

gcgggtgacc agggtcacat gtttggttat gcaactgatg agacccctga gcttatgcct    420

ctgagccatg ttcttgccac caagcttggt gcccgtctca ctgaagttcg gaagaacgga    480

accttgccgt ggctgagacc cgttggcaag acgcaagtca ctgctgaata ctacaatgac    540

catggcgcta tggttccaat ccgtgtccac acggttctca tttcaactca gcatgacgaa    600

actgttacca acgatgagat tgctgctgac ctcaaagagc atgttatcaa gcctgttgtt    660

cctgagaagt acctagacga gaagactatt ttccatctta acccatcagg tcgatttgtc    720

attggtggac ctcacggtga tgctggcctc actggccgaa agataatcat tgacacctac    780

ggtggttggg gagctcatgg tggtggtgcc ttctccggca aggaccctac caaggtagac     840

aggagtggtg cctacattgt taggcaggct gctaagagca ttgtcgccaa tggccttgcc     900

cgcaggtgca tagtgcaggt ctcgtatgcc attggtgttc ccgagccact atcagtgttc     960

gttgacagtt atggcaccgg aaagattcct gacaaggaga ttcttaaact agtaaaggag    1020

aactttgatt tcaggcctgg gatgattgcg attaacctcg atctcaagcg gggcaggtac    1080

ttgaaaacgg ctgcttatgg acacttcggt agggatgacc ctgacttctc atgggaagtg    1140

gtgaagccat tgaagtggga aaagccccaa gagtag                              1176

<210>2

<211>391

<212>PRT

<213>苹果属小金海棠(Malus xiaojinensis)

<400>2

Met Glu Asp Thr Phe Leu Phe Thr Ser Glu Ser Val Asn Glu Gly His

1               5                   10                  15

Pro Asp Lys Leu Cys Asp Gln Ile Ser Asp Ala Val Leu Asp Ala Cys

            20                  25                  30

Leu Glu Gln Asp Pro Asp Ser Lys Val Ala Cys Glu Thr Cys Thr Lys

        35                  40                  45

Thr Asn Met Val Met Val Phe Gly Glu Ile Thr Thr Thr Ala Lys Val

    50                  55                  60

Asp Tyr Glu Lys Ile Val Arg Asp Thr Cys Arg Thr Ile Gly Phe Val

65                  70                  75                  80

Ser Asp Asn Val Gly Leu Asp Ala Asp Asn Cys Lys Val Leu Val Asn

                85                  90                  95

Ile Glu Gln Gln Ser Pro Asp Ile Ala Gln Gly Val His Gly His Leu

            100                 105                 110

Thr Lys Arg Pro Glu Glu Ile Gly Ala Gly Asp Gln Gly His Met Phe

        115                 120                 125

Gly Tyr Ala Thr Asp Glu Thr Pro Glu Leu Met Pro Leu Ser His Val

    130                 135                 140

Leu Ala Thr Lys Leu Gly Ala Arg Leu Thr Glu Val Arg Lys Asn Gly

145                 150                 155                 160

Thr Leu Pro Tyr Leu Arg Pro Val Gly Lys Thr Gln Val Thr Ala Glu

                165                 170                 175

Tyr Tyr Asn Asp His Gly Ala Met Val Pro Ile Arg Val His Thr Val

            180                 185                 190

Leu Ile Ser Thr Gln His Asp Glu Thr Val Thr Asn Asp Glu Ile Ala

        195                 200                 205

Ala Asp Leu Lys Glu His Val Ile Lys Pro Val Val Pro Glu Lys Tyr

    210                 215                 220

Leu Asp Glu Lys Thr Ile Phe His Leu Asn Pro Ser Gly Arg Phe Val

225                 230                 235                 240

Ile Gly Gly Pro His Gly Asp Ala Gly Leu Thr Gly Arg Lys Ile Ile

                245                 250                 255

Ile Asp Thr Tyr Gly Gly Tyr Gly Ala His Gly Gly Gly Ala Phe Ser

            260                 265                 270

Gly Lys Asp Pro Thr Lys Val Asp Arg Ser Gly Ala Tyr Ile Val Arg

        275                 280                 285

Gln Ala Ala Lys Ser Ile Val Ala Asn Gly Leu Ala Arg Arg Cys Ile

    290                 295                 300

Val Gln Val Ser Tyr Ala Ile Gly Val Pro Glu Pro Leu Ser Val Phe

305                 310                 315                 320

Val Asp Ser Tyr Gly Thr Gly Lys Ile Pro Asp Lys Glu Ile Leu Lys

                325                 330                 335

Leu Val Lys Glu Asn Phe Asp Phe Arg Pro Gly Met Ile Ala Ile Asn

            340                 345                 350

Leu Asp Leu Lys Arg Gly Arg Tyr Leu Lys Thr Ala Ala Tyr Gly His

        355                 360                  365

Phe Gly Arg Asp Asp Pro Asp Phe Ser Tyr Glu Val  Val  Lys Pro Leu

    370                 375                  380

Lys Tyr Glu Lys Pro Gln Glu

385                 390

<210>3

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

aagcagtggt atcaacgcag agtggccatt atggccggg                           39

<210>4

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

catcgttggt aacagtttcg tca                                            23

<210>5

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

tcgttggtaa cagtttcgtc atg                                     23

<210>6

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

tgaggagatt ggtgcgggtg accagggtca catg                         34

<210>7

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

atgaccatgg cgctatggtt ccaatccgtg tcc                          33

<210>8

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

acactgggaa caccctgaag                                         20

<210>9

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

tccaaacatg ccaaattgaa                               20

<210>10

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

ctacaaagtc atcgtccagac at                           22

<210>11

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>11

tgggatgaca tggagaagat t                             21

Claims (3)

1.一种培育耐缺铁的转基因植物的方法，是将序列表中序列1的自5′末端第1-1173位脱氧核糖核苷酸转入植物中，得到耐缺铁提高的转基因植物。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述植物为双子叶植物。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述植物为拟南芥。

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