CN112794888B

CN112794888B - 来源于大刍草的BtSAMS1蛋白及其在抗蚜虫植物育种中的应用

Info

Publication number: CN112794888B
Application number: CN202110017148.6A
Authority: CN
Inventors: 杨利艳; 张玉荣; 王创云
Original assignee: Shaanxi Normal University
Current assignee: Shaanxi Normal University
Priority date: 2021-01-07
Filing date: 2021-01-07
Publication date: 2023-06-09
Anticipated expiration: 2041-01-07
Also published as: CN112794888A

Abstract

本发明公开了一种来源于大刍草的BtSAMS1蛋白及其在抗蚜虫植物育种中的应用。本发明提供的蛋白质，来源于大刍草(Z.mays ssp.parviglumis)，命名为BtSAMS1蛋白，是序列表中序列1所示的蛋白质。编码BtSAMS1蛋白的基因，命名为BtSAMS1基因，也属于本发明的保护范围。本发明还保护BtSAMS1蛋白在调控植物对蚜虫的抗性中的应用。本发明还保护BtSAMS1基因或所述重组载体或所述表达盒的应用，为培育对蚜虫的抗性增高的转基因植物。本发明提供的蛋白质、基因以及方法可用于制备抗蚜虫的转基因植物，具有育种周期短、目标定向强的优势。本发明对于蚜虫防治，对于抗蚜虫植物育种具有重大的应用推广价值。

Description

来源于大刍草的BtSAMS1蛋白及其在抗蚜虫植物育种中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种来源于大刍草的BtSAMS1蛋白及其在抗蚜虫植物育种中的应用。

背景技术

蚜虫属节肢动物门昆虫纲半翅目胸喙亚目，主要生存于温带地区，对栽培植物有着严重的损害。蚜虫的繁殖方式包括孤雌生殖和有性世代，其具有多样性、复杂性的生活史，适应环境的能力极强。蚜虫繁殖力很强，一年能繁殖10-30个世代，世代重叠现象明显。已知携带植物病毒的昆虫介体有600多种，有275种为蚜虫。研究表明，桃蚜(Myzuspersicae)是携带有超过110种植物病毒的昆虫传播介体。携带病毒的蚜虫通过口针穿刺植物嫩叶、花、茎等位点传播植物病毒，对植物造成严重的危害。

蚜虫的防治技术主要有：(1)农业防治：通过调整植物耕种时间，选育优良抗蚜品种，科学施肥与灌溉等措施改善植物的生长发育，从而增强植物对蚜虫的抵御能力；(2)物理防治：依据蚜虫的趋光性、趋黄性的特征，研发黑光灯或荧光灯捕杀蚜虫；(3)化学防治：选用高效率、低污染的化学农药，降低蚜虫密度；(4)生物防治：阿维菌素、绿僵菌、白僵菌、蜡蚧轮枝菌等高毒性菌株具有高效杀蚜能力，还可以利用蚜虫的天敌，瓢虫、食蚜绳、菜蚜茧蜂等有效防治蚜虫；(5)基因工程防治：选育抗蚜转基因植物进行栽种是防治蚜虫的根本措施。

由于植物具有定殖性，牢固扎根于土壤中，无法逃避食草动物的侵害，长期以来，他们在与食草动物的相互作用中被认为是被动的。后来，科学家们发现植物在面对害虫侵害时，自身会进化防御，产生某些性状来避免受害。植物抗性有两种，即组成抗性和诱导抗性。组成抗性是植物的独特特性，并取决于植物不同的基因型。植物的组成抗性的抗虫水平会因其生存环境条件的差异而发生变化，但始终对植物抗虫具有一定的积极作用。诱导抗性是植物在受到昆虫取食或者病原菌侵染时，自身会发生一些与抗性相关的物理表型变化、化学变化，从而影响植食者的行为或降低其嗜好性的反应，这与免疫反应抗性相似，具有开-关效应。诱导抗性是植物在受到害虫取食侵染迅速做出的防卫应答反应，其具有专一性、继代效应、动态性、传递性。

发明内容

本发明的目的是提供一种来源于大刍草的BtSAMS1蛋白及其在抗蚜虫植物育种中的应用。

本发明提供的蛋白质，来源于大刍草(Z.mays ssp.parviglumis)，命名为BtSAMS1蛋白，是如下(a1)或(a2)或(a3)或(a4)：

(a1)序列表中序列1所示的蛋白质；

(a2)在(a1)所述蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；

(a3)将(a1)所述蛋白质进行一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由其衍生的蛋白质；

(a4)来源于大刍草且与序列表中序列1所示的蛋白质至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同一性且具有相同功能的蛋白质。

这里使用的术语“同一性”指与天然氨基酸序列的序列相似性。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

示例性的，所述标签见表1。

表1标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

BtSAMS1蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

编码BtSAMS1蛋白的基因，命名为BtSAMS1基因，也属于本发明的保护范围。

BtSAMS1基因是如下(b1)或(b2)或(b3)的DNA分子：

(b1)编码区如序列表的序列2所示的DNA分子；

(b2)在严格条件下与(b1)限定的DNA分子杂交且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子；

(b3)来源于大刍草且与(b1)限定的DNA分子至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子。

上述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃条件下杂交并洗膜。

这里使用的术语“同源性”指与天然核苷酸序列的序列相似性。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明提供的BtSAMS1基因进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明提供的BtSAMS1基因具有90％或者更高同一性的核酸，只要编码BtSAMS1蛋白且具有BtSAMS1蛋白的功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

含有BtSAMS1基因的重组载体、表达盒或重组菌均属于本发明的保护范围。

可用现有的植物表达载体构建含有BtSAMS1基因的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、抗生素的标记基因或是抗化学试剂标记基因等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

所述重组载体具体可为将序列表的序列2所示的双链DNA分子插入pCAMBIA1300载体的Xba I和Kpn I酶切位点之间，得到的重组质粒35S::BtSAMS1。

本发明还保护BtSAMS1蛋白在调控植物对蚜虫的抗性中的应用。

本发明还保护BtSAMS1基因或所述重组载体或所述表达盒的应用，为培育对蚜虫的抗性增高的转基因植物。

本发明还保护一种培育转基因植物的方法，包括如下步骤：将BtSAMS1基因导入受体植物中，得到对蚜虫的抗性增高的转基因植物。BtSAMS1基因具体可通过以上任一所述重组载体导入目的植物。所述重组载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导、基因枪等常规生物学方法,转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。

本发明还保护一种植物育种方法，包括如下步骤：增加目的植物中BtSAMS1蛋白的含量和/或活性，从而使植物对蚜虫的抗性增高。

以上任一所述蚜虫为具体可为桃蚜。

以上任一所述植物为双子叶植物或单子叶植物。

以上任一所述植物为十字花科植物。

以上任一所述植物为拟南芥属植物。

以上任一所述植物为拟南芥，例如哥伦比亚生态型拟南芥。

本发明提供的蛋白质、基因以及方法可用于制备抗蚜虫的转基因植物，具有育种周期短、目标定向强的优势。本发明对于蚜虫防治，对于抗蚜虫植物育种具有重大的应用推广价值。

附图说明

图1为实施例1中BtSAMS1基因表达分析的结果。

图2为实施例1中BtSAMS1蛋白的疏水性分析的结果。

图3为实施例1中BtSAMS1蛋白的三级结构预测的结果。

图4为实施例2中T₁代植株抗性筛选的示例性照片。

图5为实施例2中PCR鉴定的示例性照片。

图6为实施例2中T₃代植株抗性筛选的示例性照片。

图7为实施例2中蚜虫取食行为的检测的结果。

图8为实施例2中观测蚜虫定殖表现中植株上的蚜虫虫口数的结果。

图9为实施例2中观测蚜虫定殖表现中植株叶片的表型照片。

图10为实施例2中化学防治效果测定实验的结果。

图11为实施例2中蚜虫繁殖率的监测的结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。大刍草，英文名为Balsas teosinte，拉丁名为Z.maysssp.parviglumis，为禾本科蜀黍属的一年生草本植物。哥伦比亚生态型拟南芥，即Arabidopsis thaliana(ecotype Columbia-0)，又称为野生型拟南芥。桃蚜(Myzuspersicae)，属于半翅目。pUC57载体为市售的克隆载体。pCAMBIA1300载体为市售的植物表达载体。如无特殊说明，以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1、BtSAMS1蛋白及其编码基因的发现和分析

一、BtSAMS1蛋白及其编码基因的发现

1、取大刍草叶片，提取总RNA，反转录得到cDNA。

2、以步骤1得到的cDNA为模板，进行第一轮PCR扩增。

3、以第一轮PCR扩增的扩增产物为模板，进行第二轮PCR扩增。

4、回收第二轮PCR扩增的扩增产物，插入pUC57载体，得到重组质粒。经测序，重组质粒中具有序列表的序列2所示的开放阅读框，表达序列表的序列1所示的蛋白质。将序列表的序列1所示的蛋白质命名为BtSAMS1蛋白。将编码BtSAMS1蛋白的基因命名为BtSAMS1基因。

二、BtSAMS1基因表达分析

分别取被蚜虫取食前的大刍草叶片和被蚜虫取食后的大刍草叶片。提取叶片的总RNA，反转录得到cDNA。以cDNA为模板，以actin基因为内参，通过荧光定量PCR鉴定BtSAMS1基因的相对表达量。

用于检测BtSAMS1基因的引物如下：

BtSAMS F：5'-TCACCGAGGTGCGCAAG-3'；

BtSAMS R：5'-CCGTACGTGTCGATGATGA-3'。

用于检测actin基因的引物如下：

actin F：5'-CTTCGAATGCCCAGCAAT-3'；

actin R：5'-CGGAGAATAGCATGAGGAAG-3'。

结果见图1。结果显示，与被蚜虫取食前的大刍草叶片相比，被蚜虫取食后的大刍草叶片的BtSAMS1基因表达水平显著提高，这表明BtSAMS1基因参与植物对蚜虫的防御响应。

三、BtSAMS1蛋白的一级结构和理化性质分析

蛋白质的基本性质主要包括其相对分子质量、等电点和氨基酸组成等。对BtSAMS1蛋白的理化性质进行预测分析，结果见表2。结果表明：BtSAMS1蛋白的等电点小于6，为酸性氨基酸；从主要氨基酸组成看出，甘氨酸(Gly)含量最高；不稳定系数小于40，为稳定蛋白；平均亲水系数为负值，即为亲水性蛋白。

表2

四、BtSAMS1蛋白的疏水性分析

利用ExPASy分析BtSAMS1蛋白的疏水性，对氨基酸序列进行疏水性分析采用Kyte&Doolittle方法。结果见图2。观察疏水峰值和亲水峰值的氨基酸所占的百分率，疏水峰值大于0的氨基酸所占的比例超过50％，可以认为氨基酸合成的整个蛋白质表现出疏水性，反之为亲水性。由平均亲水系数可得，BtSAMS1蛋白为亲水蛋白。

五、BtSAMS1蛋白的亚细胞定位分析

对BtSAMS1蛋白进行亚细胞定位分析，结果见表3。BtSAMS1蛋白主要在细胞质中发挥作用。BtSAMS1蛋白既不是分泌蛋白，也不是膜蛋白，它在细胞中合成，主要功能场所为细胞质。

表3

功能场所	细胞质	细胞骨架	细胞核	过氧化物酶体	线粒体
						概率(％)	56.5	17.4	17.4	4.3	4.3

六、BtSAMS1蛋白的二级结构和三级结构预测

蛋白质的二级结构是指蛋白质多肽链本身的折叠和盘绕的方式，主要有α-螺旋、延伸链、无规则卷曲三种形式，可利用SOPMA对其进行预测分析。BtSAMS1蛋白的二级结构预测分析结果见表4。结果显示，BtSAMS1蛋白中无规则卷曲所占比例最高。

表4

二级结构元件	百分比(％)
		α螺旋(Alpha helix)	24.11
延伸链(Extended strand)	23.10
		无规则卷曲(Random coil)	52.79

蛋白质的三级结构是指整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置，即肽链中所有原子在三维空间的排布位置。蛋白质的结构决定功能，因此预测和分析蛋白质的三级结构对理解其结构与功能之间的关系有重大作用。通过在线程序SWISS MODEL对BtSAMS1蛋白的三维结构进行模拟构建，结果见图3。结果显示，为四聚体结构。

实施例2、转基因植物的获得和鉴定

一、构建重组质粒

将序列表的序列2所示的双链DNA分子插入pCAMBIA1300载体的Xba I和Kpn I酶切位点之间，得到重组质粒35S::BtSAMS1。重组质粒35S::BtSAMS1已进行测序验证。

二、转基因植物的获得

T₁代种子长成的植株即为T₁代植株。T₂代种子长成的植株即为T₂代植株。T₃代种子长成的植株即为T₃代植株。

正常培养的条件：光周期16h/8h(光照/黑暗)，温度22℃/18℃(光照/黑暗)。

1、将重组质粒35S::BtSAMS1导入农杆菌GV3101，得到重组农杆菌；用1/2MS液体培养基悬浮重组农杆菌菌体至OD_600nm值为0.8-1.0，然后加入silwet-77并使其浓度为0.02％(体积比)，即为侵染处理液。

2、将哥伦比亚生态型拟南芥种子进行灭菌，然后均匀点在MS固体培养基平板上，待种子边缘多余的水分风干，用封口膜将培养皿封好，然后培养皿正面朝上正常培养10天，此时拟南芥幼苗长出两片子叶和两片真叶。

3、完成步骤2后，将拟南芥幼苗移栽到营养土中，正常培养。

4、将步骤3培养的拟南芥植株的开花花序和果荚剪去，然后将植株莲座叶以上部分浸入侵染处理液3min；之后将植株平放于一张保鲜膜上，再用另一张保鲜膜盖于植株上面，压平两张保鲜膜，按植株大小将保鲜膜折好，使植株完全包裹在保鲜膜内，先黑暗条件下平放培养24h(20℃)，再黑暗条件下直立培养24h(20℃)；然后揭去保鲜膜，正常培养(揭膜2天后用清水喷洒植株以清洗表面)至结实，收集种子，即为T₁代种子。

5、将T₁代种子进行灭菌，然后点种于含有50μg/mL潮霉素的MS固体培养基平板中；将平板正面朝上正常培养10d，然后观察T₁代植株表型，根据表型鉴别阳性植株和阴性植株(抗性筛选为阴性的植株长势较小，只有两片子叶，且发黄；抗性筛选为阳性的植株长得比较粗壮，具有两片子叶和两片真叶)。示例性照片见图4。图4中，深色线条的圈中具有四片叶子的植株均为阳性植株，浅色线条的圈中具有两片叶子的植株均为阴性植株。

6、将步骤5中的抗性筛选为阳性的T₁代植株移栽到营养土中，浇水并覆盖保鲜膜3-4天，然后揭去保鲜膜，正常培养30天，然后进行PCR鉴定，筛选转基因植株。

PCR鉴定的方法：取植株叶片，提取基因组DNA，采用引物Primer F和引物NOS-R组成的引物对进行PCR扩增，然后进行琼脂糖凝胶电泳；如果电泳显示具有约819bp的特征带、该植株为转基因植株，如果电泳显示不具有所述特征带、该植株为非转基因植株。

Primer F：5'-CACACCGTGCTCATCTCCAC-3'；

NOS-R：5'-AGACCGGCAACAGGATTC-3'。

部分植株的电泳图见图5。图5中，M泳道为DNA Mark2000，泳道1为阴性对照(以水为模板)，泳道2为阳性对照(以重组质粒35S::BtSAMS1为模板)，泳道3、4、5、6、11、13、14、15、16、19泳道对应转基因植株的DNA，泳道7、8、9、10、12、18对应非转基因植株的DNA。

8、T₁代转基因植株单株收种，即为T₂代种子。

9、将步骤8得到的T₂代种子进行灭菌，然后点种于含有50μg/mL潮霉素的MS培养基平板中；将平板正面朝上正常培养10d，然后观察T₂代植株表型，根据表型鉴别阳性植株和阴性植株(鉴别方法同步骤5)，如果阳性植株与阴性植株的数量比约为3：1，说明其T₁代亲本植株为单拷贝插入的转基因植株。

10、将步骤9中的抗性筛选为阳性的植株的T₂代植株(其T1代亲本植株为单拷贝插入的转基因植株)单株收种，即为T₃代种子。

11、将T₃代种子进行灭菌，然后点种于含有50μg/mL潮霉素的MS培养基平板中；将平板正面朝上正常培养10d，然后观察T₃代植株表型，根据表型鉴别阳性植株和阴性植株(鉴别方法同步骤5)。如果某一T₂代植株自交得到的T₃代植株全部为阳性植株，说明该T₂代亲本植株为纯合的转基因植株，该纯合转基因植株的自交后代作为一个纯合转BtSAMS1基因株系。如果某一T₂代植株自交得到的T₃代植株发生了阳性植株和阴性植株的表型分离，说明该T₂代亲本植株为非纯合的转基因植株。某一非纯合的T₂转基因植株自交得到的T₃代植株的表型照片见图6的A(发生了表型分离)。某一纯合的T₂转基因植株自交得到的T₃代植株的表型照片见图6的B(均为阳性植株)。

三、转空载体植物的获得

用pCAMBIA1300载体代替重组质粒35S::BtSAMS1，其他参照步骤二，得到转空载体植株。

四、蚜虫取食行为的检测

将种植有3株野生型拟南芥植株的花盆和种植有3-4株纯合转BtSAMS1基因株系T₃代植株的花盆放在两端(两个花盆的距离为25cm)(拟南芥植株均为生长30天的植株)，中间放置50只桃蚜(50只桃蚜中，25只为10日龄，25只为7日龄)，观察桃蚜的取食趋向，并拍照记录。设置3次重复试验，结果取平均值。

见图7。图7中，A为7分钟后，B为8分钟后，C为10分钟后，D为15分钟后，均从放置桃蚜开始计时。刚开始5分钟时，桃蚜基本没有移动，一直在中间休息区环绕。7分钟左右，有桃蚜开始往野生型拟南芥方向爬行，而转BtSAMS1基因拟南芥方向处没有出现桃蚜。8分钟，出现1只桃蚜往转BtSAMS1基因拟南芥方向处爬行，而野生型拟南芥处已经有桃蚜开始往植株上定殖了。10分钟时，成龄桃蚜以及幼龄若虫均出现往野生型拟南芥方向爬行的轨迹，转BtSAMS1基因拟南芥方向处虽然也有但其数量比野生型拟南芥方向处少很多。15分钟时，野生型拟南芥植株上已经定殖许多蚜虫，仍有大量蚜虫往这端方向转移，其数量远远高于往转BtSAMS1基因拟南芥路径上的蚜虫数量。这表明，桃蚜对野生型拟南芥的取食喜好性强于对转基因拟南芥。

五、观测蚜虫定殖表现

用木棍制作支架，然后罩上纱布，即为检测装置。将种植有3株野生型拟南芥植株的花盆和种植有3株纯合转BtSAMS1基因株系T₃代植株的花盆均放置于检测装置中(拟南芥均为生长30天的植株)。然后在检测装置内释放100只10日龄的桃蚜，2天后统计植株上的蚜虫虫口数。设置3次重复试验，结果取平均值。

结果见图8。释放桃蚜2天后，桃蚜迅速在野生型拟南芥上定殖(96只/株)，转BtSAMS1基因拟南芥上定殖的桃蚜数量(42只/株)显著少于野生型拟南芥，仅为野生型拟南芥的1/2。这表明，桃蚜偏向定殖于野生型拟南芥。

对比蚜虫取食2天后的野生型拟南芥叶片与转BtSAMS1基因拟南芥叶片，见图9。野生型拟南芥叶片皱缩卷曲程度较转BtSAMS1基因拟南芥卷曲程度大，且野生型拟南芥大部分叶片被蚜虫吸食叶片汁液，出现了无绿状态，而转BtSAMS1基因拟南芥只有少数叶片出现无绿状态，这也验证了桃蚜对野生型拟南芥的取食喜好性强于对转BtSAMS1基因拟南芥。

六、化学防治效果测定实验

阿维·吡虫啉是阿维菌素和吡虫啉的复配制剂。阿维菌素是由链霉菌中阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)发酵产生，其作用机制与一般杀虫剂不同的是干扰虫子的神经生理活动，刺激释放γ-氨基丁酸，而氨基丁酸对节肢动物的神经传导有抑制作用，使其会出现麻痹症状，不活动，不取食。吡虫啉是烟碱类超高效杀虫剂，是烟碱乙酰胆碱受体的作用体，害虫接触药剂后，中枢神经正常传导受阻，使其麻痹死亡。

供试植株：野生型拟南芥植株和转BtSAMS1基因株系T₃代植株(均为生长30天的植株)。

挑取10日龄的桃蚜，用毛笔接种于供试植株的莲座叶上(每株植株接种10头)。2天后，将植株分为两组(每组至少10株)，一组喷施工作浓度为0.18％的阿维·吡虫啉溶液(施用浓度下的阿维·吡虫啉对拟南芥的生长发育无不良影响)，另一组喷施清水，连续喷施3天。5天后(从第三次喷施开始计的5天后)统计植株上的蚜虫数量。

结果见图10。对于喷施清水的处理组，野生型拟南芥上的桃蚜数量显著高于转BtSAMS1基因拟南芥上的桃蚜数量。对于喷施阿维·吡虫啉溶液处理组，野生型拟南芥上的桃蚜数量显著高于转BtSAMS1基因拟南芥上的桃蚜数量。喷施阿维·吡虫啉溶液处理组植株上的桃蚜数量显著低于喷施清水的处理组。结果显示，转BtSAMS1基因拟南芥防治桃蚜的效果结合化学防治效果，桃蚜数量明显下降，几乎没有桃蚜存在。

七、蚜虫繁殖率的监测

每株供试植株取4片莲座叶，放置于培养皿中的保湿滤纸上，并在每个培养皿中用毛笔小心放置8头10日龄的桃蚜，每12小时观察检测拟南芥离体叶片上的新生若蚜数目，将新生若蚜从叶面小心去除，连续5天计数检测不同型植株上的新生若蚜数目，计算每片叶片上桃蚜的平均繁殖率。进行三次重复试验，每次重复试验中每种供试植株设置5个生物学重复。

结果见图11。结果显示，转BtSAMS1基因拟南芥离体叶片上的若虫数量很低，繁殖率被抑制，从第三天开始下降，可能桃蚜取食转BtSAMS1基因拟南芥影响其繁殖能力，导致其繁殖率下降。野生型拟南芥繁殖率持续上涨，到第四天出现下降，可能是由于离体拟南芥叶片营养供给不足。两种拟南芥繁殖率对比，转BtSAMS1基因拟南芥上的蚜虫繁殖率比野生型拟南芥上的蚜虫繁殖率低很多，表明转BtSAMS1基因拟南芥明显抑制桃蚜的繁殖。

将转空载体T₃代植株与野生型拟南芥植株分别在平行条件下进行上述步骤四、步骤五、步骤六和步骤七的实验，转空载体拟南芥的各个结果均与野生型拟南芥无显著差异。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 山西师范大学

<120> 来源于大刍草的BtSAMS1蛋白及其在抗蚜虫植物育种中的应用

<130> GNCYX210093

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 394

<212> PRT

<213> Z. mays ssp. parviglumis

<400> 1

Met Ala Ala Glu Ser Phe Leu Phe Thr Ser Glu Ser Val Asn Glu Gly

1 5 10 15

His Pro Asp Lys Leu Cys Asp Gln Val Ser Asp Ala Val Leu Asp Ala

20 25 30

Cys Leu Ala Gln Asp Pro Asp Ser Lys Val Ala Cys Glu Thr Cys Thr

35 40 45

Lys Thr Asn Met Val Met Val Phe Gly Glu Ile Thr Thr Lys Ala Thr

50 55 60

Val Asp Tyr Glu Lys Ile Val Arg Asp Thr Cys Arg Glu Ile Gly Phe

65 70 75 80

Thr Ser Asp Asp Val Gly Leu Asp Ala Asp Arg Cys Lys Val Leu Val

85 90 95

Asn Ile Glu Gln His Ser Pro Asp Ile Ala Gln Gly Val His Gly His

100 105 110

Phe Thr Lys Arg Pro Glu Glu Ile Gly Ala Gly Asp Gln Gly His Met

115 120 125

Phe Gly Tyr Ala Thr Asp Glu Thr Pro Glu Leu Met Pro Leu Ser His

130 135 140

Val Leu Ala Thr Lys Leu Gly Ala Arg Leu Thr Glu Val Arg Lys Asn

145 150 155 160

Gly Thr Cys Ala Trp Leu Arg Pro Asp Gly Lys Thr Gln Val Thr Val

165 170 175

Glu Tyr Val Asn Glu Gly Gly Ala Ile Val Pro Val Arg Val His Thr

180 185 190

Val Leu Ile Ser Thr Gln His Asp Glu Thr Val Ile Asn Asp Glu Ile

195 200 205

Ala Ala Asp Leu Lys Glu His Val Ile Lys Pro Val Ile Pro Glu Lys

210 215 220

Tyr Leu Asp Glu Lys Thr Ile Phe His Leu Asn Pro Ser Gly Arg Phe

225 230 235 240

Val Ile Gly Gly Pro His Gly Asp Ala Gly Leu Thr Gly Arg Lys Ile

245 250 255

Ile Ile Asp Thr Tyr Gly Gly Trp Gly Ala His Gly Gly Gly Ala Phe

260 265 270

Ser Gly Lys Asp Pro Thr Lys Val Asp Arg Ser Gly Ala Tyr Val Ala

275 280 285

Arg Gln Ala Ala Lys Ser Ile Val Ala Ser Gly Leu Ala Arg Arg Cys

290 295 300

Leu Val Gln Val Ser Tyr Ala Ile Gly Val Pro Glu Pro Leu Ser Val

305 310 315 320

Phe Val Asp Ser Tyr Gly Thr Gly Thr Ile Pro Asp Lys Glu Ile Leu

325 330 335

Lys Ile Val Lys Glu Asn Phe Asp Phe Arg Pro Gly Met Ile Ser Ile

340 345 350

Asn Leu Asp Leu Lys Lys Gly Gly Asn Arg Phe Ile Lys Thr Ala Ala

355 360 365

Tyr Gly His Phe Gly Arg Asp Asp Ala Asp Phe Thr Trp Glu Val Val

370 375 380

Lys Pro Leu Lys Phe Asp Lys Ala Ser Ala

385 390

<210> 2

<211> 1185

<212> DNA

<213> Z. mays ssp. parviglumis

<400> 2

atggcggcgg agagcttcct gttcacctcg gagtccgtga acgaggggca ccccgacaag 60

ctgtgcgacc aggtgtcgga cgccgtgctt gacgcatgcc tcgcgcagga ccccgacagc 120

aaggtggctt gcgagacctg caccaagacc aacatggtga tggtgttcgg cgagatcacg 180

accaaggcga ccgtggacta cgagaagatc gtgcgcgaca cctgccgcga gatcgggttc 240

acctccgacg acgtgggcct cgacgccgac cgctgcaagg tgctggtgaa catcgagcag 300

cattcccccg acatcgcgca gggcgtgcac gggcacttca cgaagcggcc cgaggagatc 360

ggcgcgggcg accagggcca catgttcggg tacgccaccg acgagacccc cgagctgatg 420

ccgctcagcc acgtgctggc caccaagctg ggcgcgcgcc tcaccgaggt gcgcaagaac 480

ggcacctgcg cctggctgag gcccgacggc aagacccagg tgacggtgga gtacgtgaac 540

gagggcggcg ccatagtgcc cgtccgcgtg cacaccgtgc tcatctccac ccagcacgac 600

gagaccgtca tcaacgacga gatcgccgcc gacctcaagg agcacgtcat caagcccgtg 660

atccctgaga agtacctcga cgagaagacc atcttccacc tcaacccgtc cgggcgcttc 720

gtcatcggcg ggccccacgg tgacgccggc ctcacaggcc gcaagatcat catcgacacg 780

tacggcggct ggggagccca cggcggtggc gccttctccg gcaaggaccc caccaaggtg 840

gaccgcagcg gcgcctacgt ggccaggcag gccgccaaga gcatcgtggc cagcggcctc 900

gcccgccgct gcctcgtgca ggtgtcgtac gccatcggcg tgccggagcc cctgtccgtg 960

ttcgtcgact cgtacggcac cggcacgatc cccgacaagg agatccttaa gatcgtgaag 1020

gagaacttcg acttcaggcc cgggatgatc agcatcaacc tcgacctgaa gaagggcggc 1080

aacaggttca tcaagaccgc cgcctacggc cacttcggcc gtgacgacgc tgacttcacc 1140

tgggaggtgg tgaagcccct caagttcgac aaggcatcgg cctaa 1185

Claims

1.BtSAMS1蛋白在调控植物对蚜虫的抗性中的应用；

所述调控为正调控，即BtSAMS1蛋白增加，植物对蚜虫的抗性增高；

所述BtSAMS1蛋白是如下（a1）或（a2）：

（a1）序列表中序列1所示的蛋白质；

（a2）在（a1）所述蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述蚜虫为桃蚜。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述植物为双子叶植物或单子叶植物。

4.编码BtSAMS1蛋白的基因或含有编码BtSAMS1蛋白的基因的重组载体或含有编码BtSAMS1蛋白的基因的表达盒的应用，为培育对蚜虫的抗性增高的转基因植物；

所述BtSAMS1蛋白是如下（a1）或（a2）：

（a1）序列表中序列1所示的蛋白质；

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于：所述编码BtSAMS1蛋白的基因是编码区如序列表的序列2所示的DNA分子。

6.如权利要求4或5所述的应用，其特征在于：所述蚜虫为桃蚜。

7.如权利要求4或5所述的应用，其特征在于：所述植物为双子叶植物或单子叶植物。

8.一种培育对蚜虫的抗性增高的转基因植物的方法，包括如下步骤：将编码BtSAMS1蛋白的基因导入受体植物中，得到对蚜虫的抗性增高的转基因植物；

所述BtSAMS1蛋白是如下（a1）或（a2）：

（a1）序列表中序列1所示的蛋白质；

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于：所述编码BtSAMS1蛋白的基因是编码区如序列表的序列2所示的DNA分子。

10.如权利要求8或9所述的方法，其特征在于：所述蚜虫为桃蚜。

11.如权利要求8或9所述的方法，其特征在于：所述植物为双子叶植物或单子叶植物。

12.一种使植物对蚜虫的抗性增高的植物育种方法，包括如下步骤：增加目的植物中BtSAMS1蛋白的含量，从而使植物对蚜虫的抗性增高；

所述BtSAMS1蛋白是如下（a1）或（a2）：

（a1）序列表中序列1所示的蛋白质；

13.如权利要求12所述的方法，其特征在于：所述蚜虫为桃蚜。

14.如权利要求12所述的方法，其特征在于：所述植物为双子叶植物或单子叶植物。