CN114438118A - 在水稻、玉米中高效表达Bt蛋白Cry56Aa1抗草地贪夜蛾的方法 - Google Patents

在水稻、玉米中高效表达Bt蛋白Cry56Aa1抗草地贪夜蛾的方法 Download PDF

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CN114438118A CN202210145037.8A CN202210145037A CN114438118A CN 114438118 A CN114438118 A CN 114438118A CN 202210145037 A CN202210145037 A CN 202210145037A CN 114438118 A CN114438118 A CN 114438118A
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Abstract

本发明公开了在水稻、玉米中高效表达Bt蛋白Cry56Aa1抗草地贪夜蛾的方法，在原有基因Cry56Aa1(GenBank：FJ597621.1)的基础上，将编码蛋白的基因改造为作物偏好的密码子，然后将改造后的基因(水稻：SEQ ID NO.5；玉米：SEQ ID NO.7)导入作物中，本发明中基于Cry56Aa1蛋白本身对草地贪夜蛾的杀虫活性，将其改造后的Cry56Aa1基因在水稻、玉米中高效表达，是转基因作物对草地贪夜蛾具有极强的杀虫活性。在本发明的效果验证试验过程中，也没有发现害虫对该蛋白产生抗性的情况。因此，本发明的Bt蛋白Cry56Aa1具有重要的经济价值和应用前景，适合大规模应用于提高植物的抗虫性中。

Description

在水稻、玉米中高效表达Bt蛋白Cry56Aa1抗草地贪夜蛾的 方法
技术领域
本发明涉及生物技术技术领域，尤其涉及在水稻、玉米中高效表达Bt蛋白Cry56Aa1抗草地贪夜蛾的方法。
背景技术
草地贪夜蛾又称为秋行军虫(fall armyworm)、秋黏虫、草地夜蛾、伪粘虫等，属于鳞翅目(Lepidoptera)夜蛾科(Noctuidae)灰翅夜蛾属(Spodoptera)的一种蛾。草地贪夜蛾具有适生区域广、迁飞能力和繁殖能力强、寄主范围广和取食量大等特性。
草地贪夜蛾最早出现于美洲，包括美国、巴西、墨西哥等地区。该物种一直被认为是一种偶发但极具破坏性的农业害虫，最早于1797年在美国佐治亚州被记载为有害害虫。一般认为草地贪夜蛾不能在热带和亚热带以外的地区越冬，但是，在温度适宜的夏季和秋季，它也可以在温带生存。1977年，以色列的Wiltshire认为草地贪夜蛾已经入侵并形成中东种群，并且根据其对性信息素(pheromone)的反应差异认为，以色列的草地贪夜蛾来源于美国-加勒比海地区，而不是来自于南美的巴西。随后，草地贪夜蛾先后入侵欧洲、非洲和亚洲等地，成为危害全球粮食生产的重大农业害虫。2016年，草地贪夜蛾在非洲首次被发现，2018年，印度首次确认草地贪夜蛾入侵并危害玉米、甘蔗和高粱等作物。目前全球共有96个国家或地区正在或曾经遭受其为害，成为全球预警的粮食作物毁灭性害虫。
苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)是一种杆状的革兰氏阳性细菌，被列为第二类第十八群芽胞杆菌属(Bacillus)中的一个种。1911年Ernst Berliner从德国苏云金省患病的地中海粉斑螟(Ephestia kuehniella)幼虫体内再次分离到这类菌株，此时苏云金芽胞杆菌才被正式命名。人类尝试将Bt运用于生物防治是在1927年Mattes又一次从地中海粉斑螟中分离出此类菌株。1928年美国启动了防治玉米螟计划，到1929年第一次大田应，这为Bt形成商业化产品奠定了基础。
苏云金芽孢杆菌分布广泛，从地上的土壤到空气中的灰尘，从河流到山川，从南极冻土到热带雨林，从平原到沙漠，均有分布。因而，苏云金杆菌菌种和基因资源十分丰富，已成为全世界最重要的杀虫基因资源。截止到2020年，按照新的分类方法，科学研究已发现79群741种Cry蛋白(https://www.bpprc.org/)。苏云金杆菌的杀虫原理主要依赖于其杀虫晶体蛋白(Cry)，该蛋白在害虫体内被分解成有毒的多肽，这些多肽与虫肠上皮细胞一些特异受体蛋白结合，破坏细胞膜，最后导致害虫死亡。而人体肠上皮细胞无相应的受体蛋白，且PH环境差异较大，因此该类蛋白对于人类及哺乳动物是安全的。同时，目前的苏云金芽孢杆菌主要分离自土壤中，本身也是属于地球环境自然生态系统不可分离的部分。
外来物种的侵害发展过程包括入侵、定殖和爆发三个阶段，2019年草地贪夜蛾已经入侵并且定殖中国，2020年以后将进入爆发为害阶段，目前我国对草地贪夜蛾的防控包括化学防控、理化诱控、农业防控、生物防控和培育抗性品种，化学防治是防治草地贪夜蛾最常用的方法，国际上常用氟氯氰菌酯、氯虫苯甲酰胺、顺式氯氰菊酯和丁硫克百威等杀虫剂来防治草地贪夜蛾，但是过多的使用化学杀虫剂会造成生产成本提高、环境污染、食用安全和破坏生态系统等问题，甚至害虫产生了抗药性；理化诱控主要指利用灯诱、性诱和食诱技术对草地贪夜蛾成虫进行诱杀，但是对危害作物的主要是幼虫时期，农业防治主要从栽培管理、作物布局和品种抗性等方面采取措施，以创造一个不利于草地贪夜蛾发生和为害的农田生态环境，农业防治也只能防治一部分，不能从根本上防治；生物防治主要指利用天敌昆虫、微生物农药、植物源农药、昆虫致病线虫来防治草地贪夜蛾，在我国，草地贪夜蛾的捕食性天敌昆虫有益蝽、黄带犀猎蝽和南方小花蝽等。但是我国没有草地贪夜蛾的专性寄生天敌，只能引进定居美洲原生境的天敌，如夜蛾黑卵蜂、长距姬小蜂和红腹侧沟茧蜂等，培育抗性品种来抗草地贪夜蛾不仅抗性持久，不易被环境因素所破坏，无农药残留，且对人畜危害小，对环境污染低不会破坏生态平衡，且成本低。
目前国内还没有发现天然的抗性品种，而应用最多的是筛选抗草地贪夜蛾的抗性基因转入作物中，基因测序同时发现，入侵的草地贪夜蛾不携带对Bt基因的抗性基因，这意味着Bt毒素和Bt作物可以有效防治草地贪夜蛾。
发明内容
1.要解决的技术问题
本发明的目的是为了解决现有技术中国内还没有发现天然的抗性品种，而应用最多的是筛选抗草地贪夜蛾的抗性基因转入作物中的问题，而提出的在水稻、玉米中高效表达Bt蛋白Cry56Aa1抗草地贪夜蛾的方法。
2.技术方案
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
在水稻、玉米中高效表达Bt蛋白Cry56Aa1抗草地贪夜蛾的方法，包括以下步骤：
步骤1：采用农杆菌介导的方法，将载体分别转入水稻、玉米愈伤组织中，转化材料经过共培养-筛选-分化-生根-转基因苗的锻炼和移栽；
步骤2：筛选高效表达Bt蛋白Cry56Aa1抗草地贪夜蛾的转基因水稻、玉米植株。
优选地，所述载体为植物表达载体。
优选地，所述水稻载体为双价表达载体，玉米载体为单价表达载体。
优选地，所述水稻载体的出发载体为pDTmar-Hyg；所述玉米载体的出发载体为pNEWMOL。
优选地，使用的水稻品种为蜀恢818；使用的玉米品种为KN5585。
本发明还提出了一种Bt蛋白Cry56Aa1，其特征在于，所述氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。
优选地，所述Bt蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸，且表达相同功能蛋白质的氨基酸序列。
应当理解，本领域技术人员可根据本发明公开的蛋白Cry56Aa1的氨基酸序列(SEQID No.2)，在不影响其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸，得到所述蛋白的突变序列。在86-108有一段跨膜区域，构成跨膜区蛋白的氨基酸大部分是疏水性氨基酸。通常，膜蛋白不能在原核表达系统中表达。因此，本发明的Bt蛋白Cry56Aa1还包括SEQID No.2所示氨基酸序列经取代、替换和/或增加一个或几个氨基酸，具有与Bt蛋白Cry56Aa1同等活性的由Cry56Aa1衍生得到的蛋白质。
编码权利要求上述Bt蛋白Cry56Aa1的基因，该核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个核苷酸，且能编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。
此外，应理解，考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。
本发明的基因和蛋白质可以从Bt菌株Ywc2-8中克隆或分离得到，或者通过DNA或肽合成的方法得到。
可将本发明基因与表达载体可操作地连接，得到能够表达本发明蛋白的重组表达载体，进而可以通过诸如农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法等转基因方法，将所述表达载体导入宿主，得到转Cry56Aa1基因的转化体，即被草地贪夜蛾危害的作物，使其具备抗虫活性。
此外，还可以通过发酵本发明菌株Ywc2-8，得到含有Cry56Aa1蛋白的发酵液，将其制备成杀虫剂，用于草地贪夜蛾的防治。本领域技术人员还可以将上述基因转化细菌或真菌，通过大规模发酵生产本发明Bt蛋白。
本发明还提出了一种含有权利要求7所述基因的重组表达载体。
本发明还提出了一种含有权利要求8所述表达载体的工程菌。
优选地，所述载体在制备转基因植物中的应用。
其中，Cry56Aa1蛋白的氨基酸组成如下表所示：
氨基酸 百分比％ 氨基酸 百分比％
Ala(A) 8.75 Met(M) 1.36
Cys(C) 0.30 Asn(N) 8.45
Asp(D) 5.73 Pro(P) 5.58
Glu(E) 4.07 Gln(Q) 3.17
Phe(F) 4.98 Arg(R) 4.98
Gly(G) 7.24 Ser(S) 7.24
His(H) 1.51 Thr(A) 6.49
Ile(I) 5.28 Val(V) 5.43
Lys(K) 4.37 Trp(W) 1.21
Leu(L) 9.50 Tyr(Y) 4.37
根据Bt改造的原则，在原有基因Cry56Aa1(GeneBank：FJ597621.1)的基础上，将新的Bt基因改造为作物(如水稻、玉米)偏好的密码子，去除特殊酶切位点，将改造后的Cry56Aa1基因合成后与载体连接，通过农杆菌介导转入到水稻、玉米基因组中，从而得到具有抗草地贪夜蛾活性的转基因品种。
3.有益效果
相比于现有技术，本发明的优点在于：
本发明中，基于Cry56Aa1蛋白本身对草地贪夜蛾的杀虫活性，将其改造后的Cry56Aa1基因在水稻、玉米中高效表达，是转基因作物对草地贪夜蛾具有极强的杀虫活性。在本发明的效果验证试验过程中，也没有发现害虫对该蛋白产生抗性的情况。因此，本发明的Bt蛋白Cry56Aa1具有重要的经济价值和应用前景，适合大规模应用于提高植物的抗虫性中。
附图说明
图1显示的是用德泰生物信息学工具对Cry56Aa1基因进行信号肽分析；
图2显示的是用德泰生物信息学工具对Cry56Aa1基因进行跨膜区预测分析；
图3显示的是敲除跨膜区域及修改Cry56Aa1基因碱基后与修改前的氨基酸对比；
图4显示的是实施例2中重组质粒pET30a-Cry56Aa1载体图谱；
图5显示的是重组质粒pET30a-Cry56Aa1的酶切鉴定图谱，其中泳道1为DNAmarker，泳道2为酶切重组质粒pET30a-Cry56Aa1；
图6显示的是Cry56Aa1基因在E.coli BL21(DE3)中表达的SDS-PAGE检测图；
其中，泳道M为蛋白marker(分子量从上到下：160、120、700、50、40、35、25、20、10KDa)；泳道0为对照(不加IPTG)；line1为含有载体pET-30a的E.coli BL21(DE3)经IPTG15℃诱导16h的表达蛋白；line 2为含有载体pET-30a的E.coli BL21(DE3)的全菌破菌后上清；line 3为含有载体pET-30a的E.coli BL21(DE3)的全菌破菌后沉淀；
图7显示的是SDS-PAGE分析包涵体中Cry56Aa1蛋白纯化结果；其中，泳道M为蛋白marker(分子量从上到下：160、120、700、50、40、35、25、20、10KDa)；line 1为包涵体溶解离心后上清；line 2为上清同上清同Ni-IDA孵育后流出液；line 3为50mM Imidazole的洗脱组分；line 4-6:300mM Imidazole的洗脱组；
图8显示的是饲喂三天以后观察幼虫情况，幼虫基本上长到二龄，长度约3-5mm，而200ng/ml Cry56Aa1蛋白配制的饲料，2龄幼虫食用后大部分死亡(注：图中标尺均为1mm)；
图9显示的是3-6龄幼虫的生长情况，存活下来的幼虫生长发育受到一定的抑制，50ng/ml蛋白饲料所饲喂的幼虫从3龄开始逐渐受到轻微抑制，而100ng/ml和200ng/ml蛋白饲料所饲喂的幼虫从3龄开始受到严重的抑制作用，从体长体重上与对照组相比，幼虫基本上停留在2-3龄，生长发育受到抑制(注：图中标尺为5mm)；
图10显示的是实施例4中高效表达双元载体pDTmar-Hyg-Cry56Aa1的载体图谱；
图11显示的是实施例4中获得的20株转基因单克隆抗潮霉素水稻植株；
图12显示的是实施例4中潮霉素PCR检测阳性转基因水稻的结果；
图13显示的是实施例4中PCR检测阳性转基因水稻的电泳结果；
图14显示的是实施例4转基因水稻生物活性测定结果；
图15显示的是实施例6中pNEWMOL-Cry56Aa1的载体图谱；
图16显示的是实施例6中获得的50株转基因单克隆抗除草剂玉米植株；
图17显示的是实施例6中PCR检测阳性转基因玉米的电泳结果；
图18显示的是实施例6转基因玉米生物活性测定结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
实施例1：
在水稻、玉米中高效表达Bt蛋白Cry56Aa1抗草地贪夜蛾的方法，包括以下步骤：
步骤1：采用农杆菌介导的方法，将载体分别转入水稻、玉米愈伤组织中，转化材料经过共培养-筛选-分化-生根-转基因苗的锻炼和移栽；
步骤2：筛选高效表达Bt蛋白Cry56Aa1抗草地贪夜蛾的转基因水稻、玉米植株。
本发明中，所述载体为植物表达载体。
本发明中，所述水稻载体为双价表达载体，玉米载体为单价表达载体。
本发明中，所述水稻载体的出发载体为pDTmar-Hyg；所述玉米载体的出发载体为pNEWMOL。
本发明中，使用的水稻品种为蜀恢818；使用的玉米品种为KN5585。
本发明还提出了一种Bt蛋白Cry56Aa1，其特征在于，所述氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。
本发明中，所述Bt蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸，且表达相同功能蛋白质的氨基酸序列。
本发明中，本领域技术人员可根据本发明公开的蛋白Cry56Aa1的氨基酸序列(SEQID No.2)，在不影响其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸，得到所述蛋白的突变序列。在86-108有一段跨膜区域，构成跨膜区蛋白的氨基酸大部分是疏水性氨基酸。通常，膜蛋白不能在原核表达系统中表达。因此，本发明的Bt蛋白Cry56Aa1还包括SEQID No.2所示氨基酸序列经取代、替换和/或增加一个或几个氨基酸，具有与Bt蛋白Cry56Aa1同等活性的由Cry56Aa1衍生得到的蛋白质。
本发明中，编码权利要求上述Bt蛋白Cry56Aa1的基因，该核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个核苷酸，且能编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。
此外，应理解，考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。
本发明的基因和蛋白质可以从Bt菌株Ywc2-8中克隆或分离得到，或者通过DNA或肽合成的方法得到。
本发明中，可将本发明基因与表达载体可操作地连接，得到能够表达本发明蛋白的重组表达载体，进而可以通过诸如农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法等转基因方法，将所述表达载体导入宿主，得到转Cry56Aa1基因的转化体，即被草地贪夜蛾危害的作物，使其具备抗虫活性。
本发明中，还可以通过发酵本发明菌株Ywc2-8，得到含有Cry56Aa1蛋白的发酵液，将其制备成杀虫剂，用于草地贪夜蛾的防治。本领域技术人员还可以将上述基因转化细菌或真菌，通过大规模发酵生产本发明Bt蛋白。
本发明还提出了一种含有权利要求7所述基因的重组表达载体。
本发明还提出了一种含有权利要求8所述表达载体的工程菌。
本发明中，所述载体在制备转基因植物中的应用。
其中，Cry56Aa1蛋白的氨基酸组成如下表所示：
Figure BDA0003508506140000111
Figure BDA0003508506140000121
本发明中，根据Bt改造的原则，在原有基因Cry56Aa1(GeneBank：FJ597621.1)的基础上，将新的Bt基因改造为作物(如水稻、玉米)偏好的密码子，去除特殊酶切位点，将改造后的Cry56Aa1基因合成后与载体连接，通过农杆菌介导转入到水稻、玉米基因组中，从而得到具有抗草地贪夜蛾活性的转基因品种。
实施例2：
改造后Cry56Aa1基因的表达及杀虫活性测定：
1.1原始序列的分析及密码子偏好改造Cry56Aa1蛋白编码，在进行原核蛋白表达前，需要将对序列进行信号肽预测，经过测试，序列中没有信号肽如图1所示。
通过跨膜区预测软件对蛋白质序列进行分析，发现在86-108区域有一跨越细胞膜的区域有23个氨基酸残基如SEQ ID No.3蓝色区域所示，原核表达前需要对跨膜区序列进行敲除。
在不改变原有Cry56Aa1基因所编码的氨基酸序列的情况下，使用大肠杆菌偏爱密码子进行优化，提高G+C的含量，避免某些可能降低表达的序列。改造后的情况如表1所示，改造后的Cry56Aa1基因序列SEQ ID No.3所示改造前后氨基酸序列对比如图3所示。
表1改造前后的情况
Figure BDA0003508506140000131
1.2 Cry56Aa1基因合成与载体构建
新型Bt基因(Cry56Aa1)为本实验室利用从川西森林采集的Bt菌Ywc2-8分离克隆并按大肠杆菌基因喜好密码子改造获得。。采用全基因合成的方法获得Cry56Aa1基因。用NdeI和HindIII内切酶处理pET30a质粒，使之线性化，通过T4连接酶将Cry56Aa1基因连接至线性化的pET30a质粒，获得重组质粒pET30a-Cry56Aa1(重组质粒图谱如图4所示)再将重组质粒pET30a-Cry56Aa1转化至DH5a，以获得大量的重组质粒。重组质粒的初步鉴定由酶切法完成，使用XbaI/XhoI内切酶处理重组质粒，通过琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，如图5所示，酶切之后的重组质粒通过电泳分离，出现两条带，条带大小符合目的基因大小，且经过测序与原基因序列一致，表明pET30a-Cry56Aa1载体构建成功。
1.3 Cry56Aa1蛋白的获得
将构建正确的的pET30a–Cry56Aa1载体转入受体菌E.coli.BL21(DE3)(购买于北京全式金生物技术有限公司)。从转化的平板中挑选单克隆，接种到4mL的LB培养基中(含50μg/mL的硫酸卡那霉素)，待培养至OD600为0.5-0.8，向试管培养液中加入终浓度0.5mMIPTG，之后置于37℃诱导表达。
扩大培养，生长至OD600＝0.8时，加终浓度0.5mM IPTG，15℃诱导16h后收集菌体。(如果当天不做纯化操作，将菌体冻于-20℃)。
取诱导后的培养液12000rpm离心5min，去除上清液，加入PBS液重悬沉淀，最后加入SDS-PAGE上样缓冲液于100℃下加热样品10min，然后离心取上清电泳。全菌采用20mMTris(pH8.0)，300mM NaCl，20mM Imidazole含1％Triton X-100，1mM DTT，1mM PMSF超声裂解，取上清与沉淀进行SDS-PAGE分析检测，如图5所示。Cry56Aa1分子量约为73.3kDa左右，与预测的蛋白分子量相符。检测结果显示，蛋白表达于包涵体中。
包涵体采用20mM Tris(pH8.0)，300mM NaCl含1％Triton X-100，2mM EDTA，5mMDTT洗涤后，以20mM Tris(pH8.0)，300mM NaCl，8M Urea，20mM Imidazole缓冲液溶解包涵体同时平衡Ni-IDA柱，最后用不同浓度咪唑的平衡缓冲液洗脱目标蛋白，并收集每个洗脱组分进行SDS-PAGE分析检测。分析结果见图7。
经Ni-IDA亲和层析纯化分析，收集纯度相对较高的Lane 5-6，将其加入到处理后的透析袋中，4℃环境下，透析到缓冲液[1×PBS(pH 7.4)，4mM GSH，0.4mM GSSG，0.4M L-Arginine，1M Urea，10％Glycerol]中复性，复性后五个蛋白最终透析于储存液1×PBS(pH7.4)，10％Glycerol溶液约6-8h。透析复性结束后，上清用0.22μm滤器过滤后分装，并将其冻存至-80℃。
1.4 Cry56Aa1蛋白稳定性测试(冻融实验)及浓度测定
将蛋白从-80℃冰箱中取出，放置于冰水浴中5-10min待其缓慢融化，融化后放置于4℃冰箱内0.5h，无异常现象，说明蛋白冻融实验是正常的。
测定蛋白浓度采用Bradford蛋白浓度测定试剂盒。测得浓度见下表2：
表2 Cry56Aa1蛋白浓度
Table2 Concentration of the target protein
Figure BDA0003508506140000151
1.5蛋白杀虫活性测定
将实施例2获得的Cry56Aa1蛋白对草地贪夜蛾进行杀虫活性测定。用1×PBS缓冲液(磷酸缓冲盐溶液，phosphate buffer saline)将蛋白溶液稀释到50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml三个浓度梯度，各取1ml加入到饲料中，采用1×PBS溶液作为阴性对照，清水为空白对照。待饲料凝固以后切块放入低龄幼虫罐中。用毛笔轻轻接入初孵幼虫，每个养虫罐30只，3个重复，放置光照培养箱中培养，3d、7d、14d以后检查幼虫死亡情况，用毛笔轻触虫体，不能正常爬行者视为死亡，统计其死亡率。
死亡率＝(死亡试虫数/处理前供试总虫数)×100％
用SPSS 10.0软件计算LC50，其测定结果见表3。
表3 Cry56Aa1的杀虫活性
供试昆虫 LC<sub>50</sub>/(μg/mL) 95％置信限/(μg/mL)
草地贪夜蛾 0.1114 0.0223-0.3423
根据表3的生物活性测定结果，Cry56Aa1表达产物对草地贪具有较好的杀虫活性，其半致死浓度LC50为0.1114μg/mL(95％置信区间:0.0223-0.3423μg/mL)；而阴性对照PBS缓冲液和空白对照对草地贪夜蛾均不具杀虫活性。
实施例3：
根据水稻、玉米等作物偏好性密码子改造Cry56Aa1蛋白编码基因，在不改变原有Cry56Aa1基因所编码的氨基酸序列的情况下使用作物偏好性密码子对密码子进行优化，提高G+C的含量，避免某些可能降低表达的序列：去除原有的PPSS结构(AATAAA、AATAAT、AATTAA和AACCAA),去除原有的内含切割序列CATTG，改掉连续的AT富集情区(≥4A/T)，对编码区存在的一些常用酶切位点进行改造(表4)，改造后的情况如表5所示，改造后的Cry56Aa1基因序列为SEQ ID No.5(水稻)、SEQ ID No.7(玉米)所示。
表4对一些常用的酶切位点进行改造(去除)
酶酶切位点 酶酶切位点
BamHⅠG！GATCC SphⅠGCATG！C
BglⅡA！GATCT XbaⅠT！CTAGA
ClaⅠAT！CGAT XhoⅠC！TCGAG
EagⅠC！GGCCG PstⅠCTGCA！G
EcoRⅠG！AATTC PvuⅡCAG！CTG
EcoRⅤGAT！ATC SacⅠGAGCT！C
HindⅢA！AGCTT SalⅠG！TCGAC
KpnⅠGGTAC！C ScaⅠAGT！ACT
NcoⅠC！CATGG SmaⅠCCC！GGG
NotⅠGC！GGCCGC
表5基因改造前后的情况
Figure BDA0003508506140000171
实施例4
Cry56Aa1基因在水稻中高效表达：将改造后的Cry56Aa1基因连入P-ubi及T-nos之间(pDTmar)，构建完成完成后，利用salI和BamHI切下元件，Klenow补平后连入pDTmar-Hyg载体以获得最终无选择标记高效表达双元载体pDTmar-Cry56Aa1(SEQIDNo.6，图10)。利用农杆菌介导的方法，将修饰后的Cry56Aa1基因转入水稻品种蜀恢818，获得T0代20株转基因单克隆抗体水稻植株(图11)，通过PCR检测发现20株含潮霉素基因(图13)，5株含Cry56Aa1基因而不含潮霉素基因(图13)。
实施例5：
转Cry56Aa1基因水稻生物活性鉴定，将催芽2d的种子均匀一致的播撒在塑料盆中(60cm x 40cm x 10cm)，将测定材料、对照组R818各播1盆，在播种10d至15d后每盆接入30头初孵幼虫，并在塑料盆外罩上120目的细密网，每个材料3次重复。保持27℃的室内温度和70％的相对湿度等适宜草地贪夜蛾正常生长的条件。3d后统计死亡数，每隔2天观察虫的存活情况，统计死亡数。
如图13、表6，接虫19d后，对照R818被全部食用光，因为幼虫在三龄后有相互捕食性，因此后19d后幼虫存活率为80％，幼虫体重为0.1439g，化蛹率为96.77％；而转Cry56Aa1基因水稻19d后幼虫存活率为20％、体重为0.0039g，与对照相比，生长发育受到了严重的抑制作用，幼虫化蛹率也极低仅为6.67％，由此看来，Cry56Aa1在水稻中高效表达后也具有极强的杀虫活性。
表6转Cry56Aa1基因水稻生物活性鉴定结果
Figure BDA0003508506140000181
实施例6：
Cry56Aa1基因在玉米中高效表达，将改造后的Cry56Aa1基因连入P-ubi及T-nos之间(pNEWMOL)，构建完成完成后，利用SacI和BamHI切下元件，Klenow补平后连入pDTmar载体以获得表达载体pNEWMOL-Cry56Aa1(SEQ ID No.6，图14)。分离未成熟的玉米胚将其与携带有目的基因载体的农杆菌共培养，再诱导转化后的未成熟胚产生愈伤组织，愈伤组织再生并进行阳性苗筛选(图15)，本发明利用农杆菌介导的方法将修饰后的Cry56Aa1基因转入玉米品种KN5585，获得T0代50株转基因单克隆抗体玉米植株(图15)，通过PCR检测发现50株含Cry56Aa1基因基因(图16)。
实施例7：
转Cry56Aa1基因玉米生物活性鉴定，将测定材料与阴性对照材料KN5585均匀的撒播至塑料盘中(60cm x 40cm x 10cm)。待幼苗长至2-3叶时期时每个材料接30初孵幼虫，并在塑料盆外罩上120目的细密网，每个材料3次重复。保持27℃的室内温度和70％的相对湿度等适宜草地贪夜蛾正常生长的条件。3d后统计死亡数，每隔2天测量一次幼虫的体重，统计死亡数。
如图17、表7，接虫17d天后，阴性对照KN5585幼苗几乎全部被危害，幼虫的存活率达85％，幼虫体重为0.2468g，化蛹率可达98.86％；而转Cry56Aa1基因玉米幼苗只少部分被危害，且幼虫的存活率仅为30.00％，幼虫体重也只有0.0078g，存活的幼虫化蛹率仅为7.36％，但不能成功孵化出成虫。由此看来，Cry56Aa1在玉米中高效表达后仍然具有极强的杀虫活性。
表7转Cry56Aa1基因玉米生物活性鉴定结果
Figure BDA0003508506140000191
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.在水稻、玉米中高效表达Bt蛋白Cry56Aa1抗草地贪夜蛾的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：采用农杆菌介导的方法，将载体分别转入水稻、玉米愈伤组织中，转化材料经过共培养-筛选-分化-生根-转基因苗的锻炼和移栽；
步骤2：筛选高效表达Bt蛋白Cry56Aa1抗草地贪夜蛾的转基因水稻、玉米植株。
2.根据权利要求1所述的在水稻、玉米中高效表达Bt蛋白Cry56Aa1抗草地贪夜蛾的方法，其特征在于，所述载体为植物表达载体。
3.根据权利要求2所述的在水稻、玉米中高效表达Bt蛋白Cry56Aa1抗草地贪夜蛾的方法，其特征在于，所述水稻载体为双价表达载体，玉米载体为单价表达载体。
4.根据权利要求3所述的在水稻、玉米中高效表达Bt蛋白Cry56Aa1抗草地贪夜蛾的方法，其特征在于，所述水稻载体的出发载体为pDTmar-Hyg；所述玉米载体的出发载体为pNEWMOL。
5.根据权利要求1-4任一所述的在水稻、玉米中高效表达Bt蛋白Cry56Aa1抗草地贪夜蛾的方法，其特征在于，使用的水稻品种为蜀恢818；使用的玉米品种为KN5585。
6.一种Bt蛋白Cry56Aa1，其特征在于，所述氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
7.根据权利要求6所述的一种Bt蛋白Cry56Aa1，其特征在于，所述Bt蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸，且表达相同功能蛋白质的氨基酸序列。
8.一种含有权利要求7所述基因的重组表达载体。
9.一种含有权利要求8所述表达载体的工程菌。
10.根据权利要求8所述的基因的重组表达载体，其特征在于，所述载体在制备转基因植物中的应用。
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