CN112390893A

CN112390893A - 一种高效抗草地贪夜蛾的融合蛋白及其应用

Info

Publication number: CN112390893A
Application number: CN202010683829.1A
Authority: CN
Inventors: 许超; 沈志成
Original assignee: Hangzhou Ruifeng Biotechnology Ltd inc
Current assignee: Hangzhou Ruifeng Biotechnology Ltd inc
Priority date: 2020-07-16
Filing date: 2020-07-16
Publication date: 2021-02-23
Anticipated expiration: 2040-07-16
Also published as: CN112390893B

Abstract

本发明公开了一种高效抗草地贪夜蛾的融合蛋白，所述的融合蛋白由BT杀虫晶体蛋白与BT营养期杀虫蛋白Vip3通过融合连接构成；所述BT杀虫晶体蛋白为BT杀虫晶体蛋白Cry1Da或者BT杀虫晶体蛋白Cry1Fa。本发明提融合蛋白对夜蛾科害虫的杀虫活性更高，显著提高了对草地贪夜蛾等鳞翅目夜蛾科害虫杀虫活性，有利于抗虫蛋白发挥生物活性，减缓害虫抗性发生的风险。本发明所述的融合蛋白可以同时高效杀灭草地贪夜蛾、黏虫、斜纹夜蛾、玉米螟、棉铃虫、甜菜夜蛾、小地老虎、二化螟、大螟、稻纵卷叶螟等水稻、玉米和大豆上的主要鳞翅目害虫。

Description

一种高效抗草地贪夜蛾的融合蛋白及其应用

(一)技术领域

本发明涉及一种抗虫融合蛋白及其应用，特别涉及一种高抗草地贪夜蛾等鳞翅目害虫的抗虫融合蛋白及其应用。

(二)背景技术

害虫给全球农业生产带来每年数十亿美元的损失。害虫的防治目前主要依靠使用化学农药和推广转基因作物。化学农药的残留会对人体健康和环境带来不良影响。利用生物技术方法培育含有抗虫基因的转基因抗虫农作物，可以大幅度降低化学杀虫剂的使用，有效保护农作物免受害虫为害。杀虫蛋白质有多种，目前使用最多的是来自苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,BT)的杀虫晶体蛋白，如Cry1A、Cry1F等；以及BT营养期杀虫蛋白，如Vip3等(Estruch,Warren et al.1996,Adang,Crickmore et al.2014)。BT杀虫蛋白质在转基因植物上的应用已经超过二十年，2017年全球抗虫转基因作物的应用面积超过7000万公顷(ISAAA 2018)。

杀虫晶体蛋白是发现最早、使用最广泛的BT杀虫蛋白质。目前商业化应用的抗虫转基因玉米中使用较多的杀虫晶体蛋白是Cry1Ab，Cry1Fa和Cry2Ab等，这些杀虫蛋白质对部分鳞翅目昆虫如玉米螟、棉铃虫、小菜蛾、二化螟、三化螟、大螟、稻纵卷叶螟等具有较高的杀虫活性。其中，转cry1Ab基因玉米、转cry1Ac基因棉花已经被广泛应用。Frankenhuyzen和Jakka等总结多项研究的生物活性测定数据后指出，Cry1Ab\1Ac蛋白对鳞翅目螟蛾科害虫的杀虫活性较高，但是对多种鳞翅目夜蛾科害虫(如草地贪夜蛾、甜菜夜蛾、小地老虎等)的杀虫活性较低(Frankenhuyzen 2009,Jakka,Ferré et al.2015)。Cry1D与Cry1F与Cry1A类蛋白在氨基酸序列上同源性不高，对鳞翅目昆虫的杀虫谱也与Cry1A类蛋白有差异。Cry1Fa蛋白对草地贪夜蛾、棉铃虫、粉纹夜蛾、小菜蛾、甜菜夜蛾等具有高杀虫生物活性，转cry1Fa基因玉米在美洲地区被大量应用于防治草地贪夜蛾等鳞翅目害虫(Frankenhuyzen2009)。Cry1Da蛋白是BT杀虫晶体蛋白中的一种，美国专利US5691308A披露了Cry1Da对鳞翅目昆虫具有生物活性及其在害虫控制上的应用(Payne and Sick 1994)。Cry1Da蛋白对欧洲玉米螟、棉铃虫、粉纹夜蛾、烟芽夜蛾、烟草天蛾等害虫的杀虫活性较低，但是对甜菜夜蛾、草地贪夜蛾的杀虫活性较高(Frankenhuyzen 2009,Wang,Wang et al.2019)。

长期大量地使用单一的杀虫蛋白质，可以导致害虫对BT杀虫蛋白质抗性的产生和发展(Carriere,Crickmore et al.2015)。自2005年发现第一例BT抗性害虫以来，全球抗性害虫发生量逐年升高，并呈现快速增长的趋势(Tabashnik and Carrière 2017)。田间检测到部分鳞翅目害虫已经产生了抗性，如Bagla等报道了中国新疆、印度等地种植的表达Cry1Ac蛋白的转基因棉花上发现了抗性棉铃虫和抗性棉红铃虫(Bagla 2010)；Monnerat等报道了巴西种植的表达Cry1Fa蛋白的转基因玉米产品上发现了抗性草地贪夜蛾(Monnerat,Martins et al.2015)。

草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)是一种鳞翅目夜蛾科的迁飞性害虫，原分布于美洲，现已经扩散到非洲、南亚和中国南方地区。该虫繁殖力高、迁飞力强、寄主广泛，尤其在玉米上为害严重，其钻蛀的取食特性使得传统化学农药较难获得预期的防治效果。草地贪夜蛾对Cry1F、Vip3A蛋白较敏感，但是对Cry1A蛋白敏感性不高(Frankenhuyzen2009)。在波多黎各、巴西、美国等美洲国家，已经发现了对BT杀虫蛋白质具有抗性的草地贪夜蛾(Huang,Qureshi et al.2014,Monnerat,Martins et al.2015,Boaventura,Ulrichet al.2019)。因此，对草地贪夜蛾防治效果好、不易产生抗性的BT转基因玉米品系具有重大应用价值。

BT营养期杀虫蛋白质Vip3与部分杀虫晶体蛋白都对夜蛾科鳞翅目昆虫具有比较高的杀虫活性。Vip3蛋白与杀虫晶体白在昆虫中肠上具有不同的结合受体，它们对昆虫的成毒机制不同，不存在交互抗性。Chakroun等总结文献研究指出，Cry1A、Cry1Da、Cry1Fa等蛋白质在昆虫中肠上典型的几种结合受体均无法与Vip3蛋白发生相互作用，杀虫晶体蛋白与Vip3蛋白在昆虫中肠的作用机理不同(Chakroun,Banyuls et al.2016)。Wang等通过研究草地贪夜蛾发现，Cry1F蛋白在草地贪夜蛾中肠上的结合受体蛋白质为ABCC2，Cry1Da的受体蛋白是APN9，而Vip3A蛋白的受体则是SR-C(Wang et al.，2019)。因此，同时使用Vip3杀虫蛋白质和杀虫晶体蛋白可以提高杀虫效果和减缓害虫的抗性发生和发展。

中国专利CN1818067A披露了通过Cry1Ab和Vip3的方法防治鳞翅目害虫的技术方法。由于Cry1Ab对鳞翅目夜蛾科害虫如草地贪夜蛾、小地老虎和斜纹夜蛾的杀虫活性比较低，因此这个融合蛋白质中的Cry1Ab对草地贪夜蛾的控制的贡献比较小，融合蛋白质对草地贪夜蛾的杀虫活性比单独Vip3仍然需要进一步提高。为了更加高效控制草地贪夜蛾等害虫，本发明披露了利用Cry1Da或Cry1Fa蛋白质与Vip3蛋白质进行融合，获得对草地贪夜蛾具有极高杀虫活性的融合蛋白质的技术，以及这种融合蛋白质在转基因农作物上的应用。本发明的特点是能够更加高效控制草地贪夜蛾等夜蛾科害虫。本发明提供了这种杀虫蛋白质的氨基酸序列及其在转基因植物中的应用方法。

(三)发明内容

本发明的目的提供一种高效抗草地贪夜蛾的融合蛋白、编码基因及其在抗虫转基因农作物中的应用，提供了一种农业上高效治理草地贪夜蛾害虫、降低害虫抗性发生的方法。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种高效抗草地贪夜蛾的融合蛋白，所述的融合蛋白由BT杀虫晶体蛋白与BT营养期杀虫蛋白Vip3通过融合连接构成，N端为BT杀虫晶体蛋白具有杀虫活性的部分多肽，C端为BT营养期杀虫蛋白Vip3；所述BT杀虫晶体蛋白为BT杀虫晶体蛋白Cry1Da或者BT杀虫晶体蛋白Cry1Fa。

进一步，所述Cry1Da蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:9所示，编码基因核苷酸序列为SEQ ID NO:7所示；所述Cry1Fa蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:10所示，编码基因核苷酸序列为SEQ ID NO:8所示。

进一步，所述融合蛋白为BT杀虫晶体蛋白Cry1Da与BT营养期杀虫蛋白Vip3通过融合连接构成，氨基酸序列为SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1具有90％以上相同性，核苷酸序列为SEQ ID NO:5所示。

进一步，所述融合蛋白为BT杀虫晶体蛋白Cry1Fa与BT营养期杀虫蛋白Vip3通过融合连接构成，氨基酸序列为SEQ ID NO:2所示或者与SEQ ID NO:2具有90％以上相同性，核苷酸序列为SEQ ID NO:6所示。

本发明所述的融合蛋白也包括与SEQ ID NO:1或者SEQ ID NO:2具有高度相似性并且对草地贪夜蛾具有杀虫活性的蛋白质。Bt杀虫蛋白质往往存在高度相似的同源蛋白质。利用这些同源蛋白质同样可以获得与SEQ ID NO:1或者SEQ ID NO:2高度相似的融合蛋白质。此外，SEQ ID NO:1或者SEQ ID NO:2也可以通过改良获得仍然具有相同或者相似或者更高杀虫活性的蛋白质。这些同源或者变异的蛋白质的特征是融合蛋白同时包含：1)与SEQ ID NO:3至少具有75％相同性的氨基酸序列片段，2)与SEQ ID NO:4至少具有90％相同性的氨基酸序列片段。

本发明还提供了编码上述融合蛋白的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6。由于一种氨基酸可以由不同的核苷酸密码子编码，因此本发明披露的杀虫蛋白质可以由不同的核苷酸序列编码。特别是在不同植物中，不同密码子的使用频率可以是不同的。因此，可以根据在不同植物中的应用使用不同的核苷酸序列。例如玉米等单子叶植物往往使用GC含量高的密码子，而双子叶植物中GC含量往往低一些。

本发明还涉及由所述融合蛋白编码基因构建的重组载体及表达所述融合蛋白的农作物细胞。植物的农杆菌转化载体，如pCambia1300，可以用来构建表达融合蛋白的基因表达框。通常一种能够控制在植物中表达的启动子与编码融合蛋白的核苷酸序列5’端进行功能性连接。这些启动子包括CaMV的35S启动子(Kay,Chan et al.1987)、玉米Ubiquitin-1启动子(Christensen,Sharrock et al.1992)、拟南芥Uniqitin启动子(Norris,Meyer etal.1993)等。抗虫融合蛋白质编码框的3’端与终止子连接。常用的终止子包括CaMV的35S终止子(Franck,Guilley et al.1980)、农杆菌的Nos终止子(Bevan,Barnes et al.1983)等。

本发明还提供一种所述融合蛋白在制备抗虫转基因农作物中的应用，所述方法如：将包含融合蛋白编码基因表达框的农杆菌转化载体通过成熟的转化方法导入到玉米(Ishida,Saito et al.1996)、大豆(Zeng,Vadnais et al.2004)、水稻(Hiei,Komari etal.1997)等植物中。这些植物的转化方法在技术上已经成熟，本专业的一般技术人员就可以实现这个技术目的。本发明所述融合蛋白能够高效杀灭草地贪夜蛾等鳞翅目害虫，比如草地贪夜蛾、黏虫、斜纹夜蛾、玉米螟、棉铃虫、甜菜夜蛾、小地老虎、二化螟、大螟或稻纵卷叶螟等。

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：(1)本发明提供的杀虫融合蛋白与现有融合蛋白相比，对夜蛾科害虫的杀虫活性更高，聚合了对草地贪夜蛾等鳞翅目夜蛾科害虫杀虫活性比较高的晶体杀虫蛋白质(Cry1Fa或Cry1Da)以及BT营养期杀虫蛋白质(Vip3)，显著提高了对草地贪夜蛾等鳞翅目夜蛾科害虫杀虫活性。(2)融合蛋白中杀虫蛋白质Cry和Vip3在植物中实现了同时等量表达，有利于抗虫蛋白发挥生物活性，减缓害虫抗性发生的风险。(3)本发明所述融合蛋白的杀虫谱更广。本发明所述的融合蛋白可以同时高效杀灭草地贪夜蛾、黏虫、斜纹夜蛾、玉米螟、棉铃虫、甜菜夜蛾、小地老虎、二化螟、大螟、稻纵卷叶螟等水稻、玉米和大豆上的主要鳞翅目害虫。

此外，值得指出的是，发明人员在研究融合蛋白时意外发现，BT蛋白的融合方法对本发明所涉及的BT融合蛋白的杀虫生物活性具有极大影响。具体来说，在相同实验方法下，BT融合蛋白质的N端为Cry蛋白、C端为Vip3蛋白时，所获得的融合蛋白质对草地贪夜蛾的杀虫生物活性显著提高；但是，当BT融合蛋白质的N端为Vip3蛋白、C端为Cry蛋白时，研究人员发现，获得的融合蛋白质对草地贪夜蛾和玉米螟的活性显著低下。由此可见，本发明提供的融合方式是实现本发明目的的关键技术，并且是本领域的研究人员无法预知或推断就可以实现的。

(四)附图说明

图1大肠杆菌表达重组蛋白质的SDS-PAGE鉴定图。图中箭头所指为每条泳道

的目的蛋白。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

本发明以下实施例中所使用的分子生物学和生物化学方法均为已知的技术。在Ausubel编写的John Wiley and Sons公司出版的Current Protocols in MolecularBiology，和J.Sambrook等编写的Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)出版的Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3^rd ED.等文献均有详细的说明。

实施例1、抗虫融合基因的载体构建、重组蛋白质的制备

本发明涉及的编码基因均由上海生工公司进行人工合成，其中，抗虫融合蛋白质Cry1Da-Vip3由BT杀虫晶体蛋白Cry1Da与BT营养期杀虫蛋白Vip3通过融合连接构成，氨基酸序列为SEQ ID NO:1，编码基因cry1da-vip3的核苷酸序列为SEQ ID NO:5。抗虫融合蛋白质Cry1Fa-Vip3由BT杀虫晶体蛋白Cry1Fa与BT营养期杀虫蛋白Vip3通过融合连接构成，氨基酸序列为SEQ ID NO:2，编码基因cry1fa-vip3的核苷酸序列为SEQ ID NO:6。BT杀虫晶体蛋白Cry1Da氨基酸序列为SEQ ID NO:9，编码基因cry1da的核苷酸序列为SEQ ID NO:7，BT杀虫晶体蛋白Cry1Fa氨基酸序列为SEQ ID NO:10，编码基因cry1fa的核苷酸序列为SEQ IDNO:8。

利用大肠杆菌(Escherichia coli)pET表达系统进行重组蛋白质的表达和制备，即将目的基因导入合适的表达载体中，再将表达载体转入合适的表达菌株，在一定条件下诱导目的基因的表达，制备重组蛋白质。

抗虫融合蛋白Cry1Da-Vip3的制备过程如下：将融合基因cry1da-vip3克隆到表达载体pET32a(Novagen，69015-3，美国)的BamHI和SacI这二个限制性内切酶酶切位点之间，获得重组质粒pET32a-cry1da-vip3；重组质粒通过热击转化法导入大肠杆菌BL21(DE3)细胞系，在含50mg/L卡那霉素的LB固体培养基上37℃过夜培养，筛选得到单克隆阳性菌落；单个菌落接种至含50mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃过夜培养后，取0.2ml菌液继代接种至装有200毫升含50mg/L氨苄青霉素的LB液体培养液的锥形瓶中，37℃振荡培养至OD₆₀₀＝0.6，然后加入IPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)至终浓度为0.5mM，并继续在同样的条件下振荡培养4小时，诱导重组蛋白质的表达；表达完成后，将细菌培养液5000g离心15分钟，弃掉上清培养液，收集细胞沉淀，并以50毫升20mM磷酸缓冲液(PBS，pH＝7.4)重悬细胞；随后将重悬液置于冰水中充分冷却后，用超声波破碎仪粉碎细胞(探头直径10mm，以650w、50％功率破碎15min)，离心，上清和沉淀(即图1中包涵)分别经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定后，将含有正确目的条带的蛋白质样品储存于-80℃冰箱中备用，获得抗虫融合蛋白Cry1Da-Vip3悬浮液，即为重组蛋白质悬浮液。所述LB液体培养基组成为：蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L，溶剂为双蒸水，120℃高温高压灭菌15分钟；LB固体培养基是在LB液体培养基中再加入15g/L琼脂，高温高压灭菌后倒置于已灭菌的培养皿中冷却即可。

以上为融合蛋白质Cry1Da-Vip3的制备方法。以相同的实验方法，可以获得抗虫融合蛋白质Cry1Fa-Vip3、杀虫蛋白质Cry1Da和Cry1Fa，如图1所示。

此外，类比上述实验方法，可以获得重组的反向融合蛋白质(Vip3-Cry1Da和Vip3-Cry1Fa)，所述的反向融合蛋白质的N端为Vip3蛋白，C端为Cry1Da或者Cry1Fa蛋白。

实施例2、重组蛋白质对鳞翅目昆虫的生物活性测定

实验对象：选取常见的鳞翅目害虫(草地贪夜蛾、玉米螟)的初孵幼虫(新生2h以内)作为被试昆虫。

实验组：实施例1方法制备的重组蛋白质进行生物活性的预实验(分别设置1ng/cm²、10ng/cm²、100ng/cm²、1000ng/cm²四组浓度)；根据预实验结果，设置8组浓度梯度(浓度范围如下表1所示，以PBS溶液稀释)，测定其对昆虫具有50％致死率的浓度区间。每组浓度测试虫数为80头。

表1对草地贪夜蛾生物活性测定的重组蛋白浓度梯度表(ng/cm²)

表2对玉米螟生物活性测定的重组蛋白浓度梯度表(ng/cm²)

阴性对照组：阴性对照的准备方法与实施例1相同，唯一的区别是大肠杆菌表达菌株中转入的质粒为不含任何插入DNA序列的pET32a空载体。

测定方法：以表面平铺法测定重组蛋白质对昆虫的致死中浓度LC₅₀。

昆虫人工饲料煮熟后平铺到24孔培养板(每孔直径为1.5cm)中，等待饲料凝固。每块24孔板中随机设置20个孔为实验组，4个为阴性对照组。实验组每孔的饲料表面铺上重组蛋白200微升，阴性对照组每孔的饲料表面铺上阴性对照蛋白200微升，待整块板铺完后将其放置在120rpm的摇床上晃动至液体晾干。每孔接入2头被试昆虫，并用透气封口膜封闭，在28℃培养箱中遮光饲养7天，统计昆虫死亡率，得出对应的致死中浓度LC₅₀，结果如下表3所示。

表3重组蛋白质对两种鳞翅目害虫的致死中浓度(LC₅₀)测定

注：a、95％CI，95％置信区间。Cry1Ab、Vip3、Cry1Ab-Vip3：中国专利CN1818067A中描

述的Cry1Ab、Vip3和融合蛋白质；Cry1Da+Vip3：Cry1Da与Vip3以摩尔比1：1的混合物；

Cry1Da-Vip3：Cry1Da与Vip3的融合杀虫蛋白质。Cry1Fa+Vip3：Cry1Fa与Vip3以摩尔比1：

1的混合物；Cry1Fa-Vip3：Cry1Fa与Vip3的融合杀虫蛋白质。Vip3-Cry1Da：Cry1Da与Vip3

的反向融合蛋白质；Vip3-Cry1Fa：Cry1Fa与Vip3的反向融合蛋白质。

从上述生物测定的结果中可以看出，重组的融合蛋白质Cry1Da-Vip3和Cry1Fa-Vip3对草地贪夜蛾和玉米螟均具有极高的杀虫活性。与单独蛋白和简单混合的蛋白相比，重组的融合蛋白质具有更高的生物活性，显著提高了对草地贪夜蛾和玉米螟的杀虫效率。此外，研究人员意外发现，反向融合的蛋白质Vip3-Cry1Da和Vip3-Cry1Fa对两种被试昆虫的杀虫活性显著降低，这预示着BT蛋白的融合方式会对融合蛋白质的活性具有关键性的影响，研究人员在未进行昆虫生物活性测定的情况下，无法预知或推断出融合蛋白对鳞翅目害虫的杀虫活性。

实施例3、重组融合蛋白质对BT抗性草地贪夜蛾的杀虫活性测定

实验对象：选用对Cry1Fa蛋白不敏感的抗性草地贪夜蛾和对Vip3A蛋白不敏感的抗性草地贪夜蛾作为研究对象，进行重组蛋白质的杀虫生物活性测定，以初孵幼虫(新生2h以内)作为被试昆虫。

实验组：具体实施方法、实验材料的准备和阴性对照组与实施例2中所述的方法一致；差别仅在于被试昆虫不同，此处为BT抗性草地贪夜蛾。

测定方法：以表面平铺法测定重组蛋白质对昆虫的致死中浓度LC₅₀。具体实现方式与实施例2所述的方法一致。

重组融合蛋白质对抗性草地贪夜蛾的杀虫生物活性的测定结果：重组融合蛋白质Cry1Da-Vip3和Cry1Fa-Vip3对抗Cry1Fa的草地贪夜蛾和抗Vip3A的草地贪夜蛾均具有显著杀虫活性，测得的半致死浓度LC₅₀如下表4所示。

表4重组蛋白质对抗性草地贪夜蛾的致死中浓度(LC₅₀)测定

注：a、95％CI，95％置信区间。b.N/A:Not active，无生物活性。

实施例4、根癌农杆菌转化T-DNA载体的构建

根癌农杆菌转化T-DNA载体是基于pCambia1300(NCBI序列编号AF234296)载体而构建的。抗虫融合蛋白编码基因cry1da-vip3的核苷酸序列(SEQ ID NO:5，5’端被设计上BamHI位点，3’端被设计上SacI位点，BamHI-SacI酶切片段)与玉米的pepc终止子(GenebankNO:X15239，5’端被设计上SacI位点，3’端被设计上KpnI位点，SacI-KpnI片段)连接，获得包括基因和终止子的BamHI-KpnI片段。抗虫融合蛋白编码基因cry1fa-vip3的核苷酸序列(SEQ ID NO:6)的设计和酶切方式与上述cry1da-vip3的方法一致。

玉米的ubiquitin-1启动子(Genebank NO:S94464)从玉米的基因组中通过PCR获得，使用的引物分别是：

ZmUbi-F(5’GCGAAGCTTGCATGCCTACAGTGCAGCGTGACCCGGTCGTGC，添加了HindIII位点)；

ZmUbi-R(5’GTGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGAAGTAACACCAAACAACAG，添加了BamHI位点)。

玉米ubiquitin-1启动子经过HindIII和BamHI酶切后，与cry1da-vip3融合基因-终止子片段(BamHI-KpnI片段)连接到预先经过HindIII-KpnI酶切的pCambia 1300载体中，获得T-DNA载体p1300-cry1da-vip3。使用相同的酶切和连接方式，获得另一个T-DNA载体p1300-cry1fa-vip3。显然，这里仅仅列举了一个实例。将上述玉米泛素启动子替换为其他合适的启动子(如CaMV 35S启动子、拟南芥泛素启动子)，或是将玉米pepc终止子替换为其他合适的终止子(如35S终止子、农杆菌Nos终止子)，均可以构建得到用于植物转化的T-DNA载体。T-DNA载体通过电击转化法转入农杆菌EHA105菌株中，将鉴定正确的阳性克隆菌保存于-80℃冰箱。

实施例5、转基因水稻的获得

转基因水稻的获得方法是根据现有技术，采用根癌农杆菌介导法转化水稻成熟胚(Hiei,Komari et al.1997)。选取成熟饱满的水稻种子去壳，诱导产生愈伤组织为转化材料。取含有目的基因的农杆菌(已转入实施例4制备的p1300-cry1da-vip3和p1300-cry1fa-vip3载体)划板，挑单菌落接种。将待转化的愈伤组织放入适当浓度的农杆菌液中(含乙酰丁香酮)，让农杆菌结合到愈伤组织表面，然后把愈伤组织转移到共培养基中，共培养2～3天。用无菌水冲洗转化后的愈伤组织，转移到含抗生素的筛选培养基上，筛选培养(50ng/ml潮霉素)两个月(中间继代一次)。把筛选后生长活力良好的愈伤组织转移到预分化培养基上培养20天左右，然后将预分化好的愈伤组织转移到分化培养基，14小时光照分化发芽。2～3周后，把抗性再生植株转移到生根培养基上壮苗生根，最后将再生植株洗去琼脂移植到温室，作为候选材料。

实施例6、转基因玉米的获得

转基因玉米的获得方法是根据现有技术，采用根癌农杆菌介导法转化玉米幼胚(Ishida,Saito et al.1996)。具体步骤如下：取授粉后8～10天的玉米穗，收集所有的未成熟胚(大小为1.0～1.5mm)，将已转入实施例4制备的p1300-cry1da-vip3和p1300-cry1fa-vip3载体的农杆菌与未成熟胚共培育2～3天(22℃)。随后，转移未成熟胚到愈伤诱导培养基(含200mg/L特美汀)上，28℃暗培养10～14天。接下来将所有的愈伤组织转移到带有50ng/ml潮霉素的筛选培养基上进行筛选，28℃暗培养2～3周。转移所有的组织到新鲜潮霉素的筛选培养基上进行第二次筛选，28℃暗培养2～3周。随后转移所有筛选后仍然成活的胚性组织到再生培养基上，28℃暗培养10～14天，每皿一个株系。转移胚性组织到新鲜的再生培养基上，26℃光照培养10～14天。转移所有发育完全的植株到生根培养基上，26℃光照培养直到根系发育完全。

实施例7、玉米转化株系中抗虫蛋白表达量的测定

测定遗传转化获得的T0代玉米转化株系中抗虫蛋白的含量。取植株表现型与非转基因无明显差异的6个株系，每个株系在V6叶期的叶片组织50mg，每个叶片组织取3份样品作为重复；液氮研磨后加入500微升PBS缓冲液，充分混合后12000rpm离心5min，将上清液稀释500倍后进行酶联免疫法(ELISA)测定，测定时使用试剂为Envirologix公司的ELISA定量试剂盒(产品编号AP-016)和上海佑隆生物公司的ELISA定量试剂盒(产品编号AA1641)，参照产品使用说明书进行操作。

对获得的玉米转化株系苗测定结果如下表5所示，表达量数据为该株系三个重复的平均值。对于融合蛋白Cry1Fa-Vip3，分别以Cry1F检测试剂盒和Vip3检测试剂盒进行蛋白表达量的测定，测得的数据如下表5所示。结果表明，表达Cry1Fa-Vip3蛋白的株系FC中，两种抗虫蛋白能够等量表达；而单独表达Cry1Fa和Vip3蛋白的株系FV中，两种抗虫蛋白的表达量差异显著，使得害虫抗性的管理存在较大隐患。

表5玉米转化株系中抗虫蛋白表达量的测定

注：*μg/g-fwt：微克每克新鲜组织。

实施例8、转基因抗虫玉米转化体的筛选

通过实施例6所描述的方法获得的转基因玉米，移栽至温室，存活两周后进行草地贪夜蛾的室内生物活性测定，筛选出对草地贪夜蛾具有高杀虫活性的转化株系。取5-6cm新鲜的植物叶片组织，放置在直径7.5cm的培养皿中，垫上一片湿润的滤纸，接入10头初孵2h内的草地贪夜蛾幼虫，盖上盖子后用封口膜封闭培养皿，防止幼虫逃逸。每个转化体设置3个重复的处理组，每次生物测定实验以相同生长期的非转基因植物作为阴性对照。5天后，统计每个实验组中幼虫的存活头数，计算出幼虫的死亡率。根据统计得到的死亡率数据，筛选出高抗草地贪夜蛾的转基因植株。

通过本实施例描述的方法，筛选出4个具有高抗草地贪夜蛾活性、植株表现型与非转基因株系接近的抗虫玉米转化体。对获得的转化体进行草地贪夜蛾的生物活性测定，杀虫率为100％，与本课题组前期获得的表达Cry1Ab-Cry2Ab蛋白的玉米转化体UL10相比，生物活性显著提高。

表6玉米转化体对草地贪夜蛾的生物活性测定

转化体	致死率
		DC12*	100％
DC35*	100％
		FC19**	100％
FC46**	100％
		UL10	40％
CK	0％

注：*表达Cry1Da-Vip3蛋白的玉米转化体；**表达Cry1Fa-Vip3蛋白的玉米转化体；UL10，表达CryAb-Cry2Ab蛋白的玉米转化体；CK，对照组非转基因玉米。

最后，以上列举的仅是本发明的若干实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多延伸和拓展。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接到导出或联想到的所有延伸，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

<110> 杭州瑞丰生物科技有限公司

<120> 一种高效抗草地贪夜蛾的融合蛋白及其应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1399

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 1

Met Glu Ile Asn Asn Gln Asn Gln Cys Val Pro Tyr Asn Cys Leu Ser

1 5 10 15

Asn Pro Lys Glu Ile Ile Leu Gly Glu Glu Arg Leu Glu Thr Gly Asn

20 25 30

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tacctgaggg agctgctgct ggccaccgac ctgagcaaca aggagaccaa gctgatcgtg 3420

ccaccgagcg gcttcatcag caacatcgtg gagaacggca gcatcgagga ggacaacctg 3480

gagccgtgga aggccaacaa caagaacgcc tacgtggacc acaccggtgg cgtgaacggc 3540

accaaggccc tgtacgtgca caaggacggt ggcttcagcc agttcatcgg cgacaagctg 3600

aagccgaaga ccgagtacgt gatccagtac accgtgaagg gcaagccgag catccacctg 3660

aaggacgaga acaccggcta catccactac gaggacacca acaacaacct gaaggactac 3720

cagaccatca ccaagaggtt caccaccggc accgacctga agggcgtgta cctgatcctg 3780

aagagccaga acggcgacga ggcctggggc gacaagttca ccatcctgga gatcaagcct 3840

gccgaggacc tgctgagccc ggagctgatc aacccgaaca gctggatcac cacccctggt 3900

gccagcatca gcggcaacaa gctgttcatc aacctgggca ccaacggcac cttcaggcag 3960

agcctgagcc tgaacagcta cagcacctac agcatcagct tcaccgccag cggcccgttc 4020

aacgtgaccg tgaggaacag cagggaagtg ctgttcgaga ggagcaacct gatgagcagc 4080

accagccaca tcagcggcac cttcaagacc gagagcaaca acaccggcct gtacgtggag 4140

ctgagcagga ggagcggtgg cggaggccac atcagcttcg agaacgtgag catcaagtag 4200

<210> 6

<211> 4197

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 6

atggagaaca acatccagaa ccagtgcgtg ccgtacaact gcctgaacaa cccagaggtg 60

gagatcctga acgaggagag gagcaccggc aggctgccgc tggacatcag cctgagcctg 120

accaggttcc tgctgagcga gttcgtgcct ggcgtgggag tggccttcgg cctgttcgac 180

ctgatctggg gcttcatcac cccgagcgac tggagcctgt tcctgctaca gatcgagcag 240

ctgatcgagc agaggatcga gaccctggag aggaacaggg ccatcaccac cctgcgtggc 300

ctggccgaca gctacgagat ctacatcgag gccctgaggg agtgggaggc caacccgaac 360

aacgcacagc tgagggagga cgtgaggatc aggttcgcca acaccgacga cgccctgatc 420

accgccatca acaacttcac cctgaccagc ttcgagatcc cgctgctgag cgtgtacgtg 480

caggctgcca acctgcacct gagcctgctg agggacgccg tgagcttcgg ccagggctgg 540

ggcctggaca tcgccaccgt gaacaaccac tacaacaggc tgatcaacct gatccacagg 600

tacaccaagc actgcctgga cacctacaac cagggtctgg agaacctgag gggcaccaac 660

accaggcagt gggccaggtt caaccagttc aggagggacc tgaccctgac cgtgctggac 720

atcgtggccc tgttcccgaa ctacgacgtg aggacctacc cgatccagac cagcagccag 780

ctgaccaggg agatctacac cagcagcgtg atcgaggact caccggtgag cgccaacatc 840

ccgaacggct tcaacagggc cgagttcggc gtgaggcctc cgcacctgat ggacttcatg 900

aacagcctgt tcgtgaccgc cgagaccgtg aggagccaga ccgtgtgggg tggccacctg 960

gtgagcagca ggaacacagc tggcaacagg atcaacttcc cgagctacgg cgtgttcaac 1020

ccaggcggtg ccatctggat cgccgacgag gacccgaggc cgttctacag gaccctgagc 1080

gacccggtgt tcgtgagggg aggcttcggc aacccgcact acgtgctggg cctgcgaggg 1140

gtggccttcc agcagaccgg caccaaccac accaggacct tcaggaacag cggcaccatc 1200

gacagcctgg acgagatccc accgcaggac aacagcggtg ctccgtggaa cgactacagc 1260

cacgtgctga accacgtgac cttcgtgagg tggcctggcg agatcagcgg cagcgacagc 1320

tggagggctc cgatgttcag ctggacccac aggagcgcca ccccgaccaa caccatcgac 1380

ccggagagga tcacccagat cccactggtg aaggcccaca ccctgcagag cggcaccacc 1440

gtggtgaggg gtccaggctt caccggtggc gacatcctga ggaggaccag cggaggccct 1500

ttcgcctaca ccatcgtgaa catcaacggc cagctgccgc agaggtacag ggccaggatc 1560

aggtacgcca gcaccaccaa cctgaggatc tacgtgaccg tggcaggcga gaggatcttc 1620

gctggccagt tcaacaagac gatggacaca ggcgacccgc tgaccttcca gagcttcagc 1680

tacgccacca tcaacaccgc cttcaccttc ccgatgagcc agagcagctt caccgtggga 1740

gccgacacct tcagcagcgg caacgaggtg tacatcgaca ggttcgagct gatccctgtg 1800

accgccaccc tggagggagg tggcggtgga gggaacaaga acaacaccaa gctgagcacc 1860

agggccctgc cgagcttcat cgactacttc aacggcatct acggcttcgc caccggcatc 1920

aaggacatca tgaacatgat cttcaagacc gacaccggtg gcaacctgac cctggacgag 1980

atcctgaaga accagcagct gctgaacgag atcagcggca agctggacgg cgtgaacggc 2040

agcctgaacg acctgatcgc ccagggcaac ctgaacaccg agctgagcaa ggagatcctg 2100

aagatcgcca acgagcagaa ccaggtgctg aacgacgtga acaacaagct ggacgccatc 2160

aacaccatgc tgcacatcta cctgccgaag atcaccagca tgctgagcga cgtgatgaag 2220

cagaactacg ccctgagcct gcagatcgag tacctgagca agcagctgca ggagatcagc 2280

gacaagctgg acatcatcaa cgtgaacgtg ctgatcaaca gcaccctgac cgagatcacc 2340

cctgcctacc agaggatcaa gtacgtgaac gagaagttcg aggagctgac cttcgccacc 2400

gagaccaccc tgaaggtgaa gaaggacagc agcccagccg acatcctgga cgagctgacc 2460

gagctgaccg agctggccaa gagcgtgacc aagaacgacg tggacggctt cgagttctac 2520

ctgaacacct tccacgacgt gatggtgggc aacaacctgt tcggcaggag cgccctgaag 2580

accgccagcg agctgatcgc caaggagaac gtgaagacca gcggcagcga ggtgggcaac 2640

gtgtacaact tcctgatcgt gctgaccgcc ctgcaggcca aggccttcct gaccctgacc 2700

acctgcagga agctgctggg cctggctgac atcgactaca ccagcatcat gaacgagcac 2760

ctgaacaagg agaaggagga gttcagggtg aacatcctgc cgaccctgag caacaccttc 2820

agcaacccga actacgccaa ggtgaagggc agcgacgagg acgccaagat gatcgtggag 2880

gccaagccag gccacgccct ggtgggcttc gagatgagca acgacagcat caccgtgctg 2940

aaggtgtacg aggccaagct gaagcagaac taccaggtgg acaaggacag cctgagcgag 3000

gtgatctacg gcgacaccga caagctgttc tgcccggacc agagcgagca gatctactac 3060

accaacaaca tcgtgttccc gaacgagtac gtgatcacca agatcgactt caccaagaag 3120

atgaagaccc tgaggtacga ggtgaccgcc aacttctacg acagcagcac cggcgagatc 3180

gacctgaaca agaagaaggt ggagagcagc gaggccgagt acaggaccct gagcgccaac 3240

gacgacggcg tgtacatgcc gctgggcgtg atcagcgaga ccttcctgac cccgatcaac 3300

ggcttcggcc tgcaggccga cgagaacagc aggctgatca ccctgacctg caagagctac 3360

ctgagggagc tgctgctggc caccgacctg agcaacaagg agaccaagct gatcgtgcca 3420

ccgagcggct tcatcagcaa catcgtggag aacggcagca tcgaggagga caacctggag 3480

ccgtggaagg ccaacaacaa gaacgcctac gtggaccaca ccggtggcgt gaacggcacc 3540

aaggccctgt acgtgcacaa ggacggtggc ttcagccagt tcatcggcga caagctgaag 3600

ccgaagaccg agtacgtgat ccagtacacc gtgaagggca agccgagcat ccacctgaag 3660

gacgagaaca ccggctacat ccactacgag gacaccaaca acaacctgaa ggactaccag 3720

accatcacca agaggttcac caccggcacc gacctgaagg gcgtgtacct gatcctgaag 3780

agccagaacg gcgacgaggc ctggggcgac aagttcacca tcctggagat caagcctgcc 3840

gaggacctgc tgagcccgga gctgatcaac ccgaacagct ggatcaccac ccctggtgcc 3900

agcatcagcg gcaacaagct gttcatcaac ctgggcacca acggcacctt caggcagagc 3960

ctgagcctga acagctacag cacctacagc atcagcttca ccgccagcgg cccgttcaac 4020

gtgaccgtga ggaacagcag ggaagtgctg ttcgagagga gcaacctgat gagcagcacc 4080

agccacatca gcggcacctt caagaccgag agcaacaaca ccggcctgta cgtggagctg 4140

agcaggagga gcggtggcgg aggccacatc agcttcgaga acgtgagcat caagtag 4197

<210> 7

<211> 1821

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 7

atggagatca acaaccagaa ccagtgcgtg ccgtacaact gcctgagcaa cccgaaggag 60

atcatcctgg gcgaggagag gctggagacc ggcaacaccg tggccgacat cagcctgggc 120

ctgatcaact tcctgtacag caacttcgtg ccaggcggtg gcttcatcgt gggcctgctg 180

gagctgatct ggggcttcat cggccctagc cagtgggaca tcttcctggc ccagatcgag 240

cagctgatca gccagaggat cgaggagttc gccaggaacc aggccatcag caggctggag 300

ggcctgagca acctgtacaa ggtgtacgtg agggccttca gcgactggga gaaggacccg 360

accaaccctg ccctgaggga ggagatgagg attcagttca acgacatgaa cagcgccctg 420

atcaccgcca tcccgctgtt cagggtgcag aactacgagg tggccctgct gagcgtgtac 480

gtgcaggctg ccaacctgca cctgagcatc ctgagggacg tgagcgtgtt cggcgagagg 540

tggggctacg acaccgccac catcaacaac aggtacagcg acctgaccag cctgatccac 600

gtgtacacca accactgcgt ggacacctac aaccagggcc tgaggaggct ggagggcagg 660

ttcctgagcg actggatcgt gtacaacagg ttcaggaggc agctgaccat cagcgtgctg 720

gacatcgtgg ccttcttccc gaactacgac atcaggacct acccgatcca gaccgccacc 780

cagctgacca gggaggtgta cctggacctg ccgttcatca acgagaacct gagcccagct 840

gccagctacc cgaccttcag cgctgccgag agcgccatca tcaggagccc gcacctggtg 900

gacttcctga acagcttcac catctacacc gacagcctgg ccaggtacgc ctactggggt 960

ggccacctgg tgaacagctt caggaccggc accaccacca acctgatcag gagcccgctg 1020

tacggcaggg agggcaacac cgagaggccg gtgaccatca ccgccagccc gagcgtgccg 1080

atcttcagga ccctgagcta catcaccggc ctggacaaca gcaacccggt ggcaggcatc 1140

gagggcgtgg agttccagaa caccatcagc aggagcatct acaggaagag cggtccgatc 1200

gacagcttca gcgagctgcc accgcaggac gccagcgtga gccctgccat cggctacagc 1260

cacaggctgt gccacgccac cttcctggag aggatcagcg gtccgaggat cgcaggcacc 1320

gtgttcagct ggacccacag gagcgccagc ccgaccaacg aggtgagccc gagcaggatc 1380

acccagatcc cgtgggtgaa ggcccacacc ctggccagcg gtgccagcgt gatcaagggc 1440

cctggcttca ccggaggcga catcctgacc aggaacagca tgggcgagct gggcaccctg 1500

agggtgacct tcaccggcag gctgccgcag agctactaca tcaggttcag gtacgccagc 1560

gtggccaaca ggagcggcac cttcaggtac agccagcctc cgagctacgg catcagcttc 1620

ccgaagacaa tggacgcagg cgagccgctg accagcagga gcttcgccca caccaccctg 1680

ttcaccccga tcaccttcag cagggcccag gaggagttcg acctgtacat ccagagcggc 1740

gtgtacatcg acaggatcga gttcatcccg gtgaccgcca ccttcgaggc cgagtacgac 1800

ctggagaggg cccagaagtg a 1821

<210> 8

<211> 1818

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 8

atggagaaca acatccagaa ccagtgcgtg ccgtacaact gcctgaacaa cccagaggtg 60

gagatcctga acgaggagag gagcaccggc aggctgccgc tggacatcag cctgagcctg 120

accaggttcc tgctgagcga gttcgtgcct ggcgtgggag tggccttcgg cctgttcgac 180

ctgatctggg gcttcatcac cccgagcgac tggagcctgt tcctgctaca gatcgagcag 240

ctgatcgagc agaggatcga gaccctggag aggaacaggg ccatcaccac cctgcgtggc 300

ctggccgaca gctacgagat ctacatcgag gccctgaggg agtgggaggc caacccgaac 360

aacgcacagc tgagggagga cgtgaggatc aggttcgcca acaccgacga cgccctgatc 420

accgccatca acaacttcac cctgaccagc ttcgagatcc cgctgctgag cgtgtacgtg 480

caggctgcca acctgcacct gagcctgctg agggacgccg tgagcttcgg ccagggctgg 540

ggcctggaca tcgccaccgt gaacaaccac tacaacaggc tgatcaacct gatccacagg 600

tacaccaagc actgcctgga cacctacaac cagggtctgg agaacctgag gggcaccaac 660

accaggcagt gggccaggtt caaccagttc aggagggacc tgaccctgac cgtgctggac 720

atcgtggccc tgttcccgaa ctacgacgtg aggacctacc cgatccagac cagcagccag 780

ctgaccaggg agatctacac cagcagcgtg atcgaggact caccggtgag cgccaacatc 840

ccgaacggct tcaacagggc cgagttcggc gtgaggcctc cgcacctgat ggacttcatg 900

aacagcctgt tcgtgaccgc cgagaccgtg aggagccaga ccgtgtgggg tggccacctg 960

gtgagcagca ggaacacagc tggcaacagg atcaacttcc cgagctacgg cgtgttcaac 1020

ccaggcggtg ccatctggat cgccgacgag gacccgaggc cgttctacag gaccctgagc 1080

gacccggtgt tcgtgagggg aggcttcggc aacccgcact acgtgctggg cctgcgaggg 1140

gtggccttcc agcagaccgg caccaaccac accaggacct tcaggaacag cggcaccatc 1200

gacagcctgg acgagatccc accgcaggac aacagcggtg ctccgtggaa cgactacagc 1260

cacgtgctga accacgtgac cttcgtgagg tggcctggcg agatcagcgg cagcgacagc 1320

tggagggctc cgatgttcag ctggacccac aggagcgcca ccccgaccaa caccatcgac 1380

ccggagagga tcacccagat ctcgctggtg aaggcccaca ccctgcagag cggcaccacc 1440

gtggtgaggg gtccaggctt caccggtggc gacatcctga ggaggaccag cggaggccct 1500

ttcgcctaca ccatcgtgaa catcaacggc cagctgccgc agaggtacag ggccaggatc 1560

aggtacgcca gcaccaccaa cctgaggatc tacgtgaccg tggcaggcga gaggatcttc 1620

gctggccagt tcaacaagac gatggacaca ggcgacccgc tgaccttcca gagcttcagc 1680

tacgccacca tcaacaccgc cttcaccttc ccgatgagcc agagcagctt caccgtggga 1740

gccgacacct tcagcagcgg caacgaggtg tacatcgaca ggttcgagct gatccctgtg 1800

accgccaccc tggagtga 1818

<210> 9

<211> 609

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 9

Gly Ser Thr Met Glu Ile Asn Asn Gln Asn Gln Cys Val Pro Tyr Asn

1 5 10 15

Cys Leu Ser Asn Pro Lys Glu Ile Ile Leu Gly Glu Glu Arg Leu Glu

20 25 30

Thr Gly Asn Thr Val Ala Asp Ile Ser Leu Gly Leu Ile Asn Phe Leu

35 40 45

Tyr Ser Asn Phe Val Pro Gly Gly Gly Phe Ile Val Gly Leu Leu Glu

50 55 60

Leu Ile Trp Gly Phe Ile Gly Pro Ser Gln Trp Asp Ile Phe Leu Ala

65 70 75 80

Gln Ile Glu Gln Leu Ile Ser Gln Arg Ile Glu Glu Phe Ala Arg Asn

85 90 95

Gln Ala Ile Ser Arg Leu Glu Gly Leu Ser Asn Leu Tyr Lys Val Tyr

100 105 110

Val Arg Ala Phe Ser Asp Trp Glu Lys Asp Pro Thr Asn Pro Ala Leu

115 120 125

Arg Glu Glu Met Arg Ile Gln Phe Asn Asp Met Asn Ser Ala Leu Ile

130 135 140

Thr Ala Ile Pro Leu Phe Arg Val Gln Asn Tyr Glu Val Ala Leu Leu

145 150 155 160

Ser Val Tyr Val Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ser Ile Leu Arg Asp

165 170 175

Val Ser Val Phe Gly Glu Arg Trp Gly Tyr Asp Thr Ala Thr Ile Asn

180 185 190

Asn Arg Tyr Ser Asp Leu Thr Ser Leu Ile His Val Tyr Thr Asn His

195 200 205

Cys Val Asp Thr Tyr Asn Gln Gly Leu Arg Arg Leu Glu Gly Arg Phe

210 215 220

Leu Ser Asp Trp Ile Val Tyr Asn Arg Phe Arg Arg Gln Leu Thr Ile

225 230 235 240

Ser Val Leu Asp Ile Val Ala Phe Phe Pro Asn Tyr Asp Ile Arg Thr

245 250 255

Tyr Pro Ile Gln Thr Ala Thr Gln Leu Thr Arg Glu Val Tyr Leu Asp

260 265 270

Leu Pro Phe Ile Asn Glu Asn Leu Ser Pro Ala Ala Ser Tyr Pro Thr

275 280 285

Phe Ser Ala Ala Glu Ser Ala Ile Ile Arg Ser Pro His Leu Val Asp

290 295 300

Phe Leu Asn Ser Phe Thr Ile Tyr Thr Asp Ser Leu Ala Arg Tyr Ala

305 310 315 320

Tyr Trp Gly Gly His Leu Val Asn Ser Phe Arg Thr Gly Thr Thr Thr

325 330 335

Asn Leu Ile Arg Ser Pro Leu Tyr Gly Arg Glu Gly Asn Thr Glu Arg

340 345 350

Pro Val Thr Ile Thr Ala Ser Pro Ser Val Pro Ile Phe Arg Thr Leu

355 360 365

Ser Tyr Ile Thr Gly Leu Asp Asn Ser Asn Pro Val Ala Gly Ile Glu

370 375 380

Gly Val Glu Phe Gln Asn Thr Ile Ser Arg Ser Ile Tyr Arg Lys Ser

385 390 395 400

Gly Pro Ile Asp Ser Phe Ser Glu Leu Pro Pro Gln Asp Ala Ser Val

405 410 415

Ser Pro Ala Ile Gly Tyr Ser His Arg Leu Cys His Ala Thr Phe Leu

420 425 430

Glu Arg Ile Ser Gly Pro Arg Ile Ala Gly Thr Val Phe Ser Trp Thr

435 440 445

His Arg Ser Ala Ser Pro Thr Asn Glu Val Ser Pro Ser Arg Ile Thr

450 455 460

Gln Ile Pro Trp Val Lys Ala His Thr Leu Ala Ser Gly Ala Ser Val

465 470 475 480

Ile Lys Gly Pro Gly Phe Thr Gly Gly Asp Ile Leu Thr Arg Asn Ser

485 490 495

Met Gly Glu Leu Gly Thr Leu Arg Val Thr Phe Thr Gly Arg Leu Pro

500 505 510

Gln Ser Tyr Tyr Ile Arg Phe Arg Tyr Ala Ser Val Ala Asn Arg Ser

515 520 525

Gly Thr Phe Arg Tyr Ser Gln Pro Pro Ser Tyr Gly Ile Ser Phe Pro

530 535 540

Lys Thr Met Asp Ala Gly Glu Pro Leu Thr Ser Arg Ser Phe Ala His

545 550 555 560

Thr Thr Leu Phe Thr Pro Ile Thr Phe Ser Arg Ala Gln Glu Glu Phe

565 570 575

Asp Leu Tyr Ile Gln Ser Gly Val Tyr Ile Asp Arg Ile Glu Phe Ile

580 585 590

Pro Val Thr Ala Thr Phe Glu Ala Glu Tyr Asp Leu Glu Arg Ala Gln

595 600 605

Lys

<210> 10

<211> 605

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 10

Met Glu Asn Asn Ile Gln Asn Gln Cys Val Pro Tyr Asn Cys Leu Asn

1 5 10 15

Asn Pro Glu Val Glu Ile Leu Asn Glu Glu Arg Ser Thr Gly Arg Leu

20 25 30

Pro Leu Asp Ile Ser Leu Ser Leu Thr Arg Phe Leu Leu Ser Glu Phe

35 40 45

Val Pro Gly Val Gly Val Ala Phe Gly Leu Phe Asp Leu Ile Trp Gly

50 55 60

Phe Ile Thr Pro Ser Asp Trp Ser Leu Phe Leu Leu Gln Ile Glu Gln

65 70 75 80

Leu Ile Glu Gln Arg Ile Glu Thr Leu Glu Arg Asn Arg Ala Ile Thr

85 90 95

Thr Leu Arg Gly Leu Ala Asp Ser Tyr Glu Ile Tyr Ile Glu Ala Leu

100 105 110

Arg Glu Trp Glu Ala Asn Pro Asn Asn Ala Gln Leu Arg Glu Asp Val

115 120 125

Arg Ile Arg Phe Ala Asn Thr Asp Asp Ala Leu Ile Thr Ala Ile Asn

130 135 140

Asn Phe Thr Leu Thr Ser Phe Glu Ile Pro Leu Leu Ser Val Tyr Val

145 150 155 160

Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ser Leu Leu Arg Asp Ala Val Ser Phe

165 170 175

Gly Gln Gly Trp Gly Leu Asp Ile Ala Thr Val Asn Asn His Tyr Asn

180 185 190

Arg Leu Ile Asn Leu Ile His Arg Tyr Thr Lys His Cys Leu Asp Thr

195 200 205

Tyr Asn Gln Gly Leu Glu Asn Leu Arg Gly Thr Asn Thr Arg Gln Trp

210 215 220

Ala Arg Phe Asn Gln Phe Arg Arg Asp Leu Thr Leu Thr Val Leu Asp

225 230 235 240

Ile Val Ala Leu Phe Pro Asn Tyr Asp Val Arg Thr Tyr Pro Ile Gln

245 250 255

Thr Ser Ser Gln Leu Thr Arg Glu Ile Tyr Thr Ser Ser Val Ile Glu

260 265 270

Asp Ser Pro Val Ser Ala Asn Ile Pro Asn Gly Phe Asn Arg Ala Glu

275 280 285

Phe Gly Val Arg Pro Pro His Leu Met Asp Phe Met Asn Ser Leu Phe

290 295 300

Val Thr Ala Glu Thr Val Arg Ser Gln Thr Val Trp Gly Gly His Leu

305 310 315 320

Val Ser Ser Arg Asn Thr Ala Gly Asn Arg Ile Asn Phe Pro Ser Tyr

325 330 335

Gly Val Phe Asn Pro Gly Gly Ala Ile Trp Ile Ala Asp Glu Asp Pro

340 345 350

Arg Pro Phe Tyr Arg Thr Leu Ser Asp Pro Val Phe Val Arg Gly Gly

355 360 365

Phe Gly Asn Pro His Tyr Val Leu Gly Leu Arg Gly Val Ala Phe Gln

370 375 380

Gln Thr Gly Thr Asn His Thr Arg Thr Phe Arg Asn Ser Gly Thr Ile

385 390 395 400

Asp Ser Leu Asp Glu Ile Pro Pro Gln Asp Asn Ser Gly Ala Pro Trp

405 410 415

Asn Asp Tyr Ser His Val Leu Asn His Val Thr Phe Val Arg Trp Pro

420 425 430

Gly Glu Ile Ser Gly Ser Asp Ser Trp Arg Ala Pro Met Phe Ser Trp

435 440 445

Thr His Arg Ser Ala Thr Pro Thr Asn Thr Ile Asp Pro Glu Arg Ile

450 455 460

Thr Gln Ile Pro Leu Val Lys Ala His Thr Leu Gln Ser Gly Thr Thr

465 470 475 480

Val Val Arg Gly Pro Gly Phe Thr Gly Gly Asp Ile Leu Arg Arg Thr

485 490 495

Ser Gly Gly Pro Phe Ala Tyr Thr Ile Val Asn Ile Asn Gly Gln Leu

500 505 510

Pro Gln Arg Tyr Arg Ala Arg Ile Arg Tyr Ala Ser Thr Thr Asn Leu

515 520 525

Arg Ile Tyr Val Thr Val Ala Gly Glu Arg Ile Phe Ala Gly Gln Phe

530 535 540

Asn Lys Thr Met Asp Thr Gly Asp Pro Leu Thr Phe Gln Ser Phe Ser

545 550 555 560

Tyr Ala Thr Ile Asn Thr Ala Phe Thr Phe Pro Met Ser Gln Ser Ser

565 570 575

Phe Thr Val Gly Ala Asp Thr Phe Ser Ser Gly Asn Glu Val Tyr Ile

580 585 590

Asp Arg Phe Glu Leu Ile Pro Val Thr Ala Thr Leu Glu

595 600 605

Claims

1.一种高效抗草地贪夜蛾的融合蛋白，其特征在于所述的融合蛋白由BT杀虫晶体蛋白与BT营养期杀虫蛋白Vip3通过融合连接构成；所述BT杀虫晶体蛋白为BT杀虫晶体蛋白Cry1Da或者BT杀虫晶体蛋白Cry1Fa。

2.如权利要求1所述融合蛋白，其特征在于融合蛋白N端为BT杀虫晶体蛋白，C端为BT营养期杀虫蛋白Vip3。

3.如权利要求1所述融合蛋白，其特征在于所述Cry1Da蛋白的氨基酸序列为SEQ IDNO:9所示；所述Cry1Fa蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:10所示。

4.如权利要求1所述融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白为BT杀虫晶体蛋白Cry1Da与BT营养期杀虫蛋白Vip3通过融合连接构成，氨基酸序列为SEQ ID NO:1或者与SEQ ID NO:1具有90％以上相同性。

5.如权利要求1所述融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白为BT杀虫晶体蛋白Cry1Fa与BT营养期杀虫蛋白Vip3通过融合连接构成，氨基酸序列为SEQ ID NO:2或者与SEQ ID NO:2具有90％以上相同性。

6.一种包含权利要求1所述融合蛋白的编码基因的重组载体，其特征在于所述编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示。

7.一种表达权利要求1所述融合蛋白的农作物细胞。

8.一种权利要求1所述融合蛋白在制备抗虫转基因农作物中的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述农作物包括玉米、大豆或水稻。

10.如权利要求8所述的应用，其特征在于抗虫转基因农作物为抗鳞翅目害虫，所述鳞翅目害虫包括草地贪夜蛾、黏虫、斜纹夜蛾、玉米螟、棉铃虫、甜菜夜蛾、小地老虎、二化螟、大螟或稻纵卷叶螟。