CN117089553B - 一种核酸分子及其在培育抗虫植物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种新的核酸分子及其在培育抗虫植物中的应用。本发明提供的核酸分子能够使水稻、玉米等单子叶植物免受鳞翅目昆虫的侵害，可用于培育新型抗虫植物。
Description
技术领域
本发明涉及植物生物技术领域。具体的说，本发明提供一种新的核酸分子及其在培育抗虫植物中的应用。
背景技术
来自于苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）的Bt杀虫晶体蛋白对鳞翅目、双翅目、鞘翅目、膜翅目等多种昆虫具有特异性的杀虫活性。Bt基因已成为植物基因工程及转基因育种中应用最广泛、 最有效的抗虫基因。1981年，Schnepft和Whiteley首次成功地克隆了第一个编码Bt杀虫蛋白基因Cry1Aa，迄今为止，已先后分离并克隆了600多个杀虫蛋白基因。研究较为深入的是Cry1类基因，它编码130 kD的杀虫晶体蛋白，主要对鳞翅目昆虫有毒，其中Cry1F可用于控制许多鳞翅目害虫，包括草地贪夜蛾、玉米螟和棉铃虫，并且对黏虫、斜纹夜蛾、大螟有活性。
来自于细菌的原始Bt基因中存在很多在真核生物中导致表达不稳定的元件，如类似植物的poly(A)信号序列、内含子切割信号位点、富含AT的序列等，可导致基因编码的mRNA不稳定；与植物基因相比，细菌的原始Bt基因GC含量和密码子的使用频率都有很大差异，不适合在植物中高效表达。原始Bt基因转化植物后，Bt杀虫蛋白（InsecticidalCrystal Protein, ICP）在植物中的表达水平普遍偏低，植株抗虫效果也较差，毒蛋白的含量只占可溶性蛋白的0.001％或低至无法检测的水平，难以满足生产应用的要求。1990年以后对Bt基因的改造研究逐步深入，修饰改造的Cry1Ab和Cry1Ac在转基因棉花中的表达水平大大提高，杀虫蛋白含量为植株可溶性总蛋白的0.05-0.1%，达到了抗虫目的，从而使转Bt基因作物在农业生产上的应用成为可能。
密码子优化需要综合考虑多种因素，才能取得良好效果，如宿主使用密码子的偏好性，以及mRNA二级结构、限制性酶切位点和GC含量等。不是简单地将外源基因的同义密码子调整为宿主细胞中表达丰度高、使用频率高的密码子就能提高蛋白的翻译效率，有时候效果往往会适得其反。因此密码子优化并不是一个简单的实验。此外，针对植物，尤其是单子叶植物的核酸序列优化的难度更大且更复杂。其一是，植物起源早于动物，基因组大小远大于微生物，植物基因组的进化历程长、演化过程更为复杂，其中存在高杂合、高度重复序列以及复杂的多倍体现象等；其二是，人类对植物基因组的研究起步较晚，研究难度也更大，所以现有的植物基因组结构和基因表达的数据信息量不够丰富。因此，对于一个特定的外源蛋白，究竟什么样的编码方式可以实现更高的蛋白功能效率，并不十分确定。
为了提高Cry1F这个杀虫蛋白在单子叶植物中的功能效率，本发明通过大量的生物信息分析和具体的实验测试，获得在单子叶植物中杀虫效果最好的核酸分子。
发明内容
本发明提供一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ IDNo.2或其反向互补序列所示。
本发明还提供表达载体，其特征在于，所述表达载体含有上述的核酸分子。
本发明还提供宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有上述的核酸分子，或上述的表达载体；所述宿主细胞非动物细胞或植物细胞。
在一些实施方案中，上述宿主细胞为农杆菌细胞或大肠杆菌细胞。
本发明还提供生产单子叶转基因植物的方法，其特征在于，将上述的核酸分子，或表达载体，或宿主细胞转化植物，获得转化的植物细胞，再将转化的植物细胞培养成转基因植物。
本发明还提供上述的核酸分子、表达载体、宿主细胞、方法在生产抗虫单子叶植物中的应用。
在一些实施方案中，上述的单子叶植物为水稻或玉米。
本发明还提供一种保护单子叶植物免于昆虫侵袭的方法，其特征在于，包括在靶昆虫的膳食中提供至少一种单子叶转基因植物细胞，所述转基因植物细胞在其基因组中包含上述的核酸分子或上述的表达载体；摄食所述转基因植物细胞的靶昆虫被抑制进一步摄食所述植物。
在一些实施方案中，上述的单子叶植物为水稻或玉米。
本发明的有益效果在于：本发明针对Cry1F杀虫蛋白，通过大量的生物信息分析和具体的实验测试，获得一个在单子叶植物中杀虫效果最好的核酸分子。该核酸分子可用于防治鳞翅目害虫，培育新的单子叶抗虫植物。
下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
图1 表达载体pCAMBIA3300-cry1F-bar物理图谱，以pA5为例。
图2转pA5水稻和玉米的抗虫性表现。A：转pA5水稻；B：水稻受体对照日本晴；C：转pA5玉米；D：玉米受体对照B104。
实施方式
提供以下定义和方法用以更好地界定本申请以及在本申请实践中指导本领域普通技术人员。除非另作说明，术语按照相关领域普通技术人员的常规用法理解。本文所引用的所有专利文献、学术论文、行业标准及其他公开出版物等，其中的全部内容整体并入本文作为参考。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本申请的范围。若无特别指明，实施例按照常规实验条件，如Sambrook等人的分子克隆实验手册（Sambrook J& Russell DW, Molecular cloning: a laboratory manual, 2001），或按照制造厂商说明书建议的条件。若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1 Cry1F蛋白编码序列的优化
生物体翻译过程中存在密码子偏好性，密码子优化最基本的原则就是用宿主细胞中使用频率高的同义密码子去替换外源mRNA序列中的密码子，保证外源mRNA序列中的密码子和宿主细胞的密码子使用偏向性更加契合，从而提高蛋白的表达水平。契合程度常用密码子适应指数（Codon Adaption Index，CAI）来表示，该指数是反映编码区同义密码子与特定物种密码子最佳使用相符合的程度，取值范围在0-1之间，具有物种特异性。理论上，此数值越接近1，外源mRNA在宿主细胞中的蛋白表达越高。此外，mRNA的二级结构对翻译效率具有一定的影响，限制性酶切位点也会影响构建表达载体的操作，GC含量与DNA的稳定性相关，若高于70%可能会间接影响基因的表达调控。
针对Cry1F蛋白（氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示），为了获得杀虫效果更好的编码核酸分子，本发明统计了水稻、玉米等单子叶植物不同基因之间的密码子使用情况，在重点考察不同物种内高表达基因密码子的CAI（密码子适应性指数）值的基础上，同时关注同义密码子相对使用度（RSCU）、有效密码子数（Nc）等参数，并结合考量mRNA的二级结构、物种重复序列结构、稀有密码子、隐藏剪辑位点、GC含量以及酶切位点等各个因素，初步筛选出50多条核苷酸序列。再从中挑选出5条CAI值较高（CAI值≥0.75）、GC含量适中（在40%-65%之间）、Nc值较小（Nc≤25）的序列，依次命名为A1-A5，序列相关参数信息见表1。
表1 cry1F核酸分子序列表
实施例2 转基因植物的获得和抗虫性鉴定
人工合成实施例1中的5个候选核酸分子A1-A5，以及已公开的3个cry1F基因的核酸分子C1-C3（依次对应专利号CA2832834A1的 SEQ ID NO:1、3、5），分别与NOS启动子和终止子连接，构建成8个植物表达载体pCAMBIA3300-cry1F-bar（bar基因表达盒作为筛选标记），依次编号为pA1- pA5、pC1- pC3，T-DNA区表达盒元件信息见表2，载体物理图谱见图1（以pA5载体为例）。
将上述表达载体转化大肠杆菌DH5α后，提取质粒，再转入农杆菌EHA105或LBA4404中。通过农杆菌介导法，将上述8个载体分别转化单子叶代表物种水稻和玉米。水稻选择粳稻品种日本晴，玉米选择自交系B104，以草铵膦作为筛选剂，最终获得82个水稻和61个玉米阳性转基因植株（载体构建和植物遗传转化采用本领域通用的方法），并对这些转基因植株的抗虫性进行鉴定。
表2 8个表达载体T-DNA区的元件信息表
水稻以日本晴作为对照，玉米以B104作为对照，通过叶片室内生测的方法筛选抗虫性较好的转基因植株。将离体叶片喂食草地贪夜蛾的初孵幼虫，对材料的抗虫性进行初筛，每个材料设置两个重复，在阴性对照死亡率不超过20%的情况下，转基因植株材料的平均死亡率超过40%的则初步认定为有抗性。
转入8个不同载体的水稻和玉米转基因植株的室内生测结果如表3和表4所示。结果显示，分别有21个水稻转基因植株和17个玉米转基因植株对草地贪夜蛾具有抗性。其中，转入pA5的水稻转基因植株和玉米转基因植株的抗性植株占比最高，分别高达72.7%和75.0%。pA5载体中核酸分子序列A5在玉米和水稻中的CAI值均不是最高的，分别为0.81和0.83。然而，出人意料的是，A5序列所获得的抗性转基因玉米和水稻占比均为最高。
表3 不同水稻转基因植株的室内生测结果
表4 不同玉米转基因植株的室内生测结果
进一步对这21个水稻转基因植株和17个玉米转基因植株的抗性等级进行评价，水稻依次编号为R1-R21、以日本晴作为对照，玉米依次编号为M1-M17、以B104作为对照，通过叶片室内生测的方法筛选抗虫性较好的转基因植株。使用离体玉米叶片喂食草地贪夜蛾的初孵幼虫，评价材料的抗虫性。根据以下公式1和公式2分别计算试虫的死亡率和校正死亡率。
结果表明，取食这21个水稻转基因植株和17个玉米转基因植株叶片的草地贪夜蛾的死亡率均显著高于对照（表5），其中R14-R21这8个水稻转基因植株和M12-M17这6个玉米转基因植株对草地贪夜蛾的抗性水平均为高抗，其余为中抗或抗。
由试验结果可知，上述14个高抗转基因植株中的核酸分子序列均为A5，其在玉米和水稻中的杀虫效果均优于已公开的3个cry1F基因的核酸分子C1-C3。
表5 抗草地贪夜蛾的水稻和玉米转基因植株室内生测结果
数值以3个生物学重复的平均值±标准差表示，同列数据的差异显著性采用LSD方法分析（α=0.05）。
综上所述，本发明通过对杀虫蛋白Cry1F的编码序列进行优化，获得了一个能在单子叶植物中具有最优杀虫效果的核酸分子，经鉴定，使用该核酸分子生产的转基因玉米和水稻具有高抗草地贪夜蛾等鳞翅目昆虫的特性。
最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。
Claims (6)
1. 一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID No.2或其反向互补序列所示。
2.表达载体，其特征在于，所述表达载体含有权利要求1所述的核酸分子。
3.宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求1所述的核酸分子、或权利要求2所述的表达载体；
所述宿主细胞为农杆菌细胞或大肠杆菌细胞。
4.生产转基因水稻或玉米植物的方法，其特征在于，将权利要求1所述的核酸分子、或权利要求2所述的表达载体、或权利要求3所述的宿主细胞转化水稻或玉米植物，获得转化的水稻或玉米植物细胞，再将转化的水稻或玉米植物细胞培养成转基因水稻或玉米植物。
5.权利要求1所述的核酸分子、权利要求2所述的表达载体、权利要求3所述的宿主细胞、权利要求4所述的方法在生产抗鳞翅目昆虫的水稻或玉米中的应用。
6.一种保护水稻或玉米植物免于鳞翅目昆虫侵袭的方法，其特征在于，包括在靶昆虫的膳食中提供至少一种转基因水稻或玉米植物细胞，所述转基因水稻或玉米植物细胞在其基因组中包含权利要求1所述的核酸分子或权利要求2所述的表达载体；摄食所述转基因水稻或玉米植物细胞的靶昆虫被抑制进一步摄食所述植物。
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