CN116514936B - 一种抗虫蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新抗虫蛋白的制备方法及其应用，属于基因工程领域。本发明提供了一种新抗虫蛋白及其编码基因，新蛋白为抗虫突变蛋白，该抗虫突变蛋白为Cry1Ie4蛋白在第174位、第209位和第260位发生了突变的蛋白。所述应用是编码基因在培育抗虫转基因玉米植株中的应用，在制备抗虫突变蛋白中的应用，以及抗虫突变蛋白在制备杀虫剂中的应用。本发明通过对Cry1Ie4蛋白的人工改造，提高了它的活性。

Description

一种抗虫蛋白及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种抗虫蛋白及其制备方法和应用，具体为改造的Cry1Ie4蛋白。

背景技术

目前，商业化的转基因抗虫玉米中，含有Cry1Ab蛋白（例如MON810、DBN9936）的玉米具有很好的玉米螟控制效果。然而，随着转基因抗虫玉米产业化种植规模逐步扩大，国外已有报道玉米螟对Cry1Ab玉米产生了抗性，而我国的转基因玉米商业化的政策也在逐步开放。为了提前做好玉米螟的抗性管理，开发不具Cry1A类交互抗性的抗虫玉米是有效的管理手段之一。已有研究表明，Cry1I类与Cry1Ab没有交互抗性，替换或者与该蛋白进行叠加，可以延缓玉米螟抗药性的产生（Xu L, Wang Z, Zhang J, et al. Cross-resistance ofCry1Ab-selected Asian corn borer to other Cry toxins[J]. Journal of AppliedEntomology, 2010, 134(5): 429-438.）。

在已经鉴定到的Cry类Bt抗虫基因（苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis基因，简称Bt基因）中，Cry1I类蛋白具有独特性，它们具有类似于Cry和VIP两者的生物化学特性，其在苏云金芽孢杆菌菌株中通常是沉默基因，在大肠杆菌培养中可以以大约81 kDa的原毒素形式表达，这是Cry1类蛋白中独一无二的分子质量。此外，Cry1I类蛋白的靶标昆虫种类包括鳞翅目和鞘翅目，且与Cry1A类蛋白不会产生交互抗性。因此，Cry1I类基因的研究具有更为重要的理论意义和实用价值，并将为解决 Bt 毒素杀虫谱较窄、害虫抗药性产生等问题提供新的基因选择。

据报道称，Cry1Ie4对小菜蛾和玉米螟具有杀虫活性（K·S·桑普森，D·J·汤姆索，R·V·杜米特鲁.杀虫蛋白和使用它们的方法：CN201080018183.X[P].CN102421905B），但经过实验室测试发现Cry1Ie4对玉米螟的杀虫活性远低于Cry1Ab，因此利用Cry1Ie4开发转基因玉米难以达到商业化种植的要求。本项目为了获得与Cry1Ab没有交互抗性的新蛋白，通过对杀虫蛋白Cry1Ie4毒性区的改造从而增强其杀虫活性，并投入抗虫玉米开发，将具有很好的应用前景。

发明内容

为了克服现有技术中存在的至少一个问题，本申请的发明人经过大量实验和反复摸索，通过对Cry1Ie4蛋白的进行点突变，提高了其杀虫活性，拓展了其应用范围。

发明人发现Cry1Ie4对玉米螟的活性并不显著，而对杀虫蛋白毒性区的改造能够增强蛋白的杀虫活性。因此，本发明通过改造Cry1Ie4蛋白获得更佳的玉米螟杀虫活性并应用于抗虫玉米的开发，其具有很好的应用前景。

首先，发明人通过连续易错PCR方法对编码Cry1Ie1蛋白的核酸分子进行突变，并将突变子表达蛋白，然后通过玉米螟生测试验筛选出了有更高杀虫活性的突变蛋白，分析编码蛋白的核苷酸序列，找到了突变位点。因为同属于Cry1Ie类蛋白，在上述研究的基础上，本发明在Cry1Ie4中找到同源的活性位点并进行突变，然后通过玉米螟生测筛选出了优于Cry1Ie4的6种重组蛋白。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一个方面是提供一种抗虫突变蛋白，其为改造的Cry1Ie4蛋白；其中，所述改造的Cry1Ie4蛋白含有SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列且在以下位点中进行突变：第174位、第209位和第260位。

在一个实施方式中，所述第174位氨基酸突变为非K的氨基酸，例如，A，V，G，L，D，F，W，Y，N，S，Q，E，M，T，C，P，H，R，I；优选地，突变为G；所述第209位氨基酸突变为非E的氨基酸，例如，A，V，G，L，D，F，W，Y，N，S，Q，K，M，T，C，P，H，R，I；优选地，突变为K；所述第260位氨基酸突变为非D的氨基酸，例如，A，V，G，L，E，F，W，Y，N，S，Q，K，M，T，C，P，H，R，I；优选地，突变为N。

进一步地，所述改造的Cry1Ie4蛋白具有的突变位点还包括：第126位，第140位；更进一步地，所述改造的Cry1Ie4蛋白具有的突变蛋白组合为：1）D140S+K174G+E209K+D260N；2）S126N+D140S+K174G+E209K+D260N。

进一步地，所述改造的Cry1Ie4蛋白1）K174G+E209K+D260N，2）D140S+K174G+E209K+D260N；3）S126N+D140S+K174G+E209K+D260N的氨基酸序列分别如SEQ ID No. 3、5、7所示。

本发明的第二个方面是提供一种用于编码任一上述的抗虫蛋白的核酸分子，其中，编码所述SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列的核酸序列如SEQ ID NO. 2所示。

进一步地，编码所述SEQ ID No.3、5、7所示的氨基酸序列的核酸序列分别如SEQID No. 4、6、8所示；

上述涉及的氨基酸及核酸序列如下表1所示：

表1 - 抗虫蛋白相关的序列信息

本发明的第三个方面是提供一种与任一上述的抗虫蛋白或与任一上述的核酸分子相关的生物材料，其包括含有如任一上述的核酸分子的重组载体、重组微生物、重组细胞系。

进一步地，所述重组载体为pET28a表达载体，其也可替换为本领域常规使用的合适的其他表达载体。

进一步地，所述重组细胞系为大肠杆菌BL21细胞系，也可采用合适的其他菌株类型的原核表达细胞系。

本发明的第四个方面是提供一种任一上述的抗虫蛋白的制备方法，其包括步骤：在编码Cry1Ie4蛋白的如SEQ ID NO. 2所述的核酸序列上，根据对应的突变位点通过同源重组的方法对其核酸序列进行改造，再将突变后的核酸分子构建到pET28a表达载体中，并转入大肠杆菌BL21细胞系，进行改造的Cry1Ie4蛋白表达。

进一步地，在设计编码Cry1Ie4蛋白的核酸序列时，其密码子设置为大肠杆菌（K12菌株）偏好性，并避免XhoI和HindIII酶切位点进行人工合成；将突变后的核酸分子克隆到pET28a表达载体中限制性内切酶XhoI和HindIII的位点之间，获得蛋白表达载体。

进一步地，大肠杆菌BL21细胞系中蛋白表达的具体步骤包括：单个菌落接种到LB液体培养基，培养至培养基浑浊，取菌液加入 IPTG（Isopropyl-β-D-thiogalactoside），继续培养，在获得的菌液中加入上样缓冲液制样电泳，根据阴性对照和加入IPTG诱导的结果对比，判断是否有表达；有表达的菌液接种到LB液体培养基中培养，获得种子液，种子液再接种到LB液体培养基培养，然后加IPTG继续培养；获得的培养液经过离心沉淀大肠杆菌细胞，然后弃上清收集沉淀；沉淀中加缓冲液，超声破碎，离心后检测上清液是否含有重组蛋白。

本发明的第五个方面是提供一种任一上述的抗虫蛋白、任一上述的核酸分子或任一上述的生物材料的应用，其选自以下应用中的至少一种：在抗虫中的应用、在制备抗虫制剂中的应用、在培育抗虫作物中的应用。

进一步地，所述抗虫作物为抗玉米螟的转基因作物。

进一步地，所述抗虫为对玉米螟具有杀虫活性。

进一步地，所述转基因作物为玉米。

与现有技术相比，本发明采用上述技术方案具有以下有益效果：

本发明通过随机突变和杀虫活性筛选，获得了具有高杀虫活性的新的杀虫蛋白（突变的Cry1Ie4蛋白），其通过对杀虫蛋白毒性区的改造，进一步增强蛋白的杀虫活性，可用于培育抗虫作物，并通过实验验证：上述重组蛋白可以在玉米等作物中进行表达，从而可用于培育抗玉米螟的转基因作物，也可以用于制备新型的杀虫剂，以防治玉米螟。

附图说明

图1显示不同蛋白在2μg/g浓度下饲喂玉米螟7天后的生测效果。图1A-D分别代表：对照（PBS）、Cry1Ie4、Cry1Ab、Cry1Ie4-5处理的生测效果。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照国家标准测定。下述实施例中未注明出处的实验材料，均为市售原料。下述实施例中的各步骤中采用的设备均为常规设备。若没有相应的国家标准，则按照通用的国际标准、常规条件、或按照制造厂商所建议的条件进行。除非另外说明，否则所有的份数为重量份，所有的百分比为质量百分比。除非另有定义或说明，本发明中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术熟练人员所熟悉的意义相同。此外任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。

需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为本发明的限定。

本发明实施例中提供以下定义和方法用以更好地界定本申请以及在本申请实践中指导本领域普通技术人员。除非另作说明，术语按照相关领域普通技术人员的常规用法理解。本文所引用的所有专利文献、学术论文、行业标准及其他公开出版物等，其中的全部内容整体并入本文作为参考。

如本文所用，“植物”是任何植物，包括整株植物、植物细胞、植物器官、植物原生质体、植物可以从中再生的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物或植物部分中完整的植物细胞，所述植物部分例如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、茎杆、根、根尖、花药等。除非另有所指，核酸以5’至3’方向从左向右书写；氨基酸序列以氨基至羧基方向从左向右书写。氨基酸在本文可以用其通常所知的三字母符号或IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号来表示。同样地，可以用通常接受的单字母码表示核苷酸。数字范围包括限定该范围的数字。如本文所用，“核酸”包括涉及单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸多聚物，并且除非另有限制，包括具有天然核苷酸基本性质的已知类似物（例如，肽核酸），所述类似物以与天然存在的核苷酸类似的方式与单链核酸杂交。如本文所用，术语“编码”或“所编码的”用于特定核酸的上下文时，指该核酸包含指导该核苷酸序列翻译成特定蛋白的必需信息。使用密码子表示编码蛋白的信息。如本文所用，涉及特定多核苷酸或其所编码的蛋白的“全长序列”指具有天然（非合成）内源序列的整个核酸序列或整个氨基酸序列。全长多核苷酸编码该特定蛋白的全长、催化活性形式。本文可互换地使用术语“多肽”、“多肽”和“蛋白”，以指氨基酸残基的多聚物。该术语用于氨基酸多聚物，其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学类似物。该术语还用于天然存在的氨基酸多聚物。本文可互换地使用术语“残基”或“氨基酸残基”或“氨基酸”，以指被并入蛋白、多肽或肽（统称“蛋白”）的氨基酸。氨基酸可以是天然存在的氨基酸，并且除非另有限制，可以包括天然氨基酸的已知类似物，所述类似物可以与天然存在的氨基酸相似的方式起作用。

术语“性状”是指植物或特定的植物材料或细胞的生理、形态、生化或物理特性。在一些情况下，此特性对人眼是可见的，诸如种子或植株大小，或者可通过生物化学技术测量，诸如检测种子或叶的蛋白质、淀粉或油含量，或者通过观察代谢或生理过程，例如通过测量对水剥夺或特定盐或糖或氮浓度的耐受性，或者通过观察一个或多个基因的表达水平，或者通过农艺观察结果诸如渗透胁迫耐受性或收率。

“转基因”是指其基因组因异源核酸（诸如重组DNA构建体）的存在而发生改变的任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植株部分或植株。本文所用的术语“转基因”包括那些最初的转基因事件以及从最初的转基因事件通过有性杂交或无性繁殖而产生的那些，并且不涵盖通过常规植物育种方法或通过自然发生的事件（诸如随机异花受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变）进行的基因组（染色体或染色体外）改变。

在本申请中，将词语“包括”、“包含”或其变体应理解为除所描述的元素、数或步骤外，还包含其它元素、数或步骤。“受试植物”或“受试植物细胞”是指遗传改造已经生效的植物或植物细胞，或者如此改造的植物或细胞的子代细胞，该子代细胞包含所述改造。“对照”或“对照植物”提供用于测量受试植物表型改变的参考点。

阴性或对照植物可以包括，例如：（a）野生型植物或细胞，即与遗传改造起始材料具有相同基因型的植物或细胞，所述遗传改造产生受试植物或细胞；（b）与所述起始材料具有相同基因型但已用空构建体（即用对目的性状无已知效果的构建体，诸如包含标物基因的构建体）转化的植物或植物细胞；（c）是受试植物或植物细胞的非转化分离子的植物或植物细胞；（d）与所述受试植物或植物细胞在遗传上一致但未暴露于会诱导目的基因表达的条件或刺激物的植物或植物细胞；或（e）受试植物或植物细胞自身，其处于目的基因不被表达的条件下。

本领域技术人员会容易地认同，诸如位点特异性诱变和随机诱变、聚合酶链式反应方法和蛋白工程化技术的分子生物学领域的进步提供了广泛的适当的工具和操作步骤，以用于改造或者工程化农业上感兴趣的蛋白的氨基酸序列和潜在的基因序列。

在一些实施方案中，可以对本申请的核苷酸序列进行改变，以进行保守氨基酸替换。保守氨基酸替换的原则和实例在下文中进一步描述。在某些实施方案中，可以依照公开的单子叶密码子偏好性对本申请的核苷酸序列进行不改变氨基酸序列的替换，例如可以用单子叶植物偏好的密码子替换编码同一氨基酸序列的密码子，而不改变该核苷酸序列所编码的氨基酸序列。在一些实施方案中，以编码同一氨基酸序列的不同密码子替换本申请中的部分核苷酸序列，从而在改变核苷酸序列的同时不改变其编码的氨基酸序列。保守变体包括由于遗传密码子简并性而编码实施方案的蛋白中的一种的氨基酸序列的那些序列。在一些实施方案中，根据单子叶植物偏好密码子替换本申请中的部分核苷酸序列。本领域技术人员会认识到氨基酸添加和/或取代通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如，所述取代基的疏水性、电荷、大小等等。具有各种前述所考虑性质的示例性氨基酸取代基团为本领域技术人员所公知，并且包括精氨酸与赖氨酸；谷氨酸和天门冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。关于不影响目的蛋白生物学活性的适当氨基酸取代的指南可以在Dayhoff 等人（1978）Atlas of Protein Sequence andStructure（蛋白序列和结构图集）（Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D. C）（通过引用并入本文）的模型中找到。可以进行诸如将一个氨基酸换作具有相似性质的另一个氨基酸的保守性取代。序列一致性的鉴定包括杂交技术。例如，将已知核苷酸序列的全部或部分用作与其它相应核苷酸序列选择性杂交的探针，所述其它相应核苷酸序列存在于来自所选生物体的已克隆基因组DNA片段或cDNA片段群（即基因组文库或cDNA 文库）。所述杂交探针可以是基因组DNA片段、cDNA片段、RNA 片段或其它寡核苷酸，并且可以用诸如32P的可检测基团或其它可检测标志物来标记。因而，例如，可以通过标记基于实施方案序列的合成寡核苷酸制备杂交探针。制备杂交探针和构建cDNA及基因组文库的方法通常为本领域已知。可以在严紧条件下进行所述序列的杂交。如本文所用，术语“严紧条件”或“严紧杂交条件”表示如下条件，即在该条件下，相对于与其它序列杂交，探针将以可检测的更大程度（例如，背景的至少2倍、5倍或10倍）与其靶序列杂交。严紧条件是序列依赖性的并且在不同环境中有所不同。通过控制杂交严紧性和/或控制清洗条件，可以鉴定与所述探针100％互补的靶序列（同源探针法）。可选择地，可以调节严紧条件，以允许一些序列错配，以便检测较低的相似度（异源探针法）。通常，探针长度少于约1000或500个核苷酸。通常，严紧条件是如下的条件，即在该条件中，盐浓度为pH 7.0至8.3下，少于约1.5 M Na离子，通常约0.01 M至1.0 M Na离子浓度（或其它盐），并且温度条件为：当用于短探针时（例如10到50个核苷酸），至少约30℃；当用于长探针时（例如大于50个核苷酸），至少约60℃。还可以通过添加诸如甲酰胺的去稳定剂来实现严紧条件。示例性的低严紧条件包括37℃下使用30％至35％的甲酰胺缓冲液、1 M NaCl、1％SDS（十二烷基硫酸钠）杂交，50℃至55℃下在1×至2×SSC（20×SSC=3.0 M NaCl/0.3 M柠檬酸三钠）中清洗。示例性的中度严紧条件包括37℃下在40％至45％甲酰胺、1.0 M NaCl、1％ SDS中杂交，55℃至60℃下在0.5×至1×SSC中清洗。示例性的高严紧条件包括37℃下在50％甲酰胺、1 M NaCl、1％ SDS中杂交，60℃至65℃下在0.1×SSC中最后清洗至少约20分钟。任选地，清洗缓冲液可以包含约0.1％至约1％SDS。杂交持续时间通常少于约24小时，通常为约4小时至约12小时。特异性通常依赖杂交后的清洗，关键因素在于最后清洗溶液的离子强度和温度。DNA-DNA杂合体的Tm（热力学熔点）可以近似自Meinkoth and Wahl (1984) Anal. Biochem. 138: 267-284的公式：Tm=81.5℃+16.6(logM)+0.41(％GC)-0.61(％甲酰胺)-500/L；其中M 是一价阳离子的克分子浓度，％GC是DNA中鸟苷和胞嘧啶核苷酸的百分数，“甲酰胺％”是杂交溶液的甲酰胺百分数，而L 是杂合体的碱基对长度。Tm是（确定的离子强度和pH下）50％的互补靶序列与完全匹配的探针杂交时的温度。通常将清洗至少进行至达到平衡，并且达到低的杂交背景水平，诸如进行2小时、1小时或30分钟。每1％的错配对应使Tm降低约1℃；因而，可以调节Tm、杂交和/或清洗条件，从而与所需一致性的序列杂交。例如，如果需要≥ 90％一致性的序列，可以将Tm降低10℃。通常，将严紧条件选择为比确定离子强度和pH下的特异序列及其互补序列的Tm低约5℃。然而，在非常严紧的条件下，可以在比所述Tm低4℃下进行杂交和/或清洗；在中度严紧条件下，可以在比所述Tm低6℃下进行杂交和/或清洗；在低严紧条件下，可以在比所述Tm低11℃下进行杂交和/或清洗。

在一些实施方案中，还包括核苷酸序列及其编码的氨基酸序列的片段。如本文所用，术语“片段”指实施方案的多核苷酸的核苷酸序列的一部分或者多肽的氨基酸序列的一部分。核苷酸序列的片段可以编码蛋白片段，所述蛋白片段保留天然或相应全长蛋白的生物学活性，并因而具有蛋白活性。突变体蛋白包括天然蛋白的生物活性片段，其包含保留天然蛋白生物学活性的连续氨基酸残基。一些实施方案还包括转化的植物细胞或转基因植物，其包含至少一种实施方案的核苷酸序列。在一些实施方案中，使用表达载体转化植物，所述表达载体包含至少一种实施方案的核苷酸序列以及与其可操作地连接的在植物细胞中驱动表达的启动子。转化的植物细胞和转基因植物表示基因组内包含异源多核苷酸的植物细胞或植物。一般来说，所述异源多核苷酸在转化的植物细胞或转基因植物的基因组内稳定地整合，以致将所述多核苷酸传递给后代。可以将所述异源多核苷酸单独地或作为表达载体的一部分整合进基因组。在一些实施方案中，本申请涉及的植物包括植物细胞、植物原生质体、可以再生出植物的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物团块和植物细胞，其为完整的植物或者植物的部分，诸如胚胎，花粉，胚珠，种子，叶，花，枝，果实，果仁，穗，穗轴，壳，秸秆，根，根尖，花药等等。本申请还包括源于本申请的转基因植物或其子代、并因而至少部分地包含本申请的核苷酸序列的植物细胞、原生质体、组织、愈伤组织、胚胎以及花、茎、果实、叶以及根。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本申请的范围。若无特别指明，实施例按照常规实验条件，如Sambrook等人的分子克隆实验手册（SambrookJ&Russell DW, MolecuLar cloning: a laboratory manual, 2001），或按照制造厂商说明书建议的条件。若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1 - 对蛋白突变位点的筛选

本实施例使用Cry1Ie1蛋白为模板进行氨基酸突变改造。一般认为Bt蛋白的结构域I参与昆虫中肠孔道的形成并决定毒性，结构域II和III决定蛋白与受体的特异性结合。Cry1Ie1蛋白的1-648位氨基酸（序列如SEQ ID NO. 9所示）是其包括结构域I-III的核心杀虫区，为了提高Cry1Ie1蛋白的杀虫活性，改造的区域主要集中在结构域I区，即58-285位氨基酸。

根据SEQ ID NO. 9所示序列，设计编码该序列的核酸序列（在如下在线工具中开展http://www.friendbio.com/codon.html），其中密码子设置为大肠杆菌（K12菌株）偏爱性，并避免XhoI和HindIII酶切位点。获得编码SEQ ID NO. 9所示氨基酸序列的核酸分子，核酸分子的序列如SEQ ID NO. 10所示。进一步，使用连续易错PCR（sequential error-prone PCR）策略对SEQ ID NO. 10所示序列进行突变，获得突变后的核酸分子。

总共获得158个突变核酸分子，将其与未突变的核酸分子一起，分别克隆到载体pET28a表达载体中限制性内切酶XhoI和HindIII的位点之间，获得蛋白表达载体。将该载体转入大肠杆菌BL21细胞系，并进行蛋白表达。具体步骤：

单个菌落接种到0.5 mL LB液体培养基，在37℃下培养4 h至培养基浑浊，取100uL菌液加入 IPTG（Isopropyl-β-D-thiogalactoside）至终浓度为0.8 mM，同时取100 uL菌液作为阴性对照，继续培养4 h，在100 uL菌液中加入25 uL 上样缓冲液制样电泳，根据阴性对照和加入IPTG诱导的结果对比，判断是否有表达。有表达的取剩余20 uL，接种到2 mLLB液体培养基中37℃下培养12-16 h作为种子液，种子液再接种到250 mL LB液体培养基至OD600=0.5-0.6，然后加IPTG（Isopropyl-β-D-thiogalactoside）至浓度为0.8 mM，并继续在同样的条件下培养4小时。培养液经过5000 g离心10分钟沉淀大肠杆菌细胞，然后弃上清收集沉淀。沉淀中加30mL 20mM Tris-50mM NaCl缓冲液，超声破碎。离心后检测上清液是否含有重组蛋白。总共获得141个重组蛋白，部分表达载体无法获得可溶的蛋白，可能由于突变后影响了蛋白的正常表达或折叠。

将获得的141个重组蛋白进行杀虫活性测试。将杀虫蛋白各50 μL涂在24孔板中已加入约1 mL昆虫人工饲料的表面，饲养玉米螟（Ostrinia furnacalis）新生一龄幼虫用来进行杀虫活性测定。饲养7天以后统计试虫的死亡率。使用Tris-HCl缓冲液作为空白对照，pET28a空载体表达产物作为阴性对照，Cry1Ab蛋白作为阳性对照。

结果显示，141个重组蛋白中有132个蛋白的杀虫活性与未突变的Cry1Ie1相当或更弱，有9个重组蛋白的杀虫活性与未突变的Cry1Ie1相比有显著提高，经过进一步测试，获得6个活性较高的重组蛋白。测试方法为：

采用表面涂抹方法进行生物测定，先在24孔板中先加入约1 mL未凝固的人工饲料（约1 g），轻微晃动使饲料铺满孔板底部，待饲料凝固后，再加入不同浓度的蛋白溶液（25 μL/孔），加入后轻轻晃动使药液均匀地平铺在饲料表面上，在通风橱内自然风干1 h。实验设置5个梯度浓度（0、0.5、10、25、50 μg/g）和一个空白对照（缓冲液），以pET28a空载体表达产物作为阴性对照，每个处理接24头初孵幼虫（孵化时间为2~12 h），设3次重复，放置在温度25±2℃，光周期14:10（L:D）h，相对湿度50-70%的养虫室培养，7天后调查死亡率。以用毛笔轻触幼虫尾部，幼虫不动视为死亡，幼虫未发育2龄的也视为死亡。

根据如下公式计算死亡率和校正死亡率，并利用SSPSS计算LC₅₀值。

上述6个活性较高的Cry1Ie1重组蛋白，分别为：1）I82V+S99N+L111I+K147G+N214S；2）D233N；3）E182K；4）D113S+E182V；5）I82S+S99D；6）D233Y。经测试，阴性对照的校正死亡率为0%，而其它蛋白的杀虫活性如表2所示。

表2 - Cry1Ie1突变蛋白的杀虫活性

“*”表示相对于未突变蛋白对照有显著差异（α=0.05）。1：单位μg/g。

实施例2 - 对目标蛋白Cry1Ie4进行突变

由于Cry1Ie4和Cry1Ie1具有相似性，本实施例进一步比对Cry1Ie4和Cry1Ie1序列，找出Cry1Ie4中与Cry1Ie1对应的上述8个突变位点（I109、S126、L138、D1140、K174、E209、N241、D260）。在Cry1Ie4的核酸序列（如SEQ ID NO. 2所示）上，通过同源重组的方法对这些位点的进行改造，再根据实施例1的方法将突变的核酸分子构建到pET28a表达载体中，并转入大肠杆菌BL21细胞系，并进行蛋白表达。最终，总共获得108个重组蛋白，部分表达载体无法获得可溶的蛋白，可能由于突变后影响了蛋白的正常表达或折叠。

将上述108个重组蛋白进行杀虫活性测试。具体为：将杀虫蛋白纯化后，定量至0.02mg/mL，取50 μL涂在已加入约1 mL昆虫人工饲料的24孔板中，放入10℃的冰箱中过夜储藏，让蛋白浸入饲料，第二天接入敏感品系的玉米螟（Ostrinia furnacalis）初孵幼虫进行杀虫活性测定，每个蛋白测试2个重复，每个重复24头试虫。饲养7天以后统计各蛋白的杀虫率。使用PBS缓冲液作为空白对照，pET28a空载体表达产物作为阴性对照，Cry1Ie4蛋白作为平行对照，Cry1Ab蛋白作为阳性对照。共筛选出6个活性较好的重组蛋白。

上述6个活性较高的Cry1Ie4重组蛋白，分别为：1）I109S+S126N+D260N；2）I109+L138I+K174G；3）S126N+K174G+D260N；4）D140S+K174G+E209K；5）K174G+E209K+D260N；6）S126N+D140S+K174G+E209K+N241S+D260N。

其杀虫活性如表3所示。

表3 - Cry1Ie4突变蛋白的杀虫活性

本实施例将实施例2中获得的6个Cry1Ie4重组蛋白进一步进行半致死浓度确定，并与Cry1Ab和Cry1Ie4进行比较。测试方法为：

采用表面涂抹方法进行生物测定，先在24孔板中先加入约1 mL未凝固的人工饲料（约1 g），待饲料凝固后，再加入不同浓度的蛋白溶液（50 μL/孔），加入后轻轻晃动使药液均匀地平铺在饲料表面上，放入10℃的冰箱中过夜储藏，让蛋白浸入饲料，第二天在通风橱内自然风干1 h，待饲料表面水分干燥后接入敏感品系的玉米螟初孵幼虫用来进行杀虫活性测定。实验设置6个梯度浓度（0.01、0.1、0.5、1、2、5μg/g）和一个空白对照（缓冲液PBS），以pET28a空载体表达产物作为阴性对照，每个处理接24头初孵幼虫（孵化时间为2~12 h），设3次重复，放置在温度25±2℃，光周期14:10（L:D）h，相对湿度50-70%的养虫室培养，7天后调查死亡率。以用毛笔轻触幼虫尾部，幼虫不动视为死亡，幼虫未发育2龄的也视为死亡。

根据如下公式计算死亡率和校正死亡率，并利用SSPS计算LC50值。

经测试，阴性对照的校正死亡率为0%，上述突变蛋白Cry1Ie4的杀虫活性结果如表4所示。

表4 - Cry1Ie4突变蛋白的杀虫活性

由表4可以看出，在第174位、第209位和第260位点发生突变的Cry1Ie4-5蛋白具有明显优于其他蛋白，同时也优于Cry1Ab的活性。此外，Cry1Ie4-4和Cry1Ie4-6也表现出较好的活性，但活性显著弱于Cry1Ie4-5和Cry1Ab。

上述实施例中的抗虫突变蛋白Cry1Ie4-4、Cry1Ie4-5、Cry1Ie4-6均可以在玉米等作物中进行表达，从而用于培育抗玉米螟的转基因作物，也可以用于制备新型的杀虫剂，以防治玉米螟。其中Cry1Ie4-5的效果最好。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (5)

1.一种抗虫突变蛋白，其特征在于，所述抗虫突变蛋白与亲本抗虫蛋白的氨基酸序列相比，在对应SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列的以下氨基酸位点处存在突变：

1）第174位的K突变为G，且第209位的E突变为K，且第260位的D突变为N所得到的蛋白；或

2）第140位的D突变为S，且第174位的K突变为G，且第209位的E突变为K，且第260位的D突变为N所得到的蛋白；或

3）第126位的S突变为N，且第140位的D突变为S，且第174位的K突变为G，且第209位的E突变为K，且第260位的D突变为N所得到的蛋白。

2.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1任一项所述抗虫突变蛋白。

3.一种载体，其特征在于，所述载体包含权利要求2所述的核酸分子以及与之可操作连接的调控元件。

4.一种原核生物重组细胞，其特征在于，所述重组细胞含有权利要求2所述的核酸分子或权利要求3所述的载体。

5.权利要求1任一项所述的抗虫突变蛋白、权利要求2所述的核酸分子、权利要求3所述的载体、权利要求4所述的原核生物重组细胞在抗玉米螟或制备抗玉米螟制剂或培育抗玉米螟作物中的应用。