CN116445446B - 野生甘蓝糖基转移酶BoUGT76C2基因及应用 - Google Patents

野生甘蓝糖基转移酶BoUGT76C2基因及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了野生甘蓝糖基转移酶BoUGT76C2基因及应用，属于生物育种技术领域。本发明首次对野生甘蓝抗根肿病性状进行精细定位，并克隆了抗病主效基因，利用转基因技术将BoUGT76C2基因转入感根肿病青花菜材料中进行功能验证，BoUGT76C2基因的过表达可导致青花菜对根肿病表现出较强的抗性，进一步体现了UGT76C2基因在植物抵御生物胁迫过程中扮演着关键作用，为青花菜等栽培甘蓝种抗根肿病分子育种提供理论基础和基因资源。本发明将为解析野生甘蓝抗根肿病分子机制提供理论依据，同时为利用野生甘蓝改良栽培甘蓝根肿病抗性奠定基础。

Description

野生甘蓝糖基转移酶BoUGT76C2基因及应用
技术领域
本发明属于生物育种技术领域，具体涉及野生甘蓝糖基转移酶BoUGT76C2基因及应用。
背景技术
我国栽培甘蓝类蔬菜种植面积和产量常年稳居世界首位，在蔬菜周年供应和出口创汇中发挥重要作用。然而，根肿病的快速蔓延造成了结球甘蓝、花椰菜、青花菜等重要甘蓝栽培种产量和品质严重下降，制约着我国甘蓝类蔬菜产业的发展。种植抗病品种是防治根肿病最经济有效的方法。
抗源筛选及抗性评价是抗病育种的前提，也是抗病基因克隆、抗病机理研究的基础。栽培甘蓝中虽然筛选出部分抗源，但表现完全抗性的资源缺乏，可作为育种材料的资源有限，很难用于抗根肿病育种。
野生甘蓝（Brassica macrocarpa）长期生长于原生境，未被人类驯化栽培，具有丰富的遗传变异和优良的抗逆性。前人报道表明野生甘蓝在抗病性（如霜霉病、黄萎病、叶斑病、黑胫病、菌核病等）和抗虫性（如甘蓝根蝇、蚜虫、白粉虱等）方面均具有较大的优势和潜力。在抗根肿病方面，第一发明人报道了1份Brassica macrocarpa资源高抗根肿菌4号小种，也是本发明所用的根肿病抗源材料B2013。在此基础上，本发明对抗病主效基因进行了定位、克隆和功能验证，对于利用野生甘蓝改良栽培甘蓝的根肿病抗性意义重大。
发明内容
本发明的目的在于提供野生甘蓝糖基转移酶BoUGT76C2基因及应用，主要是其在提高青花菜根肿病抗性的功能。
为实现上述目的，本发明采取如下技术方案：
发明人通过基因定位和克隆的方法鉴定了野生甘蓝中BoUGT76C2基因。BoUGT76C2基因编码框核苷酸序列长度为1359bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。BoUGT76C2基因编码蛋白，由452个氨基酸组成，分子量大小约为50.94kD，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
此外本发明还构建野生甘蓝BoUGT76C2基因过表达载体，含有上述基因的表达载体、转基因遗传材料以及含有所述载体的宿主细胞也落入本发明的保护范围之内。
上述野生甘蓝BoUGT76C2基因编码的蛋白还可以包括将SEQ ID NO.2氨基酸序列经过一个或多个（如1-30个；较佳地1-20个；更佳地1-10个；如5个，3个）氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有BoUGT76C2基因蛋白功能的由其衍生的蛋白；或与BoUGT76C2限定的蛋白序列有80％（较佳地90％以上，如95％，98％，99％或更高）以上同源性且具有BoUGT76C2蛋白功能的由其衍生的蛋白。
也就是说本发明所保护的基因的功能，不仅包括上述野生甘蓝BoUGT76C2基因，还包括与SEQ ID NO.1具有较高同源性（如同源性高于40％；较佳地高于50％；较佳地高于60％；更佳地高于70％；更佳地高于80％；更佳地高于90％；更佳地高于95％；更佳地高于98％）的同源基因。
本发明还构建BoUGT76C2过表达载体，含有上述基因的表达载体、重组载体或转基因植物系以及含有所述载体的宿主细胞的在提高植物根肿病抗性方面的功能也落入本发明的保护范围之内。
本发明还将所述的过表达载体利用农杆菌转化法导入到感根肿病青花菜中，获得BoUGT76C2基因过表达的转基因植株。
本发明的最主要目的是公开了野生甘蓝糖基转移酶基因BoUGT76C2的应用，对上述基因进行了克隆和鉴定，并通过构建过表达转基因株系，分析上述基因在青花菜根肿病抗性的生物学功能。通过实验得出：野生甘蓝糖基转移酶基因BoUGT76C2过表达青花菜具有抗根肿病表型。
还公开了一种植物育种方法，所述方法为通过促进目的植物中BoUGT76C2基因的表达，获得根肿病抗性强于目的植物的植株；所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明中，对于适用于本发明的植物没有特别的限制，只要其适合进行基因的转化操作，如各种农作物、花卉植物、或林业植物等。所述的植物比如可以是（不限于）：双子叶植物、单子叶植物或裸子植物。
作为一种实施方式，所述的“植物”包括但不限于：十字花科的野生甘蓝、青花菜、拟南芥、大白菜及甘蓝型油菜，凡是具有该基因或者与之同源的基因均适用，尤其适用于十字花科蔬菜如大白菜、甘蓝、花椰菜等。
本发明中所说的“植物”包括整株植物，其亲本和子代植株以及植物的不同部位，包括种子、果实、芽、茎、叶、根（包括块茎）、花、组织和器官，在这些不同的部分均有我们目的基因或者核酸。这里所提及的“植物”也包括植物细胞、悬浮培养物、愈伤组织、胚、分生组织区、配子体、孢子体、花粉和小孢子，同样，其中每种前述对象包含目的基因/核酸。
本发明包括任何植物细胞，或任何由其中的方法获得或可获得的植物，以及所有的植物部分及其繁殖体。本专利也包含由任何前述方法所获得的转染细胞、组织、器官或完整植物。唯一的要求是子代表现出相同的的基因型或表型特征，使用本专利中的方法获得的子代特性相同。
本发明还扩展到如上所述的植物的可收获的部分，但不限于种子、叶、果实、花、茎、根、根茎、块茎和球茎。同时进一步涉及植株收获后的其他衍生物，如干燥颗粒或粉末、油、脂肪和脂肪酸、淀粉或蛋白质。本发明还涉及由相关植物获得的食品或食品添加剂。
本发明具有如下优点：
（1）本发明通过精细定位获得野生甘蓝抗根肿主效QTL位点，并克隆得到目的基因BoUGT76C2基因序列，首次公开了野生甘蓝糖基转移酶BoUGT76C2基因序列。
（2）发明人利用农杆菌介导的方法将野生甘蓝BoUGT76C2基因转入感根肿病青花菜材料中，获得过表达转基因株系，有利于从分子机制上阐明BoUGT76C2在抗根肿病反应中的作用，为青花菜等栽培甘蓝抗根肿病分子育种提供理论基础和基因资源。
（3）BoUGT76C2基因的过表达可导致青花菜根肿病抗性增强，创制出抗根肿病青花菜新种质，为抗根肿病育种提供一种新的途径，同时也体现了UGT76C2基因在植物抵御生物胁迫过程中扮演着关键作用。
附图说明
图1是野生甘蓝B2013和青花菜90196植株和抗根肿病表型；
图中，图1A为青花菜90196不同时期植株形态和抗根肿病表型；图1B为野生甘蓝B2013不同时期植株形态和抗根肿病表型。
图2是野生甘蓝抗根肿病主效QTL BolCPb9.1的精细定位；
图中，图2A为根肿病抗性在90196和B2013构建的F2群体中的分离；图2B为基于QTL-seq方法获得的初步定位区间；图2C为利用传统遗传连锁分析将主效基因定位区间缩小到560 kb内；图2D为家系562-F3 的抗感分离；图2E为扩大群体获得精细定位区间；图2F为定位区间内候选基因情况。
图3是野生甘蓝抗根肿病目的基因BoUGT76C2的确定；
图中，图3A为候选基因表达量热图；图3B为BoUGT76C2在B2013和90196之间的编码序列分析；图3C为BoUGT76C2在B2013和90196之间的氨基酸分析；图3D为BoUGT76C2同源基因进化树分析。
图4是过表达BoUGT76C2青花菜T1代株系抗根肿病表型；图中，WT为对照，OE#1、OE#2、OE#4表示转基因阳性植株。
具体实施方式
下面将通过具体实施例对本发明进行详细的描述。提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。下述实施例中的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。如无特殊说明，所采用的试剂及材料，均可以通过商业途径获得。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
除非另有说明，本发明的实施将使用本领域技术人员显而易见的植物学常规技术、微生物、组织培养、分子生物学、化学、生物化学、DNA重组及生物信息学技术。这些技术均在已经公开的文献中进行了充分解释，另外，本发明所采用的DNA提取、过表达载体的构建、转基因植物获得等方法，除了下述实施例采用的方法外，采用现有文献中已经公开的方法均能实现。
此处使用的“核酸”、“核酸序列”、“核苷酸”、“核酸分子”或“多聚核苷酸”术语意思是指包括分离的DNA分子(例如，cDNA或者基因组DNA)，RNA分子(例如，信使RNA)，自然类型，突变类型，合成的DNA或RNA分子，核苷酸类似物组成的DNA或RNA分子，单链或是双链结构。这些核酸或多聚核苷酸包括基因编码序列、反义序列及非编码区的调控序列，但不仅限于此。这些术语包括一个基因。“基因”或“基因序列”广泛用来指一有功能的DNA核酸序列。因此，基因可能包括基因组序列中的内含子和外显子，和/或包括cDNA中的编码序列，和/或包括cDNA及其调控序列。在特殊实施方案中，例如有关分离的核酸序列，优先默认其为cDNA。
另外，为了对本发明技术方案更直观的理解，对于本发明涉及到的一些专业术语解释如下：
“表达载体”，是指在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件(如启动子、RBS、终止子等)，使目的基因能够表达的载体。
“农杆菌介导转化法”，指将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株的技术。
本发明中所涉及的高感青花菜90196与高抗野生甘蓝B2013等种质资源均由天津科润农业科技股份有限公司提供，也可保证对外出售至少20年。
实施例
发明人利用图位克隆的方法获得了野生甘蓝BoUGT76C2基因序列，利用农杆菌介导转化法在感病青花菜材料中获得BoUGT76C2过表达转基因株系，并对转基因植株进行抗根肿病表型鉴定。
（1）初定位：利用高感青花菜90196（图1A）与高抗野生甘蓝B2013（图1B）构建了F2分离群体，并完成了抗病性鉴定，其中F1代抗病性介于双亲之间，且偏向于抗病亲本P2，且偏向于抗病亲本P2；分离群体中所有单株抗病级别在0 ~ 4级连续分布（图2A），说明抗病性是多基因控制的数量性状，且存在显性的主效基因；从F2群体869个单株中选择50株高抗和50株高感单株分别构建了抗病池和感病池并进行重测序，利用QTL-Seq技术，在9号染色体（32.06 Mb ~ 40.01 Mb）鉴定出1个控制B2013根肿病抗性的主效基因，命名为BolC.Pb.9.1（图2B）；随后利用传统遗传连锁分析将携带BolC.Pb.9.1的片段缩小至9号染色体38.79 Mb~ 39.35 Mb内（560 kb）（图2C）。
（2）精细定位：将上述F2群体扩大至5122株，使用初定位区间侧翼标记Indel34（C09：38793526）和Indel60（C09：39353082）进行基因型鉴定，筛选获得重组单株46个，对所有重组单株进行自交授粉获得F3家系。每个F3家系播种约150株，再次使用标记Indel34和Indel60进行基因型鉴定，将每个F3家系的单株其分为三种类型：纯合非交换类型（约占1/4）、纯合交换类型（约占1/4）、杂合交换类型（约占2/4）。为保证表型的准确性，只对非交换类型和纯合交换类型进行了人工接种鉴定，得到每个F3家系两种纯合类型的病情指数，统计鉴定结果。根据双亲的重测序数据和变异信息，在初定位区间内新开发标记20个，筛选出稳定、共显性的多态性连锁标记9个，完成了对每个F3家系的在初定位区间的交换情况进行鉴定。根据每个F3家系对应的表型，进行遗传连锁分析获得1个精细定位区间，位于9号染色体38908183—38959595bp区域，区间大小约51.4 kb（图2D和图2E）。
（1）利用芸薹属数据库的结球甘蓝02-12（http://brassicadb.org/brad/），芥蓝TO1000（http://plants.ensembl.org/Brassica_oleracea/Info/Index），青花菜HDEM和花椰菜C-8参考基因组信息，获得精细定位区间内所有基因的序列和注释信息，并预测其功能。根据参考基因组注释信息，定位区间内有11个候选基因，其中7个是UDP-GLUCOSYLTRANSFERASE基因，剩余4个分别为富亮氨酸蛋白基因Bol044005和Bol044006、复制因子C基因Bol044007、PHD zinc finger转录因子基因Bol044008（图2F）。
（2）对定位区间内所有候选基因进行扩增测序，分析抗感双亲间的序列变异。Bol044004基因全长2331bp，包含2个外显子。双亲间在Exon1和Exon2中存在10个SNP，涉及到10个氨基酸的突变（图3B和图3C）。
（3）根据前期获得的转录组数据，分析定位区间内所有基因的表达情况，并作表达量热图。由图3A可见，Bol03998等10个基因在抗感材料的各个时期的表达量差异不显著。Bol044004在抗感材料的次级侵染时期表达量较高，且在抗病材料B2013中显著高于感病材料90196。从NCBI中下载Bol044004氨基酸序列相似的基因做进化树，Bol044004与十字花科拟南芥、大白菜及甘蓝型油菜UGT76C2蛋白聚在一类，说明同源性较高（图3D）。
综合候选基因注释信息、序列变异、基因表达及进化树分析，确定BolC.Pb.9.1的候选基因为Bol044004，命名为BoUGT76C2。
为了研究野生甘蓝BoUGT76C2在根肿病抗性中的作用，通过构建青花菜过表达植株来研究其功能。
（1）过表达载体的构建：扩增候选基因BoUGT76C2 CDS序列，通过酶切和连接替换pCAMBIA1301载体骨架上的GUS基因，获得BoUGT76C2的过表达载体35S:BoUGT76C2，用热激法将重组载体导入农杆菌株系GV3101或EHA105。
（2）遗传转化：通过农杆菌介导的遗传转化法侵染青花菜资源90196，该资源对根肿菌4号小种表现高感病。具体步骤如下：青花菜种子置于50 mL离心管中，用8%次氯酸钠溶液消毒10 min，75%酒精消毒3 min，无菌水洗涤3次，在无菌操作台中，用灭菌的滤纸上吸干种子表面水分，置于播种培养基中，在16h/8h（光照/黑暗），25℃下培养5天；制备农杆菌侵染液，调OD600=0.4，将青花菜下胚轴切成0.8-1cm长度，侵染10 min后，用灭菌的滤纸上吸干水分，移至共培养培养基，25℃下暗培养2天；之后将下胚轴移至选择培养基(MS 4.4 g/L+蔗糖28 g/L+琼脂8 g/L + 6-BA 0.2 mg/L+ NAA 0.1 mg/L+Timentin 300 mg/L+ BASTA15 mg/L, pH=5.8-5.9)，在16h/8h（光照/黑暗），25℃下培养，每2周更换一次选择培养基；待不定芽生长至2 cm，切下转移到长苗培养基；待生长至10 cm左右，切下转移至生根培养基，20天后完成生根，可移栽至培养箱或温室。取少量青花菜幼苗叶片进行检测。
（3）转基因阳性苗的鉴定：用改良CTAB法提取青花菜幼苗叶片基因组DNA，以bar基因特异引物对Ｔ0代植株进行检测，确定阳性植株。共获得5个转基因阳性植株，编号OE#1～OE#5。通过实时荧光定量技术对获得的5个阳性植株中目标基因BoUGT76C2的表达量做了分析，取样为根。结果显示，过表达阳性苗表达量比野生型高5～10倍。
（4）转基因植株表型分析：挑选表达量高的OE#1、OE#3和OE#4 T0代阳性株，开花后授粉获得T1代种子。以青花菜90196为对照组，以T1代阳性株为处理组，进行人工接种鉴定，确定过表达株系抗性水平是否显著提高。结果如图4显示，OE#1、OE#3和OE#4 T1代植株表现出较强的抗性。
综上所述，野生甘蓝BoUGT76C2基因在抗根肿病应答中起着正调控作用，过表达青花菜植株表现出较强的根肿病抗性。
以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，仅用以解释本发明，并非限制本发明实施范围，对于本技术领域的技术人员来说，当然可根据本说明书中所公开的技术内容，通过置换或改变的方式轻易做出其它的实施方式，故凡在本发明的原理上所作的变化和改进等，均应包括于本发明申请专利范围内。

Claims (8)

1.野生甘蓝糖基转移酶BoUGT76C2基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
2.权利要求1所述的野生甘蓝糖基转移酶BoUGT76C2基因编码的蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.包含权利要求1所述野生甘蓝糖基转移酶BoUGT76C2基因的重组载体或重组质粒。
4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为农杆菌过表达载体。
5.权利要求1所述的野生甘蓝糖基转移酶BoUGT76C2基因或权利要求2所述的蛋白在增强青花菜根肿病抗性中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，通过构建BoUGT76C2过表达载体，获得抗根肿病的转基因青花菜植株。
7.一种植物育种方法，其特征在于，所述方法为通过促进目的植物中BoUGT76C2基因的表达，获得根肿病抗性强于目的植物的植株；所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述植物为十字花科植物。
8.根据权利要求7所述植物育种方法，其特征在于，所述植物为野生甘蓝、青花菜、拟南芥、大白菜及甘蓝型油菜。
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