CN117511989A - 一种筛选根肿菌功能基因方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于分子生物技术领域，具体的本发明公开了根肿菌功能基因的筛选方法，本发明首先通过三亲杂交将包含根肿菌cDNA序列信息的大肠杆菌文库转移至农杆菌；其次，进行根肿菌cDNA文库的规模筛选；再次，观察烟草叶片表型获得有表型的目的基因。本发明利用根肿菌cDNA文库成功筛选出有功能的基因，并提供了一套能够大量、有效进行筛选进而加快从根肿菌cDNA文库中获得功能基因的方法。本发明为研究根肿菌与其寄主之间的识别和作用关系，挖掘新的抗性基因进而有针对性的进行防控奠定了基础。同时也为解析根肿菌病害发生的机理，从而不断发现新的抗病机制提供新的思路。

Description

一种筛选根肿菌功能基因方法
技术领域
本发明涉及分子生物技术领域，具体涉及一种筛选根肿菌功能基因方法。
背景技术
根肿菌(Plasmodiophoromycetes)介于粘菌和真菌之间的一类低等生物。在真菌、藻类及高等植物上尤其是十字花科作物寄生，当寄生在植物的地下部分时，被侵害部分膨大成肿瘤。该病原菌在侵染过程中会引起寄主根部肿大，严重破坏根部的正常功能，最终导致作物减产或死亡。根肿病早期分布于东欧，目前已发展为世界性病害，对各类十字花科作物造成严重危害。中国是根肿病严重受害国之一，在湖北、四川以及山东等地，以油菜、大白菜以及甘蓝为代表的各类芸薹属作物的种植都受到明显影响。
农杆菌介导的瞬时表达系统是一种快速研究蛋白质表达和蛋白质相互作用的重要手段。根癌农杆菌作为一种革兰氏阴性的土壤杆菌，在自然的状态下，农杆菌能够对植物细胞进行遗传改造。植物的伤口有利于根癌农杆菌的进入并且产生类复合物，激活农杆菌转移。植物转化载体构建已经被广泛地应用于植物分子生物学和遗传改造上。外源基因通过农杆菌转化系统进入植物基因组中能够稳定的遗传给下一代，操作方便而且有效。
发明内容
目前，高效筛选根肿菌功能基因的方法未见报道，探索和建立一套高效的筛选技术方法对研究解析根肿菌病害发生的机理，从而不断发现新的抗病机制至关重要。针对这一问题，申请人通过广泛的研究，提出了一种筛选根肿菌功能基因的方法，由此完成本发明。
一种根肿菌功能基因的筛选方法，包括如下步骤：
S1、利用三亲杂交将包含根肿菌cDNA序列信息的大肠杆菌文库转入农杆菌；
S2、利用农杆菌瞬时转化技术对根肿菌cDNA文库进行规模筛选；
S3、根据叶片注射位置产生坏死表型来确定是否为功能基因。
一种根肿菌功能基因的筛选方法，包括如下步骤：
S1、利用三亲杂交将包含根肿菌cDNA序列信息的大肠杆菌文库在辅助菌
XX的协同下转入农杆菌；
S2、利用农杆菌瞬时转化技术将带有根肿菌cDNA序列信息的农杆菌转化侵染受试植物，实现对根肿菌cDNA文库进行规模筛选；
S3、根据叶片注射位置产生坏死表型来确定是否为功能基因。
在本发明中，辅助菌选自大肠杆菌，优选大肠杆菌PRK2013，受试植物是易于被农杆菌侵染的植物，例如烟草、大豆、玉米、小麦、杨树
在本发明的一个实施例中，上述步骤S1的具体操作为：
(1)在三亲杂交配种前2天分别将农杆菌菌株和辅助菌涂于相应抗性的新鲜培养基平板上；所述辅助菌为大肠杆菌PRK2013
(2)三亲杂交配种前一天，从新鲜培养基平板中挑取农杆菌菌株单菌落，接种50mL相应抗性液体LB。农杆菌在28℃震荡培养，同时将辅助菌株接种50mL相应抗性液体LB，37℃震荡培养；
(3)第二天一早，将携带根肿菌cDNA文库的大肠杆菌接种50mL相应抗性液体LB，37℃震荡培养文库约6小时；
(4)将三种培养物各40mL分别倒入三根50mL离心管中。以10,000rpm旋转5分钟。弃上清并倒置试管以尽可能多地去除上清；
(5)每管加入15mL液体LB，旋涡重悬菌体；
(6)将三根管子里的菌液倒在一起，混匀。再以10,000rpm旋转5分钟；
(7)倒出上清液，重新加入3mL液体LB重悬细菌混合物；将整个文库铺在6个LB平板上，每个平板上0.5mL液体LB。在28℃下培养细菌过夜，不超过24小时；
(8)在每个平板上加入10mL的液体LB，洗去所有细菌。将6个培养皿中的细菌聚集在一起，旋涡确保菌体重悬并很好地混合；
(9)将细菌混合物保存在2mL离心管中，放至超低温冰箱保存。
在本发明的一个实施例中，上述步骤S2的具体操作为：
(1)将保存在超低温冰箱中的文库取出，从离心管中取1μl菌液分别稀释102，103，104倍后涂在LB固体培养基平板上，28℃下培养2天，计数，选择合适的浓度稀释进行文库筛选；
(2)用牙签将长好的单克隆接种于装有液体LB培养基的96孔板中，28℃下培养2天；
(3)用移液枪收集菌液，将每8孔的菌液收集在一起，混合均匀；
(4)4000rpm，离心10min；
(5)用缓冲液(10mM MgCl2)重悬菌体，4000rpm，离心10min，重复两次；
(6)用诱导液(10mM MgCl2，10mM MES pH 5.6，200μM乙酰丁香酮)调节细胞悬浮液浓度OD600至0.8，28℃培养箱中培养1-3小时；
(7)选取4-6周龄的烟草进行注射，注射后，将烟草置于25℃，16小时/8小时光照黑暗交替温室培养，3-7天后观察并记录结果。
在本发明的一个实施例中，上述步骤S3的具体操作为：
(1)待注射叶出现坏死表型，按照编号将原96孔板的相应编号菌液重新接种以再次确认表型，并将混在一管中的8个菌落单独摇菌后注射烟草，确认导致坏死表型产生的具体菌落；
(2)确认后，提取菌落的农杆菌质粒，转化大肠杆菌，再重新提取高质量质粒，保存，测序用于后续功能基因的进一步分析。
有益效果
本发明方法能有效的将携带根肿菌cDNA序列信息的大肠杆菌文库转入农杆菌，利用农杆菌瞬时转化技术通过注射烟草观察表型来筛选功能基因，可以高效的对根肿菌cDNA文库进行筛选，产生的结果可信度高，文库容量利用效率高，利用农杆菌瞬时转化技术去筛选根肿菌cDNA文库中的功能基因是一种快速，高效的筛选方法。
本发明的采用三亲杂交法将大肠杆菌文库转入农杆菌比普通电转或液氮速冻发转化率高，并且转化以后可保存并反复利用。
本发明利用96孔板可一次性进行大批量筛选，避免一个一个接种检测，极大的节约了时间成本。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为通过三亲杂交将大肠杆菌文库转入农杆菌后，随机抽取24个单菌落进行菌落验证的凝胶电泳检测示意图，泳道从左往右依次是Marker，单菌落1-单菌落24的菌落培养物的扩增结果。
图2为筛选流程示意图。
图3为部分烟草注射叶片未出现坏死表型的筛库结果展示图。
图4为出现烟草叶片坏死表型的筛库结果展示图。
图5为功能基因结构的初步分析结果展示图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明所需药剂为常规实验药剂，采购自市售渠道；未提及的实验方法为本领域的常规实验方法，在此不再一一赘述。
实施例1
一种根肿菌功能基因的筛选方法，包括如下步骤：
S1、利用三亲杂交将包含根肿菌cDNA序列信息的大肠杆菌文库转入农杆菌：
(1)在三亲配种前2天分别将农杆菌菌株和辅助菌在新鲜LB板上划线；
(2)三亲配种前一天，从新鲜培养基平板中挑取农杆菌菌株单菌落，接种50mL液体LB，在28℃震荡培养。同时将辅助菌株接种50mL液体LB，37℃震荡培养；
(3)第二天一早，将1mL DH10B文库(携带根肿菌cDNA序列)的细菌接种50mL液体LB，培养文库约6小时；
(4)将三种培养物各40mL分别倒入三根50mL离心管中。以10,000rpm旋转5分钟。丢弃上清并倒置试管以尽可能多地去除上清；
(5)每管加入15mL液体LB，旋涡重悬菌体；
(6)将三根管子里的菌液倒在一起，混匀。再以10,000rpm旋转5分钟；
(7)倒出上清液，重新加入3mL的液体LB重悬细菌混合物；将整个文库铺在6个LB平板上，每个平板上0.5mL液体LB。在28℃下培养细菌过夜，不超过24小时；
(8)在每个平板上加入10mL的液体LB，洗去所有细菌。将6个培养皿中的细菌聚集在一起，旋涡确保菌体重悬并很好地混合；
(9)将细菌混合物保存在2mL离心管中，放至超低温冰箱保存。
取1μl菌液涂抗性板进行PCR检测效果，28℃培养2天后挑取单菌落进行PCR扩增，凝胶电泳检测(结果见图1所示)。
PCR反应体系为：
单菌落：1μl，2x MIX：12.5μl，引物F/R：1/1μl，ddH2O补足至25μl。(引物F:GTAAAACGACGGCCAGT引物R:GGAATTGTGAGCGGATAA)
S2、利用农杆菌瞬时转化技术对根肿菌cDNA文库进行规模筛选：
(1)将保存在超低温冰箱中的文库取出，在离心管中取1μl菌液稀释104倍涂在LB固体培养基平板上，28℃，培养2天。
(2)用牙签将长好的单克隆接种于装有液体LB培养基的96孔板中，28℃，培养2天；
(3)用移液枪收集菌液，将每8孔的菌液收集在一起，混合均匀(流程参见图2)；
(4)4000rpm，离心10min；
(5)用缓冲液(10mM MgCl2)重悬菌体，4000rpm，离心10min，重复两次；
(6)用诱导液(10mM MgCl2，10mM MES pH 5.6，200μM乙酰丁香酮)调节细胞悬浮液浓度OD600至0.8，28℃培养箱中培养1-3小时；
(7)选取4-6周龄烟草进行注射(流程见图2)，注射后，将烟草置于25℃，16小时/8小时光照黑暗交替温室培养，3-7天后观察并记录结果(图3，图4)。其中图3为部分未有坏死表型的筛库结果，图4为筛到表型的筛库结果。
S3、根据叶片注射位置产生坏死表型来确定是否为功能基因
(1)待注射叶出现坏死表型，按照编号将原96孔板的相应编号菌液重新接种以再次确认表型，并将混在一管中的8个菌落单独摇菌后注射烟草，确认导致坏死表型产生的具体菌落。
(2)确认后，提取菌落的农杆菌质粒，转化大肠杆菌，再重新提取高质量质粒，保存，测序用于后续功能基因的进一步分析。
功能基因结构的初步分析结果：
对筛选到的基因进行测序，并进行基因的生物信息血分析，结果显示，该序列属于根肿菌基因组序列，其含4个外显子和3个内含子，全长621bp，编码206个氨基酸，其瞬时表达可诱发烟草产生过敏细胞死亡反应。
综上所述，本发明所描述的方法不仅提供了高效的筛选方法而且为根肿菌cDNA文库的后续应用及根肿菌对寄主植物的致病机理解析奠定了基础。本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种根肿菌功能基因的筛选方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
S1、利用三亲杂交将包含根肿菌cDNA序列信息的大肠杆菌文库转入农杆菌；
S2、利用农杆菌瞬时转化技术对根肿菌cDNA文库进行规模筛选；
S3、根据叶片注射位置产生坏死表型来确定是否为功能基因。
2.根据权利要求1所述的一种根肿菌功能基因的筛选方法，包括如下步骤：
S1、利用三亲杂交将包含根肿菌cDNA序列信息的大肠杆菌文库在辅助菌的协同下转入农杆菌；
S2、利用农杆菌瞬时转化技术将带有根肿菌cDNA序列信息的农杆菌转化侵染受试植物，实现对根肿菌cDNA文库进行规模筛选；
S3、根据叶片注射位置产生坏死表型来确定是否为功能基因。
3.根据权利要求2所述的一种根肿菌功能基因的筛选方法，其特征在于，所述辅助菌选自大肠杆菌，受试植物是易于被农杆菌侵染的植物；优选的，所述辅助菌选自大肠杆菌PRK2013所述植物选自烟草、大豆、玉米、小麦、杨树。
4.根据权利要求1或2任一所述的一种根肿菌功能基因的筛选方法，其特征在于，上述步骤S1的具体操作为：
(1)在三亲杂交配种前2天分别将农杆菌菌株和辅助菌涂于相应抗性的新鲜培养基平板上；所述辅助菌为大肠杆菌PRK2013
(2)三亲杂交配种前一天，从新鲜培养基平板中挑取农杆菌菌株单菌落，接种50mL相应抗性液体LB。农杆菌在28℃震荡培养，同时将辅助菌株接种50mL相应抗性液体LB，37℃震荡培养；
(3)第二天一早，将携带根肿菌cDNA文库的大肠杆菌接种50mL相应抗性液体LB，37℃震荡培养文库约6小时；
(4)将三种培养物各40mL分别倒入三根50mL离心管中。以10,000rpm旋转5分钟；弃上清并倒置试管以尽可能多地去除上清；
(5)每管加入15mL液体LB，旋涡重悬菌体；
(6)将三根管子里的菌液倒在一起，混匀。再以10,000rpm旋转5分钟；
(7)倒出上清液，重新加入3mL液体LB重悬细菌混合物；将整个文库铺在6个LB平板上，每个平板上0.5mL液体LB。在28℃下培养细菌过夜，不超过24小时；
(8)在每个平板上加入10mL的液体LB，洗去所有细菌。将6个培养皿中的细菌聚集在一起，旋涡确保菌体重悬并很好地混合；
(9)将细菌混合物保存在2mL离心管中，放至超低温冰箱保存。
5.根据权利要求1或2任一所述的一种根肿菌功能基因的筛选方法，其特征在于，上述步骤S2的具体操作为：
(1)将保存在超低温冰箱中的文库取出，从离心管中取1μl菌液分别稀释102，103，104倍后涂在LB固体培养基平板上，28℃下培养2天，计数，选择合适的浓度稀释进行文库筛选；
(2)用牙签将长好的单克隆接种于装有液体LB培养基的96孔板中，28℃下培养2天；
(3)用移液枪收集菌液，将每8孔的菌液收集在一起，混合均匀；
(4)4000rpm，离心10min；
(5)用缓冲液(10mM MgCl2)重悬菌体，4000rpm，离心10min，重复两次；
(6)用诱导液(10mM MgCl2，10mM MES pH 5.6，200μM乙酰丁香酮)调节细胞悬浮液浓度OD600至0.8，28℃培养箱中培养1-3小时；
(7)选取4-6周龄的烟草进行注射，注射后，将烟草置于25℃，16小时/8小时光照黑暗交替温室培养，3-7天后观察并记录结果。
6.根据权利要求1或2任一所述的一种根肿菌功能基因的筛选方法，其特征在于，上述步骤S3的具体操作为：
(1)待注射叶出现坏死表型，按照编号将原96孔板的相应编号菌液重新接种以再次确认表型，并将混在一管中的8个菌落单独摇菌后注射烟草，确认导致坏死表型产生的具体菌落；
(2)确认后，提取菌落的农杆菌质粒，转化大肠杆菌，再重新提取高质量质粒，保存，测序用于后续功能基因的进一步分析。
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