CN116004713A - 一种快速鉴定南瓜抗白粉病基因的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速鉴定南瓜抗白粉病基因的方法，通过选取高感白粉病材料的南瓜种子催芽播种，用限制性内切酶构建目的基因的超量表达载体，转化获得重组质粒的根癌农杆菌；在南瓜子叶完全展开、第一片真叶显露时，将根癌农杆菌注入南瓜子叶中进行瞬时转化，再对瞬时转化的南瓜子叶进行GUS染色，分析目的基因在植株子叶中的表达效率；对瞬时转化子叶采用喷雾法接种白粉病菌孢子悬浮液，通过观察病原菌生长进行目的基因抗病性的鉴定，该方法转化效率高、时间短、重复性好，安全、可靠，适于农业推广应用。并基于该方法，本发明鉴定获得了一种南瓜抗白粉病基因CmHsfA2a，所述基因CmHsfA2a的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

Description

一种快速鉴定南瓜抗白粉病基因的方法

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体地说，涉及一种快速鉴定南瓜抗白粉病基因的方法。

背景技术

南瓜是葫芦科南瓜属一年生草本植物，我国的主栽南瓜品种有中国南瓜、印度南瓜和美洲南瓜，作为常见的菜粮兼用作物，南瓜众多品种具有较高的耐热性、耐寒性和适应性，且南瓜在我国作为辅粮由来已久，在社会生活中具有极高的经济价值；白粉病是危害南瓜生产的重要真菌病害，药剂防治效果不佳，极易造成叶片早衰减产；而且长期使用化学杀菌剂易使病原菌产生抗药性，同时给食用带来安全隐患，又加剧环境污染。

南瓜抗病品种匮乏，挖掘抗性基因进行遗传转化是一条提高南瓜白粉病抗性育种的有效途径；然而，目前对南瓜抗白粉病分子机制了解十分有限，尤其是抗白粉病基因的克隆和功能验证方面尚未取得实质性的进展；我们前期利用转录组测序技术分离和鉴定了中国南瓜高抗白粉病材料（自交系‘112-2’）接种白粉菌后的差异表达基因，获得了4716个DEGs，其中包括转录因子 WRKY、TGA 和 HsfA等；南瓜遗传转化体系仍不成熟，而瞬时转化体系是鉴定植物基因功能的有效方法，具有简单、高效、耗时短等特点；但是，影响瞬时转化的因素很多，如农杆菌菌株、菌液浓度、侵染方法、共培养时间等，以致于现有瞬时转化体系并不能直接用于或者适用于南瓜抗病基因鉴定，从而制约了南瓜抗白粉病基因以及抗白粉病南瓜品种的多样化。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用瞬时转化快速鉴定南瓜抗白粉病基因的方法，实现南瓜抗白粉病基因的快速鉴定以及基于该鉴定方法获得南瓜抗白粉病基因。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种利用瞬时转化快速鉴定南瓜抗白粉病基因的方法，包括以下步骤：

（1）、取高感白粉病材料的南瓜种子催芽播种；

（2）、用限制性内切酶构建目的基因的超量表达载体，转化获得重组质粒的根癌农杆菌GV3101；

（3）、在南瓜子叶完全展开、第一片真叶显露时，利用去掉针头的2 mL注射器将根癌农杆菌注入南瓜子叶中，以子叶充满水渍为准，24～25℃黑暗条件下培养2～3d，随后转入正常光照下培养；

（4）、取大田感白粉病的南瓜叶片，用刷子收集白粉病菌，采用孢子悬浮液喷雾法接种于共培养结束的南瓜子叶上；

（5）、对瞬时转化的南瓜子叶进行GUS染色，分析目的基因在植株子叶中的表达效率；

优选的，步骤（2）所述的根癌农杆菌培养条件为：划板后挑取单菌落，在含有50mg·L^-1 Kan的LB液体培养基中28℃摇菌，过夜，将摇好的菌液4000 r·min^-1离心10 min，用MS液体培养基重悬菌体，28℃下放置2~3 h后用于侵染；

优选的，步骤（2）所述的超量表达载体为pCAMBIA1301；

优选的，所述MS液体培养基的组成包括：MS液体基本培养基、30%蔗糖、200μmol·L^-1 As，pH=5.2；

优选的，步骤（3）所述根癌农杆菌的浓度为OD=0.4；

基于上述技术方案，本发明鉴定获得了一种南瓜抗白粉病基因CmHsfA2a，所述基因CmHsfA2a的核苷酸序列如SEQ ID NO : 1所示。

本发明取得的有益效果：

本发明通过构建过表达载体，使目的基因在南瓜植株中过表达，再对瞬时转化的南瓜子叶进行GUS染色，分析目的基因在植株子叶中的表达效率，进而实现目的基因是否具备抗白粉病性能的快速鉴定；本发明提供的鉴定方法转化效率高、时间短、重复性好，安全、可靠，适于农业推广应用，并且依据该鉴定方法，本发明获得了一种南瓜抗白粉病基因CmHsfA2a，所述基因CmHsfA2a的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，可为抗白粉病南瓜品种的培育奠定基础。

附图说明：

图1为真空渗透法和注射法对接种白粉病菌的南瓜叶片的影响；

图2为南瓜材料“九江轿顶”GUS染色结果；

图3为白粉病菌接种后植株子叶 CmHsfA2a基因的表达分析；

图4为南瓜子叶接种白粉病菌后甲基蓝染色结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步说明

实施例1

基因CmHsfA2a的抗白粉病鉴定

1.材料准备

取高感白粉病材料‘九江轿顶’南瓜种子，55℃浸种10 min，常温蒸馏水中浸泡6 h后28℃催芽2d，将发芽的种子播种于穴盘中，待子叶完全伸展开、第一真叶显露时进行瞬时转化处理。

重组载体构建与转化：

（1）提取南瓜‘112-2’叶片总RNA

①试验采用Trizol法提取RNA，所用枪头、离心管、研钵等均进行无酶处理，操作过程中严禁RNA酶污染；具体操作步骤如下：

取0.1 g新鲜南瓜叶片于液氮下研磨成粉末，转移到含有1 ml Trizol提取液的2ml离心管中，立即震荡混匀，冰上裂解5 min，4℃，12 000 rpm离心10 min；

吸取上清液至新的2 ml RNase-Free的离心管中，加入200 μl氯仿，振荡混匀，冰上静置5 min后，4℃，12 000 rpm离心15 min；

移取600 μl上清液至新的2 ml RNase-Free的离心管中，加入600 μl试剂（酚﹕氯仿﹕异戊醇=24﹕25﹕1），颠倒混匀，冰上静置10 min，4℃，12 000 rpm离心10 min；

吸取上清至新的2 ml RNase-Free的离心管中，加入等体积氯仿，颠倒混匀，冰上静置10 min，4℃，12 000 rpm离心10 min；重复此步骤；

吸取上清至新的2 ml RNase-Free的离心管中，加入等体积异丙醇，﹣80℃放置20min后，用预冷75%乙醇洗脱2次，冰上干燥约10 min后，用50 μl DEPC H₂O溶解，﹣80℃保存备用；

②检测：1%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，并用超微量分光光度计检测其浓度及纯度；

（2）cDNA单链的合成及PCR扩增

以RNA为模板，参考PrimeScript^TMⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit的操作说明书合成cDNA；以cDNA为模板，在目的基因ORF两端设计含有 BamHI、 KpnI酶切位点的引物；

（3）胶回收

参照胶回收试剂盒说明书进行；

（4）连接

用0.2 ml离心管，依次添加反应液，轻轻混匀反应液，瞬时离心后，16℃，过夜连接；

（5）转化连接产物

参照大肠杆菌TOP10的说明书进行；

（6）用限制性内切酶 BamHI、 KpnI酶切植物表达载体 pCAMBIA1301，目的片段 CmHsfA2a与酶切后的表达载体pCAMBIA1301，16℃过夜连接产物转化大肠杆菌，用无菌涂布器使菌液在培养皿内分布均匀、挑取单菌落，摇菌，PCR检测后送测序及进行双酶切检测，检测正确后提取重组质粒，转化感受态农杆菌，PCR检测后于﹣80℃保存。

根癌农杆菌和发根农杆菌的制备

转入重组质粒的农杆菌，划板后挑取单菌落在含有50 mg·L^-1 Kan的LB液体培养基中28℃摇菌，过夜，将摇好的菌液4000 r·min^-1离心10 min，用MS液体培养基（含MS液体基本培养基、30%蔗糖、200 μmol·L^-1 AS、pH=5.2）重悬菌体，稀释至OD=0.4，28℃下放置2~3h后用于侵染，获得根癌农杆菌GV3101。

按照以上步骤同步制备发根农杆菌Ar-qual。

农杆菌、农杆菌悬浮液的筛选及农杆菌介导的南瓜基因瞬时转化

南瓜材料：中国南瓜高感白粉病南瓜品种‘九江轿顶’种质资源取自河南科技学院南瓜种质创新团队；

取所述南瓜材料120棵，均分为六组，即每组20棵，采用表1记载的实验方式，利用去掉针头的2 mL注射器将相应农杆菌注入南瓜子叶中，以子叶充满水渍为准，并在相应条件下培养；

表1

	农杆菌菌株	农杆菌悬浮液	注射子叶后培养条件	子叶坏死率
					A	GV3101	MS液体培养基	黑暗条件下25℃培养3 d，然后转入光照下（光周期16 h/8 h，光照强度约3000 lx）培养	3.0%
B	GV3101	MS液体培养基	全程在光照下（光周期16 h/8 h，光照强度约3000 lx）培养	26%
					C	GV3101	MES悬浮液	黑暗条件下25℃培养3 d，然后转入光照下（光周期16 h/8 h，光照强度约3000 lx）培养	71%
D	GV3101	MES悬浮液	全程在光照下（光周期16 h/8 h，光照强度约3000 lx）培养	85%
					E	Ar-qual	MS液体培养基	黑暗条件下25℃培养3 d，然后转入光照下（光周期16 h/8 h，光照强度约3000 lx）培养	13%
F	Ar-qual	MES悬浮液	黑暗条件下25℃培养3 d，然后转入光照下（光周期16 h/8 h，光照强度约3000 lx）培养	64%

表1中，MS液体培养基组成为MS液体基本培养基、30%蔗糖、200 μmol·L^-1 AS、pH=5.2，MES悬浮液组成为10 mmol/L MgCl2，10 mmol/L MES，200 μmol·L^-1 AS、pH=5.7；

此外，分别利用真空渗透法和注射法将MS液体培养基悬浮的根癌农杆菌GV3101注入南瓜叶片中，25℃黑暗共培养3 d，然后转入光照下（光周期16 h/8 h，光照强度约3000lx）培养；真空渗透法以离体叶片为试材，暗培养至接种白粉病菌期间，离体叶片易出现坏死、腐烂、污染现象（图1）；而注射法以活体植株为试材，注射叶片能迅速恢复正常，不影响对病害抗性的鉴定。

培养结果显示，农杆菌菌株、农杆菌悬浮液、农杆菌注入方法以及农杆菌注入后的培养条件均对瞬时转化结果起到决定性影响，采用A组的方案，注射子叶基本全部恢复正常，瞬时转化结果最好，可获得正常的过表达南瓜CmHsfA2a 基因的转化南瓜植株。

白粉病菌接种瞬时转化南瓜子叶

以暗培养结束开始计算时间，取结束后的第2、4、6、8 d，即48、96、144、192 h，瞬时转化南瓜子叶进行GUS染色分析，未瞬转子叶为对照；

取大田感白粉病的南瓜叶片，用刷子收集白粉病菌，采用孢子悬浮液喷雾法接种于共培养结束的南瓜子叶上，悬浮液浓度1×10⁵ 个/mL，25℃，55%相对湿度培养，对照植株为接菌的未转化植株；接种白粉病菌后24、48、72、96、120、144 h取样，设置5次重复，RNA提取用的鲜样采用混合取样的方法，用锡箔纸包裹，液氮冷冻后存于﹣80℃保存以备后续试验。

南瓜子叶检测

GUS染色结果显示，重组载体pCAMBIA1301 -CmHsfA2a在‘九江轿顶’植株子叶中成功表达；染色的多少一定程度反应该基因在植株中的表达效率，如图2所示，暗培养结束后4~6 d为瞬时表达的高峰期，该作用可持续至第8 d；用白粉病菌处理瞬时转化南瓜植株和未转化植株‘九江轿顶’，如图3，与未转化对照植株子叶相比，瞬时转化植株子叶接菌48h-96h期间 CmHsfA2a基因表达高于与未转化对照植株，其中48 h转化植株 CmHsfA2a较接菌未转化对照表达量上调了80%，表明瞬时转化植株 CmHsfA2a积极参与白粉病菌的早期防御反应。

瞬时转化南瓜子叶对白粉病菌生长的抗性分析

白粉病菌在瞬时转化南瓜子叶上的生长分析如图4所示，接菌24 h后，瞬时转化 CmHsfA2a基因的南瓜子叶白粉病菌孢子萌发长出芽管，对照已长出菌丝；接菌48 h后，瞬时转化植株子叶长出1~2条次级菌丝，对照菌丝分支较多、较长，且长出4~5条次级菌丝；接菌72 h后，瞬时转化植株子叶次级菌丝伸长，并开始交叉生长，呈发散状；接菌96 h后，瞬时转化植株子叶各级菌丝伸长明显，并交叉生长呈网状，分生孢子梗较少，对照菌丝生长呈网状，且具有较多分生孢子梗；总之，瞬时转化子叶白粉病菌生长受到明显的抑制，表明 CmHsfA2a超量表达抑制了南瓜白粉病菌的生长。

上述具体实施方式用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明做出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种快速鉴定南瓜抗白粉病基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）、取高感白粉病材料的南瓜种子催芽播种；

（2）、用限制性内切酶构建目的基因的超量表达载体，转化获得重组质粒的根癌农杆菌GV3101；

（3）、在南瓜子叶完全展开、第一片真叶显露时，利用去掉针头的2 mL注射器将根癌农杆菌注入南瓜子叶中，以子叶充满水渍为准，24～25℃黑暗条件下培养2～3d，随后转入正常光照下培养；

（4）、取大田感白粉病的南瓜叶片，用刷子收集白粉病菌，采用孢子悬浮液喷雾法接种于共培养结束的南瓜子叶上；

（5）、对瞬时转化的南瓜子叶进行GUS染色，分析目的基因在植株子叶中的表达效率。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）所述的根癌农杆菌培养条件为：划板后挑取单菌落，在含有50 mg·L^-1 Kan的LB液体培养基中28℃摇菌，过夜，将摇好的菌液4000 r·min^-1离心10 min，用MS液体培养基重悬菌体，28℃下放置2~3 h后用于侵染。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）所述的超量表达载体为pCAMBIA1301。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述MS液体培养基的组成包括：MS液体基本培养基、30%蔗糖、200μmol·L^-1 As，pH=5.2。

5.根据权利1所述的方法，其特征在于，步骤（3）所述根癌农杆菌的浓度为OD=0.4。

6.一种南瓜抗白粉病基因CmHsfA2a，由权利要求1-5任一所述的方法鉴定得到，所述基因CmHsfA2a的核苷酸序列如SEQ ID NO : 1所示。

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