CN113005122B - 一种抗玉米病毒的小rna - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种抗玉米病毒的小RNA，属于基因工程领域与作物分子生物学领域。本发明的小RNA为miR167来源于玉米，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1‑10任一所示。本发明发现在玉米中沉默miR167后接种玉米褪绿斑驳病毒MCMV，发现明显增强病毒侵染引起的花叶症状，且MCMV积累水平明显提高；还发现在玉米原生质体中沉默miR167导致MCMV积累增加，而过表达miR167的玉米原生质体中MCMV积累减少，表明miR167在玉米中发挥抗MCMV作用。本发明表明miR167可用于培育抗MCMV的玉米品种，还可用于抗病植物种质资源的改良及遗传育种领域，具有良好的市场应用前景。

Description

一种抗玉米病毒的小RNA
技术领域
本发明涉及作物分子生物学和分子育种领域，更具体地，涉及一种抗玉米病毒的小RNA即miR167及其应用。
背景技术
玉米是世界主要粮食作物，由病毒侵染引起的玉米致死性坏死病(Maize lethalnecrosis,MLN)是玉米上的主要病害，对玉米安全生产造成巨大威胁。该病主要由玉米褪绿斑驳病毒(maize chlorotic mottle virus,MCMV)与甘蔗花叶病毒(sugarcane mosaicvirus,SCMV)复合侵染造成。
MCMV是番茄丛矮病毒科(Tombusviridae)玉米褪绿斑驳病毒属(Machlomovirus)，可由种子、汁液、介体甲虫及蓟马等多种途径传播。主要寄主是玉米，在田间还可以侵染高粱、大麦等单子叶植物。MCMV侵染玉米的典型症状是叶片褪绿并伴随花叶，严重时可引起叶片坏死和植株矮化，被我国列入进境植物检疫性有害生物名录。目前，没有任何关于抗MCMV的基因/蛋白或者微小RNA被报道。筛选、培育和种植抗病品种，是防治玉米褪绿斑驳病毒病和MLN病的重要途径。因此寻找有效的抗病毒的基因，通过传统育种方式和分子标记辅助筛选相结合，对于有效的保障玉米产业安全具有重要的意义。
微小RNA(microRNA,简称miRNA)是由18-24个核糖核酸组成的短链小分子。miRNA在植物中广泛分布，其在调控植物的生长、发育以及对环境的适应发挥重要的作用。目前，玉米中有502个miRNA被鉴定，但是由于缺乏好的研究工具，玉米中miRNA的功能研究较少被报道，特别是与抗病抗逆相关的报道。
短的串联靶标模拟(STTM)是通过吸附植物内源与之匹配的miRNA，可以有效地阻碍内源miRNA的功能的一种技术。最近，我们以一种能侵染玉米并引起轻微花叶症状的黄瓜花叶病毒北京分离物(ZMBJ-CMV)为载体，开发了能够沉默玉米内源miRNA的工具，用于研究玉米中miRNA的功能。利用该工具，我们能够在玉米苗期瞬时阻碍玉米内源的miRNA，鉴定特定miRNA的功能。
近年来越来越多的证据表明，miRNA在多种作物针对多种病原菌的抗病过程中起重要的调节作用。运用miRNA序列调控作物自身基因来达到防治玉米褪绿斑驳病毒的应用性研究未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗玉米病毒的小RNA，其为miR167。
本发明的另一目的在于提供该miRNA在提高植物抗MCMV侵染中的用途。
本发明首先发现一种miRNA在玉米褪绿斑驳病毒侵染玉米过程中的表达量发生明显变化，该miRNA为miR167。miR167由玉米miR167家族所编码，经过加工形成的成熟体。玉米中有10个编码产生成熟miR167的基因，其产生的成熟序列分别如SEQ ID NO.1-10所示。玉米miR167的10个成熟体序列比较参见图1。本发明采用的STTM167序列是以zma-miR167a产生的成熟体的反向互补序列设计的。由于该家族产生的成熟体只在3’末端有1-2碱基的差异，原则上STTM序列能够没有差异的结合图1中不同形式的miR167。
本发明提供了含有玉米miR167的生物材料，所示生物材料为表达盒、表达载体、工程菌、宿主细胞。
本发明提供了玉米miR167或其表达促进剂或含有玉米miR167的生物材料在提高植物抗病毒能力中的应用。
所述的病毒为玉米褪绿斑驳病毒MCMV。
本发明提供了玉米miR167或其表达促进剂或含有玉米miR167的生物材料在植物种质资源改良中的应用。
本发明提供了玉米miR167或其表达促进剂或含有玉米miR167的生物材料在制备抗病能力高的转基因植物中的应用。
上述应用中，所示的植物均为单子叶植物，优选玉米、高粱、大麦、小麦、水稻、甘蔗、芋头、洋葱、百合或大蒜。
上述应用中，所述的病为由玉米褪绿斑驳病毒MCMV侵染及与其他病毒复合侵染所致的植物病害。
本发明提供了一种提高玉米抗褪绿斑驳病毒感染能力的小分子农药，该农药中含有促进玉米miR167表达的促进剂。所述促进剂为生物制剂或化学制剂。
本发明还提供了含有检测玉米miR167的特异性引物或探针的试剂盒在筛选培育能够抗玉米致死性坏色病的玉米中的应用。
本发明采用的检测植株miR167水平的探针根据miR167a的互补序列设计为：5’-tAgaTcaTgcTggCagCttCa-3’(大写字母表示该碱基被LNA修饰，目的提高检测灵敏度)，其中5’和3’都为地高辛标记。通常而言该探针检测的结果表示植株整体的miR167的水平。本发明采用的在玉米原生质体内过表达miR167的实验是根据已报道的以水稻miR528前体基因为骨架，把水稻miR528的成熟序列替换为玉米miR167a的成熟序列，并构建到pGD表达载体上。
本发明在玉米叶片中瞬时沉默miR167后接种MCMV，发现在沉默miR167的玉米中与未沉默miR167的玉米相比，病毒的花叶症状有明显的增强，且MCMV的积累水平明显提高，表现在MCMV基因组RNA水平和外壳蛋白(coat protein,CP)的蛋白水平提高。说明miR167在玉米中发挥抗MCMV作用。本发明通过在玉米原生质体中沉默和过表达miR167。在沉默miR167的原生质体中，MCMV积累增加，而在过表达miR167的原生质体中MCMV积累减少，表明miR167参与玉米抗MCMV的侵染。本发明表明miR167可用于培育抗褪绿斑驳病毒的玉米品种，还可用于抗病植物种质资源的改良及遗传育种领域，为绿色防控、培育抗病玉米提供了分子基础，具有良好的市场应用前景。
附图说明
图1为玉米miR167成熟体序列比较图；灰色阴影表示成熟的miR167的序列(从5’到3’的顺序)，与靶基因互补配对后第10位的剪切位点标注如图，黑色加粗部分表示家族之间变异的碱基；右边标注是产生该成熟体的前体基因的名称。
图2为CMV沉默载体RNA2构建示意图。
图3为MCMV在沉默miR167玉米植株上的侵染表型。miR167基因的相对表达量、MCMV基因组RNA的相对含量、MCMV CP的相对含量和CP积累量统计结果。
图4为沉默miR167促进了MCMV在玉米植株中的复制和增殖统计结果。A为接种14天后，miR167在对照组(CMV-STTM167m)和处理组(CMV-STTM167)第二片叶片中的积累量；B为接种14天后，miR167在对照组和处理组第二片叶片中的相对积累量；C为接种MCMV 7天后，MCMV的基因组在对照组和实验组中的积累量；D为接种MCMV 7天后，对应的MCMV的CP在对照组和实验组中的积累量。
图5为玉米原生质体中沉默和过表达miR167载体构建序列，以及沉默和过表达mi167对MCMV积累的影响。A为构建在玉米原生质体中沉默和过表达miR167的片段；pMDC32-STTM167(实验组)和pMDC32-STTM167m(对照组)片段用于沉默miR167的实验；pGDamiR167(实验组)和pGDamiRgfp(对照组)是用于过表达miR167的实验；B为转化玉米原生质体24小时后，miR167在积累量检测；C为转化玉米原生质体24小时后，MCMV的基因组的积累量检测；D为转化玉米原生质体24小时后，MCMV的CP的积累量检测。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例中所用的本生烟，已记录在文献Goodin MM,Zaitlin D,Naidu RAetal.Nicotiana benthamiana:its history and future as a model for plant-pathogeninteractions.Molecular plant-Microbe Interactions,2008,21(8):1015-1026。
载体pC101、载体pC301、载体pC201-2bN81在以下文献中披露：Wang R,Yang X,WangN,et al.An efficient virus-induced gene silencing vector for maize functionalgenomics research.The Plant Journal,2016,86(1):102-115。
玉米褪绿斑驳病毒(MCMV)在以下文献中披露：Scheets,K.Analysis of genefunctions in Maize chlorotic mottle virus.Virus research，2016，222:71-79。
实施例1玉米植株中沉默miR167对MCMV积累的影响一、在本生烟中扩繁携带STTM167及STTM167m的CMV病毒粒子1、用携带CMV-STTM167及CMV-STTM167m载体的农杆菌浸润本生烟(1)重组黄瓜花叶病毒(CMV)北京分离物沉默miR167载体及其对照载体的制备方法如下：
pC201-2bN81(ZMBJ-CMV RNA2bN81)为模板，用STTM167-F和STTM167-R组成的引物和STTM-48nts的模板进行PCR扩增获得STTM167。用STTM167m-F和STTM167m-R组成的引物和48nt的模板进行PCR扩增获得STTM167m(CMV沉默载体RNA2构建示意图见图2)。
STTM167-F：
5'-ATGTCCGAGTCTGAGTAGATCATGCTCTAGGCAGCTTCAGTTGTTGTTGTTATGG-3'；(SEQ IDNO.11)
STTM167-R：
5'-AAGGGGAGGTTCTAGTGAAGCTGCCTAGAGCATGATCTAATTCTTCTTCTTTAGACCA-3'；(SEQID NO.12)
STTM-48nts：
GTTGTTGTTGTTATGGTCTAATTTAAATATGGTCTAAAGAAGAAGAAT；(SEQ ID NO.13)
STTM167m-F：
5'-ATGTCCGAGTCTGAGTAGGTCGGGGTCTAGGCAACTAGTGTTGTTGTTGTTATGG-3'；(SEQ IDNO.14)
STTM167m-R：
5'-AAGGGGAGGTTCTAGACTAGTTGCCTAGACCCCGACCTAATTCTTCTTCTTTAGACCA-3'(SEQID NO.15)。
(2)将扩增得到的STTM167片段和STTM167m片段与经过双酶切(Kpn I/Xba I)的载体pC201-2bN81-MCS骨架连接，得到重组质粒pC201-2bN81-STTM167及pC201-2bN81-STTM167m。
(3)将测序正确的pC201-2bN81-STTM167和pC201-2bN81-STTM167m质粒转化到农杆菌C58C1感受态细胞中，同时将-80℃保存的携带pC101和pC301的农杆菌菌种于LB平板(含50μg/ml Kan，100μg/ml Rif)上划线，28℃培养48h左右。挑取LB平板上的单菌落接种于3～4ml的LB液体培养基(含50μg/ml Kan，100μg/ml Rif)中，28℃，180rpm培养14～18h；按1:100的比例取200～300μl的菌液转接于20～30ml LB液体培养基(含50μg/ml Kan，100μg/mlRif)中，28℃，180rpm培养10～12h；室温，4000rpm离心10min收集菌体，用2ml浸润缓冲液MMA(10mM MES，pH5.7，10mM MgCl2，200μM AS)悬浮沉淀，用MMA按比例稀释后，用分光光度计测定菌悬液的浓度，用MMA调整菌悬液浓度至最终浓度为OD600＝1.0。
将携带pC101和pC301的菌悬液分别和等体积的携带pC201-2bn81-STTM167与pC201-2bn81-STTM167m的菌悬液混匀后，室温放置3～6h。用无针头的1ml注射器浸润一周大小的本生烟叶片的下表皮。
浸润后的本生烟置于22～24℃，16h白天/8h黑暗的人工气候室中培养3天后取样。
2、STTM167及STTM167m插入片段的检测
取0.1g左右的农杆菌浸润的本生烟叶片，用TRIzol法提取烟草叶片的总RNA，用随机引物Random(NNNNNN)进行反转录，以反转录产物cDNA为模板用引物CMV2F2557及CMV123R(CMV2F2557：5'-AAATCTCAGACTGCTCCGC-3'，见SEQ ID NO.26；CMV123R：5'-AATGGATCCGGTCTCCTTTTGGAG-3'，见SEQ ID NO.27))进行PCR扩增，并对PCR产物进行电泳分析，用pC201-2bN81空载体质粒为对照，检测农杆菌浸润的本生烟叶片中重组CMV病毒携带的外源插入片段是否发生丢失。
3、含CMV病毒汁液的粗提取及针刺接种玉米
(1)分别剪下浸润培养3d后的含有CMV-STTM167及CMV-STTM167m的烟草叶片，按2:1(W/V)的质量体积比加入0.01M预冷的磷酸盐缓冲液和少许金刚砂，在预冷的研磨中研磨，收集匀浆到2ml离心管中。4℃，5000g离心3min，取上清。
(2)取B73种子若干粒，置于去离子水中浸泡40min，以玉米的胚向上摆放，放在去离子水湿润后的吸水纸上，取(1)中离心得到的上清液10-15μl滴在玉米种胚上，并在胚芽的两侧用接种针从60°方向斜向下刺入胚中1-2mm，避免伤到胚芽。实验组含有CMV-STTM167和对照组含有CMV-STTM167m的病毒汁液各针刺接种若干玉米种子。
(3)针刺接种后的种子置于25℃黑暗下催芽2天，将发芽的玉米种子种至营养土中，16h/20℃光照和8h/18℃黑暗培养条件下培养。
4、摩擦接种MCMV
在针刺接种后14天(此时为玉米两叶一心期)，选取生长良好玉米叶片，在第2片叶上撒上少许金刚砂，每棵用20μg粗提纯的MCMV病毒汁液(本实验室保存)进行摩擦接种。将接种后的玉米植株置于16h/24℃光照和8h/22℃黑暗培养条件下继续培养，在MCMV接种后7天检测miR167的沉默效率和对应的MCMV RNA和CP的积累量。
二、玉米幼苗上瞬时沉默miR167对MCMV积累的影响
1、miR167沉默效率检测
MCMV接种后第7天(见图3)，取上部第一片系统侵染叶片，以叶脉为中心平均分为两份，一份用于提取总RNA检测miR167的沉默效果及MCMV基因组积累检测，一部分用于提取蛋白检测MCMV的CP积累水平。提取的总RNA去DNA后，2μg定量反转录为cDNA，以cDNA作为模板，采用康为世纪荧光定量PCR试剂，采用设计65bp的Ubiquitin基因片段作为内参基因，stom-loop RT-qPCR鉴定miR167的相对表达量。
选用miR167沉默效果较好的三株玉米的RNA，采用Northern blot的方式检测miR167的积累水平。以空载体接种的三株玉米的叶片RNA为对照组。
用于鉴定miR167相对量的引物对如下：
zma-miR167 FP：5'-CGGCTGAAGCTGCCAGC-3'；(SEQ ID NO.28)
zma-miR167 RP：5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'(SEQ ID NO.29)。
用于鉴定Ubiquitin基因的引物对如下：
ZmUbi65-F：5'-AGACATCCGATAAAATTGGAACG-3'(SEQ ID NO.30)；
ZmUbi65-R：5'-GGACCATTTCTCGATTTGTGC-3'(SEQ ID NO.31)。
用于miR167的反转录引物：
zma-miR167RT:5'-GTCTCCTCTGGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACCAGAGGAGACTAGATCATGCTG-3'(SEQ ID NO.32)
用于Ubiquitin的反转录引物：
Oligo d(T)：TTTTTTTTTTTTTTTTTT
用于杂交miR167及Ubiquitin的探针如下：
zma-miR167-probe：5’-tAgaTcaTgcTggCagCttCa-3’(SEQ ID NO.33)，大写字母表示该碱基被LNA修饰，5’和3’采用地高辛修饰；
zma-U6-probe：5′-cGatTtgTgcGtgTcaTccTtg-3′(SEQ ID NO.34)，大写字母表示该碱基被LNA修饰，3’采用地高辛修饰。
得到的数据用2-△△CT法进行分析，步骤如下：
对实验组样本(test)和对照组样本(calibrator)，用参照基因(ref)的CT值归一目标基因(target)的CT值：
△CT(test)＝CT(target,test)-CT(ref,test)；
△CT(calibrator)＝CT(target,calibrator)-CT(ref,calibrator)；
其次，用对照组样本的△CT值归一实验组样本的△CT值：
△△CT＝△CT(test)－△CT(calibrator)；
最后，计算表达水平比率：
2-△△CT＝表达量的比值。
结果表明，与对照组相比，RT-qPCR检测表明瞬时沉默使得miR167积累量下调了40％左右；同时用Northern blot检测显示miR167积累量下调了64％左右。
2、MCMV积累量检测
根据得到的miR167的沉默结果，选取对应沉默效果较好的RNA样品以及对照的RNA样品，采用Northern blot进一步检测MCMV的基因组的积累水平。同时选取对应的另一半叶片的样品进行提取总蛋白，以MCMV CP抗血清为一抗，AP标记的羊抗兔为二抗，进行Westernblot分析。结果表明，在有效沉默miR167的植株上，MCMV的基因组以及CP的积累量明显增加，说明沉默miR167导致了MCMV复制和增殖量显著增加(见图4)。这些结果表明玉米中miR167在抵抗MCMV侵染中发挥重要作用。
实施例2原生质体中瞬时沉默和过表达miR167对MCMV积累影响
一、培育被MCMV侵染的黄化苗
1、MCMV粗提取液准备
取实验室保存的毒源，以1:1(W/V)加入0.01M的磷酸盐缓冲液和少许金刚砂，在预冷的研钵中研磨成匀浆。获得的匀浆5000rpm离心3min，取上清备用。
2、针刺接种MCMV
挑选较扁平的玉米种子，置于去离子水中浸泡40分钟，胚朝上放置于被水浸湿的吸水纸上。采用如上提到的CMV的针刺接种方法进行针刺接种，接种完成的种子置于25℃进行黑暗培养并保湿。2天后，发芽的种子种于营养土中，并继续放置于黑暗培养。
二、转化质粒的准备
1、pMDC32-STTM167载体及其对照pMDC32-STTM167m的制备；用组合pMDC32-STTM167F和pMDC32-STTM167R以及组合pMDC32-STTM167mF和pMDC32-STTM167mR组成的引物和48nt的模板进行PCR扩增获得目标产物。
pMDC32-STTM167F：
5'-AGGATCCCCGGGTACCTAGATCATGCTCTAGGCAGCTTCAGTTGTTGTTGTTATGG-3'；(SEQID NO.16)
pMDC32-STTM167R：
5'-TGCCACCTCCACTAGTTGAAGCTGCCTAGAGCATGATCTAATTCTTCTTCTTTAGACCA-3'；(SEQ ID NO.17)
pMDC32-STTM167mF：
5'-AGGATCCCCGGGTACCTAGGTCGGGGTCTAGGCAACTAGTGTTGTTGTTGTTATGG-3'；(SEQID NO.18)
pMDC32-STTM167mR：
5'-TGCCACCTCCACTAGTACTAGTTGCCTAGACCCCGACCTAATTCTTCTTCTTTAGACCA-3'；(SEQ ID NO.19)
STTM-48nts：
GTTGTTGTTGTTATGGTCTAATTTAAATATGGTCTAAAGAAGAAGAAT。
2、pGD528amiR167载体及其对照载体pGD528amiRgfp载体的制备：用组合pGD528amiR167F和pGD528amiR167R以及组合pGD528amiRgfpF和pGD528amiRgfpR组成的引物和167-58nt或gfp-58nt的模板进行PCR扩增获得目标产物。
pGD528amiR167F：5’-GAATTCTGCAGTCGACG CTGTAGCAGCAGCAGTGAAGCTGCCAGCATGATCTACAGGAG-3’(SEQ ID NO.20)
pGD528amiR167R：5’-TAGATCCGGTGGATCC GCCTAGCAGCAGGAATGAAGCTGCCAGCATGATCTAAGAGAGG-3’(SEQ ID NO.21)
167-58nt：5’-ATGATCTACAGGAGATTCAGTTTGAAGCTGGACTTCACTTTTGCCTCTCTTAGATCAT-3’(SEQ ID NO.22)
pGD528amiRgfpF：5’-GAATTCTGCAGTCGACG CTGTAGCAGCAGCAGTTAAGGGTAAGTTTTCCGCAT CAGGAG-3’(SEQ ID NO.23)
pGD528amiRgfpR：5’-TAGATCCGGTGGATCC GCCTAGCAGCAGGAATTAAGGGTAAGTTTTCCGCAT AGAGAGG-3’(SEQ ID NO.24)
167-58nt：5’-TTCCGCATCAGGAGATTCAGTTTGAAGCTGGACTTCACTTTTGCCTCTCTATGCGGAA-3’(SEQ ID NO.25)
3、将步骤1和2扩增得到的片段分别连接到经过双酶切pMDC32(Kpn I/Spe I)和pGD(Sal I/BamH I)的载体上，得到重组质粒pMDC32-STTM167、pMDC32-STTM167m、pGD528amiR167和pGD528amiRgfp(见图5)。
将以上构建的载体质粒：pMDC32-STTM167、pMDC32-STTM167m、pGD528amiR167和pGD528amiRgfp分别转化到DH5α中，阳性菌落用于提取质粒。
三、玉米原生质体的提取及转化
玉米原生质体的提取和转化参考文献中报道的方法：Zhu,M.et al.MaizeElongin C interacts with the viral genome-linked protein,VPg,of Sugarcanemosaic virus and facilitates virus infection.New phytologist 203,1291-1304,doi:10.1111/nph.12890(2014).
制备的原生质体使用适量MMG溶液悬浮原生质体使其浓度达到1×106个/ml；在2ml离心管中加入10μl(约10-20μg)待转化的质粒，100μl原生质体，轻轻混匀后加入110μlPEG4000溶液，轻轻混匀，23℃孵育15min；加入400μl W5溶液，混匀后于室温150g离心2min，去上清；最后加入1ml W5溶液轻轻悬浮原生质体，25℃黑暗培养24h。
四、miR167及MCMV积累量检测
对miR167的检测：取转化的原生质体，提取RNA，用Northern blot检测miR167的水平。结果表明，miR167在pMDC32-STTM167转化的原生质体中比pMDC32-STTM167m转化的原生质体中下调了42％，而miR167在pGD528amiR167转化的原生质体中比pGD528amiRgfp转化的原生质体中上调了4.76倍(见图5)。表明使用该方法能够在玉米原生质体中成功调节miR167的水平。
对MCMV基因组的检测：提取原生质体RNA，并用Northern blot检测MCMV基因组积累水平。结果发现沉默miR167的原生质体中MCMV基因组上调1.40倍，而过表达miR167的原生质体MCMV基因组下调了28％(见图5)。说明miR167表达水平的的改变影响了MCMV基因组的积累水平。
对MCMV的CP进行检测：提取原生质体总蛋白，并用Western blot检测MCMV的CP水平。发现沉默miR167的原生质体MCMV的CP上调1.30倍，而过表达miR167的CP没有明显变化(见图5)。
以上结果说明，在原生质体中沉默miR167导致MCMV积累增加，过表达miR167则降低MCMV积累。表明miR167在玉米中发挥抗MCMV侵染的作用。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国农业大学
<120> 一种抗玉米病毒的小RNA
<130> KHP191116599.2
<160> 34
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ugaagcugcc agcaugaucu a 21
<210> 2
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ugaagcugcc agcaugaucu a 21
<210> 3
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ugaagcugcc agcaugaucu a 21
<210> 4
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ugaagcugcc agcaugaucu a 21
<210> 5
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ugaagcugcc agcaugaucu ga 22
<210> 6
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ugaagcugcc agcaugaucu ga 22
<210> 7
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ugaagcugcc agcaugaucu ga 22
<210> 8
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ugaagcugcc agcaugaucu ga 22
<210> 9
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ugaagcugcc agcaugaucu ga 22
<210> 10
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ugaagcugcc agcaugaucu ga 22
<210> 11
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
atgtccgagt ctgagtagat catgctctag gcagcttcag ttgttgttgt tatgg 55
<210> 12
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
aaggggaggt tctagtgaag ctgcctagag catgatctaa ttcttcttct ttagacca 58
<210> 13
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gttgttgttg ttatggtcta atttaaatat ggtctaaaga agaagaat 48
<210> 14
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<210> 15
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<212> DNA
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aaggggaggt tctagactag ttgcctagac cccgacctaa ttcttcttct ttagacca 58
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aggatccccg ggtacctaga tcatgctcta ggcagcttca gttgttgttg ttatgg 56
<210> 17
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tgccacctcc actagttgaa gctgcctaga gcatgatcta attcttcttc tttagacca 59
<210> 18
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
aggatccccg ggtacctagg tcggggtcta ggcaactagt gttgttgttg ttatgg 56
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<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
tgccacctcc actagtacta gttgcctaga ccccgaccta attcttcttc tttagacca 59
<210> 20
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gaattctgca gtcgacgctg tagcagcagc agtgaagctg ccagcatgat ctacaggag 59
<210> 21
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
tagatccggt ggatccgcct agcagcagga atgaagctgc cagcatgatc taagagagg 59
<210> 22
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
atgatctaca ggagattcag tttgaagctg gacttcactt ttgcctctct tagatcat 58
<210> 23
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
gaattctgca gtcgacgctg tagcagcagc agttaagggt aagttttccg catcaggag 59
<210> 24
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
tagatccggt ggatccgcct agcagcagga attaagggta agttttccgc atagagagg 59
<210> 25
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
ttccgcatca ggagattcag tttgaagctg gacttcactt ttgcctctct atgcggaa 58
<210> 26
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
aaatctcaga ctgctccgc 19
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<212> DNA
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aatggatccg gtctcctttt ggag 24
<210> 28
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
cggctgaagc tgccagc 17
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gtgcagggtc cgaggt 16
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
agacatccga taaaattgga acg 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ggaccatttc tcgatttgtg c 21
<210> 32
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
gtctcctctg gtgcagggtc cgaggtattc gcaccagagg agactagatc atgctg 56
<210> 33
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
tagatcatgc tggcagcttc a 21
<210> 34
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
cgatttgtgc gtgtcatcct tg 22

Claims (5)

1.一种小RNA或其表达促进剂或含有所述小RNA的生物材料在提高植物抗病毒能力中的应用，所述小RNA为miR167，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1-10任一所示；所述病毒为玉米褪绿斑驳病毒MCMV，所述植物为玉米。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述生物材料为表达盒、表达载体、工程菌。
3.一种小RNA或其表达促进剂或含有所述小RNA的生物材料在制备抗病能力高的转基因植物中的应用，所述的病为由玉米褪绿斑驳病毒MCMV单独侵染及与其他病毒复合侵染所致的植物病害，所述小RNA为miR167，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1-10任一所示；所述植物为玉米。
4.一种小RNA的表达促进剂在制备提高玉米抗褪绿斑驳病毒感染能力的小分子农药中的应用，所述小RNA为miR167，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1-10任一所示。
5.含有检测小RNA的特异性引物或探针的试剂盒在筛选培育抗玉米致死性坏死病的玉米品系中的应用，所述小RNA为miR167，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1-10任一所示，所述致死性坏死病是由褪绿斑驳病毒MCMV侵染玉米所致。
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