CN115927368A - 一种提高植物抗病性的基因rel及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种提高植物抗病性的基因REL及其应用，属于植物分子生物学与植物遗传工程领域，本发明涉及一种植物源抗病基因REL及其重组表达载体和应用。该基因来源于本氏烟草，具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，其编码的产物氨基酸序列为SEQ ID NO.3。本发明还提供一种重组表达载体，包括本发明所述的基因REL。该基因对烟草抗不同疫霉菌具有关键作用。本发明可以运用在作物育种抗病性改良方面。

Description

一种提高植物抗病性的基因REL及其应用

技术领域

本发明属于植物分子生物学与植物遗传工程领域，具体地说，本发明涉及一种提高植物抗病性的基因REL及其应用。

背景技术

疫霉菌引起的作物病害每年都会给我国农业生产造成巨大的经济损失。其中由致病疫霉(Phytophthora infestans)引起的马铃薯晚疫病，是给农业生产造成毁灭性打击的病害之一，在19世纪中叶，该病导致了爱尔兰大饥荒，造成爱尔兰上百万人死亡，直到目前，致病疫霉引起的晚疫病仍然制约着马铃薯和番茄的生产发展^[1]。此外，大豆疫霉和烟草疫霉也是给农业生产造成巨大经济损失的疫霉菌，对大豆(Phytophthora sojae)、烟草(Phytophthora parasitica)等重要作物(Phytophthora capsici)的生产构成严重威胁^[2]。疫霉菌在田间发病迅速、变异快、危害严重。因此，需要通过改良作物的抗病性进行有效防控。

植物可以通过细胞膜表面的模式识别受体(Pattern Recognition Receptor,PRRs)和胞内免疫识别受体(Nucleotide-Binding Domain and Leucine-Rich-Repeat-Proteins,NLRs)来识别环境中的病原菌，激活免疫反应，抵御病原菌入侵^[3]。基于“基因对基因”假说，胞内NLR基因编码的蛋白与病原菌分泌的效应因子是一一对应的识别关系，即NLR编码的抗病蛋白只能特异性地识别病原菌分泌的效应分子，但是病原菌很容易通过自身的变异来逃避这种识别。效应分子突变之后，植物体内的NLR抗病蛋白的抗病功能就丧失了^[4]。病原模式分子(Microbe-associated molecular pattern,MAMP)是病原菌组成或者发挥功能组分的一类高度保守的免疫反应激发子，植物细胞膜上的模式识别受体PRRs能识别病原模式分子MAMPs，触发下游不同的信号途径，诱导活性氧的迸发、坏死反应(HR)等，从而抵御病原菌的入侵^[5-6]。目前已鉴定克隆到的识别受体有细菌鞭毛蛋白的识别受体FLS2和真菌细胞壁几丁质的识别受体CERK1等^[7-8]。FLS2和CERK1是通过识别细菌鞭毛蛋白和真菌细胞壁的几丁质来激活植物的免疫反应，并且细菌的鞭毛蛋白和真菌细胞壁的几丁质都是对细菌和真菌的生长及致病性非常重要的成分，在进化的过程中很难发生变异，因此，植物细胞膜上的模式识别受体所介导的免疫反应具有广谱性和持久性的特点^[9]。所以通过筛选病原菌MAMPs的识别受体，并利用抗病基因工程技术对这些受体进行改造，来获得更加广谱高效的抗病品种，已经成为植物抗病育种中更具前景的防治方法。

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发明内容

本发明的目的之一在于提供一种基因REL。

本发明目的之二在于提供一种含有REL基因的重组表达载体。

本发明目的之三在于提供基因REL的应用。

本发明内容具体详述如下：

本发明提供一种基因REL，该基因来源于烟草，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，或与序列SEQ ID NO.1具有80％以上同源性的来源于烟草的具有提高植物抗病性的基因。在一些实施例中，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，或与序列SEQ ID NO.1具有85％以上同源性来源于烟草的具有提高植物抗病性的基因。在一些更具体的实例中，核苷酸序列如SEQID NO.1所示，或与序列SEQ ID NO.1具有90％以上同源性来源于烟草的具有提高植物抗病性的基因，或更进一步与序列SEQ ID NO.1具有95％以上同源性来源于烟草的具有提高植物抗病性的基因。

本发明还提供一种敲除基因REL的片段，sgRNA序列为SEQ ID NO.2。

本发明还提供一种基因REL编码的蛋白质或与基因REL编码的蛋白质相比具有不小于50％相似性的氨基酸序列的蛋白质。在一种具体的实例中，本发明所述的基因REL编码的蛋白质，其氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示，所述的与基因REL编码的蛋白质相比具有不小于50％相似性的氨基酸序列的蛋白质其氨基酸序列为SEQ ID NO.4。也可以为具有不小于80％相似性的氨基酸序列的能够提高植物抗病性的蛋白质；进一步优选的具有不小于85％相似性的氨基酸序列的能够提高植物抗病性的蛋白质，或者具有不小于90％相似性的氨基酸序列的能够提高植物抗病性的蛋白质，或者具有不小于95％相似性的氨基酸序列的能够提高植物抗病性的蛋白质。

利用本发明的基因编码的氨基酸序列，可设计和人工添加信号肽序列以有利于在植物中的表达。

利用本发明的基因编码的氨基酸序列，可以设计和人工合成密码子优化的有利于在植物中表达的核酸序列。

本发明还提供一种包括所述基因REL的重组表达载体。

所述表达载体优选为植物转化质粒，可以为表达载体pBin::eGFP、pCambia或pTF101.1等。

优选的，所述的重组表达载体是将基因REL插入到含有C-端eGFP的双元载体pBin::eGFP酶切位点KpnI中得到的载体pBin::REL-eGFP。

一种转化体，由所述的重组表达载体导入宿主细胞所得，所述的宿主细胞优选大肠杆菌细胞或农杆菌细胞。

扩增所述基因REL的全长或任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

本发明还提供了所述基因REL或其编码的蛋白质或重组表达载体或转化体在提高植物免疫抗性或抗病性中的应用。

本发明还提供了所述基因REL或其编码的蛋白质或重组表达载体或转化体在植物提高致病菌免疫抗性或提高植物抗致病菌引起的病害中的应用。

进一步的，本发明所述致病菌为能够分泌激发子蛋白的致病菌，例如可以为疫霉菌或者腐霉菌，疫霉菌可以包括大豆疫霉、致病疫霉、辣椒疫霉、烟草疫霉等能够引起的植物病害的病原菌。

本发明还提供所述基因REL或其编码的蛋白质或重组表达载体或转化体在培育具有致病菌免疫抗性植物育种中的应用。

本发明还提供所述的烟草基因REL或其编码的蛋白质或重组表达载体或转化体在导入植物后获得显著抗病性的品种中的应用。

在一些实施例中，本发明所述的植物为茄科植物或者豆科植物，例如包括但不限于烟草、辣椒、番茄、马铃薯或大豆。

本研究对烟草中细胞膜受体的分析发现，免疫受体REL参与识别不同疫霉菌和腐霉菌分泌的激发子，对不同疫霉菌和腐霉菌分泌的激发子在植物中诱导的免疫反应起决定性作用。REL基因对烟草识别不同疫霉菌和腐霉菌起着非常重要的作用，另外烟草作为一种重要的经济作物和茄科植物的典型代表，对烟草中REL的研究可带动许多其它茄科植物如辣椒、番茄、马铃薯中细胞膜受体的相关研究。此外，激发子在不同疫霉菌和腐霉中都是保守的，因此REL具有识别不同疫霉菌和腐霉菌的能力。这些研究将能更好的阐明植物对疫霉菌及不同病原菌的抗病功能，可为抗病基因工程育种提供优秀的抗病基因资源。

本发明的有益效果：

本发明所述基因REL编码的蛋白质通过识别病原菌分泌的激发子激活植物先天免疫，从而增强植物抗病性。在植物中过表达不会影响植物生长性状，尤其对疫霉菌的识别具有广谱性，可以显著增强植物对疫霉菌的抗病性，本发明可以运用在作物育种抗病性改良方面，有望提高植物对疫病的抗病性，从而达到增产减药的目的。

附图说明

图1 REL基因的筛选和获得。A，TRV2::REL沉默烟草REL基因表达检测。实时荧光定量PCR检测TRV2::REL处理沉默烟草中REL基因表达量，其中TRV::GFP为对照植物，-1，-2为REL基因沉默的不同植物。B，疫霉菌激发子INF1和不同胞外效应子在沉默烟草上诱导的细胞坏死情况。

图2 REL敲除烟草纯合突变体鉴定。PCR克隆敲除烟草中REL基因sgRNA(基因编辑靶标)处序列，其中WT为野生型烟草，-1，-2为不同REL敲除类型株系。

图3不同疫霉和腐霉菌激发子在REL基因敲除植物上表达产生的细胞坏死症状。Ps:大豆疫霉菌，Pi:致病疫霉菌，PPTG：马铃薯晚疫病菌，Pc:辣椒疫霉菌，Py:寡雄腐霉。

图4 WT和REL基因敲除烟草接种疫霉菌后表现的发病症状。A，接种烟草疫霉3天后的发病症状。B，接种致病疫霉4天后的发病症状。

图5 WT和REL基因敲除烟草接种疫霉菌后生物量检测。A，接种烟草疫霉3天后的生物量。B，接种致病疫霉4天后的生物量。

图6 pBin::eGFP和pBin::REL-eGFP转基因烟草接种疫霉菌后表现的发病症状和蛋白表达检测。Western blot检测对照eGFP和REL-eGFP的表达量，检测抗体为anti-GFP。A,pBin::eGFP和pBin::REL-eGFP在烟草中的蛋白表达检测。B，接种疫霉菌后的发病症状。

图7 pBin::eGFP和pBin::REL-eGFP转基因辣椒接种疫霉菌后表现的发病症状和蛋白表达检测。Western blot检测对照eGFP和REL-eGFP的表达量，检测抗体为anti-GFP。A，pBin::eGFP和pBin::REL-eGFP在辣椒中的蛋白表达检测。B，接种辣椒疫霉3天后的发病症状。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。本发明实施例所涉及引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

以下实施例中所用的烟草疫霉、致病疫霉和辣椒疫霉均为实验室在田间采集分离获得，现保存于本实验室中，发明人和申请人承诺永久向公众提供。

实施例1.REL基因的筛选和获得

利用病毒诱导的基因沉默技术，在烟草叶片中沉默细胞膜类受体基因，处理后的烟草幼苗在温室(21-23℃、14小时光照/10小时黑暗)培养四周后，用疫霉菌激发子INF1、酵母纯化得到的INF1蛋白和不同胞外效应子XEG1、NPP1处理沉默烟草，根据INF1诱导的细胞坏死情况，筛选得到了识别激发子的受体蛋白REL。氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

具体步骤如下：

1)含有沉默载体的农杆菌培养

分别从平板上挑取转染pTRV2::REL载体(REL基因沉默载体)的农杆菌GV3101单菌落,含有pTRV2::GFP载体的对照农杆菌GV3101单菌落以及含有病毒pTRV1的农杆菌GV3101，分别接种到2mL LB液体培养基中(含卡纳50μg/mL、利福平50μg/mL)于恒温摇床上30℃，200rpm培养过夜至OD600为2.0。将过夜培养的GV3101农杆菌液3000g离心5分钟收集菌体。用缓冲液(组分：10mM 2-[N-morpholino]ethanesulfonic acid,10mM MgCl2,200μMacetosyringone pH 5.6)悬浮菌液后离心收集菌体。重复洗3次后，用缓冲液稀释菌液。pTRV1分别与pTRV2::REL和pTRV2::GFP的农杆菌1:1混匀标记为TRV::REL和TRV::GFP，最终浓度各为1.0.

2)烟草中基因沉默

将配好的农杆菌菌液用注射器注射2周龄的烟草幼苗的四片叶片。处理后的烟草幼苗在温室(21-23℃、14小时光照/10小时黑暗)培养四周后检测基因的沉默水平。

参考方法：Dong,Y.,Burch-Smith,T.M.,Liu,Y.,Mamillapalli,P.,Dinesh-Kumar,S.P.2007.A ligation-independent cloning TRV vector for high-throughputvirus induced gene.Plant Physiology,145,1161-1170.

3)REL基因沉默效率检测

选取沉默四周的烟草叶片提取总RNA。总RNA的抽提采用Omega公司RNA提取试剂盒按照说明操作，用分光度计检测RNA含量和质量。

反转录生成第一链：取0.7μg RNA作模板，根据Takara公司PrimeScript反转录酶配套试剂使用说明进行cDNA合成，定容至20μL反应。反转录产物用水进行10倍稀释用于实时定量PCR反应检测基因沉默效率。

实时定量PCR反应：

定量前引物：SEQ ID NO.5

5’-GTCCACCATCGATCTCTCCA-3’

定量后引物：SEQ ID NO.6

5’-GGCATAGTTGTAAGGGAATG-3’

PCR反应体系包含cDNA 5μL，SYBR Premix Ex Taq II(Tli RNase H Plus)10μL,前后引物0.4μL，ROX Reference Dye II 0.4μL,水13.8μL。反应程序：I:95度30秒，II:95度5秒，60度34秒，步骤II反应40个循环。溶解曲线分析程序是：95度15秒,60度1分钟,95度15秒。数据分析采用2-ΔΔCT方法，检测结果如图1A所示。参考文献：Livak,K.J.,andSchmittgen,T.D.(2001).Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method.Methods 25,402-408.

4)农杆菌培养

分别从平板上挑取转染致病疫霉激发子INF1载体、大豆疫霉XEG1载体和樟疫霉NPP1载体的GV3101单菌落,分别接种到2mL LB液体培养基中(含卡纳50μg/mL、利福平50μg/mL)于恒温摇床上30℃，200rpm培养过夜至OD₆₀₀为2.0。将过夜培养的GV3101农杆菌液3000g离心5分钟收集菌体。用缓冲液(组分：10mM 2-[N-morpholino]ethanesulfonic acid,10mMMgCl₂,200μM acetosyringone pH 5.6)悬浮菌液后离心收集菌体。重复洗3次后，用缓冲液稀释菌液，每种菌液稀释最终浓度各为0.2.

5)在沉默的烟草叶片上注射编码XEG1、INF1、NPP1载体的农杆菌和酵母纯化得到的INF1蛋白，注射后烟草于温室(21-23℃、14小时光照/10小时黑暗)培养，注射三天后拍照并记录细胞坏死情况。发现注射XEG1、INF1、NPP1以及纯化的INF1蛋白之后，INF1诱导的细胞坏死在沉默了受体REL基因的烟草叶片上完全消失，如图1B所示，这些结果证明了REL能够特异性识别激发子INF1。

实施例2.在REL敲除烟草上瞬时表达不同疫霉菌和腐霉菌激发子蛋白

1)纯合REL基因敲除烟草的获得

用于敲除REL基因的sgRNA其序列如SEQ ID NO.2(5’-ACAGCTCCTTCAACGAATGTTGG-3’)所示并获得REL敲除烟草，将REL敲除烟草于温室(21-23℃、14小时光照/10小时黑暗)。在每棵烟草上取叶片，液氮速冻后研磨，用DNAsecure Plant Kit(TIANGEN)提取基因组，以提取的基因组为模板，利用PCR扩增sgRNA靶定序列上下游各150bp左右片段。

PCR扩增引物序列：

上游引物：SEQ ID NO.7

(5’-TAGAAATCTAACGTCTCTTTCCG-3’)

下游引物：SEQ ID NO.8

(5’-CCAATACTTGATGTAATGCTCCC-3’)

50μL反应体系为，其中25μl 2×Phanta Max Master Mix,模板gDNA 1μl，加水至50μl；PCR扩增程序为95℃预变性5分钟，95℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸30秒，循环40次，最后72℃延伸10分钟，PCR产物送南京生工公司测序。得到的纯合REL基因敲除烟草的测序结果如图2所示。

2)在REL敲除烟草上瞬时表达不同疫霉菌激发子蛋白

分别从平板上挑取转染大豆疫霉、烟草疫霉、致病疫霉、辣椒疫霉和寡雄腐霉激发子INF1或者INF1同源基因的载体的农杆菌GV3101单菌落,分别接种到2mL LB液体培养基中(含卡纳50μg/mL、利福平50μg/mL)于恒温摇床上30℃，200rpm培养过夜至OD₆₀₀为2.0。将过夜培养的GV3101农杆菌液3000g离心5分钟收集菌体。用缓冲液(组分：10mM 2-[N-morpholino]ethanesulfonic acid,10mM MgCl₂,200μM acetosyringone pH 5.6)悬浮菌液后离心收集菌体。重复洗3次后，用缓冲液稀释菌液，每种菌液稀释最终浓度各为0.2.

2)在6周龄烟草叶片上注射编码不同病原菌激发子载体的农杆菌，注射后烟草于温室(21-23℃、14小时光照/10h黑暗)培养，注射三天后拍照并记录细胞坏死情况。发现注射不同疫霉菌激发子后，其诱导的细胞坏死在敲除受体基因REL烟草叶片上完全消失，如图3所示，这些结果证明了REL对不同疫霉菌分泌的激发子识别具有广谱性。

实施例3.敲除烟草上接种烟草疫霉菌和致病疫霉菌

1)接种烟草疫霉

取敲除烟草置于塑料培养箱中。取平展的叶片中间滴一滴10μL无菌水，并接种直径为5mm的新鲜烟草疫霉菌饼后，密封塑料箱保湿。接种植物首先置于黑暗培养24个小时后置于温室(21-23℃、14小时光照/10小时黑暗)培养。接种三天后拍照并记录叶片发病情况。和对照WT植物相比，敲除REL的叶片接种烟草疫霉菌后产生的病斑显著性增大(图4A)。这些结果证实了REL在烟草抗疫霉菌方面起重要作用。

2)接种致病疫霉

取敲除烟草置于塑料接种盘中。用ddH₂O诱导致病疫霉游动孢子产生，取10μLddH₂O(接种量为1000个游动孢子)接种于烟草叶片上，密封接种盘保湿。接种植物置于黑暗培养96个小时。接种4天后拍照并记录叶片发病情况。和对照WT植物相比，敲除REL的叶片接种致病疫霉菌后产生的病斑显著性增大(图4B)。这些结果证实了REL是烟草抗疫霉菌必须的。

3)疫霉菌生物量检测

裁剪一张能盖住病斑的锡箔纸，在侵染后叶片上以裁剪好的锡箔纸为模板裁剪大小相同的叶片，液氮速冻后研磨，用DNAsecure Plant Kit(TIANGEN)提取基因组，以提取的基因组为模板进行实时定量PCR反应检测生物量。

实时定量PCR反应：

烟草定量前引物：SEQ ID NO.9

5’-AGTATGCCTGGGTGCTTGAC-3’

烟草定量后引物：SEQ ID NO.10

5’-ACAGGGACAGTTCCAATACCA-3’

烟草疫霉定量前引物：SEQ ID NO.11

5’-ATGAACTTCCGCGCTCTGTT-3’

烟草疫霉定量后引物：SEQ ID NO.12

5’-CAGTGACGCGCACGTAGAC-3’

致病疫霉定量前引物：SEQ ID NO.13

5’-GCATTGAGGGGGCGTATT-3’

致病疫霉定量后引物：SEQ ID NO.14

5’-GCGGAAGAAGGAAGATTCGA-3’

PCR反应体系包含cDNA5μL，SYBR Premix Ex Taq II(Tli RNase H Plus)10μL,前后引物0.4μL，ROX Reference Dye II 0.4μL,水13.8μL。反应程序：I:95度30秒，II:95度5秒，60度34秒，步骤II反应40个循环。溶解曲线分析程序是：95度15秒,60度1分钟,95度15秒。数据分析采用2^-ΔΔCT方法，检测结果如图5所示，A图是接种烟草疫霉3天后的烟草疫霉生物量。B图是接种致病疫霉4天后的烟草疫霉生物量。参考文献：Livak,K.J.,andSchmittgen,T.D.(2001).Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2^-ΔΔCT method.Methods 25,402-408.

结果表明：敲除REL基因后，烟草疫霉侵染定殖的生物量大大提高。

实施例4.REL基因的克隆与序列结构分析

烟草()种子直接播于装有营养土的的花盆中，温室(21-23℃、14小时光照/10小时黑暗)培养，六周龄植株用于RNA的提取。

总RNA提取：以烟草叶片为材料，总RNA的抽提采用Omega公司RNA提取试剂盒按照说明操作，用分光度计检测其RNA含量和质量。

反转录生成第一链：取0.7μg RNA作模板，根据Takara公司PrimeScript反转录酶配套试剂使用说明进行cDNA合成，定容至20μL反应。取适量的反转录产物用于随后的基因克隆PCR。

以cDNA第一链作为RT-PCR模板，常规方法做PCR，扩增REL基因片段或全长基因：

PCR扩增引物序列：

上游引物：SEQ ID NO.15

(5’-ACGATAGCCGGTACCCCCGGGATGGAGTATCATAAATCCGTTTGTG-3’)

下游引物：SEQ ID NO.16

(5’-GCCCTTGCTCACCATCCCGGGGCCTCTTCTTTGAAACTTAGC-3’)，

50μL反应体系为，其中25μl 2×Phanta Max Master Mix,模板cDNA1μl，加水至50μl；PCR扩增程序为95℃预变性5分钟，95℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸1分30秒，循环40次，最后72℃延伸10分钟；琼脂糖凝胶上进行电泳分离，溴化乙锭(EB)染色照相，记录结果，并切胶回收REL PCR产物。用Agarose Gel DNAPurification Kit(TaKaRa)对电泳条带进行回收。切胶回收的REL的PCR产物根据ClonExpress II One Step Cloning Kit(Vazyme)按照说明操作连接到KpnI酶切的pBin::eGFP载体上得到pBin::REL-eGFP质粒，转化大肠杆菌感受态细胞JM109，涂LB(含卡纳50μg/mL)平板，37℃培养16小时后菌落PCR验证挑取三个克隆按照质粒提取试剂盒操作(Takara)提取质粒，送南京生工公司测序，序列如SEQ ID NO.1。测序正确的质粒电击转化到农杆菌GV3101中，涂LB(含卡纳50μg/mL，利福平50μg/mL)平板，30℃培养48小时后菌落PCR验证挑取正确克隆进行后续实验。

实施例5.烟草中瞬时表达REL基因

1)农杆菌培养

分别从平板上挑取转染pBin::REL-eGFP载体(REL基因双元表达载体，部分序列如SEQ ID NO.1)及pBin::eGFP载体(部分序列如SEQ ID NO.17)的农杆菌GV3101单菌落，以及沉默抑制子P19，分别接种到2mL LB液体培养基中(含卡纳50μg/mL、利福平50μg/mL)于恒温摇床上30℃，200rpm培养过夜至OD₆₀₀为2.0。将过夜培养的GV3101农杆菌液3000g离心5分钟收集菌体。用缓冲液(组分：10mM 2-[N-morpholino]ethanesulfonic acid,10mM MgCl₂,200μM acetosyringone pH 5.6)悬浮菌液后离心收集菌体。重复洗3次后，用缓冲液稀释菌液。P19和pBin::REL-eGFP或pBin::eGFP的农杆菌1:1混匀，最终浓度各为0.6.

2)烟草中瞬时表达REL

将配好的农杆菌用注射器注射到烟草叶片中，注射后烟草于温室(21-23℃、14小时光照/10小时黑暗)培养。

3)REL蛋白累计量检测

收集注射两天后的烟草叶片进行蛋白累计量的检测。将收集的烟草叶片液氮速冻后研磨加入蛋白提取液(组分为：150mM NaCl,50mM Tris-HCl pH 7.5,10mMethylenediaminetetraacetic acid,1.0％(v/v)NP-40,1mM phenylmethylsulfonylfluoride,and 1.0％(v/v)protease inhibitor cocktail)混匀至于冰上30分钟。18000g离心收集上清液80μL加入20μL 5倍蛋白上样缓冲液混合均匀后沸水浴10分钟。取20μL样品在SDS-PAGE凝胶上进行电泳分离，120V跑胶1.5小时。反应结束后将蛋白样品转到PVDF膜上，用5％PBST牛奶孵育封膜。加入1:5000稀释的GFP一抗(Abmart)孵育2小时后用PBST洗膜5分钟三次，随后加入1:10000稀释的鼠抗(LI-COR,irdye 800,926-32210)孵育30分钟后用PBST洗膜5分钟三次，扫膜拍照(图6A)。

4)过表达REL显著性增强烟草对疫霉菌抗病性

在烟草中表达REL两天后，叶片接种辣椒疫霉和烟草疫霉。分别在接种2天和3天进行发病症状观察(图6B)，拍照记录结果。与阴性对照相比，过表达REL的烟草在接种两种不同疫霉菌后均出现病斑显著性减小，这些结果证明过表达REL显著性提高烟草对不同疫霉菌的抗病性。

实施例6.辣椒中表达REL基因提高对辣椒疫霉菌的抗性

1)农杆菌培养

分别从平板上挑取转染pBin::REL-eGFP载体(REL基因双元表达载体，部分序列如SEQ ID NO.1)及pBin::eGFP载体(部分序列如SEQ ID NO.17)的农杆菌GV3101单菌落，以及沉默抑制子P19，分别接种到2mL LB液体培养基中(Kan 50μg/mL、Rif 50μg/mL)于恒温摇床上30℃，200rpm培养过夜至OD₆₀₀为2.0。将过夜培养的GV3101农杆菌液3000g离心5分钟收集菌体。用缓冲液(组分：10mM 2-[N-morpholino]ethanesulfonic acid,10mM MgCl₂,200μMacetosyringone pH 5.6)悬浮菌液后离心收集菌体。重复洗3次后，用缓冲液稀释菌液。P19和pBin::REL-eGFP或pBin::eGFP的农杆菌1:1混匀，最终浓度各为0.6.

2)辣椒中瞬时表达REL

将含有pBin::REL-eGFP载体或pBin::eGFP载体的农杆菌注射到辣椒叶片中，注射后辣椒于温室(21-23℃、14小时光照/10小时黑暗)培养。

3)REL蛋白累计量检测

收集注射两天后的辣椒叶片进行蛋白累计量的检测。将收集的辣椒叶片液氮速冻后研磨加入蛋白提取液(组分为：150mM NaCl,50mM Tris-HCl pH 7.5,10mMethylenediaminetetraacetic acid,1.0％(v/v)NP-40,1mM phenylmethylsulfonylfluoride,and 1.0％(v/v)protease inhibitor cocktail)混匀至于冰上30分钟。18000g离心收集上清液80μL加入20μL 5倍蛋白上样缓冲液混合均匀后沸水浴10分钟。取20μL样品在SDS-PAGE凝胶上进行电泳分离，120V跑胶1.5小时。反应结束后将蛋白样品转到PVDF膜上，用5％PBST牛奶孵育封膜。加入1:5000稀释的GFP一抗(Abmart)孵育2小时后用PBST洗膜5分钟三次，随后加入1:10000稀释的鼠抗(LI-COR,irdye 800,926-32210)孵育30分钟后用PBST洗膜5分钟三次，扫膜拍照(图7A)。

4)过表达REL显著性增强辣椒对疫霉菌抗病性

在辣椒叶片中表达REL两天后接种辣椒疫霉。在接种3天进行发病症状观察(图7B)，拍照记录结果。与阴性对照相比，过表达REL的辣椒在接种辣椒疫霉后表现出病斑显著性减小，这些结果证实了过表达REL显著性提高辣椒对疫霉菌的抗病性。

Claims (10)

1.一种增强植物抗病性的基因REL，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示或与序列SEQ ID NO.1具有70％以上同源性的来源于烟草的具有提高植物抗病性的基因；优选的，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示或与序列SEQ ID NO.1具有80％以上同源性的来源于烟草的具有提高植物抗病性的基因；进一步优选的，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示或与序列SEQ ID NO.1具有85％以上同源性的来源于烟草的具有提高植物抗病性的基因；更优选的，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，或与序列SEQ ID NO.1具有90％以上同源性的来源于烟草的具有提高植物抗病性的基因。

2.权利要求1所述基因REL编码的蛋白质或与权利要求1所述基因REL编码的蛋白质相比具有不小于80％相似性的氨基酸序列的蛋白质。

3.根据权利要求2所述的蛋白质，其特征在于氨基酸序列为SEQ ID NO.3或SEQ IDNO.4或这些氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且能提供植物抗病性的由他们衍生的蛋白质。

4.一种包含权利要求1所述基因REL的重组表达载体。

5.权利要求4所述重组表达载体，其特征在于是将权利要求1所述的基因REL插入到含有C-端eGFP的双元载体pBin-GFP酶切位点KpnI中得到的载体pBin::REL-eGFP。

6.一种转化体，其特征在于由权利要求4所述的重组表达载体导入宿主细胞所得，所述的宿主细胞优选大肠杆菌细胞或农杆菌细胞。

7.权利要求1所述基因REL、权利要求2或3所述的蛋白质、权利要求4或5所述重组表达载体或权利要求6转化体在提高植物免疫抗性或抗病性中的应用。

8.权利要求1所述基因REL、权利要求2或3所述的蛋白质、权利要求4或5所述重组表达载体或权利要求6转化体在提高植物致病菌免疫抗性或提高植物抗致病菌引起的病害中的应用；优选的，所述致病菌为疫霉菌或者腐霉菌；优选的，所述疫霉菌为致病疫霉、大豆疫霉、辣椒疫霉或烟草疫霉。

9.权利要求1所述基因REL、权利要求2或3所述的蛋白质、权利要求4或5所述重组表达载体或权利要求6转化体在培育具有致病菌免疫抗性植物育种中的应用；优选的，所述致病菌为疫霉菌或者腐霉菌；优选的，所述疫霉菌为致病疫霉、大豆疫霉、辣椒疫霉或烟草疫霉。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，将权利要求1所述基因REL、权利要求2或3所述的蛋白质、权利要求4或5所述重组表达载体或权利要求6转化体导入植物后获得致病菌免疫抗性的品种，所述植物优选为烟草、辣椒、番茄、大豆或马铃薯；优选的，所述致病菌为疫霉菌或者腐霉菌；优选的，所述疫霉菌为致病疫霉、大豆疫霉、辣椒疫霉或烟草疫霉。

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