CN105177001B - 与大麦抗白粉病相关的miR167d及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了与大麦抗白粉病相关的miR167d及其应用，属于基因工程领域与作物分子生物学领域。本发明的miR167d来源于大麦，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其靶标基因是ARF1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明发现在大麦表皮细胞中瞬时过表达能够使大麦细胞对白粉菌的抗性减低，本发明还发现ARF1基因的表达受miR167d的负向调控，负向调控ARF1基因表达的miR167d可以正向调控大麦对白粉病菌的抗性。本发明提供的与大麦抗白粉病相关的miR167d可用于大麦种质资源的改良及遗传育种领域，还可用于培育抗白粉病的大麦品种，具有良好的市场应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及作物分子生物学和分子育种领域，更具体地，涉及与大麦抗白粉病相关的miR167d及其应用。
背景技术
大麦是在全球广泛种植的主要粮食作物之一，其世界播种面积仅次于小麦、水稻和玉米，位列第四。大麦可做食品、饲料和啤酒酿制原料，具有重要的经济价值。大麦白粉病(barley powdery mildew)是大麦主要的真菌病害之一，由布氏白粉菌大麦专化型(Blumeria graminis f.sp.hordei)引起。该病原真菌属子囊菌纲白粉菌目，主要在宿主大麦叶片表皮细胞内专性活体寄生，可侵害大麦植株的地上部各器官，但以叶片和叶鞘为主，发病重时大麦茎秆和穗部也受侵害(1994,Crit.Rev.Plant Sci.)。大麦白粉病多发生在潮湿和半潮湿地区，分布于世界各大麦产区。在欧洲各国、北美东部和南部地区、日本等地，以及中国的贵州、四川和东南沿海等大麦种植区域均有普遍发生，一般可造成20％-25％的产量损失，而在病害流行的年份里严重损失可达30％。近年来，由于大麦品种单一化、高度密植和过量施用氮肥等栽培因素，使得大麦白粉病发病日趋严重。
目前全球大麦白粉病的防治工作主要通过施用化学农药完成。三唑类(triazole)杀菌剂是有机杂环类化合物，是近四十年来针对麦类白粉病开发的广谱、内吸、高效的化学杀菌剂，适用范围广、使用方法灵活，对大麦白粉病的防治效果较好。三唑类杀菌剂的作用机制是抑制病原真菌麦角甾醇的生物合成，使菌体细胞膜结构和功能受到破坏，进而抑制或干扰菌体附着胞及吸器的发育、以及菌丝和孢子的形成，降低病原真菌致病力。麦类作物应用三唑类杀菌剂防治白粉病至今已有四十多年的历史，白粉病菌对三唑类化合物已产生抗性在国内外均有研究和报道。三唑类杀菌剂不仅有杀菌作用，还有植物生长调节作用，因此在使用过程中常有药害发生，影响作物的产量和品质。同时，大量使用化学杀菌剂会对环境造成污染，并对人畜饮食安全和健康形成潜在的威胁。
筛选、培育和种植抗病品种，是防治大麦白粉病的另一重要途径，而发现和鉴定大麦抗白粉病基因则是抗病育种工作中的重要一环。大麦对白粉病的抗性包括：一，依赖小种专化抗性抗病基因(如MLA基因)产生的特异性抗性(Shen et al,2007,Science)；二，依赖非小种专化抗性抗病基因(如mlo基因)产生的广谱抗性(Acevedo-Garcia et al,2014,NewPhytol.)；三，依赖非小种专化抗性抗病基因产生的部分抗性。通过传统育种方式和分子标记辅助筛选相结合，可以加速将大麦白粉病抗病基因向栽培品种中导入。
大麦白粉病菌具有许多生理小种；主栽的大麦抗病品种的白粉病抗性往往与当地的白粉菌优势生理小种不同，因此不能产生有效的小种专化抗性。而且大麦白粉病菌变异速度快，使得许多一时有效的小种专化抗性抗病基因在短时间内丧失抗性，成为选育和推广大麦抗病品种过程中育种工作者一直未能解决的难题。虽然运用mlo基因可以使大麦对白粉菌产生高效的广谱抗性，但是同时也会加速作物的细胞凋亡、降低作物对其他病害的防御能力，最终影响作物产量，因此在抗性育种中的应用mlo基因也具有很大的局限性(Acevedo-Garcia et al,2014,New Phytol.)。近年来，基因沉默(RNA interference,RNAi)技术在农作物防治病虫害领域已经获得了广泛的应用(Koch and Kogel,2014,PlantBiotechnol.J.)，但是过量表达的小RNA所负向调控的靶标基因大多来自有害生物(如病毒、细菌、真菌、线虫和昆虫等)。
MicroRNA(miRNA)是一类长度一般约为21个核苷酸的小RNA分子，来源于一条能够形成茎环结构的单链RNA前体，并能通过碱基的互补配对靶向特异的靶标基因，对该基因的表达进行负向调控。在植物中，miRNA不仅参与对植株生长发育的调控和对非生物胁迫的耐受，也参与抵御外界病原菌侵染等生物胁迫过程。miRNA的表达量会在植物与病原菌的相互作用中发生显著变化，而miRNA合成缺陷突变体对病原菌入侵表现更为敏感，说明miRNA在植物防御体系中是必要的功能元件，对植物抗病反应具有重要的调控作用(Weiberg etal,2014,Annu.Rev.Phytopathol.)。例如在拟南芥中，miR393靶向生长素信号的重要受体TIR1、AFB2和AFB3，抑制生长素的信号传递过程，并增强植物对假单胞菌的抗性(Navarroet al,2006,Science)。近年来越来越多的证据表明，miRNA在多种作物针对多种病原菌的抗病过程中起重要的调节作用。运用microRNA序列调控作物自身基因来达到防治真菌病害目的的应用性研究尚鲜有报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种与大麦抗白粉病相关的miRNA。
本发明的另一目的在于提供该miRNA在提高大麦抗白粉病抗性中的用途。
本发明首先发现一种miRNA在白粉菌侵染大麦过程中的表达量发生明显变化，该miRNA命名为miR167d，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明在接种白粉菌的大麦叶片样品中利用stem-loop real-time qPCR的方法检测了miR167d的表达丰度，发现miR167d的表达量在大麦-白粉菌亲和和非亲和相互作用中均显著升高。
因此，本发明提供了与大麦抗白粉病相关的miRNA，其为miR167d，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
miR167d前体的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明利用psRNATarget分析平台预测了miR167d在大麦中的靶标基因，发现一个转录因子ARF1基因可能是miR167d的靶标基因，然后通过烟草共表达实验发现过表达miR167d可以显著降低ARF1蛋白的积累水平，从而证明了ARF1的确为miR167d的靶标基因，而且其表达受miR167d的负向调控。miR167d的靶标基因ARF1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
含有本发明的与大麦抗白粉病相关的miR167d的表达载体也属于本发明的保护范围。
本发明利用基因枪法在大麦表皮细胞中瞬时过表达miR167d的靶标基因ARF1，发现大麦细胞对白粉菌的抗性减低，在非亲和相互作用中尤其显著，表现为白粉菌的吸器指数显著升高，说明ARF1基因是大麦抗白粉病的负调因子，而负向调控ARF1基因表达的miR167d可以正向调控大麦对白粉病菌的抗性。
进一步地，本发明提供了miR167d或其表达促进剂或含有其的表达载体在负向调控ARF1基因中的应用。
更进一步地，本发明提供了miR167d或其表达促进剂或含有其的表达载体在提高植物抗白粉病抗性中的应用。
优选地，所述植物为大麦。
进一步地，本发明提供了miR167d或其表达促进剂或含有其的表达载体在作物种质资源改良中的应用。
优选地，所述作物为大麦。
本发明提供了miR167d或其表达促进剂或含有其的表达载体在制备转基因大麦中的应用。
本发明提供了用于克隆miR167d的PCR特异性引物对，上游引物如SEQ ID NO.7所示，下游引物如SEQ ID NO.8所示。
本发明提供了含有上述特异性引物对的试剂盒在筛选培育抗白粉病大麦中的应用。
本发明发现ARF1基因是大麦抗白粉病的负调因子，其过表达能够降低大麦抗白粉病抗性。
因此，本发明还提供了ARF1基因的过表达在降低大麦抗白粉病抗性中的应用。所述ARF1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示。
本发明还提供了克隆ARF1基因的特异性PCR引物对，其上下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5、6所示。
本发明通过对miRNA表达谱的分析，发现miR167d在白粉菌侵染大麦过程中表达量显著上升，说明miR167d参与大麦防御白粉病菌侵染的过程并发挥生物学功能；本发明通过在植物中同时过量表达miR167d及其靶标基因ARF1，发现过量表达miR167d可以明显抑制ARF1蛋白的积累，说明miR167d靶向ARF1基因并负向调控其表达；通过在大麦表皮细胞中瞬时过表达miR167d的靶标基因ARF1基因并接种白粉病菌，发现大麦对白粉病菌的抗性明显降低，说明miR167d可以增强大麦对白粉菌的抗性。本发明提供的miR167d可广泛应用于大麦遗传育种、种质资源改良和培育抗白粉病的转基因植物领域，对改进和改良大麦等作物的种质资源具有重要作用。
附图说明
图1为白粉菌侵染对大麦miR167d表达水平的影响。用毒性白粉菌小种A6和无毒白粉菌小种K1接种遗传背景含有MLA1基因的大麦品种P01，在接种0、4、16、22和48小时后采集叶片样品，并检测叶片组织中miR167d的相对表达量，进而研究白粉菌侵染对大麦miR167d表达水平的影响。在此，用毒性白粉菌小种A6接种大麦品种P01可以反映出大麦对白粉菌的本底抗性，而用无毒白粉菌小种K1接种大麦品种P01可以反映出大麦对白粉菌的小种专化抗性。
图2为miR167d与ARF1中靶标位点碱基序列的互补情况。图中显示了miR167d核苷酸序列和ARF1基因转录产物mRNA序列中miR167d靶向位点的碱基互补情况，碱基完全互补以竖杠标示。
图3为用于在烟草中过表达miR167d和ARF1基因的载体区段示意图。其中，HA标签融合到ARF1蛋白的C末端，用于通过蛋白印迹法监测ARF1蛋白的积累量；图中箭头标示出ARF1基因中被miR167d靶向的位点。
图4为在烟草中过表达miR167d抑制ARF1蛋白的积累效果图。实验处理中含有该过表达载体时以“+”号标示，不含有该过表达载体时以“-”号标示。利用HA标签的抗体，通过蛋白印迹法检测出HA的积累量代表了其融合蛋白ARF1的积累量，而丽春红染料染色显示了不同实验处理的蛋白样品上样量均匀一致。在检测miR167d表达量的实验中，对作为内参的肌动蛋白的表达量的检测显示了不同实验处理中所用核糖核酸量的情况。
图5为大麦表皮细胞中过表达miR167d的靶标基因ARF1对大麦白粉病菌抗性的影响效果图。白粉菌吸器指数代表了大麦表皮转化细胞的感病性，数值越高说明大麦表皮细胞越感病。其中左图和右图分别为用毒性白粉菌小种A6和无毒白粉菌小种K1接种瞬时过表达了空载体或ARF1基因的、遗传背景中含有MLA1基因的大麦品种P01的叶片后效果图，可以看出过表达miR167d的靶标基因ARF1可导致大麦细胞对白粉菌的本底抗性(左图)和小种专化抗性(右图)均有所下降。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例中使用的大麦品种均为P01，记载在Shen et al,2007,Science中，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所(以下简称为“中科院遗传所”)获得；大麦白粉菌(Blumeria graminis f.sp.hordei)生理小种K1和A6记载在Shen et al,2003,Plant Cell中，公众可从中科院遗传所获得；CTAP载体记载在Baiet al,2012,PLoS Pathog.中，公众可从中科院遗传所获得；pKANNIBAL载体记载在Liu etal,2014,PLoS Genet.中，公众可从中科院遗传所获得；pUbi载体记载在Shen et al,2003,Plant Cell中，公众可从中科院遗传所获得。
实施例1 miR167d在大麦白粉菌侵染大麦过程中的表达谱分析
(1)植物材料的准备。大麦品种P01种子播种后，待长至1周左右，剪下旗叶，叶面朝上，放置于含有培养基(1％琼脂，100mg/L苯丙咪唑)的培养皿上，恢复24小时后分别接种大麦白粉病菌生理小种K1或A6，并分别在接种后不同时间点取叶片材料。
(2)植物总RNA的提取。在液氮中迅速研磨300mg大麦叶片至粉末状，加入1mlTRizol，充分震荡混匀后于4℃12,000rpm离心10min；上清转移到新离心管中，加入1/5TRizol体积的氯仿，混匀后室温静置3min等待其分层，之后于4℃12,000g离心15min。上清转移到新离心管中，先加入上清体积10％的3M醋酸钠(pH 5.2)，混匀后再加入上清体积1倍的异丙醇，混匀后于-20℃中静置60min。4℃10,000g离心15min，弃上清，用75％乙醇洗涤沉淀两次，每次室温静置10min，之后4℃7500rpm离心5min，沉淀在室温下晾置10min。用60μlDEPC水溶解沉淀，获得的植物总RNA。
(3)Stem-loop real-time qPCR的反转录反应。
反应所需的引物：5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCAGAT-3'。(SEQ ID NO.4)
反转录体系为：dNTP 1μl，50nM stem-loop RT primer 1μl，加DEPC H2O至10μl，65℃变性5min，冰上冷却2min；之后加入10×M-MLV buffer 2μl，RNase inhibitor 0.5μl，M-MLV 1μl，总RNA 2μg，加DEPC H2O至20μl。反转录条件为：16℃30min，42℃30min，85℃5min。
(4)Stem-loop real-time qPCR的实验方法参考文献Chen et al,2007,NucleicAcids Res.。按照以下体系配置荧光定量PCR反应液：2x qPCR Mix5μl，100x CXR 0.1μl，10μM正向引物0.2μl，10μM反向引物0.2μl，加ddH2O至10μl。接着，将上述反应液以8μl/管分装到qPCR专用小管中，每管分别加入2μl待测模板cDNA混匀，离心使反应液聚集在管底，盖膜。然后，按照以下程序在ABI荧光定量PCR仪上进行反应：95℃，10min，95℃15sec，60℃1min，40个循环。最后，设置溶解曲线：95℃10sec，65℃1min，-0.2℃阶梯升温，读荧光值，升温至95℃结束。
检测miR167d表达量所需的qPCR引物如下：
正向：5'-TCGCGTGAAGCTGCCAGCATG-3'；(SEQ ID NO.9)
反向：5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'；(SEQ ID NO.10)
用白粉菌小种K1或A6接种含有MLA1基因的大麦品种P01，在0、4、16、22和48小时后收取叶片样品，用Stem-loop real-time qPCR方法可以检测出这些叶片样品中miR167d的相对表达量。实验结果见图1，结果表明，无论是在接种毒性白粉菌小种后的本底抗性中，还是在接种无毒白粉菌小种后的小种专化抗性中，大麦细胞中miR167d的表达丰度都随时间变化有显著上升，说明miR167d参与大麦对白粉病菌的抗性过程并发挥相应的生物学功能。miR167d的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其前体的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
实施例2对miR167d靶标基因ARF1基因的预测及克隆
(1)miRNA靶标基因预测。
对miR167d靶标基因的预测在psRNATarget网站上在线完成，参数设置为默认。(psRNATarget网站地址：http://plantgrn.noble.org/psRNATarget/)ARF1基因被预测为miR167d的靶标基因之一(见图2)。
(2)ARF1基因的克隆。大麦品种P01的7天幼苗接种大麦白粉菌生理小种K1，24小时后取叶片材料，提取RNA后进行反转录获得cDNA。反转录体系和过程如下：RNA 2μg，Oligo-dT 1μl，加DEPC-H2O至12μl，离心管混合上述溶液后于70℃变性10分钟，再于冰上冷却2分钟，之后在离心管中继续加入M-MLV Buffer 2μl，dNTP mix 1μl，RNase inhibitor 0.5μl，M-MLV 1μl，加DEPC-H2O至20μl，于42℃温浴1小时，70℃保温15分钟后获得反转录的cDNA。
克隆ARF1基因的PCR扩增所需的引物如下：
正向：5'-ATGTACCGGGTGAAGAGCGAG-3'；(SEQ ID NO.5)
反向：5'-TTTGAATTCCTCCGACATTTGAC-3'(SEQ ID NO.6)。
PCR反应体系为：KOD buffer 5μl，MgSO42μl，dNTP 5μl，cDNA 2μl，正、反向引物各1μl，KOD plus酶1μl，加H2O至50μl。PCR反应程序为：94℃3min+(94℃30s+58℃30s+68℃90s)×30个循环+68℃10min。
反应得到2676bp的PCR产物，将该PCR产物测序，结果为序列表中序列3所示的核苷酸序列，该序列所示的基因命名为ARF1；该基因编码的蛋白命名为ARF1，该蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列15。
实施例3对miR167d靶向ARF1基因并负向调控其表达的验证
(1)将miR167d及其靶标基因ARF1分别克隆到表达载体pKANNIBAL和CTAP中。
克隆miR167d的PCR扩增所需的引物如下：
正向：5'-GTTCCTCGAGCCGTTCCATATCTTCTAGCCCC-3'；(SEQ ID NO.7)
反向：5'-CCTCAAGCTTTTGAGGGGAAAACAAAACACCG-3'(SEQ ID NO.8)。
克隆ARF1基因的PCR扩增所需的引物如下：
正向：5'-ATGTACCGGGTGAAGAGCGAG-3'(SEQ ID NO.5)；
反向：5'-TTTGAATTCCTCCGACATTTGAC-3'(SEQ ID NO.6)。
在烟草中过表达miR167d和ARF1基因所用的载体中相应的表达框架见图3。
(2)农杆菌的转化。将农杆菌菌株GV3101在LB固体培养基上划线培养，两日后挑取单菌落，在LB培液基中180rpm 28℃过夜培养。过夜培养物扩大培养至OD600为0.5后，将菌液置于冰上30分钟，4℃3000rpm离心15分钟后收集菌体，用10ml 0.15M的预冷NaCl溶液重悬菌体，4℃5000rpm离心10分钟后再次收集菌体。用1ml预冷的20mM CaCl2溶液重悬菌体，加入0.5mL 50％甘油，充分混匀获得农杆菌感受态细胞。在农杆菌感受态细胞中加入表达载体DNA，轻轻吹打混匀，置于冰上30分钟后用液氮速冻1分钟，然后用37℃水浴热激3分钟。加入1ml LB培养液28℃180rpm培养30分钟，涂布于加有相应抗生素的LB固体培养基上，28℃倒置培养2天后挑选克隆，保存农杆菌转化体。
(3)用农杆菌介导miR167d及其靶向ARF1基因在烟草叶片中瞬时共表达。将转化相应表达载体的农杆菌菌株在LB固体培养基上划线，两日后挑取农杆菌单菌落，在LB培养液中230rpm 28℃培养过夜。过夜培养物按1:50转接到8ml LB培养液(含10mM MES及0.02mM乙酰丁香酮)中，继代培养至OD600为1.5后3000rpm离心15分钟收集菌体，重悬菌体至OD600为0.7，24℃避光静置4小时后注射4周大小的烟草(Nicotiana benthamiana)叶片。在烟草叶片中注射转化了miR167d表达载体的农杆菌菌株后保湿培养24h，在注射原位置再次注射转化了ARF1基因表达载体的农杆菌菌株，培养48h后取注射位置的叶片组织，提取总RNA及总蛋白。
(4)miR167d表达量分析及ARF1蛋白积累量分析。对提取的烟草叶片总RNA进行反转录获得cDNA，按照RT-PCR反应体系和条件在不同的循环数下扩增样品的内参基因Actin(肌动蛋白基因)。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，通过DNA条带亮度检验模板量是否一致；若不一致，将产物亮度较高的模板进行一定倍数的稀释，直至产物亮度基本一致。此时，通过RT-PCR反应检测miR167d的表达量(图4)。利用抗HA多克隆抗体，通过蛋白印迹法检测出烟草叶片总蛋白中ARF1蛋白的积累量(图4)。
检测miR167d表达量所需的qPCR引物如下：
正向：5'-TCGCGTGAAGCTGCCAGCATG-3'；(SEQ ID NO.9)
反向：5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'；(SEQ ID NO.10)
内参ACTIN1(肌动蛋白)正向：5'-TGGCACCCGAGGAGCACC-3’；(SEQ ID NO.11)
内参ACTIN1(肌动蛋白)反向：5'-GTAACCTCTCTCGGTGAG-3'。(SEQ ID NO.12)
本实施例通过相应的表达载体，利用农杆菌介导miR167d和ARF1蛋白在烟草中瞬时共表达，并以空载体和ARF1的瞬时共表达作为负对照，研究过表达miR167d对ARF1蛋白积累的影响。实验结果表明，在烟草中通过共注农杆菌法过表达miR167d后，可以显著抑制ARF1蛋白的积累(见图4)，说明miR167d确实靶向ARF1基因并负向调控其蛋白积累量。由于miR167d负向调控ARF1基因的表达量，miR167d在大麦对白粉病抗性中的作用，与ARF1基因在大麦对白粉病抗性中的作用相反。在烟草中可以通过农杆菌介导过量表达miR167d；当共表达空载体和ARF1时，ARF1蛋白有一定数量的积累，而共表达miR167d和ARF1时，ARF1蛋白的积累量有明显下降，说明在烟草中过表达miR167d可抑制ARF1蛋白的积累。
实施例4大麦表皮细胞中过表达miR167d靶标基因ARF1对大麦白粉病菌抗性的研究
(1)将miR167d靶标基因ARF1克隆到克隆载体pENTRY中，并进一步通过LR反应将该基因整合到表达载体CTAP中。
克隆ARF1基因所需的引物如下：
正向：5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGGAGAGAAAGCTCTCCATGT-3'；(SEQID NO.13)
反向：5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCCAAGACAGAACCAACCTACAC-3'。(SEQID NO.14)
(2)基因枪介导的大麦单细胞基因瞬时过表达。取9mg金粉，在65℃烘干4h后加入1ml 70％乙醇，震荡清洗5min，静置15min沉降，离心2秒后弃上清。加入1ml灭菌去离子水后震荡2min，放置1min后离心2秒，弃上清。重复2次后加入1ml 50％甘油，震荡混匀。将准备好的金粉震荡5min后，将质粒DNA与GUS报告基因表达质粒等摩尔混合，加去离子水至5μl；在50μl金粉中加入质粒DNA混合物，在震荡的同时逐滴加入50μl 2.5M CaCl2，然后快速加入20μl 0.1M亚精胺，继续震荡3min。静置1min沉降，离心2秒后弃上清，分别用140μl 70％乙醇和140μl 100％乙醇洗涤，之后加入12μl 100％乙醇后震荡混匀。
使用型号为PDS-1000/He delivery system(Bio-Rad)的基因枪进行轰击。将载体膜放到载体膜支撑盘中，将金粉均匀涂抹在载体膜中央后凉干；将爆破膜片放置到爆破膜片夹盘，固定在加速器上；将载体膜支撑盘加上阻挡网，放置到轰击室第一层，并将载有叶片的平板放在第三层后抽真空，待真空值达到27英寸汞柱后发射轰击。轰击后将叶片在培养皿上摆好，放入人工气候箱静置培养。
(3)接种白粉菌及吸器指数统计。接菌时取带有成熟白粉菌孢子的大麦植株在接受过基因枪轰击的叶片上方轻轻抖动，使孢子均匀下落；静置3min后封好培养皿，放入人工气候箱静置培养。将培养48h的大麦离体叶片浸在GUS染色液中染色，抽真空3次、每次5min，期间轻轻颠倒；37℃温育过夜，之后将叶片浸在脱色液中室温脱色两天。将叶片在清水中清洗1h，在考马斯亮蓝溶液中染色10秒，用水清洗2次；叶片正面朝上放置到载玻片上，滴50％甘油，压上盖玻片，在显微镜下观察。分别统计感病(含有吸器和次级菌丝)和抗病(只有附着胞)的、表达GUS的细胞数目，感病细胞数目与统计细胞数目总和的比值即为吸器指数。
本实验利用基因枪介导在大麦表皮单细胞中瞬时过表达miR167d的靶标基因ARF1，以瞬时过表达空载体为负对照，结合之后的白粉菌接种和吸器指数统计，研究了在大麦表皮细胞中过表达miR167d的靶标基因ARF1对大麦白粉病菌抗性的影响。实验结果表明，在大麦表皮单细胞中用基因枪轰击法过表达miR167d的靶标基因ARF1后，大麦细胞对白粉菌的本底抗性有所下降，表现为在接种毒性白粉菌小种后吸器指数较对照有所上升(图5左图)，而大麦细胞对白粉菌的小种专化抗性明显下降，表现为接种无毒白粉菌小种后吸器指数较对照明显上升(图5右图)，说明ARF1基因是大麦抗白粉病的负调因子，进一步说明miR167d可以正向调节大麦细胞对白粉菌的抗病性。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (3)
1.与大麦抗白粉病相关的miRNA或含有该miR167d的表达载体在提高植物抗白粉病抗性中的应用，所述miRNA为miR167d，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其靶标基因为ARF1基因，ARF1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.与大麦抗白粉病相关的miRNA或含有该miR167d的表达载体在制备转基因大麦中的应用，所述miRNA为miR167d，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其靶标基因为ARF1基因，ARF1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
3.含有SEQ ID NO.7-8所示的特异性引物对的试剂盒在筛选培育抗白粉病大麦中的应用。
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| 小麦白粉菌应答小分子RNA的分离_鉴定及功能分析;潘磊;《中国优秀硕士论文电子数据库》;20121231;摘要，第2.3.2.2部分、表2.2 * |
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