CN116515826A - 一种烟草疫霉诱导的miR6155及其用途 - Google Patents

一种烟草疫霉诱导的miR6155及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN116515826A
CN116515826A CN202310244849.2A CN202310244849A CN116515826A CN 116515826 A CN116515826 A CN 116515826A CN 202310244849 A CN202310244849 A CN 202310244849A CN 116515826 A CN116515826 A CN 116515826A
Authority
CN
China
Prior art keywords
tobacco
mir6155
black shank
resistance
sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202310244849.2A
Other languages
English (en)
Inventor
黄园园
邓可宣
李赜萱
张建奎
吕俊
曾倩
杨石猛
戴秀梅
宗学凤
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Southwest University
Original Assignee
Southwest University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Southwest University filed Critical Southwest University
Priority to CN202310244849.2A priority Critical patent/CN116515826A/zh
Publication of CN116515826A publication Critical patent/CN116515826A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8282—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for fungal resistance
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种烟草疫霉诱导的miR6155及其用途。烟草疫霉诱导的miR6155的前体序列的RNA片段的序列为SEQ ID NO:1所示。其成熟序列的RNA片段的序列如SEQ IDNO:2所示。还公开了含有成熟序列的生物材料，及培育对黑胫病抗性敏感的烟草的方法。本发明通过构建过表达载体和烟草遗传转化，发现miR6155过表达植株显著增强了烟草对黑胫病的抗性。本发明有助于更深入探讨烟草和黑胫病菌互作中miRNA的调控机制，为烟草抗性品种的选育提供新的种质资源，推动烟草抗黑胫病遗传机理和抗病分子育种研究，为增强烟草的黑胫病抗性的分子生物学机制研究提供可靠的材料和数据支撑。

Description

一种烟草疫霉诱导的miR6155及其用途
技术领域
本发明涉及RNA领域，尤其涉及一种烟草疫霉诱导的miR6155及其用途。
背景技术
烟草(Nicotiana tabacum L.)是茄科烟草属植物，具有较高的经济价值。然而由寄生烟草疫霉菌(Phytophthora nicotianae)引发的烟草黑胫病(tobacco black shank)作为一种世界性病害，在世界各地多有发生。烟草黑胫病发病后对烟草毁灭性极强，在烟草种植生产造成了巨大的经济损失。烟草疫霉属于卵菌纲，疫霉属，形状为无色透明的菌丝状，菌丝有较细的分枝，繁殖能力强。烟草疫霉以菌丝或厚垣孢子的形式长期寄生在植物病残体或土壤中，遇到适宜的生长条件时，便会萌发并释放出大量的游动孢子，通过植物气孔和伤口等侵入烟草。烟草黑胫病害一般在高温高湿的环境下爆发，可以在烟草的整个生育期发病，多发于成株期，主要以侵染烟草植株的茎基部和根部为主，在较短的时间内沿茎向上蔓延，导致烟草茎部变黑直至枯萎腐烂，使烟草水分、营养等运输受阻从而使烟草叶片变黄变干，最后整株烟草死亡。烟草疫霉菌在高温高湿环境下传播速度极快，会导致整个烟草种植区遭受病害，毁灭性极强。在烟草幼苗期也会受到黑胫病的干扰，幼苗期的烟草黑胫病最开始从根茎部发病，逐渐蔓延到茎上部，最后病斑面积扩散至整株烟草。当进行漂浮育苗时，空气相对湿度较高，黑胫病病原菌一旦侵染上，就会引起烟苗根部腐烂并迅速扩散到周围的烟苗，造成大规模死亡。针对烟草黑胫病的防治方法主要有以下几种：种植抗病品种、优化栽培管理措施、化学及生物防治等方法来预防和防治烟草黑胫病。传统的病害防治方法存在效率低、农药残留、环境污染等问题。利用黑胫病抗性烟草品种来种植生产是防治烟草黑胫病害最有效的方法之一，因此通过分子生物学方法筛选鉴定更多有效的黑胫病抗病基因，培育生产中可以广泛使用的烟草黑胫病高抗品种十分重要。
MicroRNAs(miRNAs)是一类非编码内源RNA小分子，通过抑制靶基因所编码的蛋白的翻译或者剪切靶基因mRNAs来发挥不同的生物学功能。随着测序技术的快速发展，大量的miRNA被发现，研究者们逐渐获得了关于植物miRNAs生物合成、作用机制以及可能的生物学功能等方面的信息。1993年第一个miRNA lin-4在秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)中被Lee等人发现；第一个植物miRNA即miRl71，发现于拟南芥中。植物miRNA的生物合成过程主要包括以下三个步骤：转录、加工成熟以及功能复合体装配。miRNA的作用方式主要有两种：当其与靶mRNA的序列互补程度较高时，miRNA会介导靶标的切割，使其无法正常翻译，这是植物中miRNA发挥作用的主要方式。但当两者互补程度较低时，miRNA无法介导切割，此时会通过与靶mRNA结合的方式来抑制其翻译。植物miRNAs参与调节植物生长和发育过程，并且广泛参与对生物和非生物胁迫的响应。通过过表达或沉默miRNAs，其在植物中的功能逐渐被揭示。例如，有报道利用高通量测序方法对烟草品种‘红花大金元’的叶片、茎和根的miRNA表达谱进行了综合分析，共鉴定出165个miRNAs，mRNA和miRNA的联合分析揭示了烟草耐盐耐碱胁迫的分子机制。烟草中miRNA对病原菌的响应也有一定研究，发现miRNA和mRNA的表达模式都可以在应对PVY感染时发生变化，可能在烟草对PVY的抗性方面有一定调控作用。然而，目前为止，关于miRNAs在烟草响应烟草疫霉中的作用研究很少。
发明内容
本发明的目的在于提供一种烟草疫霉诱导的miR6155及其用途。
为实现上述目的，本发明提供一种烟草疫霉诱导的miR6155的前体序列的RNA片段，其特征在于，所述序列为SEQ ID NO:1所示。
本发明还提供上述RNA片段的成熟序列的RNA片段，其特征在于，所述序列如SEQID NO:2所示。
本发明还提供一种生物材料，其特征在于，含有SEQ ID NO:2对应的RNA片段。
进一步，生物材料为含有权利要求2所述RNA片段的重组载体，重组细胞，转基因植物组织，转基因植物器官。
本发明还提供SEQ ID NO:1对应的RNA片段或SEQ ID NO:2对应的RNA片段的用途，优选的，所述用途为调控烟草对黑胫病的抗性；更优选的，所述调控烟草对黑胫病的抗性为增强烟草对黑胫病抗性的用途。
本发明还提供一种培育对黑胫病抗性敏感的烟草的方法，其特征在于，包括提高烟草中SEQ ID NO:1对应的RNA片段的表达量和/或SEQ ID NO:2对应的RNA片段的表达量的步骤。
本发明的SEQ ID NO:1所示序列如下：
GCAGGUGUGAUAAGGUUGCCUUGCUCUUGCAUUCUCUUAGAUAAUUUGAUUC AGCUUGCUGCCUGAAUUAAAUUUUUUGGUAGAGAGAAUUCGAGAGCAAGGCUACC UCAUGAUACGUGCAG。
SEQ ID NO:2所示序列如下：
UAAGGUUGCCUUGCUCUUGCA。
以上序列在序列表中用T代替了U。
本发明利用高通量测序技术，鉴定并筛选出一个烟草疫霉诱导的miRNA——miR6155，通过构建过表达载体和烟草遗传转化，发现miR6155过表达植株显著增强了烟草对黑胫病的抗性。本发明有助于更深入探讨烟草和黑胫病菌互作中miRNA的调控机制，为烟草抗性品种的选育提供新的种质资源。本发明推动了烟草抗黑胫病遗传机理和抗病分子育种研究，为增强烟草的黑胫病抗性的分子生物学机制研究提供可靠的材料和数据支撑。
附图说明
图1是本发明实施例1提供的miR6155前体基因PCR扩增产物的检测电泳结果图，M为5000的Maker，1和2为扩增的miR6155前体基因。
图2是本发明实施例2提供的过表达载体的检测电泳结果图，M为5000的Maker，1和2为大肠杆菌阳性质粒。
图3是本发明实施例3提供的瞬时表达结果图，左边为注射EV后接种黑胫病菌形成的病斑面积，右边为注射OE-miR6155后接种黑胫病菌形成的菌斑面积。
图4是本发明实施例4提供的转基因阳性株系T0代培养过程图。
图5是本发明实施例5提供的过表达转基因植株检测结果图，M为5000的Maker，N为阴性对照，1-10为待检测转基因株系。
图6是本发明实施例6提供的miR6155的转录水平验证图。其中A部分是miR6155对烟草疫霉表达模式分析；B部分是miR6155在转基因烟草株系OE-miR6155-9、OE-miR6155-10和野生型HD植株中的表达量图。
图7是本发明实施例7提供的miR6155过表达烟草株系的黑胫病抗性鉴定分析图。其中，A部分是离体叶片接种烟草疫霉48h后的疾病症状；B部分是离体叶片的病变病斑直径统计；C部分是整株植株接种烟草疫霉48h后的疾病症状；D部分是疾病指数统计。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：烟草miR6155前体基因的克隆
参照烟草miR6155前体基因序列设计引物如下，并且在所设计的上游引物的5’端加入了XbaI酶切位点TCTAGA，下游设计的引物5’端加入了AscI酶切位点GGCGCGCC。引物序列(5’to 3’)如下：
NtmiR6155-2300-F：
CGAACGATATCTAGAACTCGTCTTGTCCATTTTAAA(SEQ ID NO:3)
NtmiR6155-2300-R：
GTTAATTAAGGCGCGCCCTAGAGATGGATGAGTCATAT(SEQ ID NO:4)
然后按表1的反应体系和表2的循环参数进行PCR反应。
表1反应体系表
表2循环参数表
最终PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后进行回收(参照生工生物公司凝胶回收试剂盒说明书)。结果如图1所示，按PCR反应体系扩增出了预期的250bp左右的目的片段。
实施例2：烟草miR6155前体基因过表达载体的构建
(1)双酶切pCAMBIA2300载体。按照表3的酶切体系在37℃的水浴锅中对pCAMBIA2300载体(实验室自存)进行4-6h酶切反应，得到线性载体片段，对切开的pCAMBIA2300载体进行胶回收。
表3酶切体系表
组分 用量
pCAMBIA2300载体(100ng/μL) 10.0μL
XbaI 1.0μL
AscⅠ 1.0μL
Cutsmart 5.0μL
ddH2O 33.0μL
(2)将实施例1所得的目的片段连接到pCAMBIA2300载体上，连接的反应体系见表4。
表4连接体系表
组分 用量
2×CloneExpressMix 2.5μL
酶切后的pCAMBIA2300载体(0.03pmol) 1.25μL
实施例1所得的目的基因片段(0.06pmol) 1.25μL
反应参数：50℃、15min。
反应完成后，立即转化大肠杆菌：
①将上步中的5.0μL反应物加到50μL刚解冻的DH5α大肠感受态细胞中，轻弹管壁，轻轻混匀，冰浴30min。
②42℃金属浴热激1min后，立即置于冰上冰浴3min。
③向其中加入常温无抗性LB液体培养基500μL，于225rpm、37℃摇床培养1h。
④将培养好的菌液涂布于含有卡那霉素的LB平板上。
⑤放置在37℃培养箱中过夜培养24-36h。
⑥挑取单克隆大肠杆菌于含卡那霉素(Kan)的LB液体培养中，于225rpm、37℃摇菌至菌液微浑浊。
(3)大肠杆菌菌液PCR鉴定
载体正向引物P2X35SF2序列(5'to 3')为：GTTCATTTCATTTGGAGAGGAC(SEQ ID NO:5)。
用载体正向引物P2X35SF2与目的基因引物R(SEQ ID NO:4)进行PCR检测，检测体系如表5，反应体系如表6。
表5检测体系表
表6反应体系表
结束反应后，最终PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，选取条带大小正确的单克隆菌液，送擎科生物公司测序。将测序结果与烟草基因组数据库进行比对后，用质粒提取试剂盒提取质粒，即可获得序列正确的Nt-miR6155-pCAMBIA2300质粒。结果参见图2，其表明，大肠杆菌质粒中扩增出约250bp的目的片段，证明靶基因过表达载体质粒已成功转入，可以用于下步的农杆菌转化。
(4)农杆菌的转化
①向农杆菌GV1301感受态细胞中加入10μL的Nt-miR6155-pCAMBIA2300质粒DNA，用移液枪轻轻吸打混匀后立即冰浴5min。
②将①中的带有感受态细胞的离心管置于液氮冷冻5min后，于37℃水浴锅热激5min，之后再冰浴5min。
③加入无抗性的LB液体培养基500μL，于225rpm、28℃培养4-6h后，取100μL菌液涂布于含卡那霉素(Kan)和利福平(Rif)的LB平板上，于28℃暗培养36-48h。
④从LB平板上挑取单克隆放入含Kan和Rif的LB液体培养基中，于28℃、250rpm培养1-2d，得到菌液。
⑤对菌液进行PCR鉴定，引物和检测体系同大肠杆菌菌检。
⑥PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，选取条带大小正确的单克隆菌液。
⑦取适量新鲜的农杆菌菌液接种到含100μL Kan和100μL Rif的100mL LB液体培养基中，在28℃、250rpm摇床震荡培养至菌液浑浊，用于烟草遗传转化，记为OE-miR6155菌液。
实施例3：瞬时表达
当本氏烟草(Nicotiana benthamiana)幼苗长至6-8片叶时，选取完整健康的叶片进行注射。分别用1mL注射器吸取OE-miR6155菌液与对照空载体EV(pCAMBIA2300)菌液1mL，避开叶脉，轻微压住烟草叶片，慢慢将菌液分别注射到叶片中，表达36-48h后取下处于健康无萎焉状态的叶片进行接菌实验。用消毒灭菌的直径为0.5cm的打孔器在培养好的烟草疫霉平板中均匀打孔，将菌块倒放在叶片中间处，每个叶片倒放两块菌块，将托盘用保鲜膜密封，以保持托盘中离体叶片的湿度，在温度为30℃的培养箱中进行黑暗培养，并在48h时观察叶片被烟草黑胫病菌侵染的情况，测量病变直径。结果参见图3，其中左边为对照---注射空载体pCAMBIA2300菌液(即EV)后接种黑胫病菌形成的病斑面积，菌斑直径为25.05mm，右边为注射OE-miR6155菌液后接种黑胫病菌形成的菌斑面积，菌斑直径为11.64mm。与空载体相比，miR6155的瞬时表达形成的病斑显著变小，表明过表达miR6155大大增强了烟草对烟草疫霉的抗病性。
实施例4：烟草的遗传转化
(1)获得烟草无菌苗
①用适量70％酒精洗涤普通烟草品种‘红花大金元’种子一次，然后静止2min。
②用ddH2O继续清洗种子两次，振荡。
③用适量次氯酸钠(NaClO)继续洗涤，直到种子颜色由深棕变至黄色。
④用ddH2O振荡洗涤掉种子上的NaClO。
⑤将种子倒在滤纸上，用灭菌牙签蘸取种子后点在MS固体培养基上，每瓶3-5粒种子；
⑥在光照培养箱中先暗培养48h；再在温度为25℃、光照强度为15000lx、光周期为16h光照/8h黑暗的条件下培养大约1周左右可出苗；继续培养得到无菌野生型‘红花大金元’。
(2)叶盘法侵染
①将实施例2中制备好的农杆菌菌液于4000rpm离心10min，弃上清液，用MS液体培养基清洗，重复2次，收集得到农杆菌菌体。
②用20mL冰冷MS液体培养基悬浮①中的菌体，使OD600值达到0.6-0.8。
③取烟草无菌苗叶片，用打孔器将叶片处理成直径0.5cm大小的叶盘。
④将新鲜叶盘转移到悬浮液中侵染10min，期间间断摇晃促进侵染。
⑤将侵染后的叶片转移到灭菌的滤纸上，吸干表面多余菌液，转移至含6-BA(2mg/L)和NAA(0.5mg/L)的分化培养基中，于28℃共培养2d。
⑥2d后，将叶盘移至含6-BA(2mg/L)、NAA(0.5mg/L)、Cef(200mg/L)和Kan(50mg/L)的筛选培养基中培养，每14d左右更换一次筛选培养基。
⑦待不定芽长到0.5cm时，转移到含头孢霉素(Cef，200mg/L)和Kan(50mg/L)的MS固体培养基上生根，得到T0代过表达株系(图4)。
实施例5：过表达烟草株系阳性鉴定
(1)烟草总DNA的提取
①向CTAB提取液加入2％β-巯基乙醇，65℃水浴。
②取100mgT0代过表达株系的叶片于2.0mL离心管中，加入液氮进行打样，再向离心管中加入700μL步骤①溶液。
③65℃水浴裂解45-60min，每隔10min振荡混匀1次离心管。
④取出后冰浴10min，加入现配现用的700μL的氯仿∶异戊醇(体积比24∶1)混匀，离心后取上清。
⑤重复步骤④。
⑥将上清液转移至新的离心管中，并加入450μL异丙醇，混匀后置于-20℃。
⑦将步骤⑥混液离心后得到白色沉淀DNA，加入600μL 75％乙醇悬浮DNA后静置，再用75％乙醇漂洗，最后用无水乙醇脱水。
⑧倒掉废液，等DNA完全干燥后加入ddH2O溶解，即为转基因植株DNA。
(2)过表达株系的PCR检测
以野生型‘红花大金元’DNA为阴性对照，转基因植株DNA(实施例5所得)为待检测植株，进行PCR检测。PCR体系和循环参数以及具体步骤见表5和表6。结果参见图5，其中M为5000的Maker，N为阴性对照，1-10为挑选的10株转基因待检测植株，可以看出，阴性对照未见扩增条带，而1-5、7-10转基因植株均能够扩增出500bp左右的目的片段，为9株阳性过表达转基因植株，将其分别命名为OE-miR6155-1、OE-miR6155-2、OE-miR6155-3、OE-miR6155-4、OE-miR6155-5、OE-miR6155-7、OE-miR6155-8、OE-miR6155-9和OE-miR6155-10。
实施例6：转录水平的验证
(1)烟草RNA的提取
待‘红花大金元’烟草幼苗长至5-6叶期时，取长势相同的植株进行离体叶片侵染，分别在0h、24h、48h时取样，进行三次生物学重复。烟草总RNA使用天根生化产品RNAprepPure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒来提取。
(2)miRNA的反转录
解冻2×miRNARTReaction Buffer并混匀，miRNART Enzyme Mix放于冰中备用，在冰上预冷RNase Free的反应管内，按表7反应体系加入以下试剂(最后加入miRNART EnzymeMix)，表7中标有*的反应中所使用的Total RNA必须含有小分子RNA。
表7反应体系表
组分 用量
TotalRNA* 2.0μg
2×miRNARTReactionBuffer 10.0μL
miRNARTEnzymeMix 2.0μL
RNase-FreeddH2O upto20μL
移液器轻轻混匀上述配制的反应液，按表8程序进行miRNA的逆转录反应：
表8反应程序表
反应温度 反应时间 说明
42℃ 60min miRNA加A尾反应和逆转录反应
95℃ 3min 酶失活反应
合成的cDNA反应液可放置于-20℃保存；也可以直接进行下游荧光定量检测。
(3)mRNA的反转录
①去除基因组DNA反应
按表9于冰上配制反应混合液。为了保证反应液配制的准确性，进行各项反应时，应先按反应数+2的量配制Master Mix，然后再分装到每个反应管中，最后加入RNA样品。
表9反应混合液体系表
组分 用量
5×gDNAEraserBuffer 2.0μL
gDNAEraser 1.0μL
TotalRNA 1.0μg
RNase-FreeddH2O upto10μL
反应程序：42℃，2min反应结束后，4℃置于冰上。
②反转录反应
按表10的反转录反应体系表在冰上配制反应液，轻柔混匀后立即进行反转录反应。
表10反转录反应体系表
组分 用量
步骤①的反应液 10.0μL
PrimeScriptRTEnzymeMixI 1.0μL
RTPrimerMix×4 4.0μL
5×PrimeScriptBuffer2(forRealTime) 4.0μL
RNase-FreeddH2O 1.0μL
Total 20μL
反应程序：37℃，15min，85℃，5sec，反应结束后，置于冰上。
将合成好的cDNA稀释10倍，用于后续实验。暂时不用可以储存在-20℃冰箱中，备用。
(4)荧光定量PCR
①荧光定量PCR引物序列(5’to 3’)如下：
Nt-miR6155-qRTF：TAAGGTTGCCTTGCTCTTGCA(SEQ ID NO:6)
U6-qRTF：TGGCTATGGCAGTGGAATG(SEQ ID NO:7)
U6-qRTR：ATAACCATGACCGTGATAATTCG(SEQ ID NO:8)
②荧光定量PCR体系：
表11荧光定量PCR反应体系表
组分 用量
2×miRcutePlusmiRNAPreMix(SYBR&ROX) 10μL
ForwardPrimer(10μM) 0.5μL
ReversePrimer(10μM) 0.5μL
miRNA第一链cDNA(上述(3)所得) 2μL
RNase-FreeddH2O 7μL
反应程序：95℃15min，94℃20sec，60℃34sec，循环数40。
本发明通过转录水平定量分析验证了miR6155对烟草疫霉的表达模式。从烟草幼苗接种烟草疫霉起，在接种的第24h和48h分别取材进行qRT-PCR检测miR6155的表达情况，结果参见图6的A(miR6155对烟草疫霉表达模式分析)，结果显示，在黑胫病菌侵染过程中，miR6155的表达量随着时间延长显著上调，选出其中miR6155表达量显著上调的两个转基因株系OE-miR6155-9、OE-miR6155-10进行进一步实验。验证了miR6155在转基因烟草株系中的表达量，结果参见图6的B(miR6155在转基因烟草株系OE-miR6155-9、OE-miR6155-10和野生型红花大金元植株中的表达量图)，过表达转基因株系中的表达量均显著高于野生型HD植株。
实施例7：miR6155过表达烟草株系的黑胫病抗性鉴定
当过表达烟草株系长至5-6叶时，选取完整、部位相同、长势健康的植株接种烟草疫霉，‘红花大金元’烟草作为对照，分别进行离体叶片接菌和整株接菌处理，各进行三次生物学重复。在48h后时观察植株和叶片被烟草疫霉侵染的情况。统计病斑直径和疾病指数。结果参见图7，其中A是离体叶片接种烟草疫霉48h后的疾病症状；B是离体叶片的病变病斑直径统计；C是整株植株接种烟草疫霉48h后的疾病症状；D是疾病指数统计；HD表示‘红花大金元’植株，OE-miR6155-9和OE-miR6155-10分别表示miR6155过表达转基因植株的9号和10号株系。在离体叶片接种烟草疫霉后，与HD相比，OE-miR6155表现出明显的抗病性，HD叶片有较大的病斑，而OE-miR6155叶片表现出较小的病斑直径(A、B)。当整株植物接种烟草疫霉时，相对于OE-miR6155株系，HD表现出明显更严重的叶片萎蔫、茎基部发黑的疾病症状，并且疾病指数较高(C、D)。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (6)

1.一种烟草疫霉诱导的miR6155的前体序列的RNA片段，其特征在于，所述序列为SEQID NO:1所示。
2.一种权利要求1所述RNA片段的成熟序列的RNA片段，其特征在于，所述序列如SEQ IDNO:2所示。
3.一种生物材料，其特征在于，含有权利要求2所述RNA片段。
4.如权利要求1所述生物材料，其特征在于，生物材料为含有权利要求2所述RNA片段的重组载体，重组细胞，转基因植物组织，转基因植物器官。
5.权利要求1的RNA片段或权利要求2的RNA片段的用途，优选的，所述用途为调控烟草对黑胫病的抗性；更优选的，所述调控烟草对黑胫病的抗性为增强烟草对黑胫病抗性的用途。
6.一种培育对黑胫病抗性敏感的烟草的方法，其特征在于，包括提高烟草中权利要求1所述RNA片段的表达量和/或权利要求2所述RNA片段的表达量的步骤。
CN202310244849.2A 2023-03-13 2023-03-13 一种烟草疫霉诱导的miR6155及其用途 Pending CN116515826A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310244849.2A CN116515826A (zh) 2023-03-13 2023-03-13 一种烟草疫霉诱导的miR6155及其用途

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310244849.2A CN116515826A (zh) 2023-03-13 2023-03-13 一种烟草疫霉诱导的miR6155及其用途

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116515826A true CN116515826A (zh) 2023-08-01

Family

ID=87389320

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310244849.2A Pending CN116515826A (zh) 2023-03-13 2023-03-13 一种烟草疫霉诱导的miR6155及其用途

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116515826A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20210269816A1 (en) Method of Obtaining Multileaflet Medicago Sativa Materials by Means of MsPALM1 Artificial Site-Directed Mutants
CN113549635B (zh) 大丽轮枝菌VdPRMT1基因在提高作物或蔬菜抗病性中的用途
CN110331145A (zh) miR156及其相关生物材料在调控植物抗病性中的应用
CN114752599B (zh) 大丽轮枝菌VdNRPS3基因抗病原菌靶基因片段及其干扰载体和应用
CN114736915A (zh) 大丽轮枝菌VdNRPS2基因抗病原菌靶基因片段及其干扰载体和应用
CN110862995B (zh) 一种抗大豆菌核病基因GmPR5、GmPR5转基因植株的构建与应用
CN116425847B (zh) 抑制核盘菌的水稻OsGLP8-10及其应用
CN116444636B (zh) 抑制核盘菌的水稻OsGLP3-6及其应用
CN116355067B (zh) 抑制核盘菌的水稻OsGLP8-12及其应用
CN115820686A (zh) 一种柑橘CsGSTU18基因及其应用
CN116515826A (zh) 一种烟草疫霉诱导的miR6155及其用途
CN108795942B (zh) 一种水稻外因胁迫诱导表达启动子Psubs3及其应用
CN114591984B (zh) OsAP79基因诱导水稻抗褐飞虱的应用
CN116496371B (zh) 抑制核盘菌的水稻OsGLP3-5及其应用
CN115807010B (zh) 忍冬叶片腺毛发育基因及其应用
CN116496372B (zh) 抑制核盘菌的水稻OsGLP8-11及其应用
CN114085838B (zh) 马铃薯stu-miRn220及其应用
CN115960952B (zh) 过表达玉米ZmHB53基因的表达载体和构建方法及其在提高植物耐旱性中的应用
CN117431256B (zh) 一个小麦黄花叶病抗病基因TaRx-2D及其编码的蛋白和应用
CN111139262A (zh) 一种crispr介导的快速检测植物基因功能的系统
CN116789778A (zh) 细胞周期蛋白及其相关生物材料在调控玉米胚发育和籽粒大小的应用
CN118222556A (zh) 一种PagMUR1a蛋白及其应用
CN117402911A (zh) 干扰毛白杨转录因子PtoMYB240表达在提高毛白杨生物量中的应用
CN118345091A (zh) 一种调控杨树叶片和茎发育的基因PagERF49及其应用
CN114807174A (zh) 一种逆向调控水稻对稻瘟病菌抗性的遗传位点及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination