CN113957092B - OsSUT4基因在制备抗拟禾本科根结线虫转基因水稻中的应用 - Google Patents

OsSUT4基因在制备抗拟禾本科根结线虫转基因水稻中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及植物基因工程领域，公开了OsSUT4基因在制备抗拟禾本科根结线虫转基因水稻中的应用，所述基因在基因登录号为LOC_Os02g58080。申请人通过构建pds1301‑OsSUT4‑ RNAi干扰载体，并转化水稻粳稻品种日本晴（Nipponbare），得到的转基因阳性植株形态上与日本晴野生型在苗期长势上没有显著性差异，但是在苗期我们利用15天的水稻苗接种拟禾本科根结线虫，统计结果显示，无论是在根结或线虫数目方面，其侵染数目明显少于野生型。并且，我们通过水稻根尖对拟禾本科根结线虫J2趋性试验结果得知，OsSUT4‑RNAi转基因植株根尖的线虫数量明显少于野生型，因此，OsSUT4对于培育抗拟禾本科根结线虫侵染的水稻新品种将具有非常重要的意义。

Description

OsSUT4基因在制备抗拟禾本科根结线虫转基因水稻中的应用
技术领域
本发明涉及植物基因工程领域，具体到OsSUT4基因在制备抗拟禾本科根结线虫转基因水稻中的应用。
背景技术
在大多数植物中，蔗糖是主要的碳水化合物，蔗糖经过源端韧皮部装载，运输以及到库端卸载的过程中，蔗糖转运蛋白在其中发挥极其重要的作用。在过去的二十多年中，SUT蛋白的编码基因已经从单子叶植物和双子叶植物中广泛分离出来。目前，在水稻基因组中已经鉴定出了5个OsSUTs基因(Aoki et al.,The sucrose transporter gene familyin rice.Plant and Cell Physiology,2003,44(3):223-232.)。其中，OsSUT4主要在叶片，萌发中的胚胎和成熟中的花粉中表达，定位在液泡膜上，并且其表达受温度调控(Chung etal.,Influence of temperature on the expression of the rice sucrosetransporter 4 gene,OsSUT4,in germinating embryos and maturing pollen.ActaPhysiologiae Plantarum,2014,36(1):217-229.)。但是，目前对SUT4的功能研究比较少，其功能主要是将贮存在液泡中的蔗糖运输到胞质中或者参与植物光合产物的运输与分配等。
植物蔗糖转运蛋白SUTs，在寄主植物与植物寄生线虫互作中具有同样重要的生物学功能。植物寄生线虫甜菜胞囊线虫(Heterodera schachtii)在侵染寄主植物拟南芥时，甜菜胞囊线虫可诱导寄主植物根部合胞体AtSUC4的表达，负责合胞体内蔗糖的供给。在合胞体早期分化阶段，AtSUC4介导蔗糖从韧皮部微管转运至合胞体内。因此，可为甜菜胞囊线虫提供足够的营养物质(Hofmann et al.,Sucrose supply to nematode inducedsyncytia depends on the apoplasmic and symplasmic pathways.Journal ofExperimental Botany,2007,58(7):1591-1601)。在之后的研究中，同样的机制也在南方根结线虫(Meloidogyne incognita)与拟南芥互作中发现，即南方根结线虫侵染拟南芥后诱导寄主植物根部巨型细胞内AtSUC4的表达。不同于甜菜胞囊线虫的是，在整个侵染阶段，取食位点内的蔗糖运输仅是由蔗糖转运蛋白AtSUC4介导的质外体途经完成(Hofmann etal.,The Arabidopsis thaliana sucrose transporter gene AtSUC4 is expressed inMeloidogyne incognita induced root galls.Journal of Phytopatholoy,2009,157(4):256-261.)。
植物根结线虫病害是一种重要的土传病害。该属包括98种(截至2013年6月)，它们寄生在几乎所有维管植物物种。拟禾本科根结线虫(M.graminicola)是其中之一，通常被称为水稻根结线虫，是水稻农业系统中最普遍的植物寄生线虫之一。它被认为是水稻农业生产中的主要威胁，特别是在亚洲，亚洲是世界上主要的水稻种植区，每年水稻产量可达7.4亿吨，约占全球水稻总产量的90％(Muthayya et al.,An overview of global riceproduction supply trade and consumption.Annals of the New York Academy ofSciences,2014,1324:7-14.)。因此，亚洲的水稻生产对当地以及全球粮食都至关重要。由于根结线虫病害侵染植物后在地上部分没有明显的特异性的病症，因此往往会错过最佳的防治时期。所以，对于根结线虫病害的防治，一般遵循的植保方针是“预防为主，综合防治”。在农业实际生产过程中，常见的防治措施包含：农业防治、化学防治和生物防治方法等。农业防治主要包含种植抗病品种，轮作以及日晒处理等方法。而化学防治主要采用化学杀虫剂，目前使用化学杀虫剂是防治根结线虫病害的最有效的化学防治手段。传统的杀线虫试剂对环境污染严重，有有机硫类，溴甲烷，二溴氯丙烷等熏蒸剂等。部分杀虫剂已经在防治病害中被禁用。现在主要用的防治根结线虫的杀虫剂主要有阿维菌素，噻唑膦等。生物防治主要是应用生物防治因子-捕食性天敌，有益微生物，内生真菌和细菌等防治根结线虫病害。目前已研制出以生防菌孢子和菌丝为主要活性成分的海藻酸钠微胶囊剂和淡紫紫孢菌制备的生防颗粒剂对防治根结线虫病害有较好的防效。
随着近几年根结线虫病害的蔓延，根结线虫病害越来越受到人们关注。因此，抗线虫病害候选基因及培育种植抗耐品种以已经成为一项具有重要意义的科学问题。之前的研究报道中，只涉及OsSUT4在水稻上的生理功能但是并未涉及其对线虫病害的防治方面的研究。本发明中，我们发现OsSUT4-RNAi转基因水稻能够明显的抑制拟禾本科根结线虫的侵染。因此，OsSUT4对于培育抗拟禾本科根结线虫侵染的水稻新品种将具有非常重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供了OsSUT4基因在制备抗拟禾本科根结线虫转基因水稻中的应用，所述基因在基因登录号为LOC_Os02g58080。
为了实现上述的目的，本发明通过以下技术方案实现：
OsSUT4基因在制备抗拟禾本科根结线虫转基因水稻中的应用，所述基因在基因登录号为LOC_Os02g58080，CDS序列为SEQ ID NO.1所示。
以上所述的应用中，优选的，是通过本领域的常规手段来减弱、沉默OsSUT4基因的表达来构建抗拟禾本科根结线虫转基因水稻。
以上所述的常规方案，包括但不限于基因敲除，敲减，RNA干扰等方式对OsSUT4基因的表达量来进行控制。
与现有技术相比，本发明的优点如下：
拟禾本科根结线虫病是一种非常重要的水稻线虫病害，随着我国水稻主产区种植面积地不断扩大，该病害越来越受到人们关注。因此，该病害的防治以及培育抗拟禾本科根结线虫病害的水稻品种已经成为一项具有重要意义的科学问题。申请人通过构建pds1301-OsSUT4-RNAi干扰载体，并转化水稻粳稻品种日本晴(Nipponbare)，得到的转基因阳性植株形态上与日本晴野生型在苗期长势上没有显著性差异，但是在苗期我们利用15天的水稻苗接种拟禾本科根结线虫，统计结果显示，无论是在根结或线虫数目方面，其侵染数目明显少于野生型。并且，我们通过水稻根尖对拟禾本科根结线虫J2趋性试验结果得知，OsSUT4-RNAi转基因植株根尖的线虫数量明显少于野生型，综合以上结果，我们可以看出，该转基因水稻材料能够明显的抑制拟禾本科根结线虫的侵染。
附图说明
图1为pds1301干扰载体以及构建方法示意图；
上图为RNAi表达载体pds1301质粒示意图，下图为RNAi构建方法及酶切位点示意图。
图2为OsSUT4-RNAi转基因水稻中OsSUT4基因的表达水平检测以及植株照片；
上图为OsSUT4-RNAi转基因水稻与野生型植株照片；
下图为OsSUT4-RNAi转基因水稻中OsSUT4基因的表达水平检测。
图3为拟禾本科根结线虫侵染OsSUT4-RNAi转基因水稻的表型7dpi测定结果示意图；
A为水稻根最长根长；B为根鲜重；C为根结数目；D为线虫数目；E为7dpi根结内拟禾本科根结线虫酸性品红染色图。
图4为OsSUT4-RNAi转基因水稻和野生型水稻根尖对拟禾本科根结线虫二龄幼虫J2趋性测定试验；
该图为2hpi、4hpi、6hpi、8hpi、24hpi OsSUT4-RNAi转基因水稻和野生型水稻根尖对拟禾本科根结线虫二龄幼虫J2趋性统计数据分析
具体实施方式
根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用不同的用途和条件。本发明所述技术方案，如无特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
实施例1：OsSUT4目的片段获得(正义链与反义链)
本发明需要的OsSUT4参考基因全长序列在国家水稻数据中心获得，其基因登录号为LOC_Os02g58080(该基因的CDS序列为SEQ ID NO.1所示)。通过提取野生型日本晴总RNA，反转录得到cDNA,使用高保真酶
Figure BDA0003294820700000031
HS DNA Polymerase，用引物对其进行高保真PCR扩增。具体操作如下：
1)抽提日本晴野生型水稻苗期的总RNA；
2)反转录合成cDNA并进行OsSUT4基因的正义链与反义链的扩增：
PCR用到的体系为50μL，具体配法为：cDNA第一链模板1μL，2×PBS buffer 25μL，10mM dNTP 1.0μL，正向引物和反向引物各2.0μL，Super fidelity enzyme 1.0μL，加水至50μL
正义链引物：
OsSUT4-RNAi-F1：5'-CATGGGAGGGCGCGCCtgcaGGTACCAACCAACAGATGCACAACGA-3'；
OsSUT4-RNAi-R1：5'-CGACCCGGGAATTCCGGACCGGTACCAAAAAGGGAAACCACGACAA-3'
反义链引物：
OsSUT4-RNAi-F2：5'-TTAAACAATTCAATTCAGTGGAGCTCAACCAACAGATGCACAACGA-3'；
OsSUT4-RNAi-R2：5'-CCCGGGTCTGCGATCGCTCTGAGCTCAAAAAGGGAAACCACGACAA-3'。
PCR反应条件如下：①98℃5分钟，②98℃30秒，③58℃30秒，④72℃60秒，⑤从②－
④循环35次，⑥72℃10分钟，⑦4℃保存。
扩增该基因CDS序列约300bp作为干扰序列(pds1301干扰载体一般选择的最大干扰序列长度为500bp，然后将干扰片段分别以正方向和反方向两种顺序连接到载体上，也就是提到的正义链和反义链，最后两者可形成茎环结构起到干扰作用)，正义链与反义链的的酶切位点不同，正义链用KpnI和BamHI双酶切，反义链用SacI和SpeI双酶切。由于最后要形成茎环结构，所以正义链与反义链目的片段序列方向相反。
实施例2：OsSUT4-RNAi载体的构建
1)将上述步骤获得的OsSUT4正义链与反义链目的片段与KpnI,BamHI酶和SacI和SpeI酶切的RNAi干扰载体质粒pds1301(娄丽娟等.OsVIP1 RNAi转基因水稻植株的构建.2013，华中农业大学学报)，用ExnaseII连接酶直接将载体和目的片段连接；
2)本发明针对OsSUT4基因的干扰靶序列为：5'-AACCAACAGATGCACAACGATTATCTGATTCTGCGCCTCTCCTGAATGGTTCTAGAGATGATAACAATGCATCAAATGAACCTCGTAATGGAGCACTTCCTAATGGTCATACAGATGGAAGCAATGTCCCAGCTAACTCCAACGCTGAGGACTCCAATTCAAACAGAGAGAATGTCGAAGTTTTCAATGATGGACCAGGAGCAGTTTTGGTGAATATTTTGACTAGCATGAGGCATCTACCTCCTGGAATGTACTCTGTTCTTCTAGTTATGGCTCTAACATGGTTGTCGTGGTTTCCCTTTTT-3'。
3)连接产物通过热激转化的方法转化大肠杆菌DH5α。通过酶切以及测序两种方法筛选阳性克隆，获得的重组质粒载体被命名为pds1301-OsSUT4-RNAi。
3)pds1301-OsSUT4-RNAi质粒载体的转化及转基因植株阳性检测
通过农杆菌介导的水稻遗传转化方法，将上述RNAi载体pds1301-OsSUT4-RNAi转入到水稻品种“日本晴”(中国水稻研究所提供的一个公开使用的水稻品种)中，经过预培养、侵染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤、分化、生根、练苗、检测，移栽，得到转基因植株。上述农杆菌介导的水稻(日本晴)遗传转化方法(体系)在Hiei等人报道的方法(Hiei etal，Efficient transformation of rice，Oryza sativa L.，mediated by Agrobacteriumand sequence analysis of the boundaries of the T-DNA.Plant Journal，1994,6(2):271-282.)基础上进行。
实施例3：OsSUT4-RNAi转基因植株阳性检测
1)为了检测OsSUT4-RNAi转基因植株中的目标基因的表达量，申请人采用qRT-PCR的方法对转基因T0代植株进行了表达分析。该试验检测的是转基因水稻的苗期RNA，反转录得到产物后用qRT-PCR的方法检测OsSUT4的表达量。
2)采用两步法PCR反应程序，两步法PCR扩增标准程序，应用CFX96TM Real-TimePCR Detection System扩增仪的操作方法，按照下列组分配制PCR反应液(反应液配制在冰上进行)。
两步法PCR扩增标准程序:Step1:95℃30s；Step2:GOTO,39(40Cycles)；95℃,5s,60℃,30s；Step3:Melt Curve。
用到的体系为20μL，具体配法为：cDNA 第一链模板1μL，SYBR Premix Ex Taq(TliRNaseH Plus)2×10μL，正向引物和反向引物各0.5μL，加水至20μL
qRT-PCR所用引物序列为：
OsSUT4-RNAi-qF：5'-TGAACCTCGTAATGGAGCACTT-3'
OsSUT4-RNAi-qR：5'-AAAACTGCTCCTGGTCCATCAT-3'
最终得到的T0代干扰转基因植株中OsSUT4表达结果见图2，由图2中上图可知，野生型和转基因型的水稻生长情况无显著差异，下图中则显示，在转基因阳性水稻中OsSUT4的表达量显著低于野生型。最后将转基因阳性苗转至温室培养至T1代，用于后续试验操作。
实施例4：
拟禾本科根结线虫对OsSUT4-RNAi转基因植株侵染表型测定
为了评估拟禾本科根结线虫对OsSUT4-RNAi转基因植株的侵染表明，我们选取生育期为14天左右，挑选长势相同，大小形态相似的水稻苗进行拟禾本科根结线虫的侵染表型测定试验，该试验具体操作如下：选取长势相当的OsSUT4-RNAi转基因植株和日本晴野生型水稻苗，每株水稻苗接种1mL的线虫悬浮液(300头J2)，待线虫接种7天之后，测定水稻根部最大根长，根鲜重，根结数目和根部线虫总数。
结果如图3所示：OsSUT4-RNAi转基因植株和日本晴野生型在水稻根最大根长方面没有显著性差异(图3中A)；但是水稻根鲜重方面，OsSUT4-RNAi转基因植株的根鲜重明显高于野生型水稻(图3中B)。在水稻根部线虫侵染方面，OsSUT4-RNAi转基因植株根部几乎没有根结生成，而野生型水稻的单株根结数平均约达15个，最多可达25个(图3中C)；我们通过酸性品红染色对水稻根内的线虫总数进行统计，统计数据发现，单株野生型水稻根部线虫数平均约有104头，最多可达200头，然而OsSUT4-RNAi转基因水稻根部几乎没有发现线虫(图3中D，E)。这一统计结果说明OsSUT4-RNAi转基因水稻能够明显的抑制拟禾本科根结线虫的侵染。
实施例5：
拟禾本科根结线虫二龄幼虫J2对OsSUT4-RNAi转基因植株趋性表型测定
为了探究OsSUT4-RNAi转基因水稻对拟禾本科根结线虫的趋性，我们测定了不同时间水稻根尖对拟禾本科根结线虫二龄幼虫J2的趋性试验，具体操作：1.将孵化的线虫J2静置于玻璃试管中(尽可能保证线虫悬浮液无杂质)，去除上方多余的水分，保留沉在底部线虫J2。2.23g Pluronic F-127powder(NF Prill Poloxamer 407,BASF,Mt Olive,NJ,USA)加入80mL灭菌制冷的ddH2O中，放置于4℃，24h，搅拌会溶解地更快。待完全溶解后用作后续试验。3.将线虫悬浮液加入到F-127凝胶中，具体浓度根据试验安排配制，混合均匀。4.准备无菌12孔板(6孔板)，加入配制好的F-127凝胶线虫悬浮液1mL(3mL),根据试验设计可稍作调整；取水稻根尖1-1.5cm部位置于孔板中间位置(每株取一个根尖，选取粗细相同的水稻根尖)，每个处理6-10个重复。将孔板轻轻置于28-30℃培养箱中，黑暗处理。统计2、4、6、8、24hpi水稻根尖1mm左右的线虫数量，体式显微镜下拍照统计。
统计结果显示：在接种线虫2h时,OsSUT4-RNAi转基因水稻与野生型水稻根尖部位的线虫数目没有差异性，但是随着时间的延长，野生型水稻根尖部位的线虫数量间多于OsSUT4-RNAi转基因水稻，并且两者之间存在显著性差异；但在接种线虫8h后，两者之间的线虫数量持平，没有显著性差异。其后，随着时间的延长，线虫开始向四周扩散，水稻根尖的周围的线虫数量也随之减少，最后两者至今没有差异性(图4)。根据趋性试验统计结果分析可得：在接种前期，OsSUT4-RNAi转基因水稻影响线虫对水稻根尖的识别。随后接种时间的延长，再结合拟禾本科根结线虫对OsSUT4-RNAi转基因水稻的侵染表型测定试验，可知，OsSUT4-RNAi转基因水稻不仅能够影响拟禾本科根结线虫对水稻根尖的识别能力，还可以明显抑制拟禾本科根结线虫的侵染。因此，OsSUT4基因在防治拟禾本科根结线虫病害有重要的应用前景。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> OsSUT4 基因在制备抗拟禾本科根结线虫转基因水稻中的应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1788
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggactccg ccgccggcgg tggcggcctc acggccatcc gcctgcccta ccgccacctc 60
cgcgacgccg agatggagct cgtcagcctc aacggcggca ccccccgcgg aggctccccc 120
aaggaccccg acgccacgca ccagcagggg ccccccgccg cccgtaccac caccaccagg 180
aagctcgtcc tcgcctgcat ggtcgccgcc ggcgtgcagt tcggctgggc gcttcagctc 240
tcgctcctca cgccctacat ccagacccta ggaatagacc atgccatggc atcattcatt 300
tggctttgtg gacctattac tggttttgtg gttcaaccat gtgttggtgt ctggagtgac 360
aaatgccgtt caaagtatgg aagaaggaga ccgttcattt tggctggatg cttgatgata 420
tgctttgctg taactttaat cggattttct gcagaccttg gttacatttt aggagatacc 480
actgagcact gcagtacata taaaggttca agatttcgag cagctattat tttcgttctt 540
gggttctgga tgttggatct cgcaaacaat acagttcaag gtcctgctcg tgccctttta 600
gctgaccttt caggtcctga tcagtgtaat tctgcaaatg caattttttg cacatggatg 660
gctgttggaa acgttcttgg tttttcatct ggtgctagtg ggaattggca caagtggttt 720
ccttttctaa tgacaagagc atgctgtgaa gcttgtagta atttgaaagc cgcttttctg 780
gttgcagttg tattcctttt gttttgtatg tctgttaccc tgtactttgc tgaagagatc 840
ccgctggaac caacagatgc acaacgatta tctgattctg cgcctctcct gaatggttct 900
agagatgata acaatgcatc aaatgaacct cgtaatggag cacttcctaa tggtcataca 960
gatggaagca atgtcccagc taactccaac gctgaggact ccaattcaaa cagagagaat 1020
gtcgaagttt tcaatgatgg accaggagca gttttggtga atattttgac tagcatgagg 1080
catctacctc ctggaatgta ctctgttctt ctagttatgg ctctaacatg gttgtcgtgg 1140
tttccctttt tcctttttga tactgactgg atgggacgtg aggtttacca tggggaccca 1200
aatggcaact tgagtgaaag gaaagcttat gacaacggtg tccgagaagg tgcatttggt 1260
ttgctattga attcagttgt ccttggaatt gggtccttcc ttgttgatcc actatgccga 1320
ctgatgggtg ctagactggt ttgggcaatc agcaacttca cagtgtttat ctgcatgctg 1380
gctacagcaa tattaagttg gatctctttt gatttgtact caagtaaact tcaccacatc 1440
attggagcaa ataaaacagt gaagaattca gccttgattg ttttctccct acttggactg 1500
ccactctcga tcacatatag cgttcctttt tctgtgactg ctgagctgac tgctggaaca 1560
ggaggtggac aaggtctggc aacaggagtc ctgaaccttg caatcgttgt tccgcagata 1620
gtagtgtcac taggagcagg tccatgggat gctctctttg ggggagggaa cgtccctgct 1680
ttcgccttgg cttccgtttt ctcactagga gctggtgtcc tcgcggtcct taagctaccc 1740
aagctgccaa actcttacag atctgctggg ttccatggat ttggctga 1788
<210> 2
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
catgggaggg cgcgcctgca ggtaccaacc aacagatgca caacga 46
<210> 3
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgacccggga attccggacc ggtaccaaaa agggaaacca cgacaa 46
<210> 4
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ttaaacaatt caattcagtg gagctcaacc aacagatgca caacga 46
<210> 5
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cccgggtctg cgatcgctct gagctcaaaa agggaaacca cgacaa 46
<210> 6
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cccgggtctg cgatcgctct gagctcaaaa agggaaacca cgacaa 46
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tgaacctcgt aatggagcac tt 22
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aaaactgctc ctggtccatc at 22

Claims (2)

1.OsSUT4 基因在制备抗拟禾本科根结线虫转基因水稻中的应用，所述基因的CDS序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，是通过减弱、干扰OsSUT4 基因的表达、或是直接敲除OsSUT4 基因来构建抗拟禾本科根结线虫转基因水稻。
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