CN104651372B - 南方根结线虫mif基因在降低线虫对植株致病性中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了南方根结线虫MIF基因在降低线虫对植株致病性以及在培育转基因抗南方根结线虫植株中的应用，所述MIF基因为AMIF基因(如SEQ ID No.1所示)、BMIF基因(如SEQ ID No.2所示)或CMIF基因(如SEQ ID No.3所示)。通过RNAi介导的转基因技术，获得转基因植物，抑制线虫BMIF基因的表达，降低线虫对植物的为害能力，防治效果达到70％左右。

Description

南方根结线虫MIF基因在降低线虫对植株致病性中的应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及南方根结线虫MIF基因在降低线虫对植株致病性中的应用。

背景技术

根结线虫是专性内寄生植物病原线虫，可寄生超过3000种植物，对农业生产造成严重危害，每年产生巨大经济损失，被称为世界上最具破坏性的植物病原物。在我国以南方根结线虫(M.incognita)分布最广，近几年来，我国农业种植结构不断调整，设施蔬菜栽培面积迅速发展，为南方根结线虫的发生、发展提供了适宜的环境，土壤中的南方根结线虫量快速增加，严重威胁我国农业生产安全。轮作、生物熏蒸、生物防治及化学农药是防治线虫的主要方法，但是存在防治效果差、污染环境等问题。巨噬细胞移动抑制因子(macrophagemigration inhibitory factor，MIF)，是1966年发现的第一个可溶性淋巴因子，它可吸引巨噬细胞在迟发型变态反应中浸润、聚集，还可促进巨噬细胞增生以及刺激巨噬细胞分泌多种细胞因子。MIF作为一种潜在的促炎症细胞因子，是天然免疫和获得性免疫中的关键调节元件，通过多种途径促进免疫应答和炎性反应。哺乳动物(如人、小鼠、大鼠、牛等)的MIF蛋白氨基酸序列有90％的同源性，而且在鸡、鱼、蜱、寄生虫、蓝细菌等物种间有同源性和保守性。

RNA干扰(RNAi)是研究植物线虫的一种重要的反向遗传学手段。通过人工合成靶基因的dsRNA或siRNA，并溶解在线虫浸泡缓冲液中，在章鱼胺、间苯二酚等神经调节剂作用下，寄生前二龄幼虫摄取溶液中的dsRNA或siRNA，从而引发内源基因的RNA干扰，称为体外RNAi技术(in vitro RNAi)；通过构建线虫靶基因的RNAi载体，并遗传转化寄主植物，使线虫在寄生取食时，从寄主植物细胞中吸取dsRNA或siRNA，从而引发内源基因的RNA干扰，称为体内RNAi技术(in vivo RNAi)。RNAi不仅有助于分析植物线虫的基因功能，而且可以评价目标基因作为抗线虫靶标的应用潜力。

尽管已经克隆了南方根结线虫大量与寄生致病相关的基因，但目前只有少数基因的作用机制被详细研究。大量研究表明，植物寄生线虫分泌的效应蛋白在与寄主互作致病过程中发挥重要作用。多数推测的寄生致病相关基因在线虫食道腺、体壁、口器等部位表达，编码产生分泌蛋白，再经由口针穿刺、注射或直接由体壁分泌进入植物细胞内，发挥寄生致病相关的复杂功能，大多数的研究集中在食道腺分泌的效应蛋白，但由线虫体壁分泌并参与免疫调节的相关寄生致病效应蛋白的研究结果不多。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供南方根结线虫MIF基因在降低线虫对植株致病性中的应用。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

本发明提供了南方根结线虫MIF基因在降低线虫对植株致病性中的应用，所述MIF基因为如SEQ ID No.1所示的AMIF基因、如SEQ ID No.2所示的BMIF基因或如SEQ ID No.3所示的CMIF基因。

所述BMIF基因编码的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

进一步地，所述应用为通过抑制线虫MIF基因的表达，降低线虫对植物植株的为害。

本发明还提供了南方根结线虫MIF基因在培育抗南方根结线虫转基因植株中的应用，所述MIF基因为如SEQ ID No.1所示的AMIF基因、如SEQ ID No.2所示的BMIF基因或如SEQ ID No.3所示的CMIF基因。

进一步地，所述应用为将BMIF基因编码区的1-329bp或与其相似性大于90％的核苷酸序列作为RNAi干扰片段，构建RNAi干扰载体，通过农杆菌介导法获得抗南方根结线虫的转基因植物。所述构建的RNAi干扰载体，可沉默根结线虫的AMIF、BMIF和CMIF基因。

更进一步地，所述应用为将BMIF基因编码区的1-329bp作为RNAi干扰片段，按正反方向构建于pSAT5干扰载体Intron两侧，再将含有BMIF正反向干扰片段和Intron区的大片段用XbaI/KpnI双酶切从pSAT5载体上切下，连接于psuper植物表达载体，构建psuper-BMIF-Ri植物转基因RNAi干扰载体，通过农杆菌介导法获得抗南方根结线虫的转基因植物，其防治根结线虫的效果在70％左右。

本发明还提供了南方根结线虫BMIF基因，所述BMIF基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示。

本发明还提供了用于克隆所述BMIF基因的引物，所述引物包括：

上游引物BMIF-superF：5’-ATGCCAATTTTACAAGTT-3’；

下游引物BMIF-superR：5’-TTATCCTTTTAATTTCCCATC-3’。

本发明还提供了克隆所述BMIF基因的方法，具体为：

取接种南方根结线虫45-60天的番茄根系，洗净后挑取卵块在无菌水中连续孵化3天，离心收集每天孵化的新鲜的二龄幼虫；将洗净的根经过酶消解，分离、收集不同虫态的线虫；液氮冷冻，组织研磨器破碎样品，用磁珠法提取mRNA，反转录得到南方根结线虫二龄幼虫cDNA，以该cDNA为模板，利用权利要求7所述引物进行PCR扩增。

进一步地，所述PCR扩增体系为：ddH₂O 28μL，5×Phusion HF buffer 10μL，2.5mMdNTPs 4μL，BMIF-superF 2.5μL，BMIF-superR2.5μL，cDNA 1.0μL，Phusion DNApolymerase(NEB)0.5μL，DMSO1.5μL,总体系50μL。

进一步地，所述PCR扩增条件为：98℃预变性30s；98℃变性10s，58℃退火30s，72.0℃延伸1min，共30个循环；72.0℃保温10min后终止反应。

本发明的有益效果在于：

本发明首次发现南方根结线虫BMIF基因，有两个拷贝串联排列，并且在线虫体壁表达。并进一步通过实验证实了其为线虫体壁分泌并具有参与免疫调节功能的寄生致病相关效应蛋白。沉默该基因防治根结线虫的效果达70％左右，为培育抗南方根结线虫转基因植株的研究提供了靶标。为寻找防治根结线虫的新靶标并制定防治新策略提供了理论依据。

附图说明

图1为三种不同MIF基因编码区序列比对。

图2为BMIF基因在各虫态的相对表达量分析。

图3为BMIF基因正反义探针引物PCR扩增；

其中：1：未标记正义探针；2：DIG标记正义探针；3：未标记反义探针；4：DIG标记反义探针。

图4为BMIF基因的线虫组织原位杂交。

图5为构建BMIF体内RNAi干扰载体及双酶切验证XbaI和KpnI。

图6为Real-time PCR分析拟南芥RNAi株系对BMIF基因的抑制。

图7为南方根结线虫侵染拟南芥35天后每棵根内线虫总数。

图8为南方根结线虫侵染拟南芥35天后根内雌成虫数量。

图9为南方根结线虫侵染拟南芥35天后每棵根根结数。

图10为BMIF RNAi干扰株系对南方根结线虫的防效。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1南方根结线虫BMIF基因的获得

取接种南方根结线虫45-60天的番茄根系，洗净后挑取卵块在无菌水中，25摄氏度条件下孵化，离心收集第二天孵化的新鲜的二龄幼虫，液氮冷冻，组织研磨器破碎样品，用磁珠法(Invitrogen)提取mRNA，利用Super ScriptTMⅢReverse Transcriptase Kit(Invitrogen)反转录得到南方根结线虫二龄幼虫cDNA。我们通过搜索NCBI，发现在南方根结线虫和北方根结线虫的EST库中均有与动物寄生虫MIF同源的基因(基因编号：CK984698，CF804195)，通过查找南方根结线虫全基因组序列(http://meloidogyne.toulouse.inra.fr/)，发现其有两个拷贝串联排列。根据模式线虫(C.elegans)MIF序列设计保守引物，PCR扩增得到包含完整ORF区的MIF基因全序列。根据已克隆到的MIF序列，对MIF基因在基因组上的存在方式进行了初步分析，根据其所在基因组DNA序列设计引物，经过不同对引物组合进行PCR扩增，得到不同扩增条带。测序后与南方根结线虫基因组序列进行比对，发现在南方根结线虫中可能至少存在三种不同形式的MIF蛋白(图1)，并且其可能存在串联重复排列方式。以南方根结线虫cDNA为模板，分别用另外两个亚型的MIF特异引物通过PCR扩增得到另外两个亚型的MIF编码区序列，分别命名为BMIF和CMIF，之前所得到的MIF基因命名为AMIF。AMIF、BMIF和CMIF编码区分别长285bp(如SEQID No.1所示)、342bp(如SEQ ID No.2所示)和339bp(如SEQ ID No.3所示)，BMIF和CMIF与其他物种的MIF基因长度相当，AMIF基因较短为南方根结线虫中所特有的。

实施例2BMIF基因在南方根结线虫不同虫态的表达

取接种南方根结线虫45-60天的番茄根系，洗净后挑取卵块在无菌水中，25摄氏度条件下孵化，离心收集第二天孵化的新鲜的二龄幼虫；将洗净的根经过酶消解，分离、收集不同虫态的线虫。将不同虫态的线虫液氮冷冻，组织研磨器破碎样品，用磁珠法(Invitrogen)提取mRNA，利用Super ScriptTMⅢ Reverse Transcriptase Kit(Invitrogen)反转录得到南方根结线虫不同虫态cDNA。以南方根结线虫Tublin基因为内参，Real-time PCR检测各虫态BMIF基因的表达差异(图2)。

Real-time PCR反应体系

Real-time PCR所用引物：

BMIF-realF1：5’-GCCAGAATCCTACGTTAT-3’

BMIF-realR1：5’-AGCAAAAGTCTTTCCATT-3’

Mi Tub qRT-F1：5'-AAGAGGCTGAGGGTTGTGATTG-3'

Mi Tub qRT-R1：5'-GAACAGAAAGAGTTGCGTTGTAGG-3'

Real-time PCR反应条件：95℃30s；95℃5s，60℃31s，40个循环；95℃15s；60℃60s；95℃15s。

Real-time PCR结果表明，相对于侵染前的J2幼虫，卵中BMIF基因表达量最低，下调了约2.97倍。侵染后的J2幼虫中BMIF基因表达是侵染前J2期的1.42倍，J3期幼虫MIF基因上调了约1.67倍，雌虫BMIF基因上调了约1.22倍。虽各虫态间的BMIF基因表达差异不是很大，但能明显看出在J2、侵染后的J2和J3幼虫中有上升趋势，因此可以推测出BMIF基因可能在寄生过程中参与逃避植物的免疫反应，帮助建立寄生关系。

实施例3BMIF基因在南方根结线虫体壁表达

根据MIF基因序列设计了239bp的原位杂交探针，进行PCR鉴定(图3)。将南方根结线虫J2期幼虫固定，分别用DIG标记的MIF基因的反义探针和正义探针进行杂交、显色，显微镜下进行观察(图4)。在线虫体壁能看到明显的杂交信号，颜色变深，说明该基因可能在根结线虫体壁肌肉中表达，而应用正义探针作为对照的杂交反应没有观察到杂交信号，虫体没有颜色变化。

实施例4MIF类基因植物体内RNAi干扰载体的构建

通过分析三种亚型MIF基因的氨基酸序列发现，它们有非常高的同源性，我们选择构建一个能够同时干扰三个基因表达的植物RNAi干扰载体。取BMIF编码区的1-329bp作为RNAi干扰片段，先将此片段分别按正反方向构建于pSAT5干扰载体Intron两侧，再将含有BMIF正反向干扰片段和Intron区的大片段用

XbaI/KpnI双酶切从pSAT5载体上切下，连接于psuper植物表达载体，构建psuper-BMIF-Ri植物转基因RNAi干扰载体(图5)，转入农杆菌GV3101。

实施例5MIF基因的体内RNAi干扰效应分析

通过农杆菌介导蘸花法获得转基因拟南芥，对收获的T3代纯合转基因植株进行线虫侵染后MIF基因的表达鉴定和抗线虫检测实验。南方根结线虫新鲜孵化的二龄幼虫接种移栽入土中一个月的拟南芥植株，平均每棵植株接种300条，取接种线虫后的拟南芥根材料，Trizol法提取总RNA，利用Super ScriptTMⅢReverse Transcriptase Kit(Invitrogen)反转录得到cDNA，以南方根结线虫Tublin基因为内参，real-time PCR分析线虫体内MIF类基因的表达量(图6)。

Real-time PCR反应体系

Real-time PCR所用引物：

BMIF-realF1：5’-GCCAGAATCCTACGTTAT-3’

BMIF-realR1：5’-AGCAAAAGTCTTTCCATT-3’

Mi Tub qRT-F1：5'-AAGAGGCTGAGGGTTGTGATTG-3'

Mi Tub qRT-R1：5'-GAACAGAAAGAGTTGCGTTGTAGG-3'

Real-time PCR反应条件：95℃30s；95℃5s，60℃31s，40个循环；95℃15s；60℃60s；95℃15s。

线虫侵染35天后完整取出根组织，清洗干净进行根内线虫染色，统计根内线虫总数和J4期与雌成虫总数。统计结果显示野生型拟南芥平均每棵植株内根结线虫总数约27.9条，J4期和雌成虫总数约为21.4条；空载体转基因植株平均每棵植株根内根结线虫总数约27.4条，J4期和雌成虫总数约为20.6条。BMIF RNAi不同的转基因株系T3-2、5、7、8平均每棵植株内根结线虫总数分别约为8.9、8.5、9.0、10.3条(图7)，J4期和雌成虫总数分别约为5.5、6.0、5.4、4.3条(图8)。统计发现，植物体内RNAi抑制MIF表达的转基因植株根内线虫总数有明显降低，根内的J4期和雌成虫总数也有明显降低。转基因RNAi株系根内线虫总数约为野生型和空载体对照的32.9％，J4期及雌成虫总数约为对照的25.2％。植物介导体内RNAi抑制了线虫MIF基因的表达，降低了线虫的侵染能力。35天统计线虫侵染后拟南芥植株根结数统计显示，野生型根结数约为29.5个，空载体根结数约为30个。BMIF RNAi不同的转基因株系T3-2、5、7、8平均每棵植株根结数约为9.2、9.5、9.2、8个，比野生型和空载体对照根结数有明显下降(图9)。线虫通过侵染BMIF RNAi植株，降低了自身体内MIF基因的表达，降低了转基因植物对南方根结线虫的敏感性，使转基因植株抗南方根结线虫性显著增强(图10)。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (5)

1.南方根结线虫MIF基因在降低线虫对植株致病性中的应用，其特征在于，所述MIF基因为如SEQ ID No.1所示的AMIF基因、如SEQ ID No.2所示的BMIF基因或如SEQ ID No.3所示的CMIF基因。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，通过抑制线虫MIF基因的表达，降低线虫对植物的危害。

3.南方根结线虫MIF基因在培育抗南方根结线虫转基因植株中的应用，其特征在于，所述MIF基因为如SEQ ID No.1所示的AMIF基因、如SEQ ID No.2所示的BMIF基因或如SEQ IDNo.3所示的CMIF基因。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，将BMIF基因编码区的1-329bp作为RNAi干扰片段，构建RNAi干扰载体，通过农杆菌介导的方法获得抗南方根结线虫的转基因植物。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，将BMIF基因编码区的1-329bp作为RNAi干扰片段，按正反方向构建于pSAT5干扰载体Intron两侧，再将含有BMIF正反向干扰片段和Intron区的大片段用XbaI/KpnI双酶切从pSAT5载体上切下，连接于psuper植物表达载体，构建psuper-BMIF-Ri植物转基因RNAi干扰载体，通过农杆菌介导法获得抗南方根结线虫的转基因植物。