CN105838727B - 用于控制昆虫侵袭的核苷酸序列及其方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于控制昆虫侵袭的核苷酸序列及其方法，所述分离的多核苷酸序列包括：(a)SEQ ID NO:1或2所示的多核苷酸序列；或(b)在严格条件下与(a)限定的多核苷酸序列杂交的多核苷酸序列；或(c)与(a)限定的多核苷酸序列具有80％以上同一性的多核苷酸序列；或(d)(a)限定的多核苷酸序列的至少19个连续核苷酸的多核苷酸序列，其中鞘翅目昆虫害虫摄取包含与所述多核苷酸序列互补的至少一条链的双链RNA，抑制所述鞘翅目昆虫害虫的生长；或(e)上述(a)、(b)、(c)或(d)限定的多核苷酸序列的互补序列。本发明首次公开了一个用于控制鞘翅目昆虫害虫褐足角胸叶甲的靶标序列，高效、特异、方便且成本低。

Description

用于控制昆虫侵袭的核苷酸序列及其方法
技术领域
本发明涉及一种用于控制昆虫侵袭的核苷酸序列及其方法，特别是涉及一种利用RNAi技术降低或关闭褐足角胸叶甲体内靶标序列的表达来控制褐足角胸叶甲的方法。
背景技术
农田作物通常是昆虫攻击的目标。在过去数十年中，关于开发用于作物中昆虫侵袭的更为有效的方法和组合物，已有了一些实质性的进展。化学杀虫剂对于控制有害生物侵袭是比较有效的手段。但是，使用化学杀虫剂同时也有很多缺点。首先化学杀虫剂是非选择性的，人们意欲应用化学杀虫剂来控制对多种作物和其他植物来说有害的昆虫，但是由于其缺乏选择性，化学杀虫剂对于非目标的生物也会造成伤害，例如蚯蚓等。并且，在化学杀虫剂应用过的一段时间，通常会使田野贫瘠。化学杀虫剂持续存在于环境中，通常很慢被代谢。这种缓慢代谢，使得作物及环境中存在化学杀虫剂的残留，它们会积累于食物链中，特别是高等食肉动物的食物链中。这些化学杀虫剂的积累导致对更高端的物种诱导了疾病，例如人类的癌症。因此人们强烈需要对环境友善的方法用于控制或根除作物生产中的昆虫侵袭，即选择性的，环境友好的，生物可降解的，并且能很好地用于有害生物抗性管理体系的方法。
在过去的几十年中，开发用于控制植物虫害的有效方法已取得了实质性的进展。化学杀虫剂虽然对于根除植物害虫非常有效，但是其对于非靶标昆虫也会施加作用，同时化学杀虫剂持续存在于环境中，不仅对环境造成不可逆的污染，还会导致抗药性昆虫的出现。微生物杀虫剂，特别是从苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)菌株所获得的杀虫剂，作为化学杀虫剂的替代品，在农业生产中发挥了重要作用，其对包括鳞翅目、双翅目和鞘翅目等昆虫具有一定的杀虫活性，但是微生物杀虫剂对于施药环境的要求比较高，如果环境不适合这些微生物的生长，在生产上则需要重复施用，有些甚至重复施用也不能达到控制害虫的目的，大大增加了生产成本。通过基因工程将编码Bt杀虫蛋白的一种或多种基因转入植物中，可获得一些害虫抗性增强的转基因植物，例如经基因工程产生Cry毒素的玉米和棉花植物已经广泛应用于美国的农业生产中，并且为农民提供了传统害虫控制方法的可选方案。但是目前开发的含有Cry毒素的转基因作物只能用于防治范围相对狭窄的害虫，而尚未有能够防治刺吸式害虫的产品。而刺吸式害虫因其繁殖速度快，分布区域广，正在成为已开发的转基因作物中的最主要害虫。
本领域中已报道了反义方法和组合物，它们被相信能通过单链RNA分子(理论上，能在体内与高度互补的正义链RNA分子杂交)的合成施加其作用。反义技术难于在很多系统中使用，这有三个主要原因。首先，转化细胞中表达的反义序列不稳定。第二，转化细胞中表达的反义序列的不稳定性随之对将该序列运送到远离转基因细胞的宿主、细胞类型或生物系统造成困难。第三，随着不稳定性和反义序列的运送遇到的困难对于如下企图来说也制造困难，所述企图是：在编码该反义序列的重组细胞内部提供能有效调节目标正义核苷酸序列表达水平的剂量。
RNA干扰或RNAi是用以在细胞或整个生物体环境下以序列特异性方式下调基因表达的一种方法，其通过特异性靶向选择和高效mRNA遏制，可以达到定向干涉靶基因表达的目的。虽然利用RNAi技术来进行害虫防治是本领域的已知的，但是将这种技术用作控制昆虫侵袭措施的关键因素是选择最适当的靶基因，即功能缺失导致必需生物过程严重破坏和/或生物体死亡的那些基因。因此，本发明将下调害虫中的特定靶基因作为一种手段来实现控制昆虫侵袭，特别是控制植物的昆虫侵袭。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于控制昆虫侵袭的核苷酸序列及其方法，即利用RNAi技术按下述方式来下调靶标序列的表达：削弱昆虫存活、生长、繁殖、定殖特定环境和/或侵袭寄主的能力，以实现控制昆虫侵袭及由其造成的损害。
为实现上述目的，本发明提供了一种分离的多核苷酸序列，包括：
(a)SEQ ID NO:1或2所示的多核苷酸序列；或
(b)在严格条件下与(a)限定的多核苷酸序列杂交的多核苷酸序列；或
(c)与(a)限定的多核苷酸序列具有80％以上同一性的多核苷酸序列；或
(d)(a)限定的多核苷酸序列的至少17个连续核苷酸的多核苷酸序列，其中鞘翅目昆虫害虫摄取包含与所述多核苷酸序列互补的至少一条链的双链RNA，抑制所述鞘翅目昆虫害虫的生长；或
(e)上述(a)、(b)、(c)或(d)限定的多核苷酸序列的互补序列。
进一步地，所述多核苷酸序列还包括所述多核苷酸序列的互补序列。
更进一步地，所述多核苷酸序列还包括间隔序列。
优选地，所述多核苷酸序列为SEQ ID NO:3或4。
为实现上述目的，本发明还提供了一种表达盒，包含在有效连接的调控序列调控下的所述多核苷酸序列。
为实现上述目的，本发明还提供了一种包含所述多核苷酸序列或所述表达盒的重组载体。
为实现上述目的，本发明还提供了一种所述多核苷酸序列用于干扰鞘翅目昆虫害虫靶标序列表达或抑制鞘翅目昆虫害虫生长的用途。
为实现上述目的，本发明还提供了一种干扰核糖核酸序列，所述干扰核糖核酸序列在被鞘翅目昆虫害虫摄入后起到下调所述鞘翅目昆虫害虫中至少一种靶标序列表达的作用，其中所述干扰核糖核酸序列包含至少一个沉默元件，其中所述沉默元件是包含退火的互补链的一个双链RNA区域，其中一条链包含与所述靶标序列内的一个靶标片段至少部分地互补的一个核苷酸序列或由其组成，所述靶标序列包含所述多核苷酸序列。
进一步地，所述沉默元件包含与所述靶标序列内的一个靶标片段互补至少部分地互补的一个至少19个连续核苷酸的序列或由其组成。
可选择地，所述干扰核糖核酸序列包含至少两个沉默元件，每一个所述沉默元件包含与所述靶标序列内的一个靶标片段至少部分地互补的一个核苷酸序列或由其组成。
进一步地，所述沉默元件各自包含与一个不同的靶标片段互补的一个不同的核苷酸序列或由其组成。
更进一步地，所述不同的靶标片段来源于单一靶标序列或来源于不同的靶标序列。
所述不同的靶标序列来源于相同的鞘翅目昆虫害虫或不同的鞘翅目昆虫害虫。
优选地，所述鞘翅目昆虫害虫为褐足角胸叶甲。
在上述技术方案的基础上，所述干扰核糖核酸序列还包括间隔序列。
具体地，所述干扰核糖核酸序列为SEQ ID NO:3或4。
为实现上述目的，本发明还提供了一种控制鞘翅目昆虫害虫侵袭的组合物，包含至少一种所述干扰核糖核酸序列和至少一种合适的载体、赋形剂或稀释剂。
进一步地，所述组合物包含一种表达或能够表达所述干扰核糖核酸序列的宿主细胞。具体地，所述宿主细胞是细菌细胞。
更进一步地，所述组合物是固体、液体或凝胶。具体地，所述组合物是杀虫喷雾剂。
可选择地，所述组合物还包含至少一种杀虫剂，所述杀虫剂为化学杀虫剂、马铃薯块茎特异蛋白、苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白、致病杆菌杀虫蛋白、光杆状菌杀虫蛋白、侧孢芽孢杆菌杀虫蛋白或球形芽孢杆菌杀虫蛋白。
为实现上述目的，本发明还提供了一种所述控制鞘翅目昆虫害虫侵袭的组合物用于预防和/或控制鞘翅目昆虫害虫侵袭的用途。
为实现上述目的，本发明还提供了一种控制鞘翅目昆虫害虫侵袭的方法，包括使鞘翅目昆虫害虫与有效量的至少一种所述干扰核糖核酸序列接触。
为实现上述目的，本发明还提供了一种产生控制鞘翅目昆虫害虫的植物的方法，包括将所述多核苷酸序列或所述表达盒或所述重组载体导入植物。
为实现上述目的，本发明还提供了一种用于保护植物免受由鞘翅目昆虫害虫引起的损伤的方法，包括将所述多核苷酸序列或所述表达盒或所述重组载体导入植物，导入后的植物在被鞘翅目昆虫害虫摄食后起到抑制所述鞘翅目昆虫害虫的生长的作用。
在上述技术方案的基础上，所述植物为玉米、大豆、谷子、高粱或香蕉。所述鞘翅目昆虫害虫为褐足角胸叶甲。
为实现上述目的，本发明还提供了一种蛋白质，包括：
(a)具有SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或
(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且具有控制鞘翅目昆虫害虫生长活性的由(a)衍生的蛋白质。
为实现上述目的，本发明还提供了一种基因，包括：
(a)编码所述蛋白质的核苷酸序列；或
(b)在严格条件下与(a)限定的核苷酸序列杂交且编码具有控制鞘翅目昆虫害虫生长活性的蛋白质的核苷酸序列；或
(c)如SEQ ID NO:22所示的核苷酸序列。
为实现上述目的，本发明还提供了一种表达盒，包含在有效连接的调控序列调控下的所述控制鞘翅目昆虫害虫生长的基因。
为实现上述目的，本发明还提供了一种包含所述控制鞘翅目昆虫害虫生长的基因或所述表达盒的DNA构建体。
为实现上述目的，本发明还提供了一种包含所述DNA构建体的重组载体。
本发明包含对鞘翅目昆虫害虫中一种或多种靶标序列的表达加以调节或抑制的方法，所述方法包括：将经稳定的双链RNA(如dsRNA)或其修饰形式(例如，小干扰RNA序列)的部分或全部引入到无脊椎有害昆虫体内细胞或细胞外环境中。在昆虫体内，dsRNA或siRNA进入到细胞中，对至少一种或多种靶标序列的表达加以抑制，并且这种抑制产生了减弱昆虫存活、生长、繁殖以及侵袭寄主的能力。
本发明提供了一组分离和纯化的多核苷酸序列，如SEQ ID NO:1或2。本发明提供稳定化的双链RNA分子，用于抑制鞘翅目害虫中从这些序列和片段表达靶标序列。稳定化的双链RNA包括至少两个编码序列，它们相对于至少一个启动子是有义和反义方向排列的，其中包含有义链和反义链的核苷酸序列通过至少约5-1000个核苷酸的间隔序列连接或相连，其中有义链和反义链可以是不同的长度，并且其中所述两个编码序列中的至少一个编码序列与SEQ ID NO:1或2所示的任何一个或多个核苷酸序列具有至少80％的序列同一性，至少90％，至少95％，至少98％，或100％的序列同一性。
当表达为dsRNA并且提供给害虫时，该片段可以定义为导致害虫死亡、摄食抑制、受阻或停止。该片段可以例如包含SEQ ID NO:1或2中任何一个或多个序列或其互补序列的至少约19，21，23，25，40，60，80，100，125或更多个连续核苷酸，或约19-约100个核苷酸，或更多。特别有用的是包括约19-300个与害虫靶标序列同源的核苷酸的dsRNA序列。本发明也提供了从任何所述多核苷酸序列表达的RNA，包括dsRNA。可以来自一种或多种靶害虫的单个序列构建选择用于表达基因抑制剂的序列，并且用于表达抑制一种或多种靶害虫中的单个基因或基因家族的RNA，或该DNA序列可从多种DNA序列构建为嵌合体。
本发明中所述的植物可以包括一种植物的任何生殖或繁殖材料，还可以包括植物细胞、植物原生质体、植物组织培养物、植物愈伤组织及在植物或植物的部分中完好的植物细胞，这些植物部分如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、核、穗、穗轴、外壳、茎、根、根尖等。
本发明所述的褐足角胸叶甲(Basilepta fulvipes)属于鞘翅目(Coleoptera)叶甲科(Chrysomeloidea)，是在我国普遍分布的害虫，可为害多种农作物和经济作物。在西南与华南地区主要以成虫为害香蕉；北方黄淮海地区以成虫害玉米、大豆、谷子、高粱等。目前对于褐足角胸叶甲主要采用化学防治。于初夏时，趁褐足角胸叶甲成虫尚未出土时，将高毒杀虫剂喷洒于香蕉园地表，杀死土中幼虫；或用杀虫剂作为包衣剂一部分包衣于夏播玉米种子上，以期杀死一部分的幼虫。但由于往往这些杀虫剂毒性较高，同时也将土壤有益生物也杀死，而褐足角胸叶甲由于幼虫躲藏在土层的不同深度，且土壤湿度等影响，导致杀虫剂并不能有效的对褐足角胸叶甲进行防治。而一旦羽化成虫后，该虫能飞善跳，食性杂，一般杀虫剂已无法对其进行防控。
本发明中所述的“控制昆虫”或“控制害虫”或“控制昆虫害虫”是指能够导致昆虫引起的损害受到限制且作用于昆虫的任何作用，包括但不限于杀死昆虫、抑制昆虫发育、以昆虫对植物提供较小损害的方式改变昆虫的繁殖力或生长、减少昆虫产生的后代数量、产生的正常昆虫更少、产生更易受捕食者攻击的昆虫或者阻止昆虫啃食植物。
本发明中所述的“靶标序列”为意图在昆虫中下调的任何序列。通过下调靶标序列来控制昆虫的侵扰，例如破坏昆虫中必需的生物过程。因此，优选的靶标序列包括但不限于在调控摄食、存活、生长、发育、生殖、侵袭以及侵染方面发挥关键作用的基因。当该靶标序列的表达被下调或受抑制时，至少20％的昆虫被杀死；或阻止/延缓/妨碍/延迟/阻碍了至少20％的昆虫的生长，阻止了至少20％的昆虫生殖，阻止了至少20％的昆虫通过生命周期的转变；或由昆虫引起的损害和/或昆虫侵染或侵扰环境、表面和/或植物或作物物种的能力降低；或至少20％的昆虫停止从其天然食物资源(如植物和植物产物)中摄食。这些靶标序列可以在昆虫细胞的全部或部分中表达。此外，这些靶标序列可以仅在昆虫的生命周期的特定阶段表达，例如成虫期或幼虫期或卵期。
在本发明中，术语“害虫”优选地是引起植物侵袭/侵扰/侵染的昆虫，且属于鞘翅目，优选为褐足角胸叶甲。术语“侵扰”、“侵染”和/或“侵袭”总体上通篇是可以互换使用的。
本发明“RNA干扰(RNAi)”是指一些RNA可以高效、特异地阻断体内特定基因的表达，促使mRNA降解，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型，其也称为RNA干预或干涉。RNA干扰是高度特异的在mRNA水平上的基因沉默机制。
本发明中“核酸”指从5’至3’末端阅读的脱氧核糖核酸或核糖核酸碱基的单或双链聚合物。可选地，“核酸”还可含有非天然存在的或被改变的碱基，其允许通过聚合酶的正确阅读，不会降低该核酸编码的多肽的表达。“核苷酸序列”指作为单独的单链存在或存在于二体中的核酸的正义和反义链。“核糖核酸”(RNA)包括RNAi(RNA干扰)、dsRNA(双链RNA)、siRNA(小干扰RNA)、mRNA(信使RNA)、miRNA(微小RNA)、tRNA(转运RNA、被或未被相应的酰化氨基酸加上电荷的)以及cDNA和基因组DNA以及DNA-RNA杂交体。“核酸片段”、“核酸序列片段”或更常见的“片段”将被本领域技术人员理解为：其包括基因组序列、核糖体RNA序列、转运RNA序列、信使RNA序列、操纵子序列和更小的工程改造过的核苷酸序列，所述序列表达或可被改造为表达蛋白质、多肽或肽。
本发明的“干扰核糖核酸”涵盖了能够使靶标序列的表达下调或“沉默”的任何类型的RNA分子，包括但不限于正义RNA、反义RNA、短干扰RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)、双链RNA(dsRNA)、发夹RNA(RNA)等。用于测定功能性干扰RNA分子的方法在本领域中是众所周知的并且已被披露。
本发明的干扰核糖核酸通过结合于靶标序列内的靶片段来实现特异性下调靶标序列表达。结合发生的原因是干扰RNA与靶片段的互补区之间的碱基配对。术语“沉默元件”是指包含与靶标序列内的靶片段互补或至少部分互补的核苷酸序列或由其组成的干扰核糖核酸的部分或区域，并且该部分或区域作为干扰核糖核酸的活性部分起作用以指导所述靶标序列表达的下调。该沉默元件包含与靶标序列内的靶片段互补的具有至少17个连续核苷酸，优选至少18或19个连续核苷酸，更优选至少21个连续核苷酸，甚至更优选至少22、23、24或25个连续核苷酸的序列或由其组成的干扰核糖核酸。
本发明中“靶标序列表达”是指由靶标序列编码的RNA转录物的转录和积累和/或mRNA翻译成蛋白质。术语“下调”是指干扰核糖核酸借以降低由靶标序列产生的初级RNA转录物、mRNA或蛋白质水平的本领域已知的方法中的任何一种。所述下调是指借以使由一种基因产生的RNA或蛋白质的水平降低至少10％，优选至少33％，更优选至少50％，甚至更优选至少80％的情形。特别地，下调是指如与适当控制的昆虫(例如尚未暴露于干扰核糖核酸或已经暴露于对照的干扰核糖核酸的昆虫)相比，在昆虫细胞内由一种基因产生的RNA或蛋白质的水平的至少80％，优选至少90％，更优选至少95％，并且最优选至少99％的降低。用于检测RNA或蛋白质水平的降低方法在本领域中是众所周知的，并且包括RNA溶液杂交、Northern杂交、逆转录(例如定量RT-PCR分析)、微阵列分析、抗体结合、酶联免疫吸附测定(ELISA)以及Western印迹。同时，下调还可以指如与适当的昆虫控制相比，RNA或蛋白质的水平降低到足以导致昆虫表型产生可检测到的变化，例如细胞死亡、生长停止等。因此，可以使用本领域中的常规技术，通过昆虫的表型分析来测量下调。
本发明中“对靶标序列表达的抑制”指靶标序列的蛋白和/或mRNA产物水平降低或不存在(低于可检测阈值)。特异性是指抑制靶标序列而对细胞其它基因无作用并且对产生dsRNA分子的细胞内任何基因没有影响的能力。
本发明中“正义”RNA指对应于下述序列或片段的RNA转录本，所述序列或片段以能通过植物细胞翻译成蛋白质的mRNA的形式存在。本发明中“反义”RNA指与植物中正常产生的mRNA的全部或一部分互补的RNA。反义RNA的互补可以是针对特定基因转录本的任何部分的，即5’非编码序列、3’非编码序列、内含子或编码序列。本发明中“RNA转录本”指对DNA序列进行的由RNA聚合酶催化的转录得到的产物。当RNA转录本是DNA序列的完全互补拷贝时，其被称为一级转录本，或者其可以是对一级转录本进行转录后加工获得的RNA，其被称为成熟RNA。
本发明中干扰核糖核酸通过RNA干扰或RNAi来下调基因的表达。RNAi是典型地由双链RNA分子(如短干扰RNA(siRNA))所介导的一种序列特异性基因调控方法。siRNA包含通过与反义RNA链互补碱基配对而退火的一个正义RNA链。siRNA分子的正义链或“引导链”包含与位于靶标序列的RNA转录物内的核苷酸序列互补的核苷酸序列。因此，siRNA的正义链能够通过沃森-克里克型(Waston-Crick-type)碱基配对与RNA转录物退火，并且靶向该RNA以在称为RNAi诱导沉默复合物或RISC的细胞复合物内降解。在本发明优选的干扰核糖核酸的情况下，沉默元件可以是包含退火的互补链的双链区，其中至少一条链包含与靶标序列内的靶片段序列互补或至少部分互补的核苷酸序列或由其组成的干扰核糖核酸。该双链区具有至少大约19至大约25个碱基对的长度，或者大约25至大约100个碱基对的长度，甚至是大约3000个碱基对的长度。
本发明中dsRNA分子可以充当活性siRNA分子的前体，这些活性siRNA分子引导RNA转录物至RISC复合物以进行随后的降解。存在于生物体或其细胞周围环境中的dsRNA分子可以被生物体摄取并且被称为DICER的酶加工以得到siRNA分子。可选择地，dsRNA分子可以在体内产生，即由存在于细胞(例如细菌细胞或植物细胞)内的编码该dsRNA的一种或多种多核苷酸转录，并且在摄入了更长的前体dsRNA后，通过宿主细胞内或优选在昆虫细胞内的DICER加工。该dsRNA可以由借助于互补碱基配对而退火的两条单独的(正义和反义)RNA链形成。可替代地，dsRNA可以是一条单链，它能够自身重新折叠以形成发夹RNA或茎环结构。在一条RNA的情况中，双链区或“茎”是由该RNA的两个区域或区段形成，这些区域或区段基本上是彼此的反向重复序列并且具有足够的互补性以允许形成一个双链区。在该分子的这个“茎区域”中可以存在一个或多个功能性双链沉默元件。反向重复区域典型地被RNA中称为“环”区的一个区域或区段隔开。这个区域可以包含任何赋予足够柔性以允许在RNA的侧翼互补区域之间发生自配对的核苷酸序列，总体而言，该环区实质上是单链的并且充当反向重复序列之间的间隔序列。
本发明中干扰核糖核酸包含至少一个双链区，典型地是该干扰核糖核酸的沉默元件，它包含通过与反义RNA链互补碱基配对而退火的正义RNA链，其中dsRNA分子的正义链包含与位于靶标序列的RNA转录物内的核苷酸序列互补的核苷酸序列。沉默元件或其至少一条链(当沉默元件为双链时)可以与靶标序列的靶片段完全地互补或部分地互补。术语“完全地互补”是指沉默元件核苷酸序列的所有碱基都与靶片段的碱基互补或“匹配”。术语“至少部分地互补”是指沉默元件的碱基与靶片段的碱基之间存在小于100％的匹配。本领域技术人员将理解，为了介导靶标序列表达的下调，沉默元件仅需要与靶片段至少部分的互补。本领域已知，相对于靶标序列而具有插入、缺失以及错配的RNA序列在RNAi方面仍然可以有效。优选的是，沉默元件与靶标序列的靶片段共有至少80％或85％的序列一致性，优选至少90％或95％的序列一致性，或更优选至少97％或98％的序列一致性并且再优选至少99％的序列一致性。可选择的，在24个部分地互补的核苷酸的每个长度上，如与靶片段相比，沉默元件可以包含1、2或3个错配。本领域技术人员所公知的，沉默元件与靶片段之间共有的互补性程度因有待下调的靶标序列或者基因表达有待控制的昆虫物种而改变。
本发明中靶片段可以选自靶标序列或其RNA转录物的任何合适区域或核苷酸序列。例如，靶片段可以位于靶标序列或RNA转录物的5’UTR或3’UTR内，或者基因的外显子或内含子区域内。
本发明的干扰核糖核酸可以包含一个或多个沉默元件，其中每个沉默元件包含与靶标序列内的靶片段至少部分地互补的核苷酸序列或由其组成，并且在被昆虫摄入后起到下调所述靶标序列表达的作用。术语“多个”意指至少两个，至少三个，至少四个等并且直到至少10、15、20个或至少30个。干扰核糖核酸包含单一沉默元件的多个拷贝，即结合于一个特定靶标序列内的一个特定靶片段的沉默元件的重复。干扰核糖核酸内的沉默元件还可以包含与不同靶片段互补的不同核苷酸序列或由其组成。应该清楚的是，与结合于不同靶片段的沉默元件组合的相同沉默元件的多个拷贝的组合亦在本发明的范围内。
本发明中为了实现鞘翅目昆虫中特定靶标序列的下调，不同靶片段可以来源于一种昆虫中的单一靶标序列。在这种情况下，沉默元件在干扰核糖核酸中可以按靶片段在靶标序列中存在的原始顺序组合，或者如与靶标序列中靶片段的顺序相比，沉默元件在干扰核糖核酸的环境中可以打乱并按任何等级次序随机地组合。
可选择地，不同靶片段代表着单一靶标序列，但是来源于不同昆虫物种。
可选择地，不同靶片段可以来源于不同靶标序列。如果将干扰核糖核酸用于预防和/或控制害虫侵袭，那么优选的是，不同靶标序列是选自调控昆虫的必需生物功能的基因的组，这些生物功能包括但不限于存活、生长、发育、生殖以及致病性。靶标序列可以调控相同或不同的生物途径或过程。
本发明中，由不同沉默元件靶向的不同基因来源于相同的昆虫。这种方法可用来实现针对单一昆虫的增强的攻击。具体地说，不同靶标序列可以在昆虫生命周期的不同阶段，例如成熟的成虫期、未成熟的幼虫期以及卵期有差别地表达。因此，本发明的干扰核糖核酸可以用于在昆虫生命周期的一个以上阶段中预防和/或控制昆虫侵袭。可替代地，由不同沉默元件靶向的不同基因来源于不同的昆虫，因此，本发明的干扰核糖核酸还可以用于同时预防和/或控制一种以上昆虫的侵袭。
本发明中沉默元件可以为干扰核糖核酸的一个连续区域或者可以通过接头序列的存在加以隔开。接头序列可以包含不与任何靶片段或靶标序列互补的短的随机核苷酸序列。该接头序列可以为条件性自切割RNA序列，优选的是pH敏感性接头或疏水敏感性接头。该接头还可以包含与内含子序列等效的核苷酸序列。该接头序列的长度可以在1个碱基对到约10000个碱基对的范围内，其条件是该接头不会削弱干扰核糖核酸下调基因表达的能力。
除了一个或多个沉默元件和任何接头序列外，本发明的干扰核糖核酸还可以包含至少一种另外的多核苷酸序列。该另外的多核苷酸序列选自(1)能够保护干扰核糖核酸免于RNA加工的序列；(2)影响干扰核糖核酸的稳定性的序列；(3)允许蛋白质结合以促进干扰核糖核酸被昆虫细胞摄入的序列；(4)促进大规模产生干扰核糖核酸的序列；(5)作为结合于受体或结合于昆虫细胞表面上的分子以促进摄入的适体的序列；或(6)催化昆虫细胞中干扰核糖核酸的加工并由此增强干扰核糖核酸的效力的序列。
本发明的干扰核糖核酸的长度需要足以被昆虫的细胞摄入并且使昆虫的靶标序列下调。长度的上限可以取决于(1)干扰核糖核酸被昆虫细胞摄取的要求和(2)干扰核糖核酸在昆虫细胞中被加工以通过RNAi途径介导基因沉默的要求，也可以通过生产方法和用于递送干扰核糖核酸到细胞中的配制品来制定长度。优选地，本发明的干扰核糖核酸的长度将在17与10000个核苷酸之间，优选在50与5000个核苷酸之间或在100与2500个核苷酸之间，更优选长度在80与2000个核苷酸之间。
本发明该干扰核糖核酸可以包含DNA碱基、非天然碱基或者糖-磷酸骨架的非天然骨架连接或修饰，例如以增强存储期间的稳定性或增强对核酸酶降解的抗性。此外，该干扰核糖核酸可以由本领域的普通技术人员通过手动或自动反应以化学方法或酶促方法产生。可选择地，该干扰核糖核酸可以由编码其的多核苷酸转录。因此，本发明提供了编码该干扰核糖核酸中的任何一种分离的多核苷酸。
本发明的多核苷酸可以通过常规分子克隆技术插入到本领域中已知的DNA构建体或载体中。该DNA构建体可以是重组DNA载体，例如细菌、病毒或酵母载体。该DNA构建体是一种表达构建体并且该多核苷酸可操作地连接到至少一个能够驱动多核苷酸序列表达的调控序列。术语“调控序列”是指能够影响可操作地连接的多核苷酸表达的任何核苷酸序列，包括但不限于启动子、增强子以及其它天然产生的或合成的转录激活元件。调控序列可以位于该多核苷酸序列的5’或3’端。术语“可操作地连接”是指调控序列与多核苷酸序列之间的功能性连接，该连接使得该调控序列驱动该多核苷酸的表达。可操作地连接的元件可以是连续的或不连续的。
本发明中调控序列可以是一种启动子，优选地，所述启动子为植物中可表达的启动子，所述的“植物中可表达的启动子”是指确保与其连接的该多核苷酸在植物细胞内进行表达的启动子。植物中可表达的启动子可为组成型启动子。指导植物内组成型表达的启动子的示例包括但不限于，来源于花椰菜花叶病毒的35S启动子、玉米ubi启动子、水稻GOS2基因的启动子等。备选地，植物中可表达的启动子可为组织特异的启动子，即该启动子在植物的一些组织内如在绿色组织中指导编码序列的表达水平高于植物的其他组织(可通过常规RNA试验进行测定)，如PEP羧化酶启动子。备选地，植物中可表达的启动子可为创伤诱导启动子。创伤诱导启动子或指导创伤诱导的表达模式的启动子是指当植物经受机械或由昆虫啃食引起的创伤时，启动子调控下的该多核苷酸的表达较正常生长条件下有显著提高。创伤诱导启动子的示例包括但不限于，马铃薯和西红柿的蛋白酶抑制基因(pinⅠ和pinⅡ)和玉米蛋白酶抑制基因(MPI)的启动子。
可选地，一种或多种转录终止序列可以被合并到本发明的表达构建体中。术语“转录终止序列”涵盖在转录单元末端处的控制序列，它发送初级转录物的转录终止、3’加工以及多聚腺苷酸化的信号。另外的调控元件包括但不限于转录或翻译增强子，可以被合并到表达的构建体中，例如，双增强CaMV35S启动子。
本发明中用于产生任一种干扰核糖核酸的方法，包括以下步骤：(1)使编码所述干扰核糖核酸的多核苷酸或包含该多核苷酸的DNA构建体与不含细胞的组分接触；(2)将编码所述干扰核糖核酸的多核苷酸或包含该多核苷酸的DNA构建体引入(如通过转化、转染或注射)到细胞中。
本发明中，包含任一种本发明的干扰核糖核酸、任一种本发明的多核苷酸或包含这些多核苷酸的DNA构建体的宿主细胞，可以是一种原核细胞，包括但不限于革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌细胞；或一种真核细胞，包括但不限于酵母细胞或植物细胞。优选地，所述宿主细胞是一种细菌细胞或植物细胞。本发明的该多核苷酸或DNA构建体在宿主细胞中可以作为染色体外元件存在或维持，或者可以稳定地合并到宿主细胞基因组中。
本发明中，当干扰核糖核酸在宿主细胞中表达和/或被用于预防和/或控制宿主生物体的昆虫侵扰的情况下，优选的是干扰核糖核酸不展现出显著的“脱靶”效应，即干扰核糖核酸不影响宿主内非靶标序列的表达。优选地，沉默基因不展现与除靶标序列的既定靶片段之外的核苷酸序列的显著互补性。沉默元件显示出与宿主细胞或生物体的任何基因的小于30％，更优选小于20％，更优选小于10％并且甚至更优选小于5％的序列一致性。如果宿主生物体的基因组序列数据是可得到的，那么人们可以使用标准的生物信息学工具交叉检验与沉默元件的一致性。在有17个连续核苷酸的区域内，更优选在有18个或19个连续核苷酸的区域内，并且最优选在有19个或20个或21个连续核苷酸的区域内，沉默元件与来自宿主细胞或生物体的基因之间不存在序列一致性。
本发明中用于预防和/或控制昆虫侵扰的组合物包含至少一种干扰核糖核酸和任选地至少一种合适的载体、赋形剂或稀释剂，其中该干扰核糖核酸在被昆虫摄入后起到下调所述昆虫内一种靶标序列表达的作用。该干扰核糖核酸包含至少一个沉默元件或由其组成，并且所述沉默元件是包含退火的互补链的一个双链RNA区域，其中一条链(正义链)包含与靶标序列内的一个靶片段至少部分地互补的一个核苷酸序列。靶标序列包括但不限于调控昆虫存活、生长、发育、生殖以及致病性的基因。可选地，该组合物包含至少一个宿主细胞，该宿主细胞包含至少一个干扰核糖核酸或编码该干扰核糖核酸的DNA构建体以及任选地至少一种合适的载体、赋形剂或稀释剂，其中在该宿主细胞被昆虫摄入后，该干扰核糖核酸起到下调所述昆虫内一种靶标序列表达的作用。
本发明的该组合物可以呈现施用给昆虫的任何合适的物理形式。例如，该组合物可以呈固体形式(粉末、球粒或诱饵)、液体形式(包括作为一种杀昆虫喷雾剂)或凝胶形式。该组合物可以是一种涂料、糊剂或粉末，它可以被施用到一种基质以便保护所述基质免遭昆虫的侵扰。该组合物可以用来保护对昆虫侵袭或由昆虫引起的损害敏感的任何基质或材料。
赋形剂的性质和组合物的物理形式可以因所希望处理的基质的性质而改变。例如，该组合物可以是一种液体，它被刷在或喷在有待处理的材料或基质之上或者印在有待处理的材料或基质中；或是一种涂料或粉末，它被施用到有待处理的材料或基质上。
本发明中，该组合物可以呈诱饵形式。该诱饵用来引诱昆虫与该组合物接触。在与之接触之后，该组合物随后被昆虫通过例如摄取而内化并且介导RNAi，从而杀死昆虫。所述诱饵可以包含一种食物，如一种基于蛋白质的食物，例如鱼粉。硼酸也可以用作一种诱饵。该诱饵可以取决于所靶向的物种。还可以使用一种引诱剂，例如，该引诱剂可以是一种信息素，如一种雄性或雌性信息素。引诱剂起到引诱昆虫接触组合物的作用，并且可以被靶向一种特定的昆虫或可以吸引整个范围内的昆虫，增加这些被引诱的昆虫与本发明所述组合物的接触机会，从而起到杀死大量昆虫的目的。诱饵可以呈任何合适的形式，如固体、糊剂、球粒或粉末形式。
诱饵还可以被昆虫带回到群落。然后诱饵可以充当该群落其他成员的食物来源，从而提供了对大量昆虫和潜在的整个昆虫群落的一种有效控制。诱饵还可以被提供在一个合适的“壳体”或“捕获器”中。
另外，与昆虫接触的组合物可以保留在昆虫的表皮上。当清洁时，无论是一只单独的昆虫清洁自身或是昆虫彼此清洁，这些组合物都可以被摄取并且可以由此介导它们在昆虫中的作用。这需要该组合物足够地稳定以使得即使暴露于外部环境条件一段时间(如数天)后，干扰核糖核酸仍保持完整并且能够介导RNAi。
本发明中该组合物可以呈一种喷雾剂形式提供。因此，人类使用者可以直接用该组合物喷昆虫。该组合物然后被昆虫内化，在昆虫体内，它可以介导RNA干扰，从而控制昆虫。喷雾剂优选的是一种加压/雾化喷雾剂或一种泵式喷雾剂。这些颗粒可以具有合适的大小以使得它们粘附在昆虫上，例如粘附在外骨骼上，并且可以从那里被吸收。
本发明中该组合物的载体是一种带静电的粉末或颗粒，它粘附在昆虫上。可选地，该组合物的载体可以包含磁性颗粒，这些颗粒粘附在昆虫表皮上。可选地，该组合物的载体包括金属颗粒，这些颗粒最初是未磁化的但能够在经历了由昆虫身体所提供的电场时变得磁性地极化。优选地，该组合物合并入一种载体，该载体增加了昆虫中干扰RNA的摄入。这种载体可以是一种基于脂质的载体，优选地包含以下各项中的一种或多种：水包油型乳液、胶束、胆固醇、脂多胺以及脂质体。促进本发明构建体摄入的其它试剂是本领域技术人员众所周知的并且包括聚阳离子、右旋糖酐以及阳离子脂质，如CS096、CS102等。可选地，该组合物的载体是一种核酸凝聚剂，优选的核酸凝聚剂包括亚精胺或硫酸鱼精蛋白或其衍生物。
在本发明的该组合物适用于预防和/或控制植物的昆虫侵袭的情况下，该组合物可以包含一种农业上合适的载体。这种载体可以是有待处理的植物可以耐受的任何材料，这种材料不会对环境或其中的其它生物体造成不当的损害并且它允许干扰核糖核酸针对昆虫保持有效。具体地说，本发明的该组合物可以根据生物杀虫剂行业中所用的常规农业实践进行配制以递送给植物。该组合物可以包含能够执行其他功能的另外组分，这些功能包括但不限于(1)增强或促进昆虫细胞对干扰核糖核酸的摄入和(2)使该组合物的活性组分稳定。在包含干扰核糖核酸的组合物中所含的这类另外组分可以是酵母tRNA或酵母总RNA。
该组合物可以被配制用于直接施用或配制为在使用之前需要稀释的初级组合物的浓缩形式。可选地，该组合物可以按试剂盒形式供应，该试剂盒包含在一个容器中的干扰核糖核酸或者包含/表达干扰核糖核酸的宿主细胞以及在一个单独的容器中的用于该RNA或宿主细胞的合适的稀释剂或载体。在本发明的应用中，该组合物可以被施用到处于植物发育的任何阶段的植物或植物的任何部分，例如在植物于田地中培养期间，将组合物施用给植物的地上部分；当植物种子在存储时或在将其种植到土壤中之后，将组合物施用给植物种子。总而言之，在植物生长的早期获得对昆虫的良好控制是重要的，因为这是植物可能受到昆虫最严重损害的时期。
本发明中，可以通过不同的技术将该组合物施用到昆虫的环境中，这些技术包括但不限于喷雾、雾化、撒粉、散布、倾注、涂布种子、种子处理、引入到土壤中以及引入到灌溉水中。在处理对昆虫侵扰敏感的植物时，可以在出现昆虫之前(出于预防的目的)或在昆虫侵扰的迹象开始出现之后(出于控制的目的)，将该组合物递送给植物或植物的一部分。
本发明的该组合物可以被配制成包含至少一种另外的活性剂。因此，该组合物可以按一种“分多部分的试剂盒”形式提供，试剂盒包括在一个容器中的含干扰核糖核酸的组合物和在一个单独的容器中的一种或多种合适的活性成分，例如化学或生物杀虫剂。可选地，该组合物可以按一种混合物形式提供，该混合物是稳定的并且彼此联合使用。
可以按一种互补方式作用于本发明的干扰核糖核酸的合适的活性成分包括但不限于以下各项：毒死蜱、丙烯菊酯、苄呋菊酯、四溴乙基、二甲醇-环丙烷甲酸(总体上被包括在液体组合物中)；以及氟蚁腙、阿维菌素、毒死蜱、氟虫胺、烯虫乙酯、氟虫腈(GABA受体)、氨基甲酸异丙基苯基甲酯、茚虫威、多氟脲(几丁质合成抑制剂)、炔咪菊酯、阿巴美丁(谷氨酸酯门控的氯离子通道)、吡虫啉(乙酰胆碱受体)(总体上被包括在诱饵组合物中)。优选地，就健康和环境考虑来说，已知活性成分是一种杀昆虫剂，如氟蚁腙和阿维菌素。
本发明中该组合物可以被配制成包含至少一种另外的农艺学试剂，例如一种除草剂或一种另外的杀虫剂。“另外的杀虫剂”或“第二杀虫剂”是指除了该组合物的第一或原始干扰RNA分子以外的一种杀虫剂。可选地，本发明的该组合物可以与至少一种其它农艺学试剂(例如一种除草剂或一种第二杀虫剂)组合递送。该组合物可以与一种除草剂组合提供，该除草剂选自本领域中已知的任何除草剂，例如草甘膦、咪唑啉酮、磺脲以及溴苯腈。该组合物还可以与至少一种另外的杀虫剂组合提供，该另外的杀虫剂可以选自本领域中已知的任何杀虫剂和/或可以包含一种干扰核糖核酸，该干扰核糖核酸在被一种昆虫摄入后起到下调所述昆虫中的一种靶标序列表达的作用。靶害虫是一种昆虫并且干扰核糖核酸是选自本发明干扰核糖核酸中的任何一个。该另外的杀虫剂包含一种干扰核糖核酸，它起到下调任何靶害虫中一种已知基因表达的作用。该组合物原始干扰核糖核酸和第二或另外的杀虫剂可以靶向相同的或不同的昆虫。例如，原始干扰核糖核酸和第二杀虫剂可以靶向不同的昆虫或可以靶向不同科或纲的昆虫，例如真菌或线虫或昆虫。本领域的普通技术人员应清楚如何测试干扰核糖核酸与其它农艺学试剂组合的协同效应。优选地，该组合物包含一种第一干扰核糖核酸和一种或多种另外的杀虫剂，每一种都对相同的昆虫具有毒性，其中这一种或多种另外的杀虫剂选自马铃薯块茎特异蛋白、苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白、致病杆菌杀虫蛋白、光杆状菌杀虫蛋白、侧孢芽孢杆菌杀虫蛋白、球形芽孢杆菌杀虫蛋白以及木质素。不同组分可以同时或依次递送到有待处理的区域或生物体。
RNAi是基于昆虫体内自身的一些RNAi途径当中的酶来起反应的。已经被证实的是，在一些生物中由于不具有将双链RNA吸收入细胞内的能力，或者是将双链RNA剪切成为siRNA的能力，或者是缺乏能够让siRNA特异性结合到目标基因上的能力，而导致在这些生物体内不能产生RNAi反应。
本发明用于预防和/或控制昆虫侵袭的方法包括使昆虫与有效量的至少一种干扰核糖核酸接触，其中该干扰核糖核酸在被所述昆虫摄入后起到下调必需的昆虫靶标序列表达的作用。该必需的靶标序列可以是涉及于调控昆虫引发或维持侵扰所需的必需生物过程的任何昆虫的基因，该生物过程包括但不限于存活、生长、发育、生殖以及致病性。
本发明用于预防和/控制作物植物田地中的昆虫侵袭的方法包括在所述植物中表达有效量的该干扰核糖核酸，在该方法用于控制昆虫侵袭的情况下，术语“有效量”是指对昆虫产生一种表型作用以使得侵扰宿主生物体的昆虫数目减少和/或由该昆虫引起的损害量降低所需要的干扰核糖核酸的量或浓度。表型作用可以为昆虫的死亡并且使用干扰RNA实现了与对照昆虫相比，至少20％、30％、40％，优选至少50％、60％、70％，更优选至少80％或90％的昆虫死亡率。表型作用还可以包括但不限于妨碍昆虫生长、摄食停止以及减少产卵。因此，与对照昆虫相比，侵袭宿主生物体的昆虫的总数目可以减少至少20％、30％、40％，优选至少50％、60％、70％，更优选至少80％或90％。可选地，与对照昆虫相比，由昆虫引起的损害可以降低至少20％、30％、40％，优选至少50％、60％、70％，更优选至少80％或90％。因此，本发明可以用于实现至少20％、30％、40％，优选至少50％、60％、70％，更优选至少80％或90％的昆虫控制。
本发明的方法和组合物可以用于通过在害虫的食物中提供本发明一种或多种包含dsRNA分子的组合物，在任何害虫宿主、害虫共生体或害虫存在的环境内部或表面上限制或消除鞘翅目害虫的侵袭，优选为褐足角胸叶甲。该方法对于防止昆虫攻击植物特别有益，害虫限定为消化系统的pH为大约4.5至大约9.5，大约5至大约9，大约6至大约7以及大约pH7.0。
本发明的核苷酸序列可以包含被“间隔序列”分离开的反向重复。间隔序列可以是包含下述任何核苷酸序列的区域，如果需要的话，所述核苷酸序列能促进每段重复之间二级结构形成。间隔序列是用于mRNA的正义或反义编码序列的一部分。或者，间隔序列可以包含能与核酸分子共价连接的核苷酸或其同源物的任何组合。间隔序列可包含长度为至少大约10-100个核苷酸的核苷酸序列，或者长度为至少大约100-200个核苷酸，长度为至少大约200-400个核苷酸，或者长度为至少大约400-500个核苷酸。
本发明中将该干扰核糖核酸“引入”植株时，其表示可通过直接转化的方法发生，所述方法例如对植物组织的农杆菌介导的转化、微粒发射轰击、电穿孔等；或者可通过将具有异源核苷酸序列的植株与另一植株杂交来进行，使得后代具有并入它们基因组的核苷酸序列。此类育种技术是本领域技术人员公知的。
本发明提供了一种用于控制昆虫侵袭的核苷酸序列及其方法，具有以下优点：
1、本发明首次公开了用于控制鞘翅目昆虫害虫褐足角胸叶甲的靶标序列，同时验证了基于这个靶标序列获得的核酸抑制物可直接用于控制鞘翅目昆虫害虫侵袭。
2、高度特异。本发明用于控制鞘翅目昆虫害虫褐足角胸叶甲的靶片段不影响宿主内的非靶标序列的表达。
3、避免产生抗性。本发明提供了用于控制鞘翅目昆虫害虫褐足角胸叶甲的靶标序列，不定期的替换靶标序列或者混用靶标序列可避免褐足角胸叶甲产生抗性。
4、本发明利用的RNAi技术具有高效性和特异性，可将获得的dsRNA直接应用于田间控制鞘翅目昆虫害虫侵袭，方便且成本低，环境兼容性好。
下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
图1为本发明用于控制昆虫侵袭的核苷酸序列及其方法的重组表达载体DBN110017载体示意图。
具体实施方式
下面通过具体实施例进一步说明本发明用于控制昆虫侵袭的核苷酸序列及其方法的技术方案。
第一实施例、褐足角胸叶甲靶标序列的确定
通过全转录组测序，获得褐足角胸叶甲的幼虫和成虫的转录组，从各个代谢途径中筛选出来自褐足角胸叶甲5个候选基因的7个靶标序列，具体信息如表1所示：
表1、褐足角胸叶甲5个候选基因的具体信息表
第二实施例、植物表达载体的构建
按照花椰菜花叶病毒35S启动子-靶标序列正义链-间隔序列-靶标序列反义链联接在一起，并和能赋予潮霉素选择的标记基因Hpt形成表达载体。
正义引物两端分别带有EcoR I和HindⅢ酶切位点，反义引物两端分别带有Xho I和Sac I酶切位点，间隔序列引物两端分别带有HindⅢ和Sac I酶切位点。
将含有正义链的重组克隆载体经EcoR I和HindⅢ双酶切，并回收正义链片段。将重组表达载体DBNBC-01做同样的双酶切回收线性化的质粒，与目的片段r1连接，得到重组表达载体DBNBC-01-r1。将重组表达载体DBNBC-01-r1经Xho I和Sac I双酶切，并回收线性化质粒。将含有反义链的重组克隆载体经Xho I和Sac I双酶切，并回收反义链片段。将双酶切后的重组表达载体DBNBC-01-r1与反义链片段进行连接，得到重组表达载体DBNBC-01-r1X2。将重组表达载体DBNBC-01-r1X2和带有间隔序列的puc-Spacer分别用HindⅢ和Sac I双酶切，回收间隔序列和线性化的DBNBC-01-r1X2，并将两者连接，构建成含有花椰菜花叶病毒35S启动子-靶标序列正义链-间隔序列-靶标序列反义链的重组表达载体DBN110017。利用常规的酶切方法构建载体是本领域技术人员所熟知的，重组表达载体DBN110017的载体示意图如图1所示(Kan：卡那霉素基因；RB：右边界；prCaMV35S：花椰菜花叶病毒35S(SEQ IDNO:15)；r1(SEQ ID NO:3)：靶标序列1的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)+间隔序列+靶标序列1的反向互补核苷酸序列；tNos：胭脂碱合成酶基因的终止子(SEQ ID NO:16)；Hpt：潮霉素磷酸转移酶基因(SEQ ID NO:17)；LB：左边界)。
将重组表达载体DBN110017用热激方法转化大肠杆菌T1感受态细胞，其热激条件为：50μl大肠杆菌T1感受态细胞、10μl质粒DNA(重组表达载体DBN110017)，42℃水浴30秒；37℃振荡培养1小时(100rpm转速下摇床摇动)；然后在含50mg/L卡那霉素(Kanamycin)的LB固体平板(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，琼脂15g/L，用NaOH调pH至7.5)上于温度37℃条件下培养12小时，挑取白色菌落，在LB液体培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，卡那霉素50mg/L，用NaOH调pH至7.5)中于温度37℃条件下培养过夜。碱法提取其质粒。将提取的质粒用PCR进行测序鉴定，结果表明重组表达载体DBN110017构建正确。
按照上述方法构建重组表达载体DBN110018(r2(SEQ ID NO:4)：靶标序列2的核苷酸序列(SEQ ID NO:2)+间隔序列+靶标序列2的反向互补核苷酸序列)、DBN100999(r3(SEQID NO:7)：靶标序列3的核苷酸序列(SEQ ID NO:5)+间隔序列+靶标序列3的反向互补核苷酸序列)、DBN110000(r4(SEQ ID NO:8)：靶标序列4的核苷酸序列(SEQ ID NO:6)+间隔序列+靶标序列4的反向互补核苷酸序列)、DBN110013(r5(SEQ ID NO:10)：靶标序列5的核苷酸序列(SEQ ID NO:9)+间隔序列+靶标序列5的反向互补核苷酸序列)、DBN110016(r6(SEQ IDNO:12)：靶标序列6的核苷酸序列(SEQ ID NO:11)+间隔序列+靶标序列6的反向互补核苷酸序列)和DBN110041(r7(SEQ ID NO:14)：靶标序列7的核苷酸序列(SEQ ID NO:13)+间隔序列+靶标序列7的反向互补核苷酸序列)，将重组表达载体DBN110018、DBN100999、DBN110000、DBN110013、DBN110016和DBN110041用热激方法转化大肠杆菌T1感受态细胞，并碱法提取其质粒。对质粒进行PCR鉴定，并将PCR产物进行测序鉴定，确定重组表达载体DBN110018、DBN100999、DBN110000、DBN110013、DBN110016和DBN110041构建正确。
第三实施例、重组表达载体转化农杆菌
对己经构建正确的重组表达载体DBN110017、DBN110018、DBN100999、DBN110000、DBN110013、DBN110016和DBN110041用液氮法转化到农杆菌LBA4404(Invitrogen，Chicago，USA，CAT：18313-015)中，其转化条件为：100μL农杆菌LBA4404、3μL质粒DNA(重组表达载体)；置于液氮中10分钟，37℃温水浴10分钟；将转化后的农杆菌LBA4404接种于LB试管中于温度28℃、转速为200rpm条件下培养2小时，涂于含50mg/L的利福平(Rifampicin)和100mg/L的卡那霉素(Kanamycin)的LB平板上直至长出阳性单克隆，挑取单克隆培养并提取其质粒，用限制性内切酶EcoRI和Xho I对重组表达载体DBN110017、DBN110018、DBN100999、DBN110000、DBN110013、DBN110016和DBN110041酶切后进行酶切验证，结果表明重组表达载体DBN110017、DBN110018、DBN100999、DBN110000、DBN110013、DBN110016和DBN110041结构完全正确。
第四实施例、获得转基因玉米植株
按照常规采用的农杆菌侵染法，将无菌培养的玉米品种综31(Z31)的幼胚与第三实施例所述的农杆菌共培养，以将第二实施例中构建的重组表达载体DBN110017、DBN110018、DBN100999、DBN110000、DBN110013、DBN110016和DBN110041中的T-DNA(包括r1至r7核苷酸序列、花椰菜花叶病毒35S基因的启动子序列、Hpt基因和tNos终止子序列)转入到玉米染色体组中，获得了转入r1核苷酸序列的玉米植株、转入r2核苷酸序列的玉米植株、转入r3核苷酸序列的玉米植株、转入r4核苷酸序列的玉米植株、转入r5核苷酸序列的玉米植株、转入r6核苷酸序列的玉米植株和转入r7核苷酸序列的玉米植株；同时以野生型玉米植株作为对照。
对于农杆菌介导的玉米转化，简要地，从玉米中分离未成熟的幼胚，用农杆菌悬浮液接触幼胚，其中农杆菌能够将r1核苷酸序列、r2核苷酸序列、r3核苷酸序列、r4核苷酸序列、r5核苷酸序列、r6核苷酸序列、r7核苷酸序列传递至幼胚之一的至少一个细胞(步骤1：侵染步骤)。在此步骤中，幼胚优选地浸入农杆菌悬浮液(OD660＝0.4-0.6，侵染培养基(MS盐4.3g/L、MS维他命、干酪素300mg/L、蔗糖68.5g/L、葡萄糖36g/L、乙酰丁香酮(AS)40mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)1mg/L，pH5.3))中以启动接种。幼胚与农杆菌共培养一段时期(3天)(步骤2：共培养步骤)。优选地，幼胚在侵染步骤后在固体培养基(MS盐4.3g/L、MS维他命、干酪素300mg/L、蔗糖20g/L、葡萄糖10g/L、乙酰丁香酮(AS)100mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)1mg/L、琼脂8g/L，pH5.8)上培养。在此共培养阶段后，可以有一个选择性的“恢复”步骤。在“恢复”步骤中，恢复培养基(MS盐4.3g/L、MS维他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)1mg/L、植物凝胶3g/L，pH5.8)中至少存在一种己知抑制农杆菌生长的抗生素(头孢霉素)，不添加植物转化体的选择剂(步骤3：恢复步骤)。优选地，幼胚在有抗生素但没有选择剂的固体培养基上培养，以消除农杆菌并为侵染细胞提供恢复期。接着，接种的幼胚在含选择剂(潮霉素)的培养基上培养并选择生长着的转化愈伤组织(步骤4：选择步骤)。优选地，幼胚在有选择剂的筛选固体培养基(MS盐4.3g/L、MS维他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、潮霉素50mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)1mg/L、植物凝胶3g/L，pH5.8)上培养，导致转化的细胞选择性生长。然后，愈伤组织再生成植物(步骤5：再生步骤)，优选地，在含选择剂的培养基上生长的愈伤组织在固体培养基(MS分化培养基和MS生根培养基)上培养以再生植物。
筛选得到的抗性愈伤组织转移到所述MS分化培养基(MS盐4.3g/L、MS维他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、6-苄基腺嘌呤2mg/L、潮霉素50mg/L、植物凝胶3g/L，pH5.8)上，25℃下培养分化。分化出来的小苗转移到所述MS生根培养基(MS盐2.15g/L、MS维他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、吲哚-3-乙酸1mg/L、植物凝胶3g/L，pH5.8)上，25℃下培养至约10cm高，移至温室培养至结实。在温室中，每天于28℃下培养16小时，再于20℃下培养8小时。
第五实施例、用TaqMan验证转基因玉米植株
分别取转入r1核苷酸序列的玉米植株、转入r2核苷酸序列的玉米植株、转入r3核苷酸序列的玉米植株、转入r4核苷酸序列的玉米植株、转入r5核苷酸序列的玉米植株、转入r6核苷酸序列的玉米植株和转入r7核苷酸序列的玉米植株的叶片约100mg作为样品，分别用Qiagen的DNeasy Plant Maxi Kit提取其基因组DNA，通过Taqman探针荧光定量PCR方法检测Hpt基因的拷贝数以确定r1至r7核苷酸序列的拷贝数。同时以野生型玉米植株作为对照，按照上述方法进行检测分析。实验设3次重复，取平均值。
检测Hpt基因拷贝数的具体方法如下：
步骤501、分别取转入r1核苷酸序列的玉米植株、转入r2核苷酸序列的玉米植株、转入r3核苷酸序列的玉米植株、转入r4核苷酸序列的玉米植株、转入r5核苷酸序列的玉米植株、转入r6核苷酸序列的玉米植株、转入r7核苷酸序列的玉米植株和野生型玉米植株的叶片各100mg，分别在研钵中用液氮研成匀浆，每个样品取3个重复；
步骤502、使用Qiagen的DNeasy Plant Mini Kit提取上述样品的基因组DNA，具体方法参考其产品说明书；
步骤503、用NanoDrop 2000(Thermo Scientific)测定上述样品的基因组DNA浓度；
步骤504、调整上述样品的基因组DNA浓度至同一浓度值，所述浓度值的范围为80-100ng/μL；
步骤505、采用Taqman探针荧光定量PCR方法鉴定样品的拷贝数，以经过鉴定已知拷贝数的样品作为标准品，以野生型玉米植株的样品作为对照，每个样品3个重复，取其平均值；荧光定量PCR引物和探针序列分别是：
以下引物和探针用来检测Hpt核苷酸序列：
引物1：CAGGGTGTCACGTTGCAAGA如序列表中SEQ ID NO:18所示；
引物2：CCGCTCGTCTGGCTAAGATC如序列表中SEQ ID NO:19所示；
探针1：TGCCTGAAACCGAACTGCCCGCTG如序列表中SEQ ID NO:20所示；
PCR反应体系为：
所述50×引物/探针混合物包含1mM浓度的每种引物各45μl，100μM浓度的探针50μl和860μl 1×TE缓冲液，并且在4℃，贮藏在琥珀试管中。
PCR反应条件为：
利用SDS2.3软件(Applied Biosystems)分析数据。
通过分析Hpt基因拷贝数的实验结果，进而证实r1至r7核苷酸序列均己整合到所检测的玉米植株的染色体组中，而且转入r1核苷酸序列的玉米植株、转入r2核苷酸序列的玉米植株、转入r3核苷酸序列的玉米植株、转入r4核苷酸序列的玉米植株、转入r5核苷酸序列的玉米植株、转入r6核苷酸序列的玉米植株和转入r7核苷酸序列的玉米植株均获得了单拷贝的转基因玉米植株。
第六实施例、鉴定转基因玉米花丝对褐足角胸叶甲的杀虫效果
将转入r1核苷酸序列的玉米植株、转入r2核苷酸序列的玉米植株、转入r3核苷酸序列的玉米植株、转入r4核苷酸序列的玉米植株、转入r5核苷酸序列的玉米植株、转入r6核苷酸序列的玉米植株和转入r7核苷酸序列的玉米植株的花丝对褐足角胸叶甲幼虫进行抗虫效果检测。
步骤601、选用经taqman鉴定为阳性单拷贝的DBN110017玉米转化事件(r1)5个，阳性单拷贝的DBN110018玉米转化事件(r2)5个，阳性单拷贝的DBN100999玉米转化事件(r3)3个，阳性单拷贝的DBN110000玉米转化事件(r4)3个，阳性单拷贝的DBN110013玉米转化事件(r5)5个，阳性单拷贝的DBN110016玉米转化事件(r6)4个，阳性单拷贝的DBN110041玉米转化事件(r7)5个，经taqman鉴定为阴性的玉米转化事件(NGM1)3个，每个转化事件选取3-5个株系，每一株系选取5棵苗；同时以野生型玉米植株作为对照(CK1)；在温室中种植至抽出雌穗；
步骤602、取步骤601中所述材料，待玉米抽出花丝后，每棵苗上取一小束长约3cm刚抽出的绿色花丝15根，放入1.5mL离心管中，离心管壁上标记相对应的材料编号；
步骤603、每个离心管中放入20头孵化时间不超过24小时的初孵褐足角胸叶甲幼虫，并盖紧盖子，离心管盖上用昆虫针扎至少一个小孔便于管内透气；
步骤604、将装有褐足角胸叶甲幼虫和相应花丝材料的离心管放入离心管盒中，将离心管盒放入底部铺有湿纱布的生测盒中并将生测盒放置于黑暗环境下；
步骤605、从接虫第2天开始，每隔一天取出离心管内的幼虫，并将存活的幼虫挑入新准备的装有相应花丝材料的离心管中，并记录每管的幼虫存活数，连续观察并记录12天，每个转化事件以5个株系为平均水平，每个载体以5个转化事件为平均存活数水平，实验结果如表2所示。
表2、玉米转化事件花丝饲喂褐足角胸叶甲的实验结果
表2的实验结果表明：转入r1核苷酸序列的玉米植株和转入r2核苷酸序列的玉米植株对褐足角胸叶甲均具有较好的抑制效果(极显著，P-value分别为0.004和0.008)，10天时对褐足角胸叶甲的致死率可高达80％左右；而转入其它核苷酸序列的玉米植株对褐足角胸叶甲并未造成显著致死效果，与对照之间进行单因素方差分析结果如表3所示：
表3、褐足角胸叶甲在生测后各天的存活率方差分析结果
表3的结果表明：DBN110017和DBN110018对褐足角胸叶甲的致死效果最显著，p-value均小于0.01而其它载体对于褐足角胸叶甲的致死效果的p-value未达到0.01的水平；即转入r1核苷酸序列的玉米植株和转入r2核苷酸序列的玉米植株对褐足角胸叶甲的致死效果最显著。
第七实施例、鉴定转基因玉米嫩叶对褐足角胸叶甲的杀虫效果
将转入r1核苷酸序列的玉米植株、转入r2核苷酸序列的玉米植株、转入r3核苷酸序列的玉米植株、转入r4核苷酸序列的玉米植株、转入r5核苷酸序列的玉米植株、转入r6核苷酸序列的玉米植株和转入r7核苷酸序列的玉米植株的嫩叶对褐足角胸叶甲成虫进行抗虫效果检测。
步骤701、选用经taqman鉴定为阳性单拷贝的DBN110017玉米转化事件(r1)5个，阳性单拷贝的DBN110018玉米转化事件(r2)5个，阳性单拷贝的DBN100999玉米转化事件(r3)3个，阳性单拷贝的DBN110000玉米转化事件(r4)4个，阳性单拷贝的DBN110013玉米转化事件(r5)3个，阳性单拷贝的DBN110016玉米转化事件(r6)5个，经taqman鉴定为阴性的玉米转化事件(NGM2)3个，每个转化事件选取3-5个株系，每一株系选取5棵苗；同时以野生型玉米植株作为对照(CK2)；在温室中种植至V3-V5期；
步骤702、取步骤701中所述材料，每棵苗上取约10×2cm带有叶脉的玉米叶片一块，用湿润的棉花包住叶片基部约2cm的区域；
步骤703、用吸虫器吸取褐足角胸叶甲成虫15-20头，放入生测杯中；
步骤704、放置成虫后，迅速将包好的玉米叶片从生测杯顶部小孔中放入，调整湿棉花位置至小孔被盖住，以防止成虫逃逸，在上述生测杯杯身上粘贴相应材料的标签；
步骤705、每隔一天更换一次叶片，具体为：将原叶片从生测杯顶部小孔中取出，用纸盖住小孔以避免成虫逃逸，轻晃杯身至活虫飞起，死亡昆虫会停滞在杯底，记录每个杯子中停滞的昆虫数量，记录完成后，将替换叶片放入杯中。实验结果如表4。
表4、玉米转化事件叶片饲喂褐足角胸叶甲的实验结果
表4的实验结果表明：转入r1核苷酸序列的玉米植株和转入r2核苷酸序列的玉米植株对褐足角胸叶甲均具有较好的抑制效果(极显著，P-value分别为0.02和0.04)，10天时对褐足角胸叶甲的致死率可高达80％左右；而转入其它核苷酸序列的玉米植株对褐足角胸叶甲并未造成显著致死效果。
综上所述，本发明首次公开了7个用于控制鞘翅目昆虫害虫褐足角胸叶甲的靶标序列，并利用RNAi技术获得了转基因植物，所述转基因植物是通过导入由褐足角胸叶甲靶标序列形成的dsRNA序列，来控制褐足角胸叶甲的侵袭，特别是靶标序列1和靶标序列2，高效且特异，避免褐足角胸叶甲产生抗性，同时环境兼容性好，方便且成本低。
最后所应说明的是，以上实施例仅用说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

Claims (25)

1.一种分离的多核苷酸，其特征在于，如SEQ ID NO:1或2所示的多核苷酸序列。
2.一种干扰多核苷酸，其特征在于，所述干扰多核苷酸由权利要求1所述多核苷酸通过间隔序列连接其互补序列组成。
3.根据权利要求2所述干扰多核苷酸，其特征在于，所述干扰多核苷酸的序列如SEQ IDNO:3或SEQ ID NO:4所示。
4.一种表达盒，其特征在于，包含在有效连接的调控序列调控下的权利要求1所述多核苷酸或权利要求2或3所述干扰多核苷酸。
5.一种包含权利要求1所述多核苷酸或权利要求2或3所述干扰多核苷酸或权利要求4所述表达盒的重组载体。
6.一种权利要求1所述多核苷酸或权利要求2或3所述干扰多核苷酸用于干扰褐足角胸叶甲靶标序列表达或抑制褐足角胸叶甲生长的用途。
7.一种干扰核糖核酸，其特征在于，所述干扰核糖核酸在被褐足角胸叶甲摄入后起到下调所述褐足角胸叶甲中至少一种靶标序列表达的作用，其中所述干扰核糖核酸包含至少一个沉默元件，其中所述沉默元件是包含退火的互补链的一个双链RNA区域，其中一条链为与所述靶标序列内的一个靶标片段互补的一个核苷酸序列，所述靶标片段为权利要求1所述多核苷酸。
8.根据权利要求7所述干扰核糖核酸，其特征在于，所述干扰核糖核酸包含至少两个沉默元件，每一个所述沉默元件为与所述靶标序列内的一个靶标片段互补的一个核苷酸序列。
9.根据权利要求8所述干扰核糖核酸，其特征在于，所述沉默元件各自包含与一个不同的靶标片段互补的一个不同的核苷酸序列或由其组成。
10.根据权利要求9所述干扰核糖核酸，其特征在于，所述不同的靶标片段来源于单一靶标序列或来源于不同的靶标序列。
11.根据权利要求10所述干扰核糖核酸，其特征在于，所述不同的靶标序列来源于褐足角胸叶甲或不同的鞘翅目昆虫害虫。
12.根据权利要求7-11任一项所述干扰核糖核酸，其特征在于，所述干扰核糖核酸还包括间隔序列。
13.根据权利要求12所述干扰核糖核酸，其特征在于，所述干扰核糖核酸的序列为SEQID NO:3或SEQ ID NO:4所对应的RNA序列。
14.一种控制褐足角胸叶甲侵袭的组合物，其特征在于，包含至少一种权利要求7-13任一项所述干扰核糖核酸和至少一种合适的载体、赋形剂或稀释剂。
15.根据权利要求14所述控制褐足角胸叶甲侵袭的组合物，其特征在于，所述组合物包含一种表达或能够表达所述干扰核糖核酸的宿主细胞。
16.根据权利要求15所述控制褐足角胸叶甲侵袭的组合物，其特征在于，所述宿主细胞是细菌细胞。
17.根据权利要求14-16任一项所述控制褐足角胸叶甲侵袭的组合物，其特征在于，所述组合物是固体、液体或凝胶。
18.根据权利要求17所述控制褐足角胸叶甲侵袭的组合物，其特征在于，所述组合物是杀虫喷雾剂。
19.根据权利要求14-16、18任一项所述控制褐足角胸叶甲侵袭的组合物，其特征在于，所述组合物还包含至少一种杀虫剂，所述杀虫剂为化学杀虫剂、马铃薯块茎特异蛋白、苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白、致病杆菌杀虫蛋白、光杆状菌杀虫蛋白、侧孢芽孢杆菌杀虫蛋白或球形芽孢杆菌杀虫蛋白。
20.根据权利要求17所述控制褐足角胸叶甲侵袭的组合物，其特征在于，所述组合物还包含至少一种杀虫剂，所述杀虫剂为化学杀虫剂、马铃薯块茎特异蛋白、苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白、致病杆菌杀虫蛋白、光杆状菌杀虫蛋白、侧孢芽孢杆菌杀虫蛋白或球形芽孢杆菌杀虫蛋白。
21.一种权利要求14-20任一项所述控制褐足角胸叶甲侵袭的组合物用于预防和/或控制褐足角胸叶甲侵袭的用途。
22.一种控制褐足角胸叶甲侵袭的方法，其特征在于，包括使褐足角胸叶甲与有效量的至少一种权利要求7-13任一项所述干扰核糖核酸接触。
23.一种产生控制褐足角胸叶甲的植物的方法，其特征在于，包括将权利要求1所述多核苷酸或权利要求2或3所述干扰多核苷酸或权利要求4所述表达盒或权利要求5所述重组载体导入植物。
24.一种用于保护植物免受由褐足角胸叶甲引起的损伤的方法，其特征在于，包括将权利要求1所述多核苷酸或权利要求2或3所述干扰多核苷酸或权利要求4所述表达盒或权利要求5所述重组载体导入植物，导入后的植物在被褐足角胸叶甲摄食后起到抑制褐足角胸叶甲的生长的作用。
25.根据权利要求23或24所述方法，其特征在于，所述植物为玉米、大豆、谷子、高粱或香蕉。
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V-ATPase分子结构与功能及其RNAi技术在害虫防治中的应用研究进展;刘希 等;《河南农业科学》;20141231;第43卷(第5期);第1-5页 *
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