CN103201385A

CN103201385A - 下调昆虫害虫中的基因表达

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Publication number: CN103201385A
Application number: CN2011800520621A
Authority: CN
Inventors: 蒂埃里·博盖尔特; 罗曼·雷马克斯; 扬·诺代
Original assignee: Devgen NV
Current assignee: Devgen NV
Priority date: 2010-10-27
Filing date: 2011-10-27
Publication date: 2013-07-10
Also published as: MX2013004358A; EP3587580A1; ES2750007T3; EP2633048B1; RU2662995C2; WO2012055982A2; US20200140884A1; US10941415B2; AU2011322510B2; MX356506B; US20180148737A1; MX2020006263A; AU2016208418A1; US20130291188A1; CA2815116A1; AU2018200332B2; ZA201302739B; EP2633048A2; US20210254093A1; AU2018200332B9

Abstract

本发明涉及对昆虫害虫物种侵扰的预防和/或控制。特别地，本发明涉及使用干扰核糖核酸(RNA)分子下调昆虫害虫中靶基因的表达。还描述了(i)表达或能够表达本发明干扰RNA并且(ii)对昆虫害虫物种侵扰具有抗性的转基因植物。还提供了包含本发明干扰RNA的组合物。

Description

下调昆虫害虫中的基因表达

技术领域

本发明一般性地涉及昆虫害虫物种侵扰的遗传控制，特别是植物害虫的预防和/或控制。更具体地，本发明涉及通过干扰核糖核酸(RNA)分子下调昆虫害虫物种中靶基因的表达。本发明还提供了(i)表达或能够表达本发明干扰RNA并且(ii)对昆虫害虫物种侵扰具有抗性的转基因植物。本发明还描述了包含本发明干扰RNA分子的组合物，其用于局部施用到植物上或植物周围的环境中。

背景技术

存在大量可侵染或侵扰多种环境和宿主生物体的昆虫害虫物种。昆虫害虫包括以下昆虫目的多个物种：半翅目(Hemiptera)(蝽)、鞘翅目(Coleoptera)(甲虫)、蚤目(Siphonaptera)(跳蚤)、蠊螂目(Dichyoptera)(蟑螂和螳螂)、鳞翅目(Lepidoptera)(蛾和蝴蝶)、直翅目(Orthoptera)(例如草蜢)和双翅目(Diptera)(苍蝇)。害虫侵扰可导致严重的损害。侵扰植物物种的昆虫害虫在农业上特别成问题，因为它们可对作物造成严重损害并且显著降低植物产量。多种不同类型的植物都对害虫侵扰敏感，包括经济作物，例如水稻、棉花、大豆、马铃薯和玉米。

通常，通过使用化学杀虫剂预防或控制昆虫害虫侵扰。但是，这些化学品不总是适用于处理作物，原因是它们可对其他物种有毒并且可引起显著的环境损害。在最近几十年中，研究者已开发了控制害虫侵扰的更加环境友好的方法。例如，使用了天然表达对昆虫害虫有毒的蛋白质的微生物，如苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)细菌。科学家还分离了编码这些杀虫蛋白的基因并将它们用于产生对昆虫害虫具有抗性的转基因作物，例如经基因工程改造为产生Cry家族蛋白质的玉米和棉花植株。

虽然细菌毒素在控制某些类型的害虫中非常成功，但是它们并非对所有的害虫物种都有效。因此，研究者们寻找了另一些更有针对性的害虫控制的方法，特别是将RNA干扰或“基因沉默”作为在遗传水平上控制害虫的手段的方法。

RNA干扰或“RNAi”是在细胞或整个生物体环境下以序列特异性方式下调基因表达的过程。现在，RNAi是目前本领域中成熟的用于抑制或下调各种生物体(包括害虫生物体，例如真菌、线虫和昆虫)中基因表达的技术。此外，之前的研究已示出下调昆虫害虫物种中的靶基因可用作控制害虫侵扰的手段。

WO2007/074405描述了抑制无脊椎动物害虫(包括科罗拉多马铃薯甲虫)中靶基因表达的方法。WO2005/110068描述了抑制无脊椎动物害虫(包括特别是西方玉米根虫(Western corn rootworm))中靶基因表达作为控制昆虫侵扰之手段的方法。另外，WO2009/091864描述了用于抑制昆虫害虫物种(包括来自草盲蝽(Lygus)属的害虫)中靶基因的方法。

虽然本领域已知RNAi用于下调害虫物种中基因表达的用途，但是将该技术用作害虫控制措施的成功取决于最适当靶基因的选择，即其中功能缺失导致必需生物过程的严重破坏和/或生物体死亡的那些基因。因此，本发明涉及将下调害虫中特定靶基因作为手段以实现昆虫害虫侵扰，特别是植物之昆虫害虫侵扰的更有效预防和/或控制。

发明内容

本发明人试图使用遗传方法来鉴定用于预防和/或控制昆虫害虫侵扰的改良手段。特别地，他们研究了RNAi下调基因的用途，其以此方式削弱害虫存活、生长、特定环境定殖和/或侵扰宿主生物体的能力，从而限制由害虫引起的损害。

本发明人现已发现，在昆虫害虫物种中单独或组合地进行RNAi介导的特定靶基因下调可用作控制害虫侵扰的有效手段。

在一个实施方案中，本发明涉及如下干扰核糖核酸(RNA或双链RNA)，其抑制或下调编码昆虫核糖体蛋白的靶基因的表达，所述昆虫核糖体蛋白例如核糖体蛋白L19(例如，CG2746Dm蛋白的昆虫直系同源物)、核糖体蛋白L40(例如，CG2960Dm蛋白的昆虫直系同源物)或核糖体蛋白S27A(例如，CG5271Dm蛋白的昆虫直系同源物)。

根据另一个实施方案，本发明涉及如下干扰核糖核酸(RNA或双链RNA)，其抑制或下调编码昆虫蛋白酶体亚基的靶基因的表达，所述昆虫蛋白酶体亚基例如Rpn6蛋白(例如，CG10149Dm蛋白的昆虫直系同源物)、Pros25蛋白(例如，CG5266Dm蛋白的昆虫直系同源物)、Rpn2蛋白(例如，CG11888Dm蛋白的昆虫直系同源物)、蛋白酶体β1亚基蛋白(例如，CG8392Dm蛋白的昆虫直系同源物)或Prosβ2蛋白(例如，CG3329Dm蛋白的昆虫直系同源物)。

根据又一个实施方案，本发明涉及如下干扰核糖核酸(RNA或双链RNA)，其抑制或下调编码以下蛋白质的靶基因的表达：昆虫COPI囊泡的β-外被体(例如，CG6223Dm蛋白的昆虫直系同源物)、COPI囊泡的γ-外被体(例如，1528Dm蛋白的昆虫直系同源物)、β’-外被体蛋白(例如，CG6699Dm蛋白的昆虫直系同源物)或COPI囊泡的ζ-外被体(例如，CG3948Dm蛋白的昆虫直系同源物)。

根据再一个实施方案，本发明涉及如下干扰核糖核酸(RNA或双链RNA)，其抑制或下调编码昆虫四次跨膜蛋白2A(Tetraspanine2A)(例如，CG11415Dm蛋白的昆虫直系同源物)的靶基因的表达，所述四次跨膜蛋白2A蛋白是推定的跨膜结构域蛋白。

根据另一个实施方案，本发明涉及如下干扰核糖核酸(RNA或双链RNA)，其抑制或下调编码属于肌动蛋白家族之昆虫蛋白质(例如，CG5409Dm蛋白的昆虫直系同源物)例如肌动蛋白5C(例如，CG4027Dm蛋白的昆虫直系同源物)的靶基因的表达。

根据又一个实施方案，本发明涉及如下干扰核糖核酸(RNA或双链RNA)，其抑制或下调编码昆虫泛素-5E蛋白(例如，CG32744Dm蛋白的昆虫直系同源物)的靶基因的表达。

根据再一个实施方案，本发明涉及如下干扰核糖核酸(RNA或双链RNA)，其抑制或下调编码昆虫Sec23蛋白(例如，CG1250Dm蛋白的昆虫直系同源物)的靶基因的表达，所述昆虫Sec23蛋白是参与胞内蛋白质转运的GTP酶(GTPase)激活物。

根据另一个实施方案，本发明涉及如下干扰核糖核酸(RNA或双链RNA)，其抑制或下调编码昆虫皱缩蛋白(crinkled protein)(例如，CG7595Dm蛋白的昆虫直系同源物)的靶基因的表达，所述昆虫皱缩蛋白是参与肌肉运动(motor)活动的非常规肌球蛋白。

根据又一个实施方案，本发明涉及如下干扰核糖核酸(RNA或双链RNA)，其抑制或下调编码昆虫歪脖蛋白(crooked neck protein)(例如，CG3193Dm蛋白的昆虫直系同源物)的靶基因的表达，所述昆虫歪脖蛋白参与细胞核选择性mRNA剪接的调节。

根据再一个实施方案，本发明涉及如下干扰核糖核酸(RNA或双链RNA)，其抑制或下调编码昆虫空泡型H+-ATP酶G亚基蛋白(vacuolarH+-ATPase G-subunit protein)(例如，CG6213Dm蛋白的昆虫直系同源物)的靶基因的表达。

根据另一个实施方案，本发明涉及如下干扰核糖核酸(RNA或双链RNA)，其抑制或下调编码昆虫Tbp-1——Tat结合蛋白(例如，CG10370Dm蛋白的昆虫直系同源物)的靶基因的表达。

因此，根据本发明的第一方面，提供了如下干扰核糖核酸(RNA或双链RNA)，其在被昆虫害虫物种摄入后起下调所述昆虫害虫中靶基因表达的作用，其中所述靶基因

(i)选自具有包含SEQ ID NO277、138、253、152、121、122、141、273、123、142、274、124、143、125至129、144、130、145、275、131、146、132、133、147、134、148、135、149、136、150、276、137、151、139、140、153、278、251、254、279、252、255、256、280、1、21、2、22、3、23、4、24、5、25、6、26、7、27、8、28、9、29、10、30、11、31、12、32、13、33、14、34、15、35、16、36、17、37、18、38、19、39、20或40或其互补序列中任一之核苷酸序列的基因，或具有如下核苷酸序列的基因：当将两条序列进行最佳比对和比较时，所述核苷酸序列与SEQ ID NO277、138、253、152、121、122、141、273、123、142、274、124、143、125至129、144、130、145、275、131、146、132、133、147、134、148、135、149、136、150、276、137、151、139、140、153、278、251、254、279、252、255、256、280、1、21、2、22、3、23、4、24、5、25、6、26、7、27、8、28、9、29、10、30、11、31、12、32、13、33、14、34、15、35、16、36、17、37、18、38、19、39、20或40或其互补序列中的任一具有至少75％，优选至少80％、85％、90％、95％、98％或99％的同一性；或者

(ii)选自具有由SEQ ID NO277、138、253、152、121、122、141、273、123、142、274、124、143、125至129、144、130、145、275、131、146、132、133、147、134、148、135、149、136、150、276、137、151、139、140、153、278、251、254、279、252、255、256、280、1、21、2、22、3、23、4、24、5、25、6、26、7、27、8、28、9、29、10、30、11、31、12、32、13、33、14、34、15、35、16、36、17、37、18、38、19、39、20或40或其互补序列中任一组成的核苷酸序列的基因；或者

(iii)选自具有包含SEQ ID NO277、138、253、152、121、122、141、273、123、142、274、124、143、125至129、144、130、145、275、131、146、132、133、147、134、148、135、149、136、150、276、137、151、139、140、153、278、251、254、279、252、255、256、280、1、21、2、22、3、23、4、24、5、25、6、26、7、27、8、28、9、29、10、30、11、31、12、32、13、33、14、34、15、35、16、36、17、37、18、38、19、39、20或40或其互补序列中任一之至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、110、125、150、175、200、225、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、9001000、1100或1115个连续核苷酸之片段的核苷酸序列的基因，或具有如下核苷酸序列的基因：当将包含所述片段之所述基因与SEQ IDNO277、138、253、152、121、122、141、273、123、142、274、124、143、125至129、144、130、145、275、131、146、132、133、147、134、148、135、149、136、150、276、137、151、139、140、153、278、251、254、279、252、255、256、280、1、21、2、22、3、23、4、24、5、25、6、26、7、27、8、28、9、29、10、30、11、31、12、32、13、33、14、34、15、35、16、36、17、37、18、38、19、39、20或40中的任一进行最佳比对和比较时，所述核苷酸序列与SEQ ID NO277、138、253、152、121、122、141、273、123、142、274、124、143、125至129、144、130、145、275、131、146、132、133、147、134、148、135、149、136、150、276、137、151、139、140、153、278、251、254、279、252、255、256、280、1、21、2、22、3、23、4、24、5、25、6、26、7、27、8、28、9、29、10、30、11、31、12、32、13、33、14、34、15、35、16、36、17、37、18、38、19、39、20或40或其互补序列中的任一具有至少75％，优选至少80％、85％、90％、95％、98％或99％的同一性；或者

(iv)选自具有包含SEQ ID NO277、138、253、152、121、122、141、273、123、142、274、124、143、125至129、144、130、145、275、131、146、132、133、147、134、148、135、149、136、150、276、137、151、139、140、153、278、251、254、279、252、255、256、280、1、21、2、22、3、23、4、24、5、25、6、26、7、27、8、28、9、29、10、30、11、31、12、32、13、33、14、34、15、35、16、36、17、37、18、38、19、39、20或40或其互补序列中任一之至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、110、125、150、175、200、225、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、9001000、1100或1115个连续核苷酸之片段的核苷酸序列的基因，并且其中当将所述片段与SEQ ID NO277、138、253、152、121、122、141、273、123、142、274、124、143、125至129、144、130、145、275、131、146、132、133、147、134、148、135、149、136、150、276、137、151、139、140、153、278、251、254、279、252、255、256、280、1、21、2、22、3、23、4、24、5、25、6、26、7、27、8、28、9、29、10、30、11、31、12、32、13、33、14、34、15、35、16、36、17、37、18、38、19、39、20或40中任一之对应片段进行最佳比对和比较时，所述片段之所述核苷酸序列与SEQ ID NO277、138、253、152、121、122、141、273、123、142、274、124、143、125至129、144、130、145、275、131、146、132、133、147、134、148、135、149、136、150、276、137、151、139、140、153、278、251、254、279、252、255、256、280、1、21、2、22、3、23、4、24、5、25、6、26、7、27、8、28、9、29、10、30、11、31、12、32、13、33、14、34、15、35、16、36、17、37、18、38、19、39、20或40或其互补序列中任一之所述对应片段具有至少75％，优选至少80％、85％、90％、95％、98％或99％的同一性；或者

(v)是具有包含SEQ ID NO277、138、253、152、121、122、141、273、123、142、274、124、143、125至129、144、130、145、275、131、146、132、133、147、134、148、135、149、136、150、276、137、151、139、140、153、278、251、254、279、252、255、256、280、1、21、2、22、3、23、4、24、5、25、6、26、7、27、8、28、9、29、10、30、11、31、12、32、13、33、14、34、15、35、16、36、17、37、18、38、19、39、20或40或其互补序列中任一之核苷酸序列的基因的昆虫害虫直系同源物，其中所述两个直系同源基因的序列相似到如下程度：使得当将所述两个基因进行最佳比对和比较时，所述直系同源物的序列与SEQ ID NO277、138、253、152、121、122、141、273、123、142、274、124、143、125至129、144、130、145、275、131、146、132、133、147、134、148、135、149、136、150、276、137、151、139、140、153、278、251、254、279、252、255、256、280、1、21、2、22、3、23、4、24、5、25、6、26、7、27、8、28、9、29、10、30、11、31、12、32、13、33、14、34、15、35、16、36、17、37、18、38、19、39、20或40中的任一具有至少75％，优选至少80％、85％、90％、95％、98％或99％的同一性；或者

(vi)选自具有编码如下氨基酸序列的核苷酸序列的基因：当将两条氨基酸序列进行最佳比对和比较时，所述氨基酸序列与由SEQ ID NO277、138、253、152、121、122、141、273、123、142、274、124、143、125至129、144、130、145、275、131、146、132、133、147、134、148、135、149、136、150、276、137、151、139、140、153、278、251、254、279、252、255、256、280、1、21、2、22、3、23、4、24、5、25、6、26、7、27、8、28、9、29、10、30、11、31、12、32、13、33、14、34、15、35、16、36、17、37、18、38、19、39、20或40中任一所示核苷酸序列编码的氨基酸序列具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的同一性；或者

(vii)选自具有编码如下氨基酸序列的核苷酸序列的基因：当将两条氨基酸序列进行最佳比对和比较时，所述氨基酸序列与由SEQ ID NO285、242、271、226、227、281、228、282、229、230至233、234、283、235、236、237、238、239、240、284、241、243、244、286、269、270、287、288、206至225中任一所示氨基酸序列具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的同一性。

在本发明的一个具体方面中，本发明的干扰RNA分子包含至少一个双链区(通常是干扰RNA的沉默元件)，所述双链区包含通过与反义RNA链碱基互补配对而退火的有义RNA链，其中dsRNA分子的有义链包含与位于靶基因之RNA转录本内的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

在一个实施方案中，本发明涉及包含至少一个双链区(通常是干扰RNA分子的沉默元件)的干扰RNA分子，所述双链区包含通过与反义RNA链碱基互补配对而退火的有义RNA链，其中dsRNA分子的有义链包含至少17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、110、125、150、175、200、225、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、9001000、1100或1115个连续核苷酸的序列，其与位于靶基因之RNA转录本内的核苷酸序列具有至少75％，优选至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的互补性，所述靶基因编码昆虫核糖体蛋白，例如核糖体蛋白L19(例如，CG2746Dm蛋白的昆虫直系同源物)、核糖体蛋白L40(例如，CG2960Dm蛋白的昆虫直系同源物)或核糖体蛋白S27A(例如，CG5271Dm蛋白的昆虫直系同源物)。

根据本发明的另一个实施方案，本发明涉及包含至少一个双链区(通常是干扰RNA分子的沉默元件)的干扰RNA分子，所述双链区包含通过与反义RNA链碱基互补配对而退火的有义RNA链，其中dsRNA分子的有义链包含至少17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、110、125、150、175、200、225、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、9001000、1100或1115个连续核苷酸的序列，其与位于靶基因之RNA转录本内的核苷酸序列有至少75％，优选至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的互补性，所述靶基因编码昆虫蛋白酶体亚基，例如Rpn6蛋白(例如，CG10149Dm蛋白的昆虫直系同源物)、Pros25蛋白(例如，CG5266Dm蛋白的昆虫直系同源物)、Rpn2蛋白(例如，CG11888Dm蛋白的昆虫直系同源物)、蛋白酶体β1亚基蛋白(例如，CG8392Dm蛋白的昆虫直系同源物)或Prosβ2蛋白(例如，CG3329Dm蛋白的昆虫直系同源物)。

根据本发明的又一个实施方案，本发明涉及包含至少一个双链区(通常是干扰RNA分子的沉默元件)的干扰RNA分子，所述双链区包含通过与反义RNA链碱基互补配对而退火的有义RNA链，其中dsRNA分子的有义链包含至少17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、110、125、150、175、200、225、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、9001000、1100或1115个连续核苷酸的序列，其与位于靶基因之RNA转录本内的核苷酸序列有至少75％，优选至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的互补性，所述靶基因编码昆虫COPI囊泡的β-外被体(例如，CG6223Dm蛋白的昆虫直系同源物)、COPI囊泡的γ-外被体(例如，1528Dm蛋白的昆虫直系同源物)、β’-外被体蛋白(例如，CG6699Dm蛋白的昆虫直系同源物)或COPI囊泡的ζ-外被体(例如，CG3948Dm蛋白的昆虫直系同源物)。

根据本发明的再一个实施方案，本发明涉及包含至少一个双链区(通常是干扰RNA分子的沉默元件)的干扰RNA分子，所述双链区包含通过与反义RNA链碱基互补配对而退火的有义RNA链，其中dsRNA分子的有义链包含至少17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、110、125、150、175、200、225、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、9001000、1100或1115个连续核苷酸的序列，其与位于靶基因之RNA转录本内的核苷酸序列有至少75％，优选至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的互补性，所述靶基因编码昆虫四次跨膜蛋白2A，它是推定的跨膜结构域蛋白(例如，CG11415Dm蛋白的昆虫直系同源物)。

根据本发明的另一个实施方案，本发明涉及包含至少一个双链区(通常是干扰RNA分子的沉默元件)的干扰RNA分子，所述双链区包含通过与反义RNA链碱基互补配对而退火的有义RNA链，其中dsRNA分子的有义链包含至少17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、110、125、150、175、200、225、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、9001000、1100或1115个连续核苷酸的序列，其与位于靶基因之RNA转录本内的核苷酸序列有至少75％，优选至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的互补性，所述靶基因编码属于肌动蛋白家族的昆虫蛋白质(例如，CG5409Dm蛋白的昆虫直系同源物)，例如肌动蛋白5C(例如，CG4027Dm蛋白的昆虫直系同源物)。

根据本发明的又一个实施方案，本发明涉及包含至少一个双链区(通常是干扰RNA分子的沉默元件)的干扰RNA分子，所述双链区包含通过与反义RNA链碱基互补配对而退火的有义RNA链，其中dsRNA分子的有义链包含至少17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、110、125、150、175、200、225、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、9001000、1100或1115个连续核苷酸的序列，其与位于靶基因之RNA转录本内的核苷酸序列有至少75％，优选至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的互补性，所述靶基因编码昆虫泛素-5E蛋白(例如，CG32744Dm蛋白的昆虫直系同源物)。

根据本发明的再一个实施方案，本发明涉及包含至少一个双链区(通常是干扰RNA分子的沉默元件)的干扰RNA分子，所述双链区包含通过与反义RNA链碱基互补配对而退火的有义RNA链，其中dsRNA分子的有义链包含至少17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、110、125、150、175、200、225、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、9001000、1100或1115个连续核苷酸的序列，其与位于靶基因之RNA转录本内的核苷酸序列有至少75％，优选至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的互补性，所述靶基因编码昆虫Sec23蛋白，它是参与胞内蛋白质转运的GTP酶(GTPase)激活物(例如，CG1250Dm蛋白的昆虫直系同源物)。

根据本发明的另一个实施方案，本发明涉及包含至少一个双链区(通常是干扰RNA分子的沉默元件)的干扰RNA分子，所述双链区包含通过与反义RNA链碱基互补配对而退火的有义RNA链，其中dsRNA分子的有义链包含至少17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、110、125、150、175、200、225、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、9001000、1100或1115个连续核苷酸的序列，其与位于靶基因之RNA转录本内的核苷酸序列有至少75％，优选至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的互补性，所述靶基因编码昆虫皱缩蛋白，它是参与肌肉运动活动的非常规肌球蛋白(例如，CG7595Dm蛋白的昆虫直系同源物)。

根据本发明的又一个实施方案，本发明涉及包含至少一个双链区(通常是干扰RNA分子的沉默元件)的干扰RNA分子，所述双链区包含通过与反义RNA链碱基互补配对而退火的有义RNA链，其中dsRNA分子的有义链包含至少17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、110、125、150、175、200、225、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、9001000、1100或1115个连续核苷酸的序列，其与位于靶基因之RNA转录本内的核苷酸序列有至少75％，优选至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的互补性，所述靶基因编码昆虫歪脖蛋白，它参与细胞核选择性mRNA剪接(例如，CG3193Dm蛋白的昆虫直系同源物)。

根据本发明的再一个实施方案，本发明涉及包含至少一个双链区(通常是干扰RNA分子的沉默元件)的干扰RNA分子，所述双链区包含通过与反义RNA链碱基互补配对而退火的有义RNA链，其中dsRNA分子的有义链包含至少17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、110、125、150、175、200、225、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、9001000、1100或1115个连续核苷酸的序列，其与位于靶基因之RNA转录本内的核苷酸序列有至少75％，优选至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的互补性，所述靶基因编码昆虫空泡型H+-ATP酶G亚基蛋白。

根据本发明的另一个实施方案，本发明涉及包含至少一个双链区(通常是干扰RNA分子的沉默元件)的干扰RNA分子，所述双链区包含通过与反义RNA链碱基互补配对而退火的有义RNA链，其中dsRNA分子的有义链包含至少17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、110、125、150、175、200、225、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、9001000、1100或1115个连续核苷酸的序列，其与位于靶基因之RNA转录本内的核苷酸序列有至少75％，优选至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的互补性，所述靶基因编码昆虫Tbp-1——Tat结合蛋白(例如，CG10370Dm蛋白的昆虫直系同源物)。

根据本发明的第二方面，提供了选自以下的分离多核苷酸：

(i)包含SEQ ID NO277、138、253、152、198至201、121、122、141、154至157、273、123、142、158至161、274、124、143、162至165、125至129、144、166至169、130、145、170至173、275、131、146、174至177、132、133、147、178至181、134、148、182至185、135、149、186至189、136、150、190至193、276、137、151、194至197、139、140、153、202至205、278、251、254、257至260、279、252、255、256、261至268、280、1、21、41至44、2、22、45至48、3、23、49至52、4、24、53至56、5、25、57至60、6、26、61至64、7、27、65至68、8、28、69至72、9、29、73至76、10、30、77至80、11、31、81至84、12、32、85至88、13、33、89至92、14、34、93至96、15、35、97至100、16、36、101至104、17、37、105至108、18、38、109至112、19、39、113至116、20、40、117至120或其互补序列中任一所示核苷酸序列中的至少21个，优选至少22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、110、125、150、175、200、225、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、900、1000、1100或1115个连续核苷酸的多核苷酸；或者

(ii)由SEQ ID NO277、138、253、152、198至201、121、122、141、154至157、273、123、142、158至161、274、124、143、162至165、125至129、144、166至169、130、145、170至173、275、131、146、174至177、132、133、147、178至181、134、148、182至185、135、149、186至189、136、150、190至193、276、137、151、194至197、139、140、153、202至205、278、251、254、257至260、279、252、255、256、261至268、280、1、21、41至44、2、22、45至48、3、23、49至52、4、24、53至56、5、25、57至60、6、26、61至64、7、27、65至68、8、28、69至72、9、29、73至76、10、30、77至80、11、31、81至84、12、32、85至88、13、33、89至92、14、34、93至96、15、35、97至100、16、36、101至104、17、37、105至108、18、38、109至112、19、39、113至116、20、40、117至120或其互补序列中任一所示核苷酸序列中的至少21个，优选至少22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、110、125、150、175、200、225、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、900、1000、1100或1115个连续核苷酸组成的多核苷酸；或者

(iii)包含SEQ ID NO277、138、253、152、198至201、121、122、141、154至157、273、123、142、158至161、274、124、143、162至165、125至129、144、166至169、130、145、170至173、275、131、146、174至177、132、133、147、178至181、134、148、182至185、135、149、186至189、136、150、190至193、276、137、151、194至197、139、140、153、202至205、278、251、254、257至260、279、252、255、256、261至268、280、1、21、41至44、2、22、45至48、3、23、49至52、4、24、53至56、5、25、57至60、6、26、61至64、7、27、65至68、8、28、69至72、9、29、73至76、10、30、77至80、11、31、81至84、12、32、85至88、13、33、89至92、14、34、93至96、15、35、97至100、16、36、101至104、17、37、105至108、18、38、109至112、19、39、113至116、20、40、117至120或其互补序列中任一所示核苷酸序列中的至少21个，优选至少22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、110、125、150、175、200、225、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、900、1000、1100或1115个连续核苷酸的多核苷酸，当将两条序列进行最佳比对和比较时，所述多核苷酸与SEQ ID NO277、138、253、152、198至201、121、122、141、154至157、273、123、142、158至161、274、124、143、162至165、125至129、144、166至169、130、145、170至173、275、131、146、174至177、132、133、147、178至181、134、148、182至185、135、149、186至189、136、150、190至193、276、137、151、194至197、139、140、153、202至205、278、251、254、257至260、279、252、255、256、261至268、280、1、21、41至44、2、22、45至48、3、23、49至52、4、24、53至56、5、25、57至60、6、26、61至64、7、27、65至68、8、28、69至72、9、29、73至76、10、30、77至80、11、31、81至84、12、32、85至88、13、33、89至92、14、34、93至96、15、35、97至100、16、36、101至104、17、37、105至108、18、38、109至112、19、39、113至116、20、40、117至120或其互补序列中的任一具有至少75％，优选至少80％、85％、90％、95％、98％或99％的同一性；或者

(iv)包含SEQ ID NO277、138、253、152、198至201、121、122、141、154至157、273、123、142、158至161、274、124、143、162至165、125至129、144、166至169、130、145、170至173、275、131、146、174至177、132、133、147、178至181、134、148、182至185、135、149、186至189、136、150、190至193、276、137、151、194至197、139、140、153、202至205、278、251、254、257至260、279、252、255、256、261至268、280、1、21、41至44、2、22、45至48、3、23、49至52、4、24、53至56、5、25、57至60、6、26、61至64、7、27、65至68、8、28、69至72、9、29、73至76、10、30、77至80、11、31、81至84、12、32、85至88、13、33、89至92、14、34、93至96、15、35、97至100、16、36、101至104、17、37、105至108、18、38、109至112、19、39、113至116、20、40、117至120或其互补序列中任一所示核苷酸序列中的至少21个，优选至少22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、110、125、150、175、200、225、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、900、1000、1100或1115个连续核苷酸之片段的多核苷酸，并且其中所述片段或所述互补序列具有如下核苷酸序列：当将所述片段与SEQ ID NO277、138、253、152、198至201、121、122、141、154至157、273、123、142、158至161、274、124、143、162至165、125至129、144、166至169、130、145、170至173、275、131、146、174至177、132、133、147、178至181、134、148、182至185、135、149、186至189、136、150、190至193、276、137、151、194至197、139、140、153、202至205、278、251、254、257至260、279、252、255、256、261至268、280、1、21、41至44、2、22、45至48、3、23、49至52、4、24、53至56、5、25、57至60、6、26、61至64、7、27、65至68、8、28、69至72、9、29、73至76、10、30、77至80、11、31、81至84、12、32、85至88、13、33、89至92、14、34、93至96、15、35、97至100、16、36、101至104、17、37、105至108、18、38、109至112、19、39、113至116、20、40、117至120中任一之对应片段进行最佳比对和比较时，所述核苷酸序列与SEQ ID NO277、138、253、152、198至201、121、122、141、154至157、273、123、142、158至161、274、124、143、162至165、125至129、144、166至169、130、145、170至173、275、131、146、174至177、132、133、147、178至181、134、148、182至185、135、149、186至189、136、150、190至193、276、137、151、194至197、139、140、153、202至205、278、251、254、257至260、279、252、255、256、261至268、280、1、21、41至44、2、22、45至48、3、23、49至52、4、24、53至56、5、25、57至60、6、26、61至64、7、27、65至68、8、28、69至72、9、29、73至76、10、30、77至80、11、31、81至84、12、32、85至88、13、33、89至92、14、34、93至96、15、35、97至100、16、36、101至104、17、37、105至108、18、38、109至112、19、39、113至116、20、40、117至120或其互补序列中任一之所述对应片段具有至少75％，优选至少80％、85％、90％、95％、98％或99％的同一性；或者

(v)由SEQ ID NO277、138、253、152、198至201、121、122、141、154至157、273、123、142、158至161、274、124、143、162至165、125至129、144、166至169、130、145、170至173、275、131、146、174至177、132、133、147、178至181、134、148、182至185、135、149、186至189、136、150、190至193、276、137、151、194至197、139、140、153、202至205、278、251、254、257至260、279、252、255、256、261至268、280、1、21、41至44、2、22、45至48、3、23、49至52、4、24、53至56、5、25、57至60、6、26、61至64、7、27、65至68、8、28、69至72、9、29、73至76、10、30、77至80、11、31、81至84、12、32、85至88、13、33、89至92、14、34、93至96、15、35、97至100、16、36、101至104、17、37、105至108、18、38、109至112、19、39、113至116、20、40、117至120或其互补序列中任一所示核苷酸序列中的至少21个，优选至少22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、110、125、150、175、200、225、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、900、1000、1100或1115个连续核苷酸之片段组成的多核苷酸，并且其中所述片段或所述互补序列具有如下核苷酸序列：当将所述片段与SEQ IDNO277、138、253、152、198至201、121、122、141、154至157、273、123、142、158至161、274、124、143、162至165、125至129、144、166至169、130、145、170至173、275、131、146、174至177、132、133、147、178至181、134、148、182至185、135、149、186至189、136、150、190至193、276、137、151、194至197、139、140、153、202至205、278、251、254、257至260、279、252、255、256、261至268、280、1、21、41至44、2、22、45至48、3、23、49至52、4、24、53至56、5、25、57至60、6、26、61至64、7、27、65至68、8、28、69至72、9、29、73至76、10、30、77至80、11、31、81至84、12、32、85至88、13、33、89至92、14、34、93至96、15、35、97至100、16、36、101至104、17、37、105至108、18、38、109至112、19、39、113至116、20、40、117至120中任一之对应片段进行最佳比对和比较时，所述核苷酸序列与SEQ ID NO277、138、253、152、198至201、121、122、141、154至157、273、123、142、158至161、274、124、143、162至165、125至129、144、166至169、130、145、170至173、275、131、146、174至177、132、133、147、178至181、134、148、182至185、135、149、186至189、136、150、190至193、276、137、151、194至197、139、140、153、202至205、278、251、254、257至260、279、252、255、256、261至268、280、1、21、41至44、2、22、45至48、3、23、49至52、4、24、53至56、5、25、57至60、6、26、61至64、7、27、65至68、8、28、69至72、9、29、73至76、10、30、77至80、11、31、81至84、12、32、85至88、13、33、89至92、14、34、93至96、15、35、97至100、16、36、101至104、17、37、105至108、18、38、109至112、19、39、113至116、20、40、117至120或其互补序列中任一之所述对应片段具有至少75％，优选至少80％、85％、90％、95％、98％或99％的同一性；或者

(vi)编码如下氨基酸序列的多核苷酸：当将两条氨基酸序列进行最佳比对和比较时，所述氨基酸序列与由SEQ ID NO277、138、253、152、198至201、121、122、141、154至157、273、123、142、158至161、274、124、143、162至165、125至129、144、166至169、130、145、170至173、275、131、146、174至177、132、133、147、178至181、134、148、182至185、135、149、186至189、136、150、190至193、276、137、151、194至197、139、140、153、202至205、278、251、254、257至260、279、252、255、256、261至268、280、1、21、41至44、2、22、45至48、3、23、49至52、4、24、53至56、5、25、57至60、6、26、61至64、7、27、65至68、8、28、69至72、9、29、73至76、10、30、77至80、11、31、81至84、12、32、85至88、13、33、89至92、14、34、93至96、15、35、97至100、16、36、101至104、17、37、105至108、18、38、109至112、19、39、113至116、20、40、117至120中任一所示核苷酸序列编码的氨基酸序列具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的同一性；或者

(vii)编码如下氨基酸序列的核苷酸序列：当将两条氨基酸序列进行最佳比对和比较时，所述氨基酸序列与由SEQ ID NO285、242、271、226、227、281、228、282、229、230至233、234、283、235、236、237、238、239、240、284、241、243、244、286、269、270、287、288、206至225中任一所示氨基酸序列具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的同一性；

并且

其中所述多核苷酸不长于10000、9000、8000、7000、6000、5000、4000、3000、2000或1500个核苷酸。

在本发明的一个具体方面中，所述分离多核苷酸是干扰RNA分子的一部分(通常是沉默元件的一部分)，其包含至少一个双链区，所述双链区包含通过与反义RNA链碱基互补配对而退火的有义RNA链，其中dsRNA分子的有义链包含与位于靶基因之RNA转录本内的核苷酸序列互补的核苷酸序列。更特别地，所述分离多核苷酸以有义和反义方向克隆到DNA构建体中使得有义和反义多核苷酸转录后形成dsRNA分子，所述dsRNA分子在被害虫摄入后起抑制或下调所述害虫中靶基因表达的作用。

在一个实施方案中，本发明涉及如下分离多核苷酸，其以有义和反义方向克隆到DNA构建体中使得有义和反义多核苷酸转录后形成dsRNA分子，所述dsRNA分子在被昆虫摄入后起抑制或下调编码昆虫核糖体蛋白之靶基因表达的作用，所述昆虫核糖体蛋白例如核糖体蛋白L19(例如，CG2746Dm蛋白的昆虫直系同源物)、核糖体蛋白L40(例如，CG2960Dm蛋白的昆虫直系同源物)或核糖体蛋白S27A(例如，CG5271Dm蛋白的昆虫直系同源物)。

根据另一个实施方案，本发明涉及如下分离多核苷酸，其以有义和反义方向克隆到DNA构建体中使得有义和反义多核苷酸转录后形成dsRNA分子，所述dsRNA分子在被昆虫摄入后起抑制或下调编码昆虫蛋白酶体亚基之靶基因表达的作用，所述昆虫蛋白酶体亚基例如Rpn6蛋白(例如，CG10149Dm蛋白的昆虫直系同源物)、Pros25蛋白(例如，CG5266Dm蛋白的昆虫直系同源物)、Rpn2蛋白(例如，CG11888Dm蛋白的昆虫直系同源物)、蛋白酶体β1亚基蛋白(例如，CG8392Dm蛋白的昆虫直系同源物)或Prosβ2蛋白(例如，CG3329Dm蛋白的昆虫直系同源物)。

根据又一实施方案，本发明涉及如下分离多核苷酸，其以有义和反义方向克隆到DNA构建体中使得有义和反义多核苷酸转录后形成dsRNA分子，所述dsRNA分子在被昆虫摄入后起抑制或下调编码以下蛋白质之靶基因表达的作用：昆虫COPI囊泡的β-外被体(例如，CG6223Dm蛋白的昆虫直系同源物)、COPI囊泡的γ-外被体(例如，1528Dm蛋白的昆虫直系同源物)、β’-外被体蛋白(例如，CG6699Dm蛋白的昆虫直系同源物)或COPI囊泡的ζ-外被体(例如，CG3948Dm蛋白的昆虫直系同源物)。

根据再一实施方案，本发明涉及如下分离多核苷酸，其以有义和反义方向克隆到DNA构建体中使得有义和反义多核苷酸转录后形成dsRNA分子，其在被害虫摄入后起抑制或下调所述编码昆虫四次跨膜蛋白2A之靶基因表达的作用，所述四次跨膜蛋白2A是推定的跨膜结构域蛋白(例如，CG11415Dm蛋白的昆虫直系同源物)。

根据另一实施方案，本发明涉及如下分离多核苷酸，其以有义和反义方向克隆到DNA构建体中使得有义和反义多核苷酸转录后形成dsRNA分子，所述dsRNA分子在被昆虫摄入后起抑制或下调编码属于肌动蛋白家族的昆虫蛋白质(例如，CG5409Dm蛋白的昆虫直系同源物)例如肌动蛋白5C(例如，CG4027Dm蛋白的昆虫直系同源物)之靶基因表达的作用。

根据又一实施方案，本发明涉及如下分离多核苷酸，其以有义和反义方向克隆到DNA构建体中使得有义和反义多核苷酸转录后形成dsRNA分子，所述dsRNA分子在被昆虫摄入后起抑制或下调编码昆虫泛素-5E蛋白(例如，CG32744Dm蛋白的昆虫直系同源物)之靶基因表达的作用。

根据再一实施方案，本发明涉及如下分离多核苷酸，其以有义和反义方向克隆到DNA构建体中使得有义和反义多核苷酸转录后形成dsRNA分子，所述dsRNA分子在被昆虫摄入后起抑制或下调编码昆虫Sec23蛋白之靶基因表达的作用，所述Sec23蛋白是参与胞内蛋白质转运的GTP酶激活物(例如，CG1250Dm蛋白的昆虫直系同源物)。

根据另一实施方案，本发明涉及如下分离多核苷酸，其以有义和反义方向克隆到DNA构建体中使得有义和反义多核苷酸转录后形成dsRNA分子，所述dsRNA分子在被昆虫摄入后起抑制或下调编码昆虫皱缩蛋白之靶基因表达的作用，所述皱缩蛋白是参与肌肉运动活动的非常规肌球蛋白(例如，CG7595Dm蛋白的昆虫直系同源物)。

根据又一实施方案，本发明涉及如下分离多核苷酸，其以有义和反义方向克隆到DNA构建体中使得有义和反义多核苷酸转录后形成dsRNA分子，所述dsRNA分子在被昆虫摄入后起抑制或下调编码昆虫歪脖蛋白之靶基因表达的作用，所述歪脖蛋白参与细胞核选择性mRNA剪接(例如，CG3193Dm蛋白的昆虫直系同源物)。

根据再一实施方案，本发明涉及如下分离多核苷酸，其以有义和反义方向克隆到DNA构建体中使得有义和反义多核苷酸转录后形成dsRNA分子，所述dsRNA分子在被昆虫摄入后起抑制或下调编码昆虫空泡型H+-ATP酶G亚基蛋白之靶基因表达的作用(例如，CG6213Dm蛋白的昆虫直系同源物)。

根据另一实施方案，本发明涉及如下分离多核苷酸，其以有义和反义方向克隆到DNA构建体中使得有义和反义多核苷酸转录后形成dsRNA分子，所述dsRNA分子在被昆虫摄入后起抑制或下调编码昆虫Tbp-1——Tat结合蛋白之靶基因表达的作用(例如，CG10370Dm蛋白的昆虫直系同源物)。

根据本发明的第三方面，提供了用于预防和/或控制害虫侵扰的组合物，其包含至少一种干扰核糖核酸(RNA)和至少一种合适的载体、赋形剂或稀释剂，其中所述干扰DNA在被害虫摄入后起下调所述害虫中靶基因表达的作用，其中所述靶基因

(iii)选自具有包含SEQ ID NO277、138、253、152、121、122、141、273、123、142、274、124、143、125至129、144、130、145、275、131、146、132、133、147、134、148、135、149、136、150、276、137、151、139、140、153、278、251、254、279、252、255、256、280、1、21、2、22、3、23、4、24、5、25、6、26、7、27、8、28、9、29、10、30、11、31、12、32、13、33、14、34、15、35、16、36、17、37、18、38、19、39、20或40或其互补序列中任一的至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、110、125、150、175、200、225、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、9001000、1100或1115个连续核苷酸之片段的核苷酸序列的基因，或具有如下核苷酸序列的基因：当将包含所述片段之所述基因与SEQ IDNO277、138、253、152、121、122、141、273、123、142、274、124、143、125至129、144、130、145、275、131、146、132、133、147、134、148、135、149、136、150、276、137、151、139、140、153、278、251、254、279、252、255、256、280、1、21、2、22、3、23、4、24、5、25、6、26、7、27、8、28、9、29、10、30、11、31、12、32、13、33、14、34、15、35、16、36、17、37、18、38、19、39、20或40中的任一进行最佳比对和比较时，所述核苷酸序列与SEQ ID NO277、138、253、152、121、122、141、273、123、142、274、124、143、125至129、144、130、145、275、131、146、132、133、147、134、148、135、149、136、150、276、137、151、139、140、153、278、251、254、279、252、255、256、280、1、21、2、22、3、23、4、24、5、25、6、26、7、27、8、28、9、29、10、30、11、31、12、32、13、33、14、34、15、35、16、36、17、37、18、38、19、39、20或40或其互补序列中的任一具有至少75％，优选至少80％、85％、90％、95％、98％或99％的同一性；或者

(v)是具有包含SEQ ID NO277、138、253、152、121、122、141、273、123、142、274、124、143、125至129、144、130、145、275、131、146、132、133、147、134、148、135、149、136、150、276、137、151、139、140、153、278、251、254、279、252、255、256、280、1、21、2、22、3、23、4、24、5、25、6、26、7、27、8、28、9、29、10、30、11、31、12、32、13、33、14、34、15、35、16、36、17、37、18、38、19、39、20或40或其互补序列中任一之核苷酸序列的基因的昆虫害虫直系同源物，其中所述两个直系同源物基因的序列相似到如下程度：使得当将所述两个基因进行最佳比对和比较时，所述直系同源物的序列与SEQ IDNO277、138、253、152、121、122、141、273、123、142、274、124、143、125至129、144、130、145、275、131、146、132、133、147、134、148、135、149、136、150、276、137、151、139、140、153、278、251、254、279、252、255、256、280、1、21、2、22、3、23、4、24、5、25、6、26、7、27、8、28、9、29、10、30、11、31、12、32、13、33、14、34、15、35、16、36、17、37、18、38、19、39、20或40中的任一具有至少75％，优选至少80％、85％、90％、95％、98％或99％的同一性；或者

根据本发明的第四方面，提供了一种用于下调昆虫害虫物种中靶基因表达的方法，其包括使所述害虫物种与有效量的至少一种干扰核糖核酸(RNA)或有效量的包含至少一种干扰核糖核酸(RNA)和至少一种合适载体、赋形剂或稀释剂之组合物相接触，其中所述干扰RNA在被害虫摄入后起下调所述害虫中靶基因表达的作用，并且其中所述靶基因

优选地，本发明的方法在预防和/或控制昆虫害虫侵扰中，特别是在控制作物植物的害虫侵扰中具有实际应用，所述作物植物例如但不限于水稻，棉花，草莓，种子作物例如苜蓿、大豆、马铃薯、番茄、油菜、向日葵、高粱、紫御谷(pearl millet)、玉米、茄子、胡椒和烟草。此外，可通过常规遗传工程技术将本发明的干扰RNA引入到待保护植物中。

因此，根据本发明的第五方面，提供了一种用于产生对昆虫害虫物种侵扰具有抗性的转基因植物的方法，其包括：

(a)用包含编码干扰核糖核酸(RNA)的多核苷酸序列的DNA构建体转化植物细胞，所述干扰核糖核酸(RNA)在被昆虫害虫物种摄入后起下调所述昆虫害虫中靶基因表达的作用，其中所述靶基因

(vii)选自具有编码如下氨基酸序列的核苷酸序列的基因：当将两条氨基酸序列进行最佳比对和比较时，所述氨基酸序列与由SEQ ID NO285、242、271、226、227、281、228、282、229、230至233、234、283、235、236、237、238、239、240、284、241、243、244、286、269、270、287、288、206至225中任一所示氨基酸序列具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的同一性；

(b)从转化植物细胞再生植物；以及

(c)在适用于从重组DNA构建体表达干扰RNA的条件下使转化植物生长，因此与未转化植物相比所述植物对所述害虫具有抗性。

根据本发明的第六方面，提供了转基因植物、或用于转基因植物的再生或繁殖材料或者培养的转基因植物细胞，其表达或能够表达至少一种干扰核糖核酸(RNA)，所述干扰核糖核酸(RNA)在被昆虫害虫物种摄入后起下调所述害虫中靶基因表达的作用，其中所述靶基因

在一个实施方案中，本发明涉及包含干扰核糖核酸(RNA或双链RNA)的转基因植物或植物细胞，所述干扰核糖核酸与编码昆虫核糖体蛋白之mRNA的至少17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、110、125、150、175、200、225、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、9001000、1100或1115个连续核苷酸的部分或全部具有至少75％，优选至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的互补性，所述昆虫核糖体蛋白例如核糖体蛋白L19(例如，CG2746Dm蛋白的昆虫直系同源物)、核糖体蛋白L40(例如，CG2960Dm蛋白的昆虫直系同源物)或核糖体蛋白S27A(例如，CG5271Dm蛋白的昆虫直系同源物)；并且其中所述干扰核糖核酸抑制或干扰所述mRNA的翻译并且其中与未转化植物相比所述植物或植物细胞对昆虫具有抗性。

根据另一个实施方案，本发明涉及包含干扰核糖核酸(RNA或双链RNA)的转基因植物或植物细胞，所述干扰核糖核酸与编码昆虫蛋白酶体亚基之mRNA的至少17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、110、125、150、175、200、225、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、9001000、1100或1115个连续核苷酸的部分或全部具有至少75％，优选至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的互补性，所述昆虫蛋白酶体亚基例如Rpn6蛋白(例如，CG10149Dm蛋白的昆虫直系同源物)、Pros25蛋白(例如，CG5266Dm蛋白的昆虫直系同源物)、Rpn2蛋白(例如，CG11888Dm蛋白的昆虫直系同源物)、蛋白酶体β1亚基蛋白(例如，CG8392Dm蛋白的昆虫直系同源物)或Pros β2蛋白(例如，CG3329Dm蛋白的昆虫直系同源物)；并且其中所述干扰核糖核酸抑制或干扰所述mRNA的翻译并且其中与未转化植物相比所述植物或植物细胞对昆虫具有抗性。

根据又一个实施方案，本发明涉及包含干扰核糖核酸(RNA或双链RNA)的转基因植物或植物细胞，所述干扰核糖核酸与编码以下蛋白质之mRNA的至少17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、110、125、150、175、200、225、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、9001000、1100或1115个连续核苷酸的部分或全部具有至少75％，优选至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的互补性：昆虫COPI囊泡的β-外被体(例如，CG6223Dm蛋白的昆虫直系同源物)、COPI囊泡的γ-外被体(例如，1528Dm蛋白的昆虫直系同源物)、β’-外被体蛋白(例如，CG6699Dm蛋白的昆虫直系同源物)或COPI囊泡的ζ-外被体(例如，CG3948Dm蛋白的昆虫直系同源物)；并且其中所述干扰核糖核酸抑制或干扰所述mRNA的翻译并且其中与未转化植物相比所述植物或植物细胞对昆虫具有抗性。

根据再一个实施方案，本发明涉及包含干扰核糖核酸(RNA或双链RNA)的转基因植物或植物细胞，所述干扰核糖核酸与编码昆虫四次跨膜蛋白2A之mRNA的至少17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、110、125、150、175、200、225、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、9001000、1100或1115个连续核苷酸的部分或全部具有至少75％，优选至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的互补性，所述四次跨膜蛋白2A是推定的跨膜结构域蛋白(例如，CG11415Dm蛋白的昆虫直系同源物)；并且其中所述干扰核糖核酸抑制或干扰所述mRNA的翻译并且其中与未转化植物相比所述植物或植物细胞对昆虫具有抗性。

根据另一个实施方案，本发明涉及包含干扰核糖核酸(RNA或双链RNA)的转基因植物或植物细胞，所述干扰核糖核酸与编码属于肌动蛋白家族的昆虫蛋白质(例如，CG5409Dm蛋白的昆虫直系同源物)例如肌动蛋白5C(例如，CG4027Dm蛋白的昆虫直系同源物)之mRNA的至少17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、110、125、150、175、200、225、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、9001000、1100或1115个连续核苷酸的部分或全部具有至少75％，优选至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的互补性；并且其中所述干扰核糖核酸抑制或干扰所述mRNA的翻译并且其中与未转化植物相比所述植物或植物细胞对昆虫具有抗性。

根据又一个实施方案，本发明涉及包含干扰核糖核酸(RNA或双链RNA)的转基因植物或植物细胞，所述干扰核糖核酸与编码昆虫泛素-5E蛋白(例如，CG32744Dm蛋白的昆虫直系同源物)之mRNA的至少17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、110、125、150、175、200、225、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、9001000、1100或1115个连续核苷酸的部分或全部具有至少75％，优选至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的互补性；并且其中所述干扰核糖核酸抑制或干扰所述mRNA的翻译并且其中与未转化植物相比所述植物或植物细胞对昆虫具有抗性。

根据再一个实施方案，本发明涉及包含干扰核糖核酸(RNA或双链RNA)的转基因植物或植物细胞，所述干扰核糖核酸与编码昆虫Sec23蛋白之mRNA的至少17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、110、125、150、175、200、225、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、9001000、1100或1115个连续核苷酸的部分或全部具有至少75％，优选至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的互补性，所述Sec23蛋白是参与胞内蛋白质转运的GTP酶激活物(例如，CG1250Dm蛋白的昆虫直系同源物)；并且其中所述干扰核糖核酸抑制或干扰所述mRNA的翻译并且其中与未转化植物相比所述植物或植物细胞对昆虫具有抗性。

根据另一个实施方案，本发明涉及包含干扰核糖核酸(RNA或双链RNA)的转基因植物或植物细胞，所述干扰核糖核酸与编码昆虫皱缩蛋白之mRNA的至少17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、110、125、150、175、200、225、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、9001000、1100或1115个连续核苷酸的部分或全部具有至少75％，优选至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的互补性，所述皱缩蛋白是参与肌肉运动活动的非常规肌球蛋白(例如，CG7595Dm蛋白的昆虫直系同源物)；并且其中所述干扰核糖核酸抑制或干扰所述mRNA的翻译并且其中与未转化植物相比所述植物或植物细胞对昆虫具有抗性。

根据又一个实施方案，本发明涉及包含干扰核糖核酸(RNA或双链RNA)的转基因植物或植物细胞，所述干扰核糖核酸与编码昆虫歪脖蛋白之mRNA的至少17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、110、125、150、175、200、225、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、9001000、1100或1115个连续核苷酸的部分或全部具有至少75％，优选至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的互补性，所述歪脖蛋白参与细胞核选择性mRNA剪接(例如，CG3193Dm蛋白的昆虫直系同源物)；并且其中所述干扰核糖核酸抑制或干扰所述mRNA的翻译并且其中与未转化植物相比所述植物或植物细胞对昆虫具有抗性。

根据再一个实施方案，本发明涉及包含干扰核糖核酸(RNA或双链RNA)的转基因植物或植物细胞，所述干扰核糖核酸与编码昆虫空泡型H+-ATP酶G亚基蛋白(例如，CG6213Dm蛋白的昆虫直系同源物)之mRNA的至少17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、110、125、150、175、200、225、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、9001000、1100或1115个连续核苷酸的部分或全部具有至少75％，优选至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的互补性；并且其中所述干扰核糖核酸抑制或干扰所述mRNA的翻译并且其中与未转化植物相比所述植物或植物细胞对昆虫具有抗性。

根据另一个实施方案，本发明涉及包含干扰核糖核酸(RNA或双链RNA)的转基因植物或植物细胞，其与编码昆虫Tbp-1——Tat结合蛋白(例如，CG10370Dm蛋白的昆虫直系同源物)之mRNA的至少17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、110、125、150、175、200、225、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、9001000、1100或1115个连续核苷酸的部分或全部具有至少75％，优选至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的互补性；并且其中所述干扰核糖核酸抑制或干扰所述mRNA的翻译并且其中与未转化植物相比所述植物或植物细胞对昆虫具有抗性。

表格及附图说明

表1在马铃薯甲虫(Leptinotarsa decemlineata)(科罗拉多马铃薯甲虫，CPB)中鉴定的靶基因的多核苷酸序列。

表2在马铃薯甲虫(科罗拉多马铃薯甲虫，CPB)中鉴定的靶基因的氨基酸序列。

表3在豆荚草盲蝽(Lygus hesperus)中鉴定的靶基因的多核苷酸序列。

表4在豆荚草盲蝽中鉴定的靶基因的氨基酸序列。

表5对应于马铃薯甲虫靶基因的dsRNA(由相应DNA序列表示的有义链)。

表6对应于豆荚草盲蝽靶基因的dsRNA(由相应DNA序列表示的有义链)。

表7来源于不同靶基因的dsRNA杀死50％(LT₅₀)CPB幼虫的时间效应，表示为与来源于参照靶基因Ld248(SEQ ID NO40)之dsRNA的作用之比。

表8来源于不同靶基因的dsRNA对杀死50％(LT₅₀)CPB成虫的时间效应，表示为与来源于参照靶基因Ld248(SEQ ID NO40)之dsRNA的作用之比。

表9来源于不同靶基因的dsRNA对CPB产卵的作用。缩写：EM，正常卵块；SE，单个卵；YS，黄色弥散状(yellow smear)；无，没有卵。

表10在豆荚草盲蝽若虫喂食测定(nymph feeding assay)中在tRNA存在下靶标dsRNA与GFP dsRNA的存活分析。对数秩(log-rank)检验用于检验使用Kaplan-Meier评估产生的靶标dsRNA(或仅饮食)与GFPdsRNA的存活曲线之间的差异。

表11不同靶基因根据效力的排序。

表120.1、0.05或0.025μg/μL测试靶标与0.1μg/μL GFP dsRNA的存活曲线比较。对图5所图示的数据进行统计学分析。＊＊＊：P值≤0.001；＊＊：0.001＜P值≤0.01；＊：0.01＜P值≤0.05；ns：不显著，P值＞0.05。

表13克隆其全长cDNA的盲蝽靶标。

表14在豆荚草盲蝽中鉴定的靶基因的全长核苷酸序列。

表15在豆荚草盲蝽中鉴定的靶基因之全长cDNA的对应氨基酸序列。

图1来源于不同靶基因的dsRNA对CPB成虫之存活和健康的作用。对于所研究的每一种靶基因，最初的24小时向10只年轻成年甲虫各自喂食经靶标dsRNA处理的马铃薯叶盘(总共10μg dsRNA)，然后一起放到未经处理的马铃薯叶子上。经14天的时间评价死亡或濒死昆虫的数目。数据表示为死亡百分比或濒死百分比。GFP dsRNA(SEQ ID NO245)用作对照。Ld105dsRNA(SEQ ID NO39)、Ld248dsRNA(SEQ ID NO40)、Ld516dsRNA(SEQ ID NO29)、Ld511dsRNA(SEQ ID NO36)、Ld512dsRNA(SEQ ID NO37)、Ld513dsRNA(SEQ ID NO22)、Ld520dsRNA(SEQ ID NO24)、Ld537dsRNA(SEQ ID NO25)、Ld563dsRNA(SEQ ID NO38)、Ld579dsRNA(SEQ ID NO30)。

图2在喂食测定中在5μg/μL酵母tRNA存在下暴露于0.5μg/μL靶标dsRNA的豆荚草盲蝽若虫的存活曲线。(a)靶标：Lh520(SEQ ID NO143)、Lh423(SEQ ID NO152)、Lh537(SEQ ID NO144)、(b)靶标：Lh504.2(SEQ ID NO142)、Lh512(SEQ ID NO153)、Lh334(SEQ IDNO145)、(c)靶标：Lh300.1(SEQ ID NO151)、Lh327(SEQ ID NO146)、Lh332(SEQ ID NO148)、(d)靶标：Lh237(SEQ ID NO149)、Lh579(SEQ ID NO147)、Lh261(SEQ ID NO150)、Lh513(SEQ ID NO141)。分别在相同浓度下的GPS dsRNA加酵母tRNA和仅饮食处理用作对照。将幼小的若虫各自暴露于含有或不含有测试组分的25μL15％蔗糖饮食中三天，然后将其转移到50μL Bioserv饮食上。第7天更换为复合饮食。对于所有的处理，n＝24。

图3在喂食测定中在5μg/μL酵母tRNA存在下暴露于0.5μg/μL靶标dsRNA的豆荚草盲蝽若虫的存活曲线，其中所述靶标根据效力被分组为A、B、C、D。设定(set-up)如图2所述。

图4在喂食生物测定中在酵母转运RNA(5μg/μL)存在下暴露于降低浓度(由0.5至0.1μg/μL)之新型靶标dsRNA的豆荚草盲蝽若虫随时间的存活曲线。生物测定中的每组处理由24只一天龄的若虫组成，其被单独地放入24孔板的每个孔中。将每只若虫暴露于含15％蔗糖溶液中核糖核酸的石蜡膜小袋中，维持3天。在第3天和第7天，将饮食更换为新鲜饮食(Bioserv)。测定中包括以下对照：GFP dsRNA和仅饮食。

图5在喂食生物测定中在酵母转运RNA(5μg/μL)存在下将豆荚草盲蝽若虫暴露于降低浓度(由0.1至0.025μg/μL)之新型靶标dsRNA随时间的存活曲线。设定类似地如图4所述。

图6在喂食生物测定中在酵母转运RNA(5μg/μL)存在下暴露于0.5μg/μL靶标dsRNA的豆荚草盲蝽若虫随时间的存活曲线。测试的靶标dsRNA：Lh105.2(SEQ ID NO254)、Lh248.2(SEQ ID NO255)、Lh248.3(SEQ ID NO256)、Lh327(SEQ ID NO146)和Lh300(SEQ IDNO151)。设定类似地如图4所述。

图7含有豆荚草盲蝽hpRNA表达盒(hpRNA cassette)的植物表达载体的示意图。RB：右边界；LB：左边界；P35S：花椰菜花叶病毒(Cauliflower Mosaic Virus)35S启动子；T35S：花椰菜花叶病毒35S终止子；TNOS：胭脂碱合酶终止子；GFP：绿色荧光报告基因；NPT II：新霉素磷酸转移酶II基因的编码序列；KmR：卡那霉素抗性基因；pBR322ori：pBR322复制起点；pBR322bom：pBR322转移；pVS1rep：pVS1复制子；pVS1sta：pVS1稳定元件。

图8：植物测定(planta assay)设定中的马铃薯-盲蝽。白色箭头表示昆虫损害。

图9表达Lh423发夹的转基因马铃薯上的盲蝽喂食测定。以携带Lh423发夹(P006/XX)或GUS发夹(P001/XX)的转基因马铃薯为食的盲蝽若虫的存活率。还用野生型(WT)马铃薯作为对照。

图10表达Lh423发夹的阳性转基因马铃薯的盲蝽喂食测定。以携带Lh423发夹(P006/59、P006/29和P006/22)或GUS发夹(P001/19、P001/28)的转基因马铃薯为食的盲蝽若虫的存活率。野生型(WT)马铃薯也用作对照。基于GraphPad存活曲线分析的统计分析结果：＊＊＊＝P＜0.001；＊＝0.01＜P＜0.05。

发明详述

本发明已发现，通过RNAi下调昆虫害虫物种中特定靶基因的表达可用于有效预防和/或控制所述昆虫害虫的侵扰。本文使用的术语“控制”害虫侵扰指对害虫产生的用来限制和/或减少害虫生物体数目和/或由害虫引起的损害的任何作用。因此，优选的靶基因是控制或调节昆虫害虫中一种或更多种必需生物功能的必需基因，所述必需生物功能例如细胞分裂、繁殖、能量代谢、消化、神经功能等。通过RNAi技术下调这些必需基因可导致昆虫死亡，或者另外显著延缓生长和发育或者损害害虫在环境中定殖或侵扰宿主生物体的能力。

因此，在第一方面中，本发明提供了在被昆虫害虫物种摄入后起下调所述昆虫害虫中靶基因表达的作用的干扰核糖核酸(RNA)。

本文使用的“靶基因”包括意图在害虫中下调的任何基因。在一个优选实施方案中，下调靶基因以控制害虫侵扰，例如通过扰乱害虫中发生的必需生物过程，或者通过降低昆虫的致病性。因此，优选靶基因包括但不限于在调节摄食、存活、生长、发育、繁殖、侵扰和侵染方面发挥关键作用的那些基因。根据一个实施方案，所述靶基因使得当下调或抑制其表达时，昆虫害虫被杀死。根据另一个实施方案，所述靶基因使得当下调或抑制其表达时，会阻止或延缓或阻碍或延迟或妨碍害虫的生长或者阻止昆虫繁殖。根据本发明的又一个实施方案，所述靶基因使得当下调或抑制其表达时，会降低由害虫引起的损害和/或害虫侵染或侵扰环境、表面和/或植物或作物物种的能力；或者害虫停止从其天然食物资源(如植物和植物产物)中摄食。在全文中术语“侵染”和“感染”一般可交换使用。

所述靶基因可在昆虫害虫细胞的全部或一些中表达。此外，所述靶基因可仅在其生命周期的特定阶段由昆虫害虫表达，例如成熟的成虫期、未成熟的若虫期或幼虫期或卵期。

在一些具体实施方案中，本发明提供了如下靶基因，其编码与蛋白酶体(亚基或调节颗粒)、核糖体蛋白、胞内蛋白质转运、COPI囊泡(外被蛋白复合体，coat protein complex)、蛋白质修饰过程、细胞骨架、ATP酶或GTP酶激活物活性的功能有关的蛋白质(在表7和8中详细说明)。

在一些优选实施方案中，本发明提供了选自以下的靶基因：具有包含SEQ ID NO277、138、253、152、121、122、141、273、123、142、274、124、143、125至129、144、130、145、275、131、146、132、133、147、134、148、135、149、136、150、276、137、151、139、140、153、278、251、254、279、252、255、256、280、1、21、2、22、3、23、4、24、5、25、6、26、7、27、8、28、9、29、10、30、11、31、12、32、13、33、14、34、15、35、16、36、17、37、18、38、19、39、20或40或其互补序列中任一之核苷酸序列的基因，或具有如下核苷酸序列的基因：当将两条序列进行最佳比对和比较时，所述核苷酸序列与SEQ ID NO277、138、253、152、121、122、141、273、123、142、274、124、143、125至129、144、130、145、275、131、146、132、133、147、134、148、135、149、136、150、276、137、151、139、140、153、278、251、254、279、252、255、256、280、1、21、2、22、3、23、4、24、5、25、6、26、7、27、8、28、9、29、10、30、11、31、12、32、13、33、14、34、15、35、16、36、17、37、18、38、19、39、20或40或其互补序列中的任一具有至少75％，优选至少80％、85％、90％、95％、98％或99％的同一性；或者具有由SEQ ID NO277、138、253、152、121、122、141、273、123、142、274、124、143、125至129、144、130、145、275、131、146、132、133、147、134、148、135、149、136、150、276、137、151、139、140、153、278、251、254、279、252、255、256、280、1、21、2、22、3、23、4、24、5、25、6、26、7、27、8、28、9、29、10、30、11、31、12、32、13、33、14、34、15、35、16、36、17、37、18、38、19、39、20或40或其互补序列中任一组成的核苷酸序列的基因；或者具有包含SEQ IDNO277、138、253、152、121、122、141、273、123、142、274、124、143、125至129、144、130、145、275、131、146、132、133、147、134、148、135、149、136、150、276、137、151、139、140、153、278、251、254、279、252、255、256、280、1、21、2、22、3、23、4、24、5、25、6、26、7、27、8、28、9、29、10、30、11、31、12、32、13、33、14、34、15、35、16、36、17、37、18、38、19、39、20或40或其互补序列中任一之至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、110、125、150、175、200、225、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、9001000、1100或1115个连续核苷酸之片段的核苷酸序列的基因，或具有如下核苷酸序列的基因：当将包含所述片段之所述基因与SEQ ID NO277、138、253、152、121、122、141、273、123、142、274、124、143、125至129、144、130、145、275、131、146、132、133、147、134、148、135、149、136、150、276、137、151、139、140、153、278、251、254、279、252、255、256、280、1、21、2、22、3、23、4、24、5、25、6、26、7、27、8、28、9、29、10、30、11、31、12、32、13、33、14、34、15、35、16、36、17、37、18、38、19、39、20或40中的任一进行最佳比对和比较时，所述核苷酸序列与SEQ ID NO277、138、253、152、121、122、141、273、123、142、274、124、143、125至129、144、130、145、275、131、146、132、133、147、134、148、135、149、136、150、276、137、151、139、140、153、278、251、254、279、252、255、256、280、1、21、2、22、3、23、4、24、5、25、6、26、7、27、8、28、9、29、10、30、11、31、12、32、13、33、14、34、15、35、16、36、17、37、18、38、19、39、20或40或其互补序列中的任一具有至少75％，优选至少80％、85％、90％、95％、98％或99％的同一性；或者具有包含SEQ ID NO277、138、253、152、121、122、141、273、123、142、274、124、143、125至129、144、130、145、275、131、146、132、133、147、134、148、135、149、136、150、276、137、151、139、140、153、278、251、254、279、252、255、256、280、1、21、2、22、3、23、4、24、5、25、6、26、7、27、8、28、9、29、10、30、11、31、12、32、13、33、14、34、15、35、16、36、17、37、18、38、19、39、20或40或其互补序列中任一之至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、110、125、150、175、200、225、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、9001000、1100或1115个连续核苷酸之片段的核苷酸序列的基因，并且其中当将所述片段与SEQ ID NO277、138、253、152、121、122、141、273、123、142、274、124、143、125至129、144、130、145、275、131、146、132、133、147、134、148、135、149、136、150、276、137、151、139、140、153、278、251、254、279、252、255、256、280、1、21、2、22、3、23、4、24、5、25、6、26、7、27、8、28、9、29、10、30、11、31、12、32、13、33、14、34、15、35、16、36、17、37、18、38、19、39、20或40中任一之对应片段进行最佳比对和比较时，所述片段之所述核苷酸序列与SEQ ID NO277、138、253、152、121、122、141、273、123、142、274、124、143、125至129、144、130、145、275、131、146、132、133、147、134、148、135、149、136、150、276、137、151、139、140、153、278、251、254、279、252、255、256、280、1、21、2、22、3、23、4、24、5、25、6、26、7、27、8、28、9、29、10、30、11、31、12、32、13、33、14、34、15、35、16、36、17、37、18、38、19、39、20或40或其互补序列中任一之所述对应片段具有至少75％，优选至少80％、85％、90％、95％、98％或99％的同一性；或者如下基因：具有包含SEQ ID NO277、138、253、152、121、122、141、273、123、142、274、124、143、125至129、144、130、145、275、131、146、132、133、147、134、148、135、149、136、150、276、137、151、139、140、153、278、251、254、279、252、255、256、280、1、21、2、22、3、23、4、24、5、25、6、26、7、27、8、28、9、29、10、30、11、31、12、32、13、33、14、34、15、35、16、36、17、37、18、38、19、39、20或40或其互补序列中任一之核苷酸序列的基因的昆虫害虫直系同源物，其中所述两个直系同源物基因的序列相似到如下程度：使得当将所述两个基因进行最佳比对和比较时，所述直系同源物的序列与SEQ ID NO277、138、253、152、121、122、141、273、123、142、274、124、143、125至129、144、130、145、275、131、146、132、133、147、134、148、135、149、136、150、276、137、151、139、140、153、278、251、254、279、252、255、256、280、1、21、2、22、3、23、4、24、5、25、6、26、7、27、8、28、9、29、10、30、11、31、12、32、13、33、14、34、15、35、16、36、17、37、18、38、19、39、20或40中的任一具有至少75％，优选至少80％、85％、90％、95％、98％或99％的同一性；或者具有编码如下氨基酸序列的核苷酸序列的基因：当将两条氨基酸序列进行最佳比对和比较时，所述氨基酸序列与由SEQ ID NO277、138、253、152、121、122、141、273、123、142、274、124、143、125至129、144、130、145、275、131、146、132、133、147、134、148、135、149、136、150、276、137、151、139、140、153、278、251、254、279、252、255、256、280、1、21、2、22、3、23、4、24、5、25、6、26、7、27、8、28、9、29、10、30、11、31、12、32、13、33、14、34、15、35、16、36、17、37、18、38、19、39、20或40中任一所示核苷酸序列编码的氨基酸序列具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的同一性；或者具有编码如下氨基酸序列的核苷酸序列的基因：当将两条氨基酸序列进行最佳比对和比较时，所述氨基酸序列与由SEQ ID NO285、242、271、226、227、281、228、282、229、230至233、234、283、235、236、237、238、239、240、284、241、243、244、286、269、270、287、288、206至225中任一所示氨基酸序列具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的同一性；并且其中所述基因的核苷酸序列不长于5000、4000、3000、2000或1500个核苷酸。

本文使用的术语“序列同一性”用于描述两条或更多条核苷酸或氨基酸序列之间的序列关系。通过在比较窗(限定数目的位置)中比较两条最佳比对序列来测定两条序列之间“序列同一性”的百分比，其中比较窗中序列的部分可包括与参照序列相比的插入或缺失(即缺口)以实现最佳比对。序列同一性百分比通过以下方法来计算：确定两条序列中相同核苷酸碱基或氨基酸残基发生的位置数目以产生“匹配”位置数目，用匹配位置数目除以比较窗中的位置总数目，结果乘以100。对于两条最佳比对序列的比较，比较窗通过比对区域的全长确定。用于测定序列同一性的方法和软件可得自于本领域，包括Blast软件和GAP分析。对于核酸，优选通过BlastN比对工具计算同一性百分比，凭借该比对工具可在疑问核苷酸序列的全长上计算百分比同一性。

本领域技术人员认识到，可鉴定由SEQ ID NO277、138、253、152、121、122、141、273、123、142、274、124、143、125至129、144、130、145、275、131、146、132、133、147、134、148、135、149、136、150、276、137、151、139、140、153、278、251、254、279、252、255、256、280、1、21、2、22、3、23、4、24、5、25、6、26、7、27、8、28、9、29、10、30、11、31、12、32、13、33、14、34、15、35、16、36、17、37、18、38、19、39、20或40中任一所示靶基因的同源物或直系同源物(存在于不同物种中的同源物)。这些害虫的同源物和/或直系同源物也在本发明范围内。优选的同源物和/或直系同源物是如下基因，其序列相似到如下程度：使得当对两个基因进行最佳比对和比较时，所述同源物和/或直系同源物的序列与SEQ ID NO277、138、253、152、121、122、141、273、123、142、274、124、143、125至129、144、130、145、275、131、146、132、133、147、134、148、135、149、136、150、276、137、151、139、140、153、278、251、254、279、252、255、256、280、1、21、2、22、3、23、4、24、5、25、6、26、7、27、8、28、9、29、10、30、11、31、12、32、13、33、14、34、15、35、16、36、17、37、18、38、19、39、20或40或其互补序列中的任一具有至少75％，优选至少80％或85％，更优选至少90％或95％，最优选至少约99％的同一性。

另一些同源物是如下基因，它是包含SEQ ID NO277、138、253、152、121、122、141、273、123、142、274、124、143、125至129、144、130、145、275、131、146、132、133、147、134、148、135、149、136、150、276、137、151、139、140、153、278、251、254、279、252、255、256、280、1、21、2、22、3、23、4、24、5、25、6、26、7、27、8、28、9、29、10、30、11、31、12、32、13、33、14、34、15、35、16、36、17、37、18、38、19、39、20或40中任一所示序列之基因的等位基因。另一些优选的同源物是与包含SEQ ID NO277、138、253、152、121、122、141、273、123、142、274、124、143、125至129、144、130、145、275、131、146、132、133、147、134、148、135、149、136、150、276、137、151、139、140、153、278、251、254、279、252、255、256、280、1、21、2、22、3、23、4、24、5、25、6、26、7、27、8、28、9、29、10、30、11、31、12、32、13、33、14、34、15、35、16、36、17、37、18、38、19、39、20或40中任一所示序列的基因相比，包含至少一个单核苷酸多态性(SNP)的基因。

本发明的“干扰核糖核酸(RNA)”包括能够下调或“沉默”靶基因表达的任何类型的RNA分子，其包括但不限于有义RNA、反义RNA、短干扰RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)、双链RNA(dsRNA)、短发夹RNA(shRNA)等。用于测定功能性干扰RNA分子的方法为本领域所公知并且在本文其他地方公开。

本发明的干扰RNA分子通过结合靶基因中的靶标核苷酸序列从而序列特异性地下调靶基因的表达。结合发生的原因是干扰RNA与靶标核苷酸序列的互补区之间的碱基配对。本文使用的术语‘沉默元件’指包含与靶基因中的靶标核苷酸序列互补或至少部分互补的核苷酸序列或由其组成的干扰RNA的部分或区域，所述部分或区域作为干扰RNA的活性部分起指导下调所述靶基因表达的作用。在本发明的一个实施方案中，所述沉默元件包含有至少17个连续核苷酸，优选至少18或19个连续核苷酸，更优选至少21个连续核苷酸，甚至更优选至少22、23、24或25个连续核苷酸与靶基因中靶标核苷酸序列互补的序列或由其组成。

本文使用的“靶基因表达”指由靶基因编码的RNA转录本的转录和积累和/或mRNA翻译成蛋白质。术语“下调”旨在指本领域已知的干扰RNA分子降低由靶基因产生的初级RNA转录本、mRNA或蛋白质水平的方法中的任何一种。在某些实施方案中，下调指由基因产生的RNA或蛋白质水平降低至少10％，优选至少33％，更优选至少50％，更优选至少80％的情况。在一些特别优选的实施方案中，下调指与例如未暴露于干扰RNA或暴露于对照干扰RNA分子的适当对照昆虫害虫相比，在昆虫害虫细胞中由基因产生的RNA或蛋白质水平降低至少80％，优选至少90％，更优选至少95％，最优选至少99％。用于检测RNA或蛋白质水平降低的方法为本领域所公知，包括RNA溶液杂交、Northern杂交、逆转录(例如定量RT-PCR分析)、微阵列分析、抗体结合、酶联免疫吸附测定(ELISA)和Western印迹。在本发明的另一个实施方案中，下调指与适当的害虫对照相比，RNA或蛋白质水平降低到足以导致害虫表型的可检测变化，例如细胞死亡、生长停止等。因此可使用本领域常规技术通过昆虫害虫的表型分析来测量下调。

在本发明的一个优选实施方案中，干扰RNA通过RNA干扰或RNAi下调基因表达。RNAi是通常由双链RNA分子如短干扰RNA(siRNA)介导的序列特异性基因调节的过程。siRNA包含通过与反义RNA链碱基互补配对而退火的有义RNA链。siRNA分子的有义链或“引导链(guidestrand)”包含与位于靶基因之RNA转录本中的核苷酸序列互补的核苷酸序列。因此，siRNA的有义链能够通过Waston-Crick型碱基配对与RNA转录本退火，从而靶向RNA以在称为RNAi诱导沉默复合体(RNAi-induced silencing complex)或RISC的细胞复合体内降解。因此，在本发明的优选干扰RNA分子中，本文所提及的沉默元件可以是包含退火互补链的双链区，其中的至少一条链包含与靶基因中靶标核苷酸序列互补或至少部分互补的核苷酸序列或者由其组成。在一个实施方案中，所述双链区的长度为至少21、22、23、24、25、30、35、40、50、55、60、70、80、90、100、125、150、175、200个碱基对。

在本发明范围内还考虑了较长的双链RNA(dsRNA)分子，其包含一个或更多个如本文其他地方所述的功能性双链沉默元件并且能够发生RNAi介导的基因沉默。这种较长的dsRNA分子包含至少80、200、300、350、400、450、500、550、600、700、800、900、1000或1100个碱基对。这些dsRNA分子可充当活性siRNA分子的前体，所述活性siRNA分子引导RNA转录本至RISC复合体以随后降解。存在于生物体或其细胞周围的环境中的dsRNA分子可被生物体摄入并且被称为Dicer的酶加工以产生siRNA分子。或者，dsRNA可在体内产生，即在宿主细胞或优选在昆虫害虫细胞中摄入较长的前体dsRNA后，由编码存在于细胞(例如细菌细胞或植物细胞)内的所述dsRNA的一种或更多种多核苷酸转录，之后通过Dicer加工。所述dsRNA可由两条单独的(有义和反义)RNA链借助碱基互补配对退火形成。或者，dsRNA可以是能够自身向后折叠形成短发夹RNA(shRNA)或茎环(stem-loop)结构的单一链。在shRNA的情况中，双链区或“茎”由RNA的两个区域或区段形成，所述区域或区段基本上是彼此的反向重复并且具有足够的互补性以允许形成双链区。在分子的该“茎区域”中可存在一个或更多个功能性双链沉默元件。反向重复区域通常被RNA中称为“环”区域的区域或区段分隔开。该区域可包含给予足够柔性的任何核苷酸序列以允许在RNA的侧翼互补区域之间发生自身配对。一般来说，所述环区域基本上是单链的并且充当反向重复之间的间隔子元件。

所有本发明的干扰RNA分子通过结合靶基因中的靶标核苷酸序列从而序列特异性地下调靶基因的表达。由于干扰RNA的沉默元件与靶标核苷酸序列之间的碱基互补配对，发生结合。在本发明的一个实施方案中，所述靶标核苷酸序列包含靶基因之RNA转录本所示核苷酸序列或其片段，其中所述片段优选至少17个核苷酸，更优选18、19或20个核苷酸，或最优选至少21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、110、125、150、175、200、225、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、900、1000或1100个核苷酸。在本发明的一个优选实施方案中，所述靶标核苷酸序列包含与选自以下的多核苷酸中任一编码的RNA转录本相同的核苷酸序列：(i)包含SEQ ID NO277、138、253、152、198至201、121、122、141、154至157、273、123、142、158至161、274、124、143、162至165、125至129、144、166至169、130、145、170至173、275、131、146、174至177、132、133、147、178至181、134、148、182至185、135、149、186至189、136、150、190至193、276、137、151、194至197、139、140、153、202至205、278、251、254、257至260、279、252、255、256、261至268、280、1、21、41至44、2、22、45至48、3、23、49至52、4、24、53至56、5、25、57至60、6、26、61至64、7、27、65至68、8、28、69至72、9、29、73至76、10、30、77至80、11、31、81至84、12、32、85至88、13、33、89至92、14、34、93至96、15、35、97至100、16、36、101至104、17、37、105至108、18、38、109至112、19、39、113至116、20、40、117至120或其互补序列中任一所示核苷酸序列中的至少21个，优选至少22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、110、125、150、175、200、225、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、900、1000、1100或1115个连续核苷酸的多核苷酸；或者(ii)由SEQ ID NO277、138、253、152、198至201、121、122、141、154至157、273、123、142、158至161、274、124、143、162至165、125至129、144、166至169、130、145、170至173、275、131、146、174至177、132、133、147、178至181、134、148、182至185、135、149、186至189、136、150、190至193、276、137、151、194至197、139、140、153、202至205、278、251、254、257至260、279、252、255、256、261至268、280、1、21、41至44、2、22、45至48、3、23、49至52、4、24、53至56、5、25、57至60、6、26、61至64、7、27、65至68、8、28、69至72、9、29、73至76、10、30、77至80、11、31、81至84、12、32、85至88、13、33、89至92、14、34、93至96、15、35、97至100、16、36、101至104、17、37、105至108、18、38、109至112、19、39、113至116、20、40、117至120或其互补序列中任一所示核苷酸序列中的至少21个，优选至少22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、110、125、150、175、200、225、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、900、1000、1100或1115个连续核苷酸组成的多核苷酸；

或者(iii)包含SEQ ID NO277、138、253、152、198至201、121、122、141、154至157、273、123、142、158至161、274、124、143、162至165、125至129、144、166至169、130、145、170至173、275、131、146、174至177、132、133、147、178至181、134、148、182至185、135、149、186至189、136、150、190至193、276、137、151、194至197、139、140、153、202至205、278、251、254、257至260、279、252、255、256、261至268、280、1、21、41至44、2、22、45至48、3、23、49至52、4、24、53至56、5、25、57至60、6、26、61至64、7、27、65至68、8、28、69至72、9、29、73至76、10、30、77至80、11、31、81至84、12、32、85至88、13、33、89至92、14、34、93至96、15、35、97至100、16、36、101至104、17、37、105至108、18、38、109至112、19、39、113至116、20、40、117至120或其互补序列中任一所示核苷酸序列中的至少21个，优选至少22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、110、125、150、175、200、225、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、900、1000、1100或1115个连续核苷酸的多核苷酸，当将两条序列进行最佳比对和比较时，所述多核苷酸与SEQ ID NO277、138、253、152、198至201、121、122、141、154至157、273、123、142、158至161、274、124、143、162至165、125至129、144、166至169、130、145、170至173、275、131、146、174至177、132、133、147、178至181、134、148、182至185、135、149、186至189、136、150、190至193、276、137、151、194至197、139、140、153、202至205、278、251、254、257至260、279、252、255、256、261至268、280、1、21、41至44、2、22、45至48、3、23、49至52、4、24、53至56、5、25、57至60、6、26、61至64、7、27、65至68、8、28、69至72、9、29、73至76、10、30、77至80、11、31、81至84、12、32、85至88、13、33、89至92、14、34、93至96、15、35、97至100、16、36、101至104、17、37、105至108、18、38、109至112、19、39、113至116、20、40、117至120或其互补序列中的任一具有至少75％，优选至少80％、85％、90％、95％、98％或99％的同一性；或者(iv)包含SEQ ID NO277、138、253、152、198至201、121、122、141、154至157、273、123、142、158至161、274、124、143、162至165、125至129、144、166至169、130、145、170至173、275、131、146、174至177、132、133、147、178至181、134、148、182至185、135、149、186至189、136、150、190至193、276、137、151、194至197、139、140、153、202至205、278、251、254、257至260、279、252、255、256、261至268、280、1、21、41至44、2、22、45至48、3、23、49至52、4、24、53至56、5、25、57至60、6、26、61至64、7、27、65至68、8、28、69至72、9、29、73至76、10、30、77至80、11、31、81至84、12、32、85至88、13、33、89至92、14、34、93至96、15、35、97至100、16、36、101至104、17、37、105至108、18、38、109至112、19、39、113至116、20、40、117至120或其互补序列中任一所示核苷酸序列中的至少21个，优选至少22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、110、125、150、175、200、225、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、900、1000、1100或1115个连续核苷酸之片段的多核苷酸，并且其中所述片段或所述互补序列具有如下核苷酸序列：当将所述片段与SEQ ID NO277、138、253、152、198至201、121、122、141、154至157、273、123、142、158至161、274、124、143、162至165、125至129、144、166至169、130、145、170至173、275、131、146、174至177、132、133、147、178至181、134、148、182至185、135、149、186至189、136、150、190至193、276、137、151、194至197、139、140、153、202至205、278、251、254、257至260、279、252、255、256、261至268、280、1、21、41至44、2、22、45至48、3、23、49至52、4、24、53至56、5、25、57至60、6、26、61至64、7、27、65至68、8、28、69至72、9、29、73至76、10、30、77至80、11、31、81至84、12、32、85至88、13、33、89至92、14、34、93至96、15、35、97至100、16、36、101至104、17、37、105至108、18、38、109至112、19、39、113至116、20、40、117至120中任一之对应片段进行最佳比对和比较时，所述核苷酸序列与SEQ ID NO277、138、253、152、198至201、121、122、141、154至157、273、123、142、158至161、274、124、143、162至165、125至129、144、166至169、130、145、170至173、275、131、146、174至177、132、133、147、178至181、134、148、182至185、135、149、186至189、136、150、190至193、276、137、151、194至197、139、140、153、202至205、278、251、254、257至260、279、252、255、256、261至268、280、1、21、41至44、2、22、45至48、3、23、49至52、4、24、53至56、5、25、57至60、6、26、61至64、7、27、65至68、8、28、69至72、9、29、73至76、10、30、77至80、11、31、81至84、12、32、85至88、13、33、89至92、14、34、93至96、15、35、97至100、16、36、101至104、17、37、105至108、18、38、109至112、19、39、113至116、20、40、117至120或其互补序列中任一之所述对应片段具有至少75％，优选至少80％、85％、90％、95％、98％或99％的同一性；

或者(v)由SEQ ID NO277、138、253、152、198至201、121、122、141、154至157、273、123、142、158至161、274、124、143、162至165、125至129、144、166至169、130、145、170至173、275、131、146、174至177、132、133、147、178至181、134、148、182至185、135、149、186至189、136、150、190至193、276、137、151、194至197、139、140、153、202至205、278、251、254、257至260、279、252、255、256、261至268、280、1、21、41至44、2、22、45至48、3、23、49至52、4、24、53至56、5、25、57至60、6、26、61至64、7、27、65至68、8、28、69至72、9、29、73至76、10、30、77至80、11、31、81至84、12、32、85至88、13、33、89至92、14、34、93至96、15、35、97至100、16、36、101至104、17、37、105至108、18、38、109至112、19、39、113至116、20、40、117至120或其互补序列中任一所示核苷酸序列中的至少21个，优选至少22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、110、125、150、175、200、225、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、900、1000、1100或1115个连续核苷酸之片段组成的多核苷酸，并且其中所述片段或所述互补序列具有如下核苷酸序列：当将所述片段与SEQ IDNO277、138、253、152、198至201、121、122、141、154至157、273、123、142、158至161、274、124、143、162至165、125至129、144、166至169、130、145、170至173、275、131、146、174至177、132、133、147、178至181、134、148、182至185、135、149、186至189、136、150、190至193、276、137、151、194至197、139、140、153、202至205、278、251、254、257至260、279、252、255、256、261至268、280、1、21、41至44、2、22、45至48、3、23、49至52、4、24、53至56、5、25、57至60、6、26、61至64、7、27、65至68、8、28、69至72、9、29、73至76、10、30、77至80、11、31、81至84、12、32、85至88、13、33、89至92、14、34、93至96、15、35、97至100、16、36、101至104、17、37、105至108、18、38、109至112、19、39、113至116、20、40、117至120中任一之对应片段进行最佳比对和比较时，所述核苷酸序列与SEQ ID NO277、138、253、152、198至201、121、122、141、154至157、273、123、142、158至161、274、124、143、162至165、125至129、144、166至169、130、145、170至173、275、131、146、174至177、132、133、147、178至181、134、148、182至185、135、149、186至189、136、150、190至193、276、137、151、194至197、139、140、153、202至205、278、251、254、257至260、279、252、255、256、261至268、280、1、21、41至44、2、22、45至48、3、23、49至52、4、24、53至56、5、25、57至60、6、26、61至64、7、27、65至68、8、28、69至72、9、29、73至76、10、30、77至80、11、31、81至84、12、32、85至88、13、33、89至92、14、34、93至96、15、35、97至100、16、36、101至104、17、37、105至108、18、38、109至112、19、39、113至116、20、40、117至120或其互补序列中任一之所述对应片段具有至少75％，优选至少80％、85％、90％、95％、98％或99％的同一性；或者(vi)编码如下氨基酸序列的多核苷酸：当将两条氨基酸序列进行最佳比对和比较时，所述氨基酸序列与由SEQ ID NO277、138、253、152、198至201、121、122、141、154至157、273、123、142、158至161、274、124、143、162至165、125至129、144、166至169、130、145、170至173、275、131、146、174至177、132、133、147、178至181、134、148、182至185、135、149、186至189、136、150、190至193、276、137、151、194至197、139、140、153、202至205、278、251、254、257至260、279、252、255、256、261至268、280、1、21、41至44、2、22、45至48、3、23、49至52、4、24、53至56、5、25、57至60、6、26、61至64、7、27、65至68、8、28、69至72、9、29、73至76、10、30、77至80、11、31、81至84、12、32、85至88、13、33、89至92、14、34、93至96、15、35、97至100、16、36、101至104、17、37、105至108、18、38、109至112、19、39、113至116、20、40、117至120中任一所示核苷酸序列编码的氨基酸序列具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的同一性；或者(vii)编码如下氨基酸序列的核苷酸序列：当将两条氨基酸序列进行最佳比对和比较时，所述氨基酸序列与由SEQ ID NO285、242、271、226、227、281、228、282、229、230至233、234、283、235、236、237、238、239、240、284、241、243、244、286、269、270、287、288、206至225中任一所示氨基酸序列具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的同一性。在以上的一个更优选实施方案中，所述多核苷酸不长于10000、9000、8000、7000、6000、5000、4000、3000、2000或1500个核苷酸。

优选地，本发明的干扰RNA分子包含至少一个双链区(通常是干扰RNA的沉默元件)，其包含通过与反义RNA链碱基互补配对而退火的有义RNA链，其中dsRNA分子的有义链包含与位于靶基因之RNA转录本中的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

沉默元件(或当沉默元件为双链时其至少一条链)可与靶基因的靶标核苷酸序列完全互补或部分互补。本文使用的术语“完全互补”意指沉默元件核苷酸序列的所有碱基与靶标核苷酸序列碱基互补或“匹配”。术语“至少部分互补”意指沉默元件碱基与靶标核苷酸序列碱基之间的匹配小于100％。本领域技术人员将理解，为介导靶基因表达的下调，沉默元件仅需要与靶标核苷酸序列至少部分互补。本领域已知，相对于靶基因具有插入、缺失和错配的RNA序列也可在RNAi方面有效。根据本发明，优选沉默元件与靶基因的靶标核苷酸序列具有至少80％或85％序列同一性，优选至少90％或95％序列同一性，或更优选至少97％或98％序列同一性，并且更优选至少99％序列同一性。或者，在24个部分互补核苷酸的每个长度上，与靶标核苷酸序列相比沉默元件可包含1、2或3个错配。

本领域技术人员将理解，沉默元件与靶标核苷酸序列之间具有的互补程度可根据待下调靶基因或者根据基因表达待控制的昆虫害虫物种而改变。

在本发明的另一个实施方案中，所述沉默元件包含如下核苷酸序列，它是选自以下多核苷酸的多核苷酸中任一之RNA等同物：包含SEQ IDNO277、138、253、152、198至201、121、122、141、154至157、273、123、142、158至161、274、124、143、162至165、125至129、144、166至169、130、145、170至173、275、131、146、174至177、132、133、147、178至181、134、148、182至185、135、149、186至189、136、150、190至193、276、137、151、194至197、139、140、153、202至205、278、251、254、257至260、279、252、255、256、261至268、280、1、21、41至44、2、22、45至48、3、23、49至52、4、24、53至56、5、25、57至60、6、26、61至64、7、27、65至68、8、28、69至72、9、29、73至76、10、30、77至80、11、31、81至84、12、32、85至88、13、33、89至92、14、34、93至96、15、35、97至100、16、36、101至104、17、37、105至108、18、38、109至112、19、39、113至116、20、40、117至120或其互补序列中任一所示核苷酸序列中的至少21个，优选至少22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、110、125、150、175、200、225、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、900、1000、1100或1115个连续核苷酸的多核苷酸；或者(ii)包含SEQ ID NO277、138、253、152、198至201、121、122、141、154至157、273、123、142、158至161、274、124、143、162至165、125至129、144、166至169、130、145、170至173、275、131、146、174至177、132、133、147、178至181、134、148、182至185、135、149、186至189、136、150、190至193、276、137、151、194至197、139、140、153、202至205、278、251、254、257至260、279、252、255、256、261至268、280、1、21、41至44、2、22、45至48、3、23、49至52、4、24、53至56、5、25、57至60、6、26、61至64、7、27、65至68、8、28、69至72、9、29、73至76、10、30、77至80、11、31、81至84、12、32、85至88、13、33、89至92、14、34、93至96、15、35、97至100、16、36、101至104、17、37、105至108、18、38、109至112、19、39、113至116、20、40、117至120或其互补序列中任一所示核苷酸序列中的至少21个，优选至少22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、110、125、150、175、200、225、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、900、1000、1100或1115个连续核苷酸的多核苷酸，当将两条序列进行最佳比对和比较时，所述多核苷酸与SEQID NO277、138、253、152、198至201、121、122、141、154至157、273、123、142、158至161、274、124、143、162至165、125至129、144、166至169、130、145、170至173、275、131、146、174至177、132、133、147、178至181、134、148、182至185、135、149、186至189、136、150、190至193、276、137、151、194至197、139、140、153、202至205、278、251、254、257至260、279、252、255、256、261至268、280、1、21、41至44、2、22、45至48、3、23、49至52、4、24、53至56、5、25、57至60、6、26、61至64、7、27、65至68、8、28、69至72、9、29、73至76、10、30、77至80、11、31、81至84、12、32、85至88、13、33、89至92、14、34、93至96、15、35、97至100、16、36、101至104、17、37、105至108、18、38、109至112、19、39、113至116、20、40、117至120或其互补序列中的任一具有至少75％，优选至少80％、85％、90％、95％、98％或99％的同一性；或者(iii)包含SEQ ID NO277、138、253、152、198至201、121、122、141、154至157、273、123、142、158至161、274、124、143、162至165、125至129、144、166至169、130、145、170至173、275、131、146、174至177、132、133、147、178至181、134、148、182至185、135、149、186至189、136、150、190至193、276、137、151、194至197、139、140、153、202至205、278、251、254、257至260、279、252、255、256、261至268、280、1、21、41至44、2、22、45至48、3、23、49至52、4、24、53至56、5、25、57至60、6、26、61至64、7、27、65至68、8、28、69至72、9、29、73至76、10、30、77至80、11、31、81至84、12、32、85至88、13、33、89至92、14、34、93至96、15、35、97至100、16、36、101至104、17、37、105至108、18、38、109至112、19、39、113至116、20、40、117至120或其互补序列中任一所示核苷酸序列中的至少21个，优选至少22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、110、125、150、175、200、225、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、900、1000、1100或1115个连续核苷酸之片段的多核苷酸，并且其中所述片段或所述互补序列具有如下核苷酸序列：当将所述片段与SEQ ID NO277、138、253、152、198至201、121、122、141、154至157、273、123、142、158至161、274、124、143、162至165、125至129、144、166至169、130、145、170至173、275、131、146、174至177、132、133、147、178至181、134、148、182至185、135、149、186至189、136、150、190至193、276、137、151、194至197、139、140、153、202至205、278、251、254、257至260、279、252、255、256、261至268、280、1、21、41至44、2、22、45至48、3、23、49至52、4、24、53至56、5、25、57至60、6、26、61至64、7、27、65至68、8、28、69至72、9、29、73至76、10、30、77至80、11、31、81至84、12、32、85至88、13、33、89至92、14、34、93至96、15、35、97至100、16、36、101至104、17、37、105至108、18、38、109至112、19、39、113至116、20、40、117至120中任一之对应片段进行最佳比对和比较时，所述核苷酸序列与SEQ ID NO277、138、253、152、198至201、121、122、141、154至157、273、123、142、158至161、274、124、143、162至165、125至129、144、166至169、130、145、170至173、275、131、146、174至177、132、133、147、178至181、134、148、182至185、135、149、186至189、136、150、190至193、276、137、151、194至197、139、140、153、202至205、278、251、254、257至260、279、252、255、256、261至268、280、1、21、41至44、2、22、45至48、3、23、49至52、4、24、53至56、5、25、57至60、6、26、61至64、7、27、65至68、8、28、69至72、9、29、73至76、10、30、77至80、11、31、81至84、12、32、85至88、13、33、89至92、14、34、93至96、15、35、97至100、16、36、101至104、17、37、105至108、18、38、109至112、19、39、113至116、20、40、117至120或其互补序列中任一之所述对应片段具有至少75％，优选至少80％、85％、90％、95％、98％或99％的同一性；其中所述多核苷酸不长于10000、9000、8000、7000、6000、5000、4000、3000、2000或1500个核苷酸。应理解在这样的实施方案中，沉默元件可包含双链RNA区域或由其组成，所述双链RNA区域包含退火的互补链，其中的一条链有义链包含与靶基因中的靶标核苷酸序列至少部分互补的核苷酸序列。

靶标核苷酸序列可选自靶基因或其RNA转录本的任何合适区域或核苷酸序列。例如，靶标核苷酸序列可位于靶基因或RNA转录本的5’UTR或3’UTR内，或者基因的外显子或内含子区域内。

本领域技术人员熟知在全长靶基因背景下鉴定最合适的靶标核苷酸序列的方法。例如，可合成并测试靶向靶基因不同区域的多种沉默元件。或者，用酶如RNAse H消化RNA转录本可用于确定RNA的构象对基因沉默敏感的位点。使用计算机模拟(in silico)方法也可鉴定靶标位点，例如使用设计成以靶向全长基因中不同位点为基础来预测基因沉默效力的计算机算法。

本发明的干扰RNA可包含一个沉默元件或多个沉默元件，其中每个沉默元件包含与靶基因中的靶标核苷酸序列至少部分互补的核苷酸序列或由其组成，并且在被昆虫害虫物种摄入后起下调所述靶基因表达的作用。WO2006/046148中公开了该类型的多联体DNA构建体，其通过引用并入本文。在本发明的上下文中，术语“多个”意指至少两个，至少三个，至少四个等并且直至至少10、15、20个或至少30个。在一个实施方案中，干扰RNA包含多拷贝的单一沉默元件，即与特定靶基因中的特定靶标核苷酸序列结合的沉默元件的重复。在另一个实施方案中，干扰RNA中的沉默元件包含与不同靶标核苷酸序列序列互补的不同核苷酸序列或由其组成。应清楚的是，多拷贝的相同沉默元件与结合不同靶标核苷酸序列之沉默元件的组合在本发明范围内。

不同靶标核苷酸序列可来源于昆虫害虫物种的单一靶基因以实现改善的昆虫害虫物种中特定靶基因的下调。在这种情况下，沉默元件在干扰RNA中可以以靶基因中靶标核苷酸序列存在的原始顺序组合，或者沉默元件在干扰RNA中可以以与靶基因中靶标核苷酸序列的顺序相比的任何顺序随机打乱并组合。

或者，不同靶标核苷酸序列代表单一的但来源于不同昆虫害虫物种的靶基因。

或者，不同靶标核苷酸序列可来源于不同靶基因。如果将干扰RNA用于预防和/或控制害虫侵扰，则优选的是不同靶基因选自调节昆虫害虫物种的必需生物学功能的基因，所述生物学功能包括但不限于存活、生长、发育、繁殖和致病性。靶基因可调节相同或不同的生物学途径或过程。在一个实施方案中，沉默元件中的至少一种包含与靶基因中靶标核苷酸序列至少部分互补的核苷酸序列或由其组成，其中所述靶基因：选自具有包含SEQ ID NO277、138、253、152、121、122、141、273、123、142、274、124、143、125至129、144、130、145、275、131、146、132、133、147、134、148、135、149、136、150、276、137、151、139、140、153、278、251、254、279、252、255、256、280、1、21、2、22、3、23、4、24、5、25、6、26、7、27、8、28、9、29、10、30、11、31、12、32、13、33、14、34、15、35、16、36、17、37、18、38、19、39、20或40或其互补序列中任一之核苷酸序列的基因，或具有如下核苷酸序列的基因：当将两条序列进行最佳比对和比较时，所述核苷酸序列与SEQ ID NO277、138、253、152、121、122、141、273、123、142、274、124、143、125至129、144、130、145、275、131、146、132、133、147、134、148、135、149、136、150、276、137、151、139、140、153、278、251、254、279、252、255、256、280、1、21、2、22、3、23、4、24、5、25、6、26、7、27、8、28、9、29、10、30、11、31、12、32、13、33、14、34、15、35、16、36、17、37、18、38、19、39、20或40或其互补序列中的任一具有至少75％，优选至少80％、85％、90％、95％、98％或99％的同一性；或者(ii)选自具有包含SEQ ID NO277、138、253、152、121、122、141、273、123、142、274、124、143、125至129、144、130、145、275、131、146、132、133、147、134、148、135、149、136、150、276、137、151、139、140、153、278、251、254、279、252、255、256、280、1、21、2、22、3、23、4、24、5、25、6、26、7、27、8、28、9、29、10、30、11、31、12、32、13、33、14、34、15、35、16、36、17、37、18、38、19、39、20或40或其互补序列中任一之至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、110、125、150、175、200、225、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、9001000、1100或1115个连续核苷酸之片段的核苷酸序列的基因，或具有如下核苷酸序列的基因：当将包含所述片段之所述基因与SEQ IDNO277、138、253、152、121、122、141、273、123、142、274、124、143、125至129、144、130、145、275、131、146、132、133、147、134、148、135、149、136、150、276、137、151、139、140、153、278、251、254、279、252、255、256、280、1、21、2、22、3、23、4、24、5、25、6、26、7、27、8、28、9、29、10、30、11、31、12、32、13、33、14、34、15、35、16、36、17、37、18、38、19、39、20或40中的任一进行最佳比对和比较时，所述核苷酸序列与SEQ ID NO277、138、253、152、121、122、141、273、123、142、274、124、143、125至129、144、130、145、275、131、146、132、133、147、134、148、135、149、136、150、276、137、151、139、140、153、278、251、254、279、252、255、256、280、1、21、2、22、3、23、4、24、5、25、6、26、7、27、8、28、9、29、10、30、11、31、12、32、13、33、14、34、15、35、16、36、17、37、18、38、19、39、20或40或其互补序列中的任一具有至少75％，优选至少80％、85％、90％、95％、98％或99％的同一性；或者(iii)选自具有包含SEQ ID NO277、138、253、152、121、122、141、273、123、142、274、124、143、125至129、144、130、145、275、131、146、132、133、147、134、148、135、149、136、150、276、137、151、139、140、153、278、251、254、279、252、255、256、280、1、21、2、22、3、23、4、24、5、25、6、26、7、27、8、28、9、29、10、30、11、31、12、32、13、33、14、34、15、35、16、36、17、37、18、38、19、39、20或40或其互补序列中任一之至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、110、125、150、175、200、225、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、9001000、1100或1115个连续核苷酸之片段的核苷酸序列的基因，并且其中当将所述片段与SEQ ID NO277、138、253、152、121、122、141、273、123、142、274、124、143、125至129、144、130、145、275、131、146、132、133、147、134、148、135、149、136、150、276、137、151、139、140、153、278、251、254、279、252、255、256、280、1、21、2、22、3、23、4、24、5、25、6、26、7、27、8、28、9、29、10、30、11、31、12、32、13、33、14、34、15、35、16、36、17、37、18、38、19、39、20或40中任一之对应片段进行最佳比对和比较时，所述片段之所述核苷酸序列与SEQ ID NO277、138、253、152、121、122、141、273、123、142、274、124、143、125至129、144、130、145、275、131、146、132、133、147、134、148、135、149、136、150、276、137、151、139、140、153、278、251、254、279、252、255、256、280、1、21、2、22、3、23、4、24、5、25、6、26、7、27、8、28、9、29、10、30、11、31、12、32、13、33、14、34、15、35、16、36、17、37、18、38、19、39、20或40或其互补序列中任一之所述对应片段具有至少75％，优选至少80％、85％、90％、95％、98％或99％的同一性；或者(iv)是具有包含SEQ ID NO277、138、253、152、121、122、141、273、123、142、274、124、143、125至129、144、130、145、275、131、146、132、133、147、134、148、135、149、136、150、276、137、151、139、140、153、278、251、254、279、252、255、256、280、1、21、2、22、3、23、4、24、5、25、6、26、7、27、8、28、9、29、10、30、11、31、12、32、13、33、14、34、15、35、16、36、17、37、18、38、19、39、20或40或其互补序列中任一之核苷酸序列的基因的昆虫害虫直系同源物，其中所述两个直系同源物基因的序列相似到如下程度：使得当将所述两个基因进行最佳比对和比较时，所述直系同源物的序列与SEQ ID NO277、138、253、152、121、122、141、273、123、142、274、124、143、125至129、144、130、145、275、131、146、132、133、147、134、148、135、149、136、150、276、137、151、139、140、153、278、251、254、279、252、255、256、280、1、21、2、22、3、23、4、24、5、25、6、26、7、27、8、28、9、29、10、30、11、31、12、32、13、33、14、34、15、35、16、36、17、37、18、38、19、39、20或40中的任一具有至少75％，优选至少80％、85％、90％、95％、98％或99％的同一性；或者(v)选自具有编码如下氨基酸序列的核苷酸序列的基因：当将两条氨基酸序列进行最佳比对和比较时，所述氨基酸序列与由SEQ ID NO277、138、253、152、121、122、141、273、123、142、274、124、143、125至129、144、130、145、275、131、146、132、133、147、134、148、135、149、136、150、276、137、151、139、140、153、278、251、254、279、252、255、256、280、1、21、2、22、3、23、4、24、5、25、6、26、7、27、8、28、9、29、10、30、11、31、12、32、13、33、14、34、15、35、16、36、17、37、18、38、19、39、20或40中任一所示核苷酸序列编码的氨基酸序列具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的同一性；或者(vi)选自具有编码如下氨基酸序列的核苷酸序列的基因：当将两条氨基酸序列进行最佳比对和比较时，所述氨基酸序列与由SEQ ID NO285、242、271、226、227、281、228、282、229、230至233、234、283、235、236、237、238、239、240、284、241、243、244、286、269、270、287、288、206至225中任一所示氨基酸序列具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的同一性。优选地，所述靶基因的核苷酸序列不长于5000、4000、3000、2000或1500个核苷酸。

在本发明的另一实施方案中，不同沉默元件靶向的不同基因来源于相同的昆虫害虫物种。该方法设计成实现针对单一昆虫害虫物种的增强攻击。特别地，不同靶基因可在昆虫生命周期的不同阶段中差异性表达，例如成熟的成虫期、未成熟的幼虫期和卵期。因此，本发明的干扰RNA可用于在昆虫生命周期的多于一个阶段中预防和/或控制昆虫害虫侵扰。

在本发明的一个替代实施方案中，不同沉默元件靶向的不同基因来源于不同的昆虫害虫物种。因此，本发明的干扰RNA可用于同时预防和/或控制多于一种昆虫害虫物种的侵扰。

沉默元件可排列为干扰RNA的一个连续区域或者可通过接头序列的存在而分隔开。接头序列可包括不与任何靶标核苷酸序列或靶基因互补的短的随机核苷酸序列。在一个实施方案中，所述接头是条件性自切割RNA，优选pH敏感性接头或疏水敏感性接头，在一个实施方案中，所述接头包含与内含子序列相同的核苷酸序列。本发明接头序列的长度可以为约1个碱基对至约10,000个碱基对，前提是所述接头不破坏干扰RNA下调靶基因表达的能力。

除了沉默元件和任何接头序列之外，本发明的干扰RNA可包含至少一种另外的多核苷酸序列。在本发明的不同实施方案中，另外的序列选自：(i)能够保护干扰RNA免于RNA加工的序列，(ii)影响干扰RNA稳定性的序列，(iii)允许蛋白质结合(例如用以促进昆虫害虫物种的细胞摄入干扰RNA)的序列，(iv)利于大规模生产干扰RNA的序列，(v)属于与昆虫害虫细胞表面之受体或分子结合以促进摄入的适配体的序列，或(v)在昆虫害虫细胞中催化干扰RNA加工并由此增加干扰RNA效力的序列。增加RNA分子稳定性的结构为本领域所公知并且在WO2006/046148中有进一步描述，其通过引用并入本文。

本发明干扰RNA的长度需要足以被昆虫害虫物种细胞摄入并且下调害虫中的靶基因，如本文其他地方所述。但是，长度的上限可取决于(i)干扰RNA被害虫细胞摄入的要求和(ii)干扰RNA在害虫细胞中被加工以通过RNAi途径介导基因沉默的要求。也可根据生产方法和递送干扰RNA至细胞的制剂来制定长度。优选地，本发明干扰RNA的长度在21与10,000个核苷酸之间，优选在50与5000个核苷酸之间或在100与2500个核苷酸之间，更优选长度在80与2000个核苷酸之间。

所述干扰RNA可包含DNA碱基、非天然碱基或糖-磷酸骨架的非天然骨架连接或修饰，例如以增加储存期间的稳定性或增加对核酸酶降解的抗性。此外，所述干扰RNA可由本领域技术人员通过手动或自动反应化学地或酶促地生产。或者，所述干扰RNA可由编码其的多核苷酸转录。因此，本文提供了编码本发明干扰RNA中任一之分离多核苷酸。

本文还提供了选自以下的分离多核苷酸：(i)包含SEQ ID NO277、138、253、152、198至201、121、122、141、154至157、273、123、142、158至161、274、124、143、162至165、125至129、144、166至169、130、145、170至173、275、131、146、174至177、132、133、147、178至181、134、148、182至185、135、149、186至189、136、150、190至193、276、137、151、194至197、139、140、153、202至205、278、251、254、257至260、279、252、255、256、261至268、280、1、21、41至44、2、22、45至48、3、23、49至52、4、24、53至56、5、25、57至60、6、26、61至64、7、27、65至68、8、28、69至72、9、29、73至76、10、30、77至80、11、31、81至84、12、32、85至88、13、33、89至92、14、34、93至96、15、35、97至100、16、36、101至104、17、37、105至108、18、38、109至112、19、39、113至116、20、40、117至120或其互补序列中任一所示核苷酸序列中的至少21个，优选至少22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、110、125、150、175、200、225、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、900、1000、1100或1115个连续核苷酸的多核苷酸；或者(ii)由SEQ ID NO277、138、253、152、198至201、121、122、141、154至157、273、123、142、158至161、274、124、143、162至165、125至129、144、166至169、130、145、170至173、275、131、146、174至177、132、133、147、178至181、134、148、182至185、135、149、186至189、136、150、190至193、276、137、151、194至197、139、140、153、202至205、278、251、254、257至260、279、252、255、256、261至268、280、1、21、41至44、2、22、45至48、3、23、49至52、4、24、53至56、5、25、57至60、6、26、61至64、7、27、65至68、8、28、69至72、9、29、73至76、10、30、77至80、11、31、81至84、12、32、85至88、13、33、89至92、14、34、93至96、15、35、97至100、16、36、101至104、17、37、105至108、18、38、109至112、19、39、113至116、20、40、117至120或其互补序列中任一所示核苷酸序列中的至少21个，优选至少22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、110、125、150、175、200、225、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、900、1000、1100或1115个连续核苷酸组成的多核苷酸；或者(iii)包含SEQ ID NO277、138、253、152、198至201、121、122、141、154至157、273、123、142、158至161、274、124、143、162至165、125至129、144、166至169、130、145、170至173、275、131、146、174至177、132、133、147、178至181、134、148、182至185、135、149、186至189、136、150、190至193、276、137、151、194至197、139、140、153、202至205、278、251、254、257至260、279、252、255、256、261至268、280、1、21、41至44、2、22、45至48、3、23、49至52、4、24、53至56、5、25、57至60、6、26、61至64、7、27、65至68、8、28、69至72、9、29、73至76、10、30、77至80、11、31、81至84、12、32、85至88、13、33、89至92、14、34、93至96、15、35、97至100、16、36、101至104、17、37、105至108、18、38、109至112、19、39、113至116、20、40、117至120或其互补序列中任一所示核苷酸序列中的至少21个，优选至少22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、110、125、150、175、200、225、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、900、1000、1100或1115个连续核苷酸的多核苷酸，当将两条序列进行最佳比对和比较时，所述多核苷酸与SEQ ID NO277、138、253、152、198至201、121、122、141、154至157、273、123、142、158至161、274、124、143、162至165、125至129、144、166至169、130、145、170至173、275、131、146、174至177、132、133、147、178至181、134、148、182至185、135、149、186至189、136、150、190至193、276、137、151、194至197、139、140、153、202至205、278、251、254、257至260、279、252、255、256、261至268、280、1、21、41至44、2、22、45至48、3、23、49至52、4、24、53至56、5、25、57至60、6、26、61至64、7、27、65至68、8、28、69至72、9、29、73至76、10、30、77至80、11、31、81至84、12、32、85至88、13、33、89至92、14、34、93至96、15、35、97至100、16、36、101至104、17、37、105至108、18、38、109至112、19、39、113至116、20、40、117至120或其互补序列中的任一具有至少75％，优选至少80％、85％、90％、95％、98％或99％的同一性；或者(iv)包含SEQ ID NO277、138、253、152、198至201、121、122、141、154至157、273、123、142、158至161、274、124、143、162至165、125至129、144、166至169、130、145、170至173、275、131、146、174至177、132、133、147、178至181、134、148、182至185、135、149、186至189、136、150、190至193、276、137、151、194至197、139、140、153、202至205、278、251、254、257至260、279、252、255、256、261至268、280、1、21、41至44、2、22、45至48、3、23、49至52、4、24、53至56、5、25、57至60、6、26、61至64、7、27、65至68、8、28、69至72、9、29、73至76、10、30、77至80、11、31、81至84、12、32、85至88、13、33、89至92、14、34、93至96、15、35、97至100、16、36、101至104、17、37、105至108、18、38、109至112、19、39、113至116、20、40、117至120或其互补序列中任一所示核苷酸序列中的至少21个，优选至少22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、110、125、150、175、200、225、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、900、1000、1100或1115个连续核苷酸之片段的多核苷酸，并且其中所述片段或所述互补序列具有如下核苷酸序列：当将所述片段与SEQ ID NO277、138、253、152、198至201、121、122、141、154至157、273、123、142、158至161、274、124、143、162至165、125至129、144、166至169、130、145、170至173、275、131、146、174至177、132、133、147、178至181、134、148、182至185、135、149、186至189、136、150、190至193、276、137、151、194至197、139、140、153、202至205、278、251、254、257至260、279、252、255、256、261至268、280、1、21、41至44、2、22、45至48、3、23、49至52、4、24、53至56、5、25、57至60、6、26、61至64、7、27、65至68、8、28、69至72、9、29、73至76、10、30、77至80、11、31、81至84、12、32、85至88、13、33、89至92、14、34、93至96、15、35、97至100、16、36、101至104、17、37、105至108、18、38、109至112、19、39、113至116、20、40、117至120中任一之对应片段进行最佳比对和比较时，所述核苷酸序列与SEQ ID NO277、138、253、152、198至201、121、122、141、154至157、273、123、142、158至161、274、124、143、162至165、125至129、144、166至169、130、145、170至173、275、131、146、174至177、132、133、147、178至181、134、148、182至185、135、149、186至189、136、150、190至193、276、137、151、194至197、139、140、153、202至205、278、251、254、257至260、279、252、255、256、261至268、280、1、21、41至44、2、22、45至48、3、23、49至52、4、24、53至56、5、25、57至60、6、26、61至64、7、27、65至68、8、28、69至72、9、29、73至76、10、30、77至80、11、31、81至84、12、32、85至88、13、33、89至92、14、34、93至96、15、35、97至100、16、36、101至104、17、37、105至108、18、38、109至112、19、39、113至116、20、40、117至120或其互补序列中任一之所述对应片段具有至少75％，优选至少80％、85％、90％、95％、98％或99％的同一性；或者(v)由SEQ ID NO277、138、253、152、198至201、121、122、141、154至157、273、123、142、158至161、274、124、143、162至165、125至129、144、166至169、130、145、170至173、275、131、146、174至177、132、133、147、178至181、134、148、182至185、135、149、186至189、136、150、190至193、276、137、151、194至197、139、140、153、202至205、278、251、254、257至260、279、252、255、256、261至268、280、1、21、41至44、2、22、45至48、3、23、49至52、4、24、53至56、5、25、57至60、6、26、61至64、7、27、65至68、8、28、69至72、9、29、73至76、10、30、77至80、11、31、81至84、12、32、85至88、13、33、89至92、14、34、93至96、15、35、97至100、16、36、101至104、17、37、105至108、18、38、109至112、19、39、113至116、20、40、117至120或其互补序列中任一所示核苷酸序列中的至少21个，优选至少22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、110、125、150、175、200、225、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、900、1000、1100或1115个连续核苷酸之片段组成的多核苷酸，并且其中所述片段或所述互补序列具有如下核苷酸序列：当将所述片段与SEQ ID NO277、138、253、152、198至201、121、122、141、154至157、273、123、142、158至161、274、124、143、162至165、125至129、144、166至169、130、145、170至173、275、131、146、174至177、132、133、147、178至181、134、148、182至185、135、149、186至189、136、150、190至193、276、137、151、194至197、139、140、153、202至205、278、251、254、257至260、279、252、255、256、261至268、280、1、21、41至44、2、22、45至48、3、23、49至52、4、24、53至56、5、25、57至60、6、26、61至64、7、27、65至68、8、28、69至72、9、29、73至76、10、30、77至80、11、31、81至84、12、32、85至88、13、33、89至92、14、34、93至96、15、35、97至100、16、36、101至104、17、37、105至108、18、38、109至112、19、39、113至116、20、40、117至120中任一之对应片段进行最佳比对和比较时，所述核苷酸序列与SEQ ID NO277、138、253、152、198至201、121、122、141、154至157、273、123、142、158至161、274、124、143、162至165、125至129、144、166至169、130、145、170至173、275、131、146、174至177、132、133、147、178至181、134、148、182至185、135、149、186至189、136、150、190至193、276、137、151、194至197、139、140、153、202至205、278、251、254、257至260、279、252、255、256、261至268、280、1、21、41至44、2、22、45至48、3、23、49至52、4、24、53至56、5、25、57至60、6、26、61至64、7、27、65至68、8、28、69至72、9、29、73至76、10、30、77至80、11、31、81至84、12、32、85至88、13、33、89至92、14、34、93至96、15、35、97至100、16、36、101至104、17、37、105至108、18、38、109至112、19、39、113至116、20、40、117至120或其互补序列中任一之所述对应片段具有至少75％，优选至少80％、85％、90％、95％、98％或99％的同一性；或者(vi)编码如下氨基酸序列的多核苷酸：当将两条氨基酸序列进行最佳比对和比较时，所述氨基酸序列与由SEQ ID NO277、138、253、152、198至201、121、122、141、154至157、273、123、142、158至161、274、124、143、162至165、125至129、144、166至169、130、145、170至173、275、131、146、174至177、132、133、147、178至181、134、148、182至185、135、149、186至189、136、150、190至193、276、137、151、194至197、139、140、153、202至205、278、251、254、257至260、279、252、255、256、261至268、280、1、21、41至44、2、22、45至48、3、23、49至52、4、24、53至56、5、25、57至60、6、26、61至64、7、27、65至68、8、28、69至72、9、29、73至76、10、30、77至80、11、31、81至84、12、32、85至88、13、33、89至92、14、34、93至96、15、35、97至100、16、36、101至104、17、37、105至108、18、38、109至112、19、39、113至116、20、40、117至120中任一所示核苷酸序列编码的氨基酸序列具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的同一性；或者(vii)编码如下氨基酸序列的核苷酸序列：当将两条氨基酸序列进行最佳比对和比较时，所述氨基酸序列与SEQ ID NO285、242、271、226、227、281、228、282、229、230至233、234、283、235、236、237、238、239、240、284、241、243、244、286、269、270、287、288、206至225中任一所示氨基酸序列具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的同一性；并且其中所述多核苷酸不长于10000、9000、8000、7000、6000、5000、4000、3000、2000或1500个核苷酸。

在一些优选实施方案中，所述分离的多核苷酸是干扰RNA分子的一部分，通常是沉默元件的一部分，其包含至少一个双链区，所述双链区包含通过与反义RNA链碱基互补配对而退火的有义RNA链，其中dsRNA分子的有义链包含与位于靶基因之RNA转录本中的核苷酸序列互补的核苷酸序列。因此，dsRNA的有义链能够退火至RNA转录本并在RNAi诱导的沉默复合体或RISC内靶向RNA以降解。

本发明的多核苷酸可通过常规分子克隆技术插入到本领域已知的DNA构建体或载体中。因此，根据一个实施方案，提供了包含本发明多核苷酸中任一之DNA构建体。优选地，本文提供了包含编码本发明干扰RNA中任一之多核苷酸的DNA构建体。DNA构建体可以是重组DNA构建体，例如细菌载体或酵母载体或质粒。在本发明的一个优选实施方案中，所述DNA构建体是表达构建体并且所述多核苷酸有效连接至至少一个能够驱动多核苷酸序列表达的调控序列。术语“调控序列”应取广义并且旨在指有效连接至多核苷酸的能够影响所述多核苷酸表达的任何核苷酸序列，包括但不限于启动子、增强子和其他天然或合成的转录激活元件。调控序列可位于多核苷酸序列的5’或3’端。术语“有效连接”指调控序列与多核苷酸序列之间的功能性连接使得调控序列驱动多核苷酸表达。有效连接元件可以是相邻的或不相邻的。

优选地，所述调控序列是选自包括但不限于以下的启动子：组成型启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子和生长/发育阶段特异性启动子。在一个实施方案中，多核苷酸被置于强组成型启动子之下，所述启动子例如是选自以下启动子的任何一种：CaMV35S启动子、双CaMV35S启动子(doubled CaMV35S promoter)、泛素启动子、肌动蛋白启动子、核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(rubisco)启动子、GOS2启动子、玄参花叶病毒(Figwort mosaic virus，FMV)34S启动子。在另一个实施方案中，调节序列是用于调节植物中多核苷酸表达的植物启动子。包括在本发明范围内的植物启动子，特别是组织特异性植物启动子在本文其他地方进行了更详细地描述。

任选地，一种或更多种转录终止序列可合并到本发明的表达构建体中。术语“转录终止序列”涵盖在转录单元末端的控制序列，其发送转录终止(3’加工和初级转录本的多聚腺苷酸化)的信号。另外的调节元件，包括但不限于转录的或翻译的增强子，可合并到表达构建体中，例如与双增强CaMV35S启动子一起。

本发明还包括用于产生本发明干扰RNA中任何一种的方法，其包括步骤：(i)使编码所述干扰RNA的多核苷酸或包含所述多核苷酸的DNA构建体与不含细胞的组分相接触；或(ii)将编码所述干扰RNA的多核苷酸或包含所述多核苷酸的DNA构建体引入(例如通过转化、转染或注射)到细胞中。因此，本文还提供了如下宿主细胞，其包含本发明干扰RNA中的任何一种、本发明多核苷酸中的任何一种或包含其的DNA构建体。宿主细胞可以是原核细胞(包括但不限于革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌细胞)或真核细胞(包括但不限于酵母细胞或植物细胞)。优选地，所述宿主细胞是细菌细胞或植物细胞。细菌可选自包括但不限于以下的细菌：革兰氏阳性和阴性细胞，包括埃希菌(Escherichia)属(如大肠杆菌)、芽孢杆菌(Bacillus)属(如苏云金芽孢杆菌B.thuringiensis)、根瘤菌(Rhizobium)属、乳酸菌(Lactobacilllus)属、乳球菌(Lactococcus)属、假单胞菌(Pseudomonas)属和农杆菌(Agrobacterium)属。本发明的多核苷酸或DNA构建体在宿主细胞中可作为染色体外元件存在或维持，或者可稳定地合并到宿主细胞染色体中。为了本发明的目的，在选择宿主细胞时特别在意的特征包括编码干扰RNA的多核苷酸或DNA构建体可引入到宿主中的容易程度、兼容表达系统的可用性、表达的效率和干扰RNA在宿主中的稳定性。

本发明的DNA构建体还可包含复制起点，其对于在具体细胞类型或宿主细胞中的维持和/或复制是必需的。一个实例是要求表达构建体作为细胞中的外染色体或游离遗传元件(例如质粒或粘粒分子)维持在细菌细胞中的时候。优选的复制起点包括，但不限于，f1-ori、pBR322ori(pMB1)和colE1ori。

重组构建体可任选地包含选择标记基因。本文使用的术语“选择标记基因”包括任何下述基因，其向它在其中表达的细胞赋予表型，以促进对经本发明表达构建体转染或转化的细胞的鉴定和/或选择。合适的选择标记的实例包括抗氨苄青霉素(Ampr)、四环素(Tcr)、卡那霉素(Kanr)、膦丝菌素和氯霉素(CAT)的抗性基因。另外的合适的标记基因提供代谢性状，例如manA。也可使用可视的标记基因，包括例如β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)、荧光素酶和绿色荧光蛋白(GFP)。

在干扰RNA在宿主细胞中表达和/或用于预防和/或控制宿主生物体害虫侵扰的情况下，优选的是干扰RNA不表现出显著的“脱靶(off-target)”作用，即干扰RNA不影响宿主内的基因表达。优选地，沉默基因不与除靶基因的预定靶标核苷酸序列之外的核苷酸序列表现出显著互补性。在本发明的一个实施方案中，沉默元件显示出与宿主细胞或生物体的任何基因具有小于30％、更优选小于20％、更优选小于10％、甚至更优选小于5％的序列同一性。如果宿主生物体的基因组序列数据是可得到的，人们可以使用标准的生物信息学工具交叉检验与沉默元件的序列同一性。在一个实施方案中，沉默元件与来自宿主细胞或宿主生物体的基因之间对于17个连续核苷酸的区域、更优选18个或19个的区域，更优选20个或21个的区域没有序列同一性。

如本文所述的干扰RNA分子或编码干扰RNA分子的DNA构建体或包含干扰RNA分子的宿主细胞中的任何一种可用于预防和/或控制昆虫害虫侵扰。由此，所述干扰RNA或DNA构建体或包含其的宿主细胞可称为杀虫剂(pesticide)或杀昆虫剂(insecticide)。优选地，本发明的干扰RNA分子和/或DNA构建体或宿主细胞作为预防和/或控制植物害虫侵扰的手段用于处理植物。特别地。可提供干扰RNA分子和/或DNA构建体或宿主细胞可作为试剂盒以预防和/或控制害虫侵扰，优选植物的害虫侵扰。

此外，根据本发明的另一方面，本文提供了用于预防和/或控制昆虫害虫侵扰的组合物，其包含至少一种干扰核糖核酸(RNA)和任选至少一种合适的载体、赋形剂或稀释剂，其中所述干扰RNA在被害虫摄入后起下调所述害虫中靶基因表达的作用。所述干扰RNA可以是本文其他地方所公开的那些中的任何一种。优选地，所述干扰RNA包含至少一个沉默元件或由其组成，并且所述沉默元件是包含退火互补链的双链RNA区域，其中一条链(有义链)包含与靶基因中的靶标核苷酸序列至少部分互补的核苷酸序列。“靶基因”可以是本文其他地方所公开的害虫靶基因中的任何一种，其包括但不限于参与调节害虫存活、生长、发育、繁殖和致病性的基因。或者，所述组合物包含至少一种宿主细胞和任何至少一种合适的载体、赋形剂或稀释剂，所述宿主细胞包含至少一种干扰RNA分子或编码所述干扰RNA分子的DNA构建体，其中所述干扰RNA在被昆虫害虫摄入后起下调所述害虫中靶基因表达的作用。

在本发明的实际应用中，所述组合物可用于预防和/或控制属于以下目的任何昆虫害虫：鞘翅目、鳞翅目、双翅目、蠊螂目、直翅目、半翅目和蚤目。因此，组合物可以任何合适的形式施用于昆虫害虫，或施用于对所述昆虫害虫侵扰敏感的基质和/或生物体，特别是植物。在一个实施方案中，组合物用于预防和/或控制植物或者植物繁殖或再生材料的害虫侵扰并因此针对于侵扰植物的昆虫害虫物种。当昆虫害虫属于通过吃植物组织(如根、叶、花、芽、细枝等)对植物造成相当大损害的“咀嚼”昆虫种类时，本发明的组合物特别有效。该大昆虫种类的实例包括甲虫及其幼虫。在本发明的一个优选实施方案中，所述昆虫害虫选自甲虫(Leptinotarsa)属。更优选地，所述靶标昆虫害虫物种是马铃薯甲虫。

本发明的组合物对刺吸和/或舐吸植物细胞和组织的流体的昆虫物种也有效。因此，在本发明的另一个优选实施方案中，所述昆虫害虫选自盲蝽(Lygus)属。优选地，所述靶标昆虫害虫物种选自Lygus adspersus、阿拉善迈盲蝽(Lygus alashanensis)、Lygus borealis、Lygus elisus、青绿草盲蝽(Lygus gemellatus)、豆荚草盲蝽(Lygus hesperus)、美国牧草盲蝽(Lygus lineolaris)或长毛草盲蝽(Lygus rugulipennis)。更优选地，所述靶标昆虫害虫物种是豆荚草盲蝽。本发明的组合物可用于在害虫生命周期所有阶段(包括成熟的成熟期、幼虫期和卵期)中控制昆虫害虫。

在本发明组合物的背景中，干扰RNA可由包含编码所述干扰RNA的多核苷酸的DNA构建体，特别是如本文其他地方所述的表达构建体产生。此外，干扰RNA可在改造成由编码其的多核苷酸表达所述干扰RNA的宿主细胞或生物体内产生。用于本发明组合物的合适宿主生物体包括但不限于已知在目的植物或作物(对害虫物种侵扰敏感的植物或作物)上和/或周围环境中定殖的微生物。这些微生物包括但不限于居住在叶面(植物叶子的表面)和/或根际(植物根部周围的土壤)的那些。选择这些微生物以使得能够成功竞争植物环境中存在的任何野生型生物体。用作宿主的合适微生物包括细菌、藻类和真菌的多种物种。清楚的是，所选择的微生物必须对植物没有毒性。

不是天然在植物和/或其环境中定殖的宿主生物体也在本发明范围内。在一个实施方案中，在细菌宿主中发酵产生干扰RNA，加工所得死亡细菌并且通过与将苏云金芽孢杆菌菌株用作喷雾施用的杀虫剂相同的方式将其用作杀虫喷雾。

在本发明的组合物用于预防和/控制植物的害虫侵扰的情况下，所述组合物可包含农业上合适的载体。这种载体可以是待处理植物可容忍的任何材料，其不对环境或其中的其他生物体产生过度损害并且允许干扰RNA对昆虫害虫物种仍然有效。特别地，本发明的组合物可配制成用于根据生物杀虫剂工业的常规农业方法递送至植物。所述组合物可包含能够执行另一些功能的另一些组分，所述另一些功能包括但不限于(i)增强或促进害虫细胞对干扰RNA的摄入和(ii)稳定组合物中的活性组分。在包含干扰RNA的组合物中包含的这些另一些组分的具体实例是酵母tRNA或酵母总RNA。

可将组合物配制用于直接施用或作为在使用前需要稀释的原始组合物的浓缩物。或者，组合物可作为试剂盒提供，所述试剂盒在一个容器中包含干扰RNA或者包含或表达所述干扰RNA的宿主细胞并且在另一个容器中包含对于RNA或宿主细胞合适的稀释剂或载体。在本发明的实际应用中，所述组合物可施用于植物发育任何阶段时的植物或植物的任何部位。在一个实施方案中，组合物施用于植物的地上部分，例如在田地中耕种植物作物期间。在另一个实施方案中，组合物在植物种子储存时或者被播种到土壤中后施用于所述植物种子。一般重要的是在植物生长早期得到良好的害虫控制，原因是这时候害虫物种可最严重地损害所述植物。

可通过多种技术将组合物施用于昆虫害虫的环境，所述技术包括但不限于喷洒、喷雾、撒粉、撒播、倾倒、种子包衣、种子处理、引入到土壤中和引入到灌溉用水中。在处理对害虫侵扰敏感的植物时，组合物可在害虫出现前(为了预防)或害虫侵扰信号一开始出现(为了害虫控制)就递送至植物或植物部分中。

在本发明的另一个实施方案中，组合物配制成使得其包含至少一种另外的农艺用药，例如除草剂或另一种杀虫剂。本文使用的“第二杀虫剂”或“另外的杀虫剂”指除组合物中的第一或原始干扰RNA分子之外的杀虫剂。或者，本发明的组合物可与至少一种其他农艺用药(例如除草剂或另外的杀虫剂)组合递送。在一个实施方案中，提供了与选自以下的本领域公知的除草剂相组合的所述组合物：例如草甘膦、咪唑啉酮、磺脲和溴草腈。在另一个实施方案中，提供了与至少一种另外的杀虫剂相组合的所述组合物。所述另外的杀虫剂可选自本领域已知的任何杀虫剂和/或可包含在被害虫摄入后起下调所述害虫物种中靶基因表达的干扰核糖核酸。在一个实施方案中，所述靶标害虫是昆虫害虫物种并且所述干扰RNA选自本文所述干扰RNA中的任何一种。在另一个实施方案中，另外的杀虫剂包括起下调任何靶标害虫物种(不限于昆虫害虫)中已知基因表达作用的干扰RNA。组合物的原始干扰RNA分子和第二或另外的杀虫剂可靶向相同的昆虫害虫物种，或者可旨在靶向不同的昆虫害虫物种。例如，原始干扰RNA和第二杀虫剂可靶向昆虫害虫的不同物种或者可靶向害虫生物体(如真菌或线虫或昆虫)的不同家族或种类。对于本领域技术人员来说，很清楚如何测试干扰RNA分子与其他农艺用药之组合的协同效应。在一个优选实施方案中，所述组合物包含本文其他地方所述的第一干扰RNA分子和一种或更多种另外的杀虫剂，每一种都对相同的昆虫害虫有毒性，其中所述一种或更多种另外的杀虫剂选自马铃薯糖蛋白、苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白、致病杆菌(Xenorhabdus)杀虫蛋白、发光杆菌(Photorhabdus)杀虫蛋白、Bacillus laterosporous杀虫蛋白、球形芽孢杆菌(Bacillusspaericus)杀虫蛋白和木质素，并且其中所述苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白选自Cry1Ab、Cry1C、Cry2Aa、Cry3、TIC851、CryET70、Cry22、VIP、TIC901、TIC1201、TIC407、TIC417、双成分杀菌蛋白(选自CryET33和CryET34、CryET80和CryET76、TIC100和TIC101)、和PS14981和上述杀虫蛋白中任何一种的杀虫嵌合体。

本文所述组合的不同组分可以以任何顺序施用于例如对害虫侵扰敏感的宿主生物体。组分可同时或顺序施用于待处理区域或生物体。

根据本发明的另一方面，本文提供了一种用于下调昆虫害虫物种中靶基因表达的方法，其包括使所述害虫与有效量的至少一种干扰核糖核酸(RNA)相接触，其中所述干扰RNA在被害虫摄入后起下调所述害虫中靶基因表达的作用。

所述靶基因可以是本文其他地方所述的害虫基因的任何一种。特别地，所述靶基因可以是：选自具有包含SEQ ID NO277、138、253、152、121、122、141、273、123、142、274、124、143、125至129、144、130、145、275、131、146、132、133、147、134、148、135、149、136、150、276、137、151、139、140、153、278、251、254、279、252、255、256、280、1、21、2、22、3、23、4、24、5、25、6、26、7、27、8、28、9、29、10、30、11、31、12、32、13、33、14、34、15、35、16、36、17、37、18、38、19、39、20或40或其互补序列中任一之核苷酸序列的基因，或具有如下核苷酸序列的基因：当将两条序列进行最佳比对和比较时，所述核苷酸序列与SEQ ID NO277、138、253、152、121、122、141、273、123、142、274、124、143、125至129、144、130、145、275、131、146、132、133、147、134、148、135、149、136、150、276、137、151、139、140、153、278、251、254、279、252、255、256、280、1、21、2、22、3、23、4、24、5、25、6、26、7、27、8、28、9、29、10、30、11、31、12、32、13、33、14、34、15、35、16、36、17、37、18、38、19、39、20或40或其互补序列中的任一具有至少75％，优选至少80％、85％、90％、95％、98％或99％的同一性；或者选自具有由SEQ ID NO277、138、253、152、121、122、141、273、123、142、274、124、143、125至129、144、130、145、275、131、146、132、133、147、134、148、135、149、136、150、276、137、151、139、140、153、278、251、254、279、252、255、256、280、1、21、2、22、3、23、4、24、5、25、6、26、7、27、8、28、9、29、10、30、11、31、12、32、13、33、14、34、15、35、16、36、17、37、18、38、19、39、20或40或其互补序列中任一组成的核苷酸序列的基因；或者选自具有包含SEQ ID NO277、138、253、152、121、122、141、273、123、142、274、124、143、125至129、144、130、145、275、131、146、132、133、147、134、148、135、149、136、150、276、137、151、139、140、153、278、251、254、279、252、255、256、280、1、21、2、22、3、23、4、24、5、25、6、26、7、27、8、28、9、29、10、30、11、31、12、32、13、33、14、34、15、35、16、36、17、37、18、38、19、39、20或40或其互补序列中任一之至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、110、125、150、175、200、225、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、9001000、1100或1115个连续核苷酸之片段的核苷酸序列的基因，或具有如下核苷酸序列的基因：当将包含所述片段之所述基因与SEQ ID NO277、138、253、152、121、122、141、273、123、142、274、124、143、125至129、144、130、145、275、131、146、132、133、147、134、148、135、149、136、150、276、137、151、139、140、153、278、251、254、279、252、255、256、280、1、21、2、22、3、23、4、24、5、25、6、26、7、27、8、28、9、29、10、30、11、31、12、32、13、33、14、34、15、35、16、36、17、37、18、38、19、39、20或40中的任一进行最佳比对和比较时，所述核苷酸序列与SEQ IDNO277、138、253、152、121、122、141、273、123、142、274、124、143、125至129、144、130、145、275、131、146、132、133、147、134、148、135、149、136、150、276、137、151、139、140、153、278、251、254、279、252、255、256、280、1、21、2、22、3、23、4、24、5、25、6、26、7、27、8、28、9、29、10、30、11、31、12、32、13、33、14、34、15、35、16、36、17、37、18、38、19、39、20或40或其互补序列中的任一具有至少75％，优选至少80％、85％、90％、95％、98％或99％的同一性；或者选自具有包含SEQ ID NO277、138、253、152、121、122、141、273、123、142、274、124、143、125至129、144、130、145、275、131、146、132、133、147、134、148、135、149、136、150、276、137、151、139、140、153、278、251、254、279、252、255、256、280、1、21、2、22、3、23、4、24、5、25、6、26、7、27、8、28、9、29、10、30、11、31、12、32、13、33、14、34、15、35、16、36、17、37、18、38、19、39、20或40或其互补序列中任一之至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、110、125、150、175、200、225、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、9001000、1100或1115个连续核苷酸之片段的核苷酸序列的基因，并且其中当将所述片段与SEQ ID NO277、138、253、152、121、122、141、273、123、142、274、124、143、125至129、144、130、145、275、131、146、132、133、147、134、148、135、149、136、150、276、137、151、139、140、153、278、251、254、279、252、255、256、280、1、21、2、22、3、23、4、24、5、25、6、26、7、27、8、28、9、29、10、30、11、31、12、32、13、33、14、34、15、35、16、36、17、37、18、38、19、39、20或40中任一之对应片段进行最佳比对和比较时，所述片段之所述核苷酸序列与SEQ ID NO277、138、253、152、121、122、141、273、123、142、274、124、143、125至129、144、130、145、275、131、146、132、133、147、134、148、135、149、136、150、276、137、151、139、140、153、278、251、254、279、252、255、256、280、1、21、2、22、3、23、4、24、5、25、6、26、7、27、8、28、9、29、10、30、11、31、12、32、13、33、14、34、15、35、16、36、17、37、18、38、19、39、20或40或其互补序列中任一之所述对应片段具有至少75％，优选至少80％、85％、90％、95％、98％或99％的同一性。

靶基因还可以是具有包含SEQ ID NO277、138、253、152、121、122、141、273、123、142、274、124、143、125至129、144、130、145、275、131、146、132、133、147、134、148、135、149、136、150、276、137、151、139、140、153、278、251、254、279、252、255、256、280、1、21、2、22、3、23、4、24、5、25、6、26、7、27、8、28、9、29、10、30、11、31、12、32、13、33、14、34、15、35、16、36、17、37、18、38、19、39、20或40或其互补序列中任一之核苷酸序列的基因的昆虫害虫直系同源物，其中所述两个直系同源物基因的序列相似到如下程度：使得当将所述两个基因进行最佳比对和比较时，所述直系同源物的序列与SEQ ID NO277、138、253、152、121、122、141、273、123、142、274、124、143、125至129、144、130、145、275、131、146、132、133、147、134、148、135、149、136、150、276、137、151、139、140、153、278、251、254、279、252、255、256、280、1、21、2、22、3、23、4、24、5、25、6、26、7、27、8、28、9、29、10、30、11、31、12、32、13、33、14、34、15、35、16、36、17、37、18、38、19、39、20或40中的任一具有至少75％，优选至少80％、85％、90％、95％、98％或99％的同一性。优选地，所述靶基因的核苷酸序列不长于5000、4000、3000、2000或1500个核苷酸。

用于本方法的干扰RNA可以是本文其他地方所述的干扰RNA分子中的任何一种。在一个实施方案中，所述干扰RNA通过RNA干扰或RNAi过程介导基因表达的下调，并且所述干扰RNA选自能够实现RNAi或“基因沉默”的调节RNA分子，其包括但不限于短干扰RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)、双链RNA(dsRNA)和发夹RNA(shRNA)。

在一些优选实施方案中，用于本方法的干扰RNA分子包含至少一个沉默元件，其中所述沉默元件是包含通过与反义RNA链碱基互补配对而退火的有义RNA链的双链RNA区域，其中dsRNA分子的有义链包含与位于靶基因之RNA转录本中的核苷酸序列互补的核苷酸序列。因此，dsRNA的有义链能够与RNA转录本退火并且靶向所述RNA用以在被称为RNAi诱导沉默复合体(RNAi-induced silencing complex)或RISC的细胞复合体内降解。

在本方法中，用至少一种干扰RNA处理昆虫害虫。在该方法的一个实施方案中，可使所述昆虫害虫物种与多种干扰RNA分子相接触。在害虫与多种干扰RNA相接触时，不同RNA可起下调相同靶基因或不同靶基因的作用。

待递送至昆虫害虫物种的干扰RNA可配制成包含至少一种合适载体、赋形剂或稀释剂的组合物。此外，干扰RNA可由编码其的多核苷酸或包含所述多核苷酸的DNA构建体转录。在一个实施方案中，干扰RNA在宿主细胞或生物体(包括原核或真核生物体)内表达。宿主细胞或生物体可以是对昆虫害虫侵扰敏感的宿主，其中所述干扰RNA起下调所述害虫中靶基因表达的作用。在一个优选实施方案中，所述宿主生物体是对所靶向的昆虫害虫物种侵扰敏感的植物。

用于本方法上下文的术语“使......相接触”指使昆虫害虫物种或其细胞暴露于干扰RNA并允许干扰RNA被害虫细胞摄入的任何方法。因此，“使......相接触”包括例如细胞转化、显微注射和喂食的方法。这些技术可对体外生长的分离细胞或昆虫害虫物种完好身体内的细胞进行。在将完好昆虫害虫与本方法的干扰RNA相接触的情况下，RNA可被显微注射到胞外空间中然后通过天然过程(如内吞或转胞吞)被身体细胞吸收。在本发明的一个优选实施方案中，以害虫待摄取食物的形式或包含于其的形式向害虫提供干扰RNA。一旦被摄取，干扰RNA会经过昆虫的消化道，通过天然过程(如内吞或转胞吞)进入身体细胞中。在一个实施方案中，使昆虫害虫暴露于已经干扰RNA或包含其的组合物处理的植物，由于害虫以植物组织为食，所以干扰RNA被作为害虫饮食摄入。干扰RNA可存在于植物或其一部分的表面上，或者可存在于被昆虫害虫吃掉的植物或植物组织的细胞内。

在用于下调昆虫害虫物种中靶基因表达之方法的上下文中，短语“有效量”应意指使靶基因表达下调至少10％或20％，优选至少33％，更有选至少50％，更更优选至少80％或90％所需干扰RNA的量或浓度。在一些特别优选实施方案中，“有效量“是相对于干扰RNA不存在或对照RNA存在下的靶基因表达，使其表达下调至少60％、70％或80％，优选至少90％，更优选至少95％，最优选至少99％所需干扰RNA的量或浓度。如本文其他地方所述，可通过RNA转录本或由靶基因最终产生的蛋白质的水平降低来测量基因表达的下调。可使用本领域常规技术来测量RNA和/或蛋白质水平。

本文还提供了一种用于预防和/或防止害虫侵扰的方法，其包括使昆虫害虫物种与有效量的至少一种干扰RNA相接触，其中所述RNA在被所述害虫摄入后起下调必需的害虫靶基因表达的作用。所述必需的靶基因可以是参与调节昆虫引发或维持侵扰所需的必需生物过程的任何害虫基因，所述生物过程包括但不限于存活、生长、发育、繁殖和致病性。特别地，所述靶基因可以是本文其他地方所述的害虫基因中的任何一种。此外，本文提供了一种用于预防和/或控制作物植株田地中昆虫害虫侵扰的方法，所述方法包括在所述植株中表达有效量的本文其他地方所述的干扰RNA。

在所述方法用于控制害虫侵扰的情况下，短语“有效量”扩展至对害虫产生表型作用使得侵扰宿主生物体的害虫生物体数目减少和/或由害虫引起的损害量减少所需干扰RNA的量或浓度。在一个实施方案中，所述表型作用是害虫死亡并且所述干扰RNA用于实现与对照昆虫害虫相比的至少20％、30％、40％，优选至少50％、60％、70％，更优选至少80％或90％的害虫死亡率。在另一个实施方案中，所述表型作用包括但不限于抑制害虫生长、取食停止和产卵减少。因此，与对照害虫相比，侵扰宿主生物体的害虫生物体总数可以减少至少20％、30％、40％，优选至少50％、60％、70％，更优选至少80％或90％。或者，与对照昆虫害虫相比，由所述昆虫害虫引起的损害可减少至少20％、30％、40％，优选至少50％、60％、70％，更优选至少80％或90％。因此，本发明的方法可用于实现至少20％、30％、40％，优选至少50％、60％、70％，更优选至少80％或90％的害虫控制。本文使用的“对照害虫”是不与任何杀虫剂相接触的害虫、或与靶向非必需基因(即，引发或维持害虫侵扰所不需要的基因)相接触的害虫或与所述害虫中未发现和/或未表达之干扰RNA相接触的害虫。

用于下调昆虫害虫物种中靶基因表达的方法可用于预防和/或控制对所述昆虫害虫敏感的特定基质或材料上的害虫侵扰。在一个实施方案中，所述方式用于处理对所述害虫侵扰敏感的任何植物。本发明方法用于的目的植物包括但不限于水稻、马铃薯、棉花、番茄、油菜、大豆、向日葵、高粱、紫御谷、玉米、种子作物(如苜蓿、草莓、茄子、胡椒和烟草)。

此外，本文提供了一种用于增加植物作物产量的方法，其包括使所述植物与有效量的干扰RNA相接触，所述干扰RNA在被昆虫害虫物种摄入后起下调所述害虫中靶基因表达的作用，其中下调靶基因影响害虫引发和/或维持侵扰所需的必需生物学功能，使得对植物作物造成的损害与未处理作物相比减少。

根据本发明方法的待处理植物或植物作物可用干扰RNA或表达其的组合物进行外部处理。例如，可通过以下方法将所述干扰RNA或者包含或表达其的宿主细胞施用于植物表面或植物环境，所述方法包括但不限于喷洒、喷雾、撒粉、撒播、倾倒、种子包衣、种子处理、引入到土壤中和引入到灌溉用水中。在一个实施方案中，改造待处理植物以在细胞内通过合并到其中的多核苷酸的转录来表达干扰RNA。因为害虫以植物组织为食，所以包含干扰RNA的细胞将在昆虫的消化道中分解，从而使干扰RNA在昆虫身体内散布，导致靶基因的下调。

因此，本发明的另一方面提供了一种用于产生对昆虫害虫物种侵扰具有抗性的转基因植物，其包括以下步骤：(a)用包含编码干扰核糖核酸(RNA)之多核苷酸的DNA构建体转化植物细胞，所述干扰核糖核酸(RNA)在被昆虫害虫物种摄入后起下调所述昆虫害虫物种中靶基因表达的作用，(b)从所述转化植物细胞再生植物；和(c)在适于从重组DNA构建体表达所述干扰RNA的条件下使转化植物生长，因此，与未转化植物相比所述植物对所述害虫具有抗性。

由植物或其部分表达的干扰RNA可以是本文其他地方公开的那些中的任何一种。优选地，所述干扰RNA包含至少一个沉默元件或由其组成并且所述沉默元件是包含退火互补链的双链RNA区域，其中一条链(有义链)包含与靶基因中的靶标核苷酸序列至少部分互补的核苷酸序列。在干扰RNA的一部分是双链的情况下，所述分子的两条链可由至少两条单独的多核苷酸表达或可由单一多核苷酸表达，所述多核苷酸编码例如具有如本文其他地方所述的茎-环结构的干扰RNA。

由植物或其部分表达的干扰RNA可靶向本文其他地方所述的害虫基因中的任何一种。特别地，所述靶基因可：选自具有包含SEQ ID NO277、138、253、152、121、122、141、273、123、142、274、124、143、125至129、144、130、145、275、131、146、132、133、147、134、148、135、149、136、150、276、137、151、139、140、153、278、251、254、279、252、255、256、280、1、21、2、22、3、23、4、24、5、25、6、26、7、27、8、28、9、29、10、30、11、31、12、32、13、33、14、34、15、35、16、36、17、37、18、38、19、39、20或40或其互补序列中任一之核苷酸序列的基因，或具有如下核苷酸序列的基因：当将两条序列进行最佳比对和比较时，所述核苷酸序列与SEQ ID NO277、138、253、152、121、122、141、273、123、142、274、124、143、125至129、144、130、145、275、131、146、132、133、147、134、148、135、149、136、150、276、137、151、139、140、153、278、251、254、279、252、255、256、280、1、21、2、22、3、23、4、24、5、25、6、26、7、27、8、28、9、29、10、30、11、31、12、32、13、33、14、34、15、35、16、36、17、37、18、38、19、39、20或40或其互补序列中的任一具有至少75％，优选至少80％、85％、90％、95％、98％或99％的同一性；选自具有由SEQID NO277、138、253、152、121、122、141、273、123、142、274、124、143、125至129、144、130、145、275、131、146、132、133、147、134、148、135、149、136、150、276、137、151、139、140、153、278、251、254、279、252、255、256、280、1、21、2、22、3、23、4、24、5、25、6、26、7、27、8、28、9、29、10、30、11、31、12、32、13、33、14、34、15、35、16、36、17、37、18、38、19、39、20或40或其互补序列中任一组成的核苷酸序列的基因；或者选自具有包含SEQ ID NO277、138、253、152、121、122、141、273、123、142、274、124、143、125至129、144、130、145、275、131、146、132、133、147、134、148、135、149、136、150、276、137、151、139、140、153、278、251、254、279、252、255、256、280、1、21、2、22、3、23、4、24、5、25、6、26、7、27、8、28、9、29、10、30、11、31、12、32、13、33、14、34、15、35、16、36、17、37、18、38、19、39、20或40或其互补序列中任一之至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、110、125、150、175、200、225、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、9001000、1100或1115个连续核苷酸之片段的核苷酸序列的基因，或具有如下核苷酸序列的基因：当将包含所述片段之所述基因与SEQ ID NO277、138、253、152、121、122、141、273、123、142、274、124、143、125至129、144、130、145、275、131、146、132、133、147、134、148、135、149、136、150、276、137、151、139、140、153、278、251、254、279、252、255、256、280、1、21、2、22、3、23、4、24、5、25、6、26、7、27、8、28、9、29、10、30、11、31、12、32、13、33、14、34、15、35、16、36、17、37、18、38、19、39、20或40中的任一进行最佳比对和比较时，所述核苷酸序列与SEQ ID NO277、138、253、152、121、122、141、273、123、142、274、124、143、125至129、144、130、145、275、131、146、132、133、147、134、148、135、149、136、150、276、137、151、139、140、153、278、251、254、279、252、255、256、280、1、21、2、22、3、23、4、24、5、25、6、26、7、27、8、28、9、29、10、30、11、31、12、32、13、33、14、34、15、35、16、36、17、37、18、38、19、39、20或40或其互补序列中的任一具有至少75％，优选至少80％、85％、90％、95％、98％或99％的同一性；或者选自具有包含SEQ ID NO277、138、253、152、121、122、141、273、123、142、274、124、143、125至129、144、130、145、275、131、146、132、133、147、134、148、135、149、136、150、276、137、151、139、140、153、278、251、254、279、252、255、256、280、1、21、2、22、3、23、4、24、5、25、6、26、7、27、8、28、9、29、10、30、11、31、12、32、13、33、14、34、15、35、16、36、17、37、18、38、19、39、20或40或其互补序列中任一之至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、110、125、150、175、200、225、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、9001000、1100或1115个连续核苷酸之片段的核苷酸序列的基因，并且其中当将所述片段与SEQ ID NO277、138、253、152、121、122、141、273、123、142、274、124、143、125至129、144、130、145、275、131、146、132、133、147、134、148、135、149、136、150、276、137、151、139、140、153、278、251、254、279、252、255、256、280、1、21、2、22、3、23、4、24、5、25、6、26、7、27、8、28、9、29、10、30、11、31、12、32、13、33、14、34、15、35、16、36、17、37、18、38、19、39、20或40中任一之对应片段进行最佳比对和比较时，所述片段之所述核苷酸序列与SEQ ID NO277、138、253、152、121、122、141、273、123、142、274、124、143、125至129、144、130、145、275、131、146、132、133、147、134、148、135、149、136、150、276、137、151、139、140、153、278、251、254、279、252、255、256、280、1、21、2、22、3、23、4、24、5、25、6、26、7、27、8、28、9、29、10、30、11、31、12、32、13、33、14、34、15、35、16、36、17、37、18、38、19、39、20或40或其互补序列中任一之所述对应片段具有至少75％，优选至少80％、85％、90％、95％、98％或99％的同一性。靶基因还可以是具有包含SEQ ID NO277、138、253、152、121、122、141、273、123、142、274、124、143、125至129、144、130、145、275、131、146、132、133、147、134、148、135、149、136、150、276、137、151、139、140、153、278、251、254、279、252、255、256、280、1、21、2、22、3、23、4、24、5、25、6、26、7、27、8、28、9、29、10、30、11、31、12、32、13、33、14、34、15、35、16、36、17、37、18、38、19、39、20或40或其互补序列中任一之核苷酸序列的基因的昆虫害虫直系同源物，其中所述两个直系同源物基因的序列相似到如下程度：使得当将所述两个基因进行最佳比对和比较时，所述直系同源物的序列与SEQ ID NO277、138、253、152、121、122、141、273、123、142、274、124、143、125至129、144、130、145、275、131、146、132、133、147、134、148、135、149、136、150、276、137、151、139、140、153、278、251、254、279、252、255、256、280、1、21、2、22、3、23、4、24、5、25、6、26、7、27、8、28、9、29、10、30、11、31、12、32、13、33、14、34、15、35、16、36、17、37、18、38、19、39、20或40中的任一具有至少75％，优选至少80％、85％、90％、95％、98％或99％的同一性。优选地，所述靶基因的核苷酸序列不长于5000、4000、3000、2000或1500个核苷酸。此外，重要的是，所述干扰RNA不破坏植物宿主中任何基因的表达。

本文使用的术语“转基因植物”或“转基因植物细胞”指已经基因工程改造的或者由经基因工程改造从而携带外源多核苷酸序列的植物遗传而来的任何植物或植物细胞。“外源”指多核苷酸来源于植物细胞外部的事实。通常，所述外源多核苷酸对于转基因植物不是天然的，即不天然存在于植物的基因组中。

本文使用的术语“转化”指将外源多核苷酸分子引入到植物或其细胞中。用于将多核苷酸引入到植物中的技术为本领域已知。在本发明的一个实施方案中，用多核苷酸或包含其的DNA构建体“稳定转化”植物，即，引入到植物细胞的多核苷酸或DNA构建体整合到植物的基因组中并且能够由其后代遗传。用于将多核苷酸或DNA构建体引入到植物细胞中的转化方案可以根据相关植物的类型而改变。合适的转化方法包括但不限于显微注射、电穿孔、农杆菌(Agrobacterium)介导转化和弹道颗粒加速(ballistic particle acceleration)。使用位点特异性重组系统将多核苷酸或DNA构建体靶向掺入到的植物基因组的特定位点中的方法也为本领域所已知。

包含编码活性干扰RNA分子的多核苷酸的DNA构建体可以是适用于植物细胞转化的任何载体。合适的载体包括但不限于细菌质粒(例如根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的Ti质粒)和病毒载体系统。引入到植物细胞中的DNA构建体不可以对植物有害或有毒和/或不可以对以所述植物为食的食物链较高级的任何生物体有害或有毒。

在一个实施方案中，所述DNA构建体是包含编码干扰RNA的多核苷酸的表达构建体，所述干扰RNA与能够驱动植物中多核苷酸序列表达的调节序列有效连接，所述调节序列例如选自以下的任何一种：CaMV35S启动子、双CaMV35S启动子、泛素启动子、肌动蛋白启动子、核酮糖-二磷酸羧化酶(rubisco)启动子、GOS2启动子、玄参花叶病毒34S启动子和双增强CaMV35S启动子。优选地，所述调节序列是选自本领域已知的那些的植物启动子。在一些实施方案中，可优选的是，植物仅在植物与昆虫害虫物种相接触和/或被其损害的部分中表达干扰RNA分子，所述部分例如植物的地上部分、根部等。该作用可通过使用组织特异性植物启动子实现，所述组织特异性植物启动子包括但不限于本领域已知的叶特异性启动子、根特异性启动子、茎特异性启动子、花特异性启动子和果实特异性启动子。根特异性启动子的合适实例是PsMTA和III型壳多糖酶启动子。叶和茎特异性或光合作用组织特异性启动子(也是光敏化的)的实例是来自甜菜的两种叶绿色结合蛋白质(cab1和cab2)、由rbcS编码的核酮糖-二磷酸羧化酶、叶绿体3-磷酸甘油醛脱氢酶的A(gapA)和B(gapB)亚基的启动子、编码叶和茎特异性(ST-LS1)蛋白质的马铃薯(Solanumtuberosum)基因启动子、茎调节性的防卫诱导基因启动子(如JAS启动子)、花特异性启动子(如查耳酮合酶启动子)和果实特异性启动子(如来自草莓RJ39的启动子)。

在一些实施方案中，可优选植物仅在其生长的特定阶段产生干扰RNA分子。该作用可通过使用仅在植物发育的某些阶段中驱动表达的发育特异性植物启动子来实现。特别地，重要的是在植物生长初级阶段期间或开花(例如在水稻的情况下)期间或结果或果实成熟或播种期间保护植物免受害虫侵扰，原因是这是植物可受到最严重损坏的时间。

根据本发明的用于转化植物的DNA构建体可包含多于一种编码本发明干扰RNA分子的多核苷酸。在一个实施方案中，不同的多核苷酸可编码靶向相同靶基因中不同核苷酸序列的干扰RNA分子。在另一个实施方案中，不同的多核苷酸可编码靶向不同靶基因中不同核苷酸序列的干扰RNA分子，其中所述不同靶基因来源于相同或不同昆虫害虫物种。在所述DNA构建体编码多于一种干扰RNA的情况下，可通过处于在本文其他地方所述的不同组织特异性启动子序列的控制下使得这些RNA在这些植物的不同组织中差异表达。在一个实施方案中，改造植物以在叶中表达干扰RNA以下调以叶为食的昆虫的靶基因的表达，并且另外地以在根中表达干扰RNA以下调在土壤中定殖并以植物根为食的靶基因的表达。

所述DNA构建体可还包含至少一种其他的目的多核苷酸，例如编码另一种调节RNA分子的多核苷酸、编码对昆虫害虫物种有毒的蛋白质的多核苷酸和/或编码赋予除草剂抗性的蛋白质的多核苷酸。

根据本方法，使用本领域已知技术从转化植物细胞再生植物。一种这样的技术包括酶消化植物细胞壁以产生植物原生质体，其可随后经历多轮的细胞分裂和分化以产生成年植物。可随后测试以此方式产生的成年植物对害虫侵扰的抗性。本文使用的“抗性”应广义理解并且指植物对抗通常能够使植物遭受损害或损失的害虫的能力。抗性可理解为植物对害虫侵扰不再敏感或者由害虫侵扰产生的任何疾病症状减少至少约20％，优选至少30％、40％或50％，更优选至少60％、70％或80％，并且最优选至少90％。测量植物对昆虫害虫物种抗性的技术是本领域一般知道的，包括但不限于测量随时间的平均病变数目、害虫生物质和/或衰败植物组织的总百分比。

在一个实施方案中，产生转基因植物的本方法还包括从转基因植物产生子代或后代并测试后代对昆虫害虫的抗性。可产生两代或更多代以确保抗性性状的表达稳定维持并遗传。也可从亲本转基因植物和/或其后代中收获种子以测试对昆虫害虫的抗性。

本发明还包括一种用于产生对昆虫害虫物种侵扰具有抗性的转基因植物的方法，其包括步骤：使携带编码起下调害虫靶基因表达作用之干扰RNA的DNA构建体的第一转基因植物与缺少所述DNA构建体的第二植物杂交，以及选择对所述害虫有抗性的后代。可通过常规用于植物育种背景的任何方法进行杂交。针对害虫抗性选择的后代也可以自花授粉或“自交”产生随后一代的害虫抗性后代。在一个实施方案中，可进行多轮自花授粉或自交以产生2、3、4、5或更多代后代。可测试所得后代的害虫抗性以确保稳定维持并遗传抗性性状的表达。

在另一个实施方案中，来源于携带目的DNA构建体的第一转基因植物与缺少所述DNA构建体的第二植物之杂交的任何害虫抗性后代植物可以与第二亲本植物回交，随后测试后代对害虫侵扰的抗性。可通过本文其他地方所述的表型分析或通过标准分子技术测试植物或其后代对害虫侵扰的抗性。例如，可通过检测包含编码在被昆虫害虫物种摄入后起下调靶基因表达作用之干扰RNA的多核苷酸的DNA构建体的存在来鉴定害虫抗性植物。用于检测细胞内特定多核苷酸序列存在的技术是本领域已知的，并且包括PCR、酶促消化和SNP分析。

本发明的方法可用于产生对昆虫害虫物种具有抗性的“堆叠转基因(stacked transgenic)”植物并且其任选地具有至少一种其他的期望性状。本文使用的“堆叠”转基因植物指携带多于一种外源多核苷酸序列的植物。短语“多于一种”指植物携带至少2种、至少3种、至少4种外源多核苷酸的可能性。在一个实施方案中，用编码靶向害虫基因之干扰RNA的DNA构建体转化的植物细胞可在之前被改造成携带不同的外源多核苷酸。或者，本文所述的用于从植物细胞产生转基因植物的方法可包括共转化方案，其中编码本发明干扰RNA的DNA构建体与不同外源多核苷酸被同时或依次递送至植物细胞。

证实害虫抗性的堆叠转基因植物也可由标准植物育种技术产生。在一个实施方案中，使第一害虫抗性转基因植物与改造成表达赋予期望植物性状之外源多核苷酸或异源基因的第二植物杂交。可测试所产生之任何后代的害虫抗性和另一种期望性状的获得。作为替代地或者另外地，由杂交产生的任何害虫抗性后代可与第二亲本回交以产生进一步的后代，从而可选择第二亲本所携带异源基因的遗传，并因此选择另一种期望的植物性状。由本发明堆叠转基因植物携带的外源多核苷酸可在植物的相同部分表达或者可根据不同组织特异性启动子控制各自表达的事实来区别表达。

在一个实施方案中，携带赋予另一种期望性状的外源多核苷酸或异源基因编码另一种靶向相同或不同昆虫害虫物种的干扰RNA。在另一个实施方案中，所述异源基因编码对植物昆虫害虫物种有害或有毒的蛋白质，例如选自包括但不限于以下的杀虫蛋白：Cry1Ab、Cry1C、Cry2Aa、Cry3、CryET70、Cry22、CryET33、CryET34、CryET80、CryET76、TIC100、TIC101、TIC851、TIC900、TIC901、TIC1201、TIC407、TIC417、PS149B1和VIP杀虫蛋白。在又一个实施方案中，所述异源基因编码赋予除草剂抗性的蛋白质。赋予除草剂抗性的基因的实例包括但不限于Bar、赋予草甘膦抗性的EPSPS、赋予咪唑啉酮和磺脲抗性的ALS和赋予溴草腈抗性的bxn。

本文还提供了一种由通过本发明方法产生的转基因植物中任何一种产生杂交种子的方法，所述方法包括步骤：(i)播种得自于第一近交植物的种子和得自于第二近交植物的种子，其中所述近交植物中的至少一种是对害虫侵扰具有抗性的转基因植物，(ii)将种子培养为开花的植物，(iii)防止所述第一或第二成年植物中的至少一种自花授粉，(iv)允许在所述第一与第二成年植物之间发生异花授粉；和(v)收获由异花授粉产生的种子。由该方法产生的杂交种子和由培养所述种子产生的杂交植物在本领域范围内。由该方法产生的杂交植物通常是遗传均匀的并且似乎表现出杂种强盛或杂种优势。因此，可通过这种方法产生具有增加产量潜力的作物。

本发明的另一方面提供了对昆虫害虫物种具有抗性的转基因植物。特别地，本文提供了表达或能够表达至少一种干扰核糖核酸(RNA)的转基因植物，如本文其他地方所述，所述干扰核糖核酸(RNA)在被昆虫害虫物种摄入后起下调所述害虫中靶基因表达的作用。所述干扰RNA可以是本文其他地方公开的那些中的任何一种。优选地，所述干扰RNA包含至少一个沉默元件或由其组成并且所述沉默元件是包含退火互补链的双链RNA区域，其中一条链(有义链)包含与靶基因中的靶标核苷酸序列至少部分互补的核苷酸序列。下调害虫靶基因可用于破坏害虫的必需生物学过程或功能，其中“必需”指所述过程或功能是引发或维持害虫侵扰必需的的事实。

本文使用的术语“植物”可包括植物的任何再生或繁殖材料。提到植物可还包括植物细胞、植物原生质体、植物组织培养物、植物愈伤组织、植物块和植物或植物部分中完好的植物细胞(例如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、内核、穗、穗轴、外皮、茎秆、根、根尖等)。本文所述转基因植物中任何一种的后代、变体或突变体在本领域范围内。还包括由所述转基因植物中任何一种产生的种子。

本发明转基因植物的组包括由本文所述方法中任何一种产生的转基因植物。因此，在本发明的一个实施方案中，所述转基因植物包括携带赋予害虫抗性的第一外源多核苷酸和至少一种赋予另一种期望植物性状的其他外源多核苷酸或异源基因的堆叠转基因性状。另一种异源基因可包括编码另外的杀虫剂的基因、编码对昆虫害虫物种有毒或有害的蛋白质的基因和/或编码赋予如本文其他地方所述的除草剂抗性的蛋白质的基因。

本文还提供了本文所述干扰核糖核酸(RNA)或本文所述DNA构建体用于预防和/或控制昆虫害虫侵扰，优选植物昆虫害虫侵扰的用途。

参照以下非限制性实施例将进一步理解本发明。

实施例

实施例1昆虫害虫物种中靶基因的鉴定

1.1马铃薯甲虫基因的部分序列的克隆

核酸分离自科罗拉多马铃薯甲虫CPB(马铃薯甲虫)幼虫的内脏细胞并且制备了cDNA文库。将内脏cDNA克隆到pGN49A载体(如W001/88121所述)中使得它们侧翼是在cDNA双链体两端反向的化学诱导型T7启动子。将重组载体构建体转化到大肠杆菌菌株AB301-105(DE3)的细胞中。随后稀释转化细胞并铺板以得到单一菌落或克隆。检查克隆以确保用于文库的克隆冗余性不超过5％。产生了3000至4000克隆。

1.2测试细菌表达的dsRNA分子对马铃薯甲虫幼虫存活的作用

向多孔板中预先装入LB(Luria肉汤)培养基并且每孔接种由CPBcDNA文库获得的转化细菌细胞的单独克隆。在28℃下并以280rpm振摇使细菌生长，然后在37℃下进行化学诱导步骤。离心之后，所得细菌沉淀用水洗涤并经过热处理以使细菌失活。

使用基于人工饮食的喂食测定测试细菌悬液对CPB幼虫存活的作用。由单一细菌克隆产生的细菌悬液被局部施用于多孔板孔中的固体人工饮食。一式三份地测试每个克隆的作用。然后将单只第2期CPB幼虫添加到每个孔中。在25±2℃，60±5％相对湿度并且16∶8小时光照∶黑暗光周期下将板储存昆虫饲养室中。经空载体pGN29(WO01/88121)转化的细菌细胞用作对照。在第14天评估每个孔中CPB幼虫的存活。

多个细菌克隆表现出对CPB幼虫的高效力，表明编码其中所含双链RNA的cDNA对于害虫存活是必需的，并因此代表出于害虫控制目的而感兴趣的靶基因。因此确定了这些靶基因的DNA序列和对应的氨基酸序列并分别在表1和2中提供。

表1

表2

靶标ID	示于表1的cDNA克隆对应的氨基酸序列

Ld556	SEQ ID NO206(框+2)
		Ld513	SEQ ID NO207(框+3)
Ld5042	SEQ ID NO208(框+2)
		Ld520	SEQ ID NO209(框+3)
Ld537	SEQ ID NO210(框+1)
		Ld334	SEQ ID NO211(框+1)
Ld327	SEQ ID NO212(框+3)
		Ld502	SEQ ID NO213(框+2)
Ld516	SEQ ID NO214(框+3)
		Ld579	SEQ ID NO215(框+1)
Ld332	SEQ ID NO216(框+3)
		Ld237	SEQ ID NO217(框+2)
Ld261	SEQ ID NO218(框+3)
		Ld300.1	SEQ ID NO219(框+3)
Ld423	SEQ ID NO220(框+1)
		Ld511	SEQ ID NO221(框+3)
Ld512	SEQ ID NO222(框+3)
		Ld563	SEQ ID NO223(框+1)
Ld105	SEQ ID NO224(框+1)
		Ld248	SEQ ID NO225(框+1)

1.3用于克隆豆荚草盲蝽直向同源序列的简并引物的设计

通过使用对应于每一种马铃薯甲虫靶标的蛋白质序列搜索节肢动物非冗余蛋白质数据库来进行每一种目的靶基因的蛋白质(blastp)搜索。由代表昆虫物种多样性的最佳命中(best hit)选择了多至20种蛋白质序列。首先使用产生蛋白质序列保守区域的多条序列比对和分析的“Blockmaker”程序(http://bioinfo.weizmann.ac.il/blockmkr-bin/makeblocks.pl)将这些序列加工成块。将保守氨基酸序列块提交到CodeHop(http://blocks.fhcrc.org/codehop.html)。由简并引物输出导致对于每种靶标选择了多至十种正向引物和十种反向引物。

1.4通过家族PCR对豆荚草盲蝽基因的部分序列的克隆

高质量的完整RNA分离自豆荚草盲蝽的第一龄期若虫。通过DNA酶处理移除RNA制备物中存在的任何基因组DNA。使用逆转录酶产生cDNA。为了分离包含Lh513、Lh504.2、Lh520、Lh537、Lh334、Lh327、Lh579、Lh332、Lh237、Lh261、Lh300.1、Lh423、Lh512、Lh105和Lh248基因之区段的cDNA序列，用简并引物进行了一系列PCR反应。

在琼脂糖凝胶上分析、纯化并测序所得PCR片段。所得PCR产物的序列由表3中提供的各自的SEQ ID NO表示并且称为部分序列。对应的部分氨基酸序列由表4中提供的各自的SEQ ID NO表示。

表3

表4

1.5通过RAGE(cDNA末端快速扩增)进行全长cDNA克隆

为了克隆全长cDNA，从来自最有效靶标的内部片段之已知克隆开始，使用5’/3’RACE试剂盒(Roche，货号1734792；基于Sambrook，J.&Russell，D.M)。然后进行Instruction Manual中描述的标准方案。简言之，对于5’RACE，使用盲蝽RNA作为模板在已知序列上设计靶标序列特异性反义引物并用于第一链cDNA克隆。为第一链cDNA添加尾部并用作用于第二链合成和转录本未知末端部分扩增的锚。对于3’RACE，寡dT锚引物用于第一链cDNA合成。对于5’和3’RACE，特定于靶标序列的巢式引物用于第二PCR反应。PCR片段在琼脂糖凝胶上分析，纯化，克隆并测序确认。

将对应于表13所列盲蝽靶标的全长cDNA序列组装到VectorNTi中，VectorNTi是用于DNA序列分析的全整合序列分析软件程序包(Invitrogen)。由组装产生的核苷酸序列在表14中提供并且对应的氨基酸序列在表15中提供。

表13

靶标ID	Dm直系同源物	名称	符号
				Lh049	CG8055	shrub-snf7(膜泡运输)	shrb
Lh248	CG6699	β′-外被体	beta′Cop
				Lh105	CG1250	sec23	sec23
Lh300	CG6213	空泡型H[+]ATP酶G亚基	Vha13
				Lh327	CG6223	β-外被体蛋白	betaCop
Lh423	CG2746	核糖体蛋白L19	RpL19
				Lh504	CG5271	核糖体蛋白S27A	RpS27A
Lh520	CG2960	核糖体蛋白L40	RpL40

表14

表15

靶标ID	由表14表示的cDNA克隆对应的氨基酸序列
		Lh049	SEQ ID NO288
Lh248	SEQ ID NO287
		Lh105	SEQ ID NO286
Lh300	SEQ ID NO284
		Lh327	SEQ ID NO283
Lh423	SEQ ID NO285
		Lh504	SEQ ID NO281
Lh520	SEQ ID NO282

实施例2用于基因沉默的双链RNA的体外生产

2.1产生对应于马铃薯甲虫和豆荚草盲蝽靶基因之部分序列的dsRNA

以毫克量合成双链RNA。首先，通过PCR产生两条单独的5′T7RNA聚合酶启动子模板(有义模板和反义模板)。设计并进行PCR以产生有义和反义模板多核苷酸，其各自在相对于待转录靶标序列的不同方向上具有T7启动子。

对于每一种靶基因，使用靶标特异性T7正向引物和靶标特异性反向引物产生有义模板。使用靶标特异性有义引物和靶标特异性T7反向引物产生反义模板。表5(马铃薯甲虫cDNA)和表6(豆荚草盲蝽cDNA)提供了对于每一种靶基因，用于通过PCR扩增有义和反义模板各自的引物的序列。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳分析并纯化。将所得T7有义与反义模板混合并且通过添加T7RNA聚合酶转录。使由模板转录产生的单链RNA退火，用DNA酶和RNA酶处理，然后通过沉淀纯化。表5(马铃薯甲虫)和表6(豆荚草盲蝽)提供了由每一种靶基因产生的所得dsRNA的单链。

表5

表6

实施例3作为实现害虫控制之手段的马铃薯甲虫中靶基因下调表达

3.1测试体外合成的dsRNA分子对抗马铃薯甲虫幼虫的活性

使用喂食测定测试由来源于根据实施例1方法鉴定之靶基因的模板多核苷酸转录的体外合成dsRNA对CPB幼虫存活的作用。简言之，如下进行基于人工饮食的测定。向48孔板的每个孔中添加0.5ml经局部施用25μL的1000ng/cm²合成dsRNA预处理的人工饮食。向每个孔中添加单只L2幼虫。使用该方法测试了来源于多种靶基因的dsRNA并且对每种dsRNA测试了24只幼虫。在喂食开始后多至14天中定期对存活幼虫的数目计数。对于研究的每种靶基因，计算每种dsRNA杀死50％处理幼虫(LT₅₀)所用的时间并与之前WO2007/074405中描述的参照靶基因(Ld248)的LT₅₀比较。结果示于表7中。

表7

¹果蝇(Drosophila melanogaster)

由这些结果可推断，实施例1中鉴定的靶向CPB基因的dsRNA比之前WO2007/074405中描述的参照CPB靶基因更有效或至少与其一样有效，即在大多数情况下，CPB幼虫的“杀死时间”比参照靶标Ld105和Ld248(如之前WO2007/074405中所述：Ld105＝[靶标ID NO LD010]、Ld248＝[靶标ID NO LD027])短。在食用dsRNA后对CPB幼虫的效力根据靶向基因的性质而不同。

3.2测试体外合成的dsRNA分子对抗马铃薯甲虫成虫的活性

以下提供的数据举例说明了如下发现：摄取的由来源于多种CPB靶基因的模板多核苷酸产生的dsRNA对CPB成虫的存活、健康、摄食习惯、交配行为、产卵和子代产生有不利影响。

测试了选自幼虫内脏cDNA表达文库并且如以上实施例3.1所示对杀死CPB幼虫有效的多种基因靶标，以评价其在成年甲虫中基因下调的作用。鉴定为在CPB幼虫和成年甲虫中都重要的基因靶标是特别感兴趣的，原因是它们可用于控制和/或预防昆虫生命周期不同阶段下的昆虫害虫侵扰。

简言之，如下建立了叶盘测定(leaf disc assay)以测试来源于不同靶基因之dsRNA分子对成年甲虫的作用。将用20μL中提供的5μg体外合成的靶标dsRNA处理的直径1.5cm的马铃薯叶盘与一周龄CPB成虫一起放到6孔板的孔中。几小时后，叶盘被昆虫完全食用完后，将用经5μg体外合成的靶标dsRNA处理的另一叶盘提供给成虫。对于每一种待测试的dsRNA，将总共十只年轻成虫甲虫(雄性和雌性混合)暴露于处理的叶盘。第二天，在第二处理叶盘被完全食用后，将每个处理组中的十只成虫合并到相同盒子中并喂食丰富的未处理的马铃薯叶子。在该测定中以衍生自GFP基因的dsRNA为食的成年甲虫用作对照。

在喂食测定开始后第4天至14天中定期对存活和/或濒死的成年昆虫数目计数。如果CPB成虫看上去虚弱，比健康成虫活动少，并且当将其放置为背部朝上维持长于1分钟时不能自己恢复，则将它们归类为濒死。从第4天起还定期评价了对喂食、交配、产卵和孵化的作用。

死亡率和濒死率

图1示出对于每种测试靶基因，在14天时间段中评价的濒死和/或死亡CPB成虫的百分比。另外，计算了每个处理组中实现成年甲虫50％死亡率所用的时间(LT₅₀)，表8所示结果表示为基于之前WO2007/074405中描述的参照靶基因计算之LT₅₀的比率。

表8

由这些结果可得出结论，实施例1中鉴定的靶向多种CPB基因的dsRNA比之前WO2007/074405中报道的参照CPB靶基因更有效或至少与其一样有效，即在大多数情况下，CPB成虫的“杀死时间”比参照靶标Ld105和Ld248(如之前WO2007/074405中所述：Ld105＝[靶标ID NOLD010]、Ld248＝[靶标ID NO LD027])短。dsRNA食用后对CPB幼虫的效力根据靶向基因的性质而不同。

喂食抑制

对于所有的目的靶基因，从测试的第5天开始(用未处理的马铃薯叶子替换处理的马铃薯叶子后第4天)观察CPB成虫摄食的完全停止。对照CPB在整个测定中正常摄食。

交配、产卵和卵孵化

在整个的14天测定时程中评价交配、产卵和卵孵化。结果示于表9中。

表9

靶标

第4天

第5天

第6天

第7天

第8天

第14天

Ld105

EM

SE

无

Ld248

EM

YS

无

Ld516

EM

SE

无

Ld511

EM&SE

YS

无

Ld512

EM&SE

SE

无

Ld513

EM&SE

无

Ld520

SE

无

Ld537

EM&SE

SE

无

Ld563

无

SE

无

Ld579

EM

SE

无

GFP

EM

从第5天开始，在处理组的CPB成虫中没有观察到交配，但是，GFP对照组的CPB成虫的交配正常。

在第4天，在用靶向Ld105、Ld248、Ld516、Ld579和GFP的dsRNA处理的组中观察到正常卵块(20-30个卵/卵块)。(这些卵块在测定第1天与第3天之间产生)。但是，对于用靶向Ld511、Ld512、Ld513和Ld537的dsRNA处理的组，发现正常卵块和单个卵的混合物。在用靶向Ld520的dsRNA处理的CPB组中观察到没有正常卵块；仅观察到个别的单个卵。

收获第4天鉴定的卵并且评价孵化频率和幼虫存活二者。在所有的收获正常卵块的处理组中，除了Ld537组收获的单个卵块中仅有50％卵进行孵化之外都是100％孵化。来自这些卵块的所有幼虫都发育正常。

对于Ld511和Ld537是目的靶基因的组，少于10％的单个卵孵化并且这些幼虫内在孵化后7天内死亡。对于其中靶基因是Ld512、Ld520和Ld513的组，孵化频率分别为30％、70％和100％。

在第5天，在除GFP对照之外的任何处理组中都没观察到卵块。但是，在其中靶基因是Ld105、Ld516、Ld512、Ld537、Ld563和Ld579的组中存在单一卵。在用靶向Ld248和Ld511之dsRNA处理组的昆虫摄食室中可看见黄色涂片(没有完整卵的指示)。在其中Ld513和Ld520是靶基因的组中，没有发现卵。

收获第5天鉴定的卵并且评价孵化频率和幼虫存活二者。在所有的收获正常卵块的处理组中，对于用靶基因Ld512、Ld516和Ld563处理的组，孵化在20％与50％之间；而在组Ld563中所有幼虫在孵化7天内死亡。对于Ld579作为基因靶标的组，所有的卵都孵化并且幼虫发育正常。

在第6天，在其中靶基因是Ld512和Ld579的处理组中仅鉴定到单个卵。在Ld248处理组中注意到黄色涂片。在其他处理组的任何一组中都不存在卵。从第7天开始，任何处理的成年甲虫都没有产卵。但是，GFP dsRNA处理的对照雌性在整个测试中继续产生正常卵块。

实施例4作为实现害虫控制之手段的通过摄取dsRNA对豆荚草盲蝽中靶基因表达的下调

4.1修改豆荚草盲蝽喂食测定以允许更有效地摄入dsRNA分子

虽然用于维持多代盲蝽培养物的来自BioServ的饲养饮食是有效的，但是该饮食可能不适用于在喂食测定中测定候选dsRNA分子。寡合饮食(oligidic diet)包含未化学限定的成分，因此一些成分可与待递送至若虫的分子相互作用。因此，修改盲蝽喂食测定使得它由两阶段组成：使早期龄若虫最初暴露于简化饮食(仅有15％蔗糖)中的dsRNA维持三天，然后将若虫转移到正常寡合盲蝽饮食维持测定的剩余时间。

4.2多种靶标dsRNA加酵母tRNA对豆荚草盲蝽存活的作用

在喂食测定中，在5μg/μL酵母tRNA(Sigma)存在下将豆荚草盲蝽若虫暴露于0.5μg/μL本文所述的多种豆荚草盲蝽靶基因衍生的dsRNA中(图2)。对照分别是相同浓度下的GFP dsRNA加酵母tRNA，和仅有饮食处理。将幼小的若虫各自暴露于具有或没有合并测试组分的25μL15％蔗糖饮食中维持3天，然后将它们转移到50μL复合(Bioserv)饮食上。在第7天更新复合饮食。

在该测定中，当与GFP dsRNA或仅饮食对照处理相比时，摄取的来自所有测试靶标的dsRNA与tRNA之组合导致豆荚草盲蝽的高死亡率(表10)。

表10

存活曲线显著性差异？＊＊＊＝极其显著，＊＊＝非常显著，＊＝显著，ns＝不显著

基于该RNAi喂食测定(RNAi-by-feeding assay)的结果得到根据效力对靶标排序的表格(表11和图3)。

表11

在如本文上述的相同条件下的另一种RNAi喂食测定中，我们测试了Lh105和Lh248靶标dsRNA对豆荚草盲蝽若虫存活的作用。在5μg/μLtRNA存在下的0.5μg/μL来自靶标Lh105和Lh248的双链RNA导致了在喂食测定的第10天显著的豆荚草盲蝽若虫致死率(对于Lh105.2dsRNA为83％，对于Lh248.2dsRNA为58％，对于Lh248.3dsRNA为71％)(图6)。在相同测定中，Lh327和Lh300在生物测定结束时分别显示出4％和13％的幸存者(图6)。

4.3在RNAi喂食测定中对抗豆荚草盲蝽若虫的靶标dsRNA随时间的剂量响应关系

在RNAi喂食测定中研究了剂量响应关系以确定豆荚草盲蝽若虫对降低浓度的测试靶标dsRNA的敏感性。数据用图表示于图4和5中。使用对数秩检验比较0.1、0.05和0.025μg/μL低浓度之测试靶标的Kaplan-Meier估算存活曲线与0.1μg/μL GFP dsRNA对照的曲线(表12)。

表12

¹在5μg/μL酵母转运RNA存在下

在低至0.1μg/μL的浓度下，测试的所有靶标对豆荚草盲蝽若虫都有毒。在生物测定结束时该浓度下的靶标Lh423产生低于10％的若虫存活。在测试的最低浓度(即0.025μg/μL)下，靶标Lh423与GFP相比仍示出存活的显著下降。来自Lh300.1和Lh327的双链RNA也证明在低浓度下的高效力，并且在0.05μg/μL下显著降低存活。

实施例5产生对昆虫害虫物种具有抗性的植物

5.1组装包含豆荚草盲蝽发夹序列或马铃薯甲虫发夹序列的植物表达载体用于转化马铃薯或棉花

因为RNA干扰的机制通过dsRNA片段起作用，所以将靶标多核苷酸序列以反义和有义方向克隆，由内含子(SEQ ID NO250)隔开，以形成dsRNA发夹构建体。将编码来源于本文所述靶基因的豆荚草盲蝽dsRNA分子的dsRNA发夹构建体亚克隆到植物表达载体中。类似地，将GUS dsRNA发夹对照构建体亚克隆到植物表达载体中，所述对照构建体中编码GUS(SEQ ID NO272)的有义多核苷酸序列以反义和有义方向克隆，被相同内含子(SEQ ID NO250)隔开。

所述植物表达载体还包含在细菌细胞中维持质粒所必需的元件。dsRNA发夹构建体位于左侧边界(LB)和右侧边界(RB)之间，花椰菜花叶病毒35S启动子(P35S)的3’下游和TNOS终止子的5’上游。将包含侧翼是P35S启动子和终止子的GFP序列的GFP受体表达盒亚克隆到具有豆荚草盲蝽发夹盒的植物转化载体中。包含侧翼是P35S启动子和终止子的NPT II序列的NPT II表达盒用于选择有效转化的植物。通过测序确定植物表达载体中遗传片段的正确组装(图7)。

随后将包含单独豆荚草盲蝽靶标发夹的植物表达载体转化到根癌农杆菌中。对于本文所述的所有豆荚草盲蝽靶基因，可以以相似方式选择片段并将其克隆为发夹。

5.2用包含豆荚草盲蝽发夹序列或马铃薯甲虫发夹序列的植物表达载体转化马铃薯并测试转化马铃薯植物对豆荚草盲蝽或马铃薯甲虫的抗性。

以下提供的实施例举例说明了如下发现：表达靶基因特异性发夹RNA的转基因马铃薯植物对昆虫害虫物种的存活和/或发育有不利影响。

植物中的豆荚草盲蝽RNAi喂食

马铃薯转化

使用通过NSF马铃薯基因组计划(http://www.potatogenome.org/nsf5)中的Julie Gilbert收到的适合方案得到稳定转化的马铃薯植物。来源于敏感二倍体马铃薯(Solanumtuberosum)6487-9的马铃薯“第V系”茎节间外植体(得自于RIWageningen，the Netherlands的植物育种实验室)用作转化的原始材料。用包含发夹结构的根癌农杆菌C58C₁Rif^R接种体外来源的外植体。共培养三天后，将外植体放在包含100mg/L卡那霉素和300mg/L特美汀(Timentin)的选择培养基上。转化后6周之后，取第一推定嫩枝并且在选择培养基上生根。将起源于不同外植体的嫩枝处理为单独事件，起源于相同愈伤组织的嫩枝叫做“同胞(sibling)”直至其克隆状态可通过Southern印迹验证，并且将嫩枝的节点插条称为“克隆”。

通过GFP荧光并通过用于插入靶基因的+/-PCR检查生根嫩枝的转基因状态。然后将阳性嫩枝在组织培养中克隆性繁殖以确保足够复制可用于豆荚草盲蝽或马铃薯甲虫测定。将这些嫩枝维持在组织培养基中以更有灵活性，从而测试对豆荚草盲蝽若虫/成虫或马铃薯甲虫幼虫/成虫的抗性。转化后14周的第一植物可用于测试。

生物测定

根据dsRNA喂食实验中得到的阳性结果，开始进行原理验证性植物实验。

在繁殖之前通过PCR分析苗(plantlet)以确定T-DNA的整合和发夹的存在。对于每种构建体，为了得到至少30个独立事件，生产过量的外植体。

用支撑昆虫存活至少8天的体外马铃薯苗(维持低的背景死亡率)进行豆荚草盲蝽的植物研究。豆荚草盲蝽存活并以野生马铃薯苗为食。这由在叶和芽上观察到的昆虫造成的可视损害所支持(图8)。

在该测定中，豆荚草盲蝽以转基因马铃薯为食，所述转基因马铃薯表达靶向本文鉴定的豆荚草盲蝽靶标的发夹dsRNA。产生了携带发夹构建体和GUS对照的质粒。

在具有以下条件的植物生长室中使幼小的转基因马铃薯植株在组织培养基上维持：25±1℃，50±5％相对湿度，16∶8小时光照∶黑暗光周期。对于每个构建体，使用每个事件的合适数目克隆(多于20个)产生多个事件，在该情况下为30(P006/XX)。将多只幼小盲蝽若虫/成虫放在各自控制的幼小(例如，4-5片未展开叶期)马铃薯植物上并维持至少7天。在若虫/成虫存活减少，发育延迟和生长停止和/成植物摄食损伤减少方面在测定时间段中定期评价了对豆荚草盲蝽的抗性。图9特别示出豆荚草盲蝽若虫的存活。比较转基因事件与对照GUS发夹转化事件(P001/XX)和野生型马铃薯(图9和图10)。

以与豆荚草盲蝽所述的相同方法进行生物测定，用于测试经马铃薯甲虫特异性发夹构建体转化的转基因植物对马铃薯甲虫幼虫或成虫的抗性。

5.3用包含豆荚草盲蝽发夹序列的植物表达载体转化棉花并测试转化棉花愈伤组织材料或植株对豆荚草盲蝽的抗性

以下提供的实施例举例说明了如下发现：表达靶基因特异性发夹RNA的转基因棉花植物或愈伤组织对昆虫害虫物种的存活和/或发育有不利影响。

棉花转化

首先使用在70％乙醇中洗涤5分钟对Coker312种子进行表面除菌，然后在每升加入10滴非离子型去污剂

的20％漂白剂(Chlorox Co.USA，1％有效氯)溶液中振摇。然后将种子在无菌蒸馏水中冲洗3次，然后在无菌滤纸上印干。使无菌种子在种子萌发(SG)培养基上维持4-6天发芽，并且在此时收获下胚轴并切成0.5cm的长度备用于农杆菌接种。将切割的部分放在不含植物激素的覆盖着Murashige和Skoog基培养基的无菌滤纸上。将外植体在16∶8小时白天∶黑夜循环和28℃+/-2℃下孵育3天后接种。

为了接种，使根瘤农杆菌液体LB培养物(10ml)——包含RNA选择的发夹靶标和潮霉素抗性的编码植物选择盒的菌株GV3101(pMP90)Gent^R或菌株LBA4404生长过夜并且在接种前一晚将5ml用于接种100ml培养物。使培养物旋转减慢，在细菌稀释培养基中重悬并稀释至OD600为0.15。

用农杆菌悬液对下胚轴区段接种5分钟。在此之后将外植体印到无菌滤纸上以除去多余的细菌悬液。在黑暗中在棉花共培养培养基(CCM)中孵育外植体48小时。然后将外植体放在包含10mg/l潮霉素和500mg/l头孢噻肟并且包含植物激素2，4-二氯苯氧基乙酸(0.1μg/ml)和激动素(0.1μg/ml)的选择性愈伤组织诱导培养基(SCIM)上。4-6周后观察第一抗性愈伤组织，并且可移出这些以更换SCIM并进一步扩增用于分子评价和昆虫生物测定。每4-6周更换板以维持营养素和抗菌性选择。

选择在昆虫喂食生物测定中显示阳性结果的愈伤组织用于再生并将愈伤组织转移到非选择性培养基上以使体细胞胚成熟，该方法基于出版物Trolinder and Goodin，1986。胚长度达到4mm并且分化为子叶和胚根后(转移到成熟培养基后2-3个月)，可将它们转移至根延长培养基。这由大测试管中的无菌蛭石组成，所述测试管中浸有补加了激动素和赤霉酸(添加二者至终浓度为0.1mg/l)的基于Stewart&Hsu(1977)的液体培养基。在28℃在16∶8白天/黑夜循环中孵育胚，并且在它们达到2-3叶期后，在包含肥料的蛭石盆中可使苗露天强壮生长以维持湿度。当植物完全强壮后(4-6片真叶期)可将它们盆栽到50∶50泥∶壤土混合物中并以14∶10光循环在30/20℃白天/黑暗下生长。

生物测定

将豆荚草盲蝽放在包含表达靶标发夹RNA的未分化棉花愈伤组织的培养皿(Petri dish)中。对于每种构建体，产生多个转化棉花愈伤组织并在喂食生物测定中测试若虫/成虫存活减少和/或发育延迟和生长停止。不表达盲蝽靶标发夹RNA基因片段的转基因愈伤组织充当阴性对照。此外，由转基因愈伤组织再生的幼小棉花植物在具有以下条件的植物生长室的土壤中生长：30/20℃白天/黑夜，50±5％相对湿度，14∶10小时光照∶黑暗光周期。对于每种构建体，产生多个事件(例如，20个)。将多只幼小的盲蝽若虫/成虫放在单独置于笼中的幼小(例如，至少4-5片未展开叶期)植物上并维持至少7天，然后根据若虫/成虫存活减少、发育延迟和生长停止和/或减少的植物性摄食损害评价对豆荚草盲蝽的抗性。未经盲蝽靶标发夹RNA基因片段转化的棉花植株充当阴性对照。

本领域技术人员应理解，在不偏离一般所述的该测定精神和范围的情况下可对上述测定做出多种变化和/或修改。本领域技术人员仅使用常规实验方法就认识到或能够确定具体实施例的多个等同方案，并且本发明旨在包括这些等同方案。因此，本实施例在所有方面都被认为是举例说明的而不是限制性的。

Claims

1.干扰核糖核酸(RNA)，其在被昆虫害虫物种摄入后起下调所述昆虫害虫中靶基因表达的作用，其中所述靶基因

(i)选自具有包含SEQ ID NO 277、138、253、152、121、122、141、273、123、142、274、124、143、125至129、144、130、145、275、131、146、132、133、147、134、148、135、149、136、150、276、137、151、139、140、153、278、251、254、279、252、255、256、280、1、21、2、22、3、23、4、24、5、25、6、26、7、27、8、28、9、29、10、30、11、31、12、32、13、33、14、34、15、35、16、36、17、37、18、38、19、39、20或40或其互补序列中任一之核苷酸序列的基因，或具有如下核苷酸序列的基因：当将两条序列进行最佳比对和比较时，所述核苷酸序列与SEQ ID NO 277、138、253、152、121、122、141、273、123、142、274、124、143、125至129、144、130、145、275、131、146、132、133、147、134、148、135、149、136、150、276、137、151、139、140、153、278、251、254、279、252、255、256、280、1、21、2、22、3、23、4、24、5、25、6、26、7、27、8、28、9、29、10、30、11、31、12、32、13、33、14、34、15、35、16、36、17、37、18、38、19、39、20或40或其互补序列中任一具有至少75％的同一性；或者

(ii)选自具有包含SEQ ID NO 277、138、253、152、121、122、141、273、123、142、274、124、143、125至129、144、130、145、275、131、146、132、133、147、134、148、135、149、136、150、276、137、151、139、140、153、278、251、254、279、252、255、256、280、1、21、2、22、3、23、4、24、5、25、6、26、7、27、8、28、9、29、10、30、11、31、12、32、13、33、14、34、15、35、16、36、17、37、18、38、19、39、20或40或其互补序列中任一之至少20个连续核苷酸之片段的核苷酸序列的基因，或具有如下核苷酸序列的基因：当将包含所述片段之所述基因与SEQ ID NO 277、138、253、152、121、122、141、273、123、142、274、124、143、125至129、144、130、145、275、131、146、132、133、147、134、148、135、149、136、150、276、137、151、139、140、153、278、251、254、279、252、255、256、280、1、21、2、22、3、23、4、24、5、25、6、26、7、27、8、28、9、29、10、30、11、31、12、32、13、33、14、34、15、35、16、36、17、37、18、38、19、39、20或40中任一进行最佳比对和比较时，所述核苷酸序列与SEQ ID NO 277、138、253、152、121、122、141、273、123、142、274、124、143、125至129、144、130、145、275、131、146、132、133、147、134、148、135、149、136、150、276、137、151、139、140、153、278、251、254、279、252、255、256、280、1、21、2、22、3、23、4、24、5、25、6、26、7、27、8、28、9、29、10、30、11、31、12、32、13、33、14、34、15、35、16、36、17、37、18、38、19、39、20或40或其互补序列中任一具有至少75％的同一性；或者

(iii)选自具有包含SEQ ID NO 277、138、253、152、121、122、141、273、123、142、274、124、143、125至129、144、130、145、275、131、146、132、133、147、134、148、135、149、136、150、276、137、151、139、140、153、278、251、254、279、252、255、256、280、1、21、2、22、3、23、4、24、5、25、6、26、7、27、8、28、9、29、10、30、11、31、12、32、13、33、14、34、15、35、16、36、17、37、18、38、19、39、20或40或其互补序列中任一之至少20个连续核苷酸之片段的核苷酸序列的基因，并且其中当将所述片段与SEQ ID NO 277、138、253、152、121、122、141、273、123、142、274、124、143、125至129、144、130、145、275、131、146、132、133、147、134、148、135、149、136、150、276、137、151、139、140、153、278、251、254、279、252、255、256、280、1、21、2、22、3、23、4、24、5、25、6、26、7、27、8、28、9、29、10、30、11、31、12、32、13、33、14、34、15、35、16、36、17、37、18、38、19、39、20或40中任一之对应片段进行最佳比对和比较时，所述片段之所述核苷酸序列与SEQ ID NO 277、138、253、152、121、122、141、273、123、142、274、124、143、125至129、144、130、145、275、131、146、132、133、147、134、148、135、149、136、150、276、137、151、139、140、153、278、251、254、279、252、255、256、280、1、21、2、22、3、23、4、24、5、25、6、26、7、27、8、28、9、29、10、30、11、31、12、32、13、33、14、34、15、35、16、36、17、37、18、38、19、39、20或40或其互补序列中任一之所述对应片段具有至少75％的同一性；或者

(iv)是具有包含SEQ ID NO 277、138、253、152、121、122、141、273、123、142、274、124、143、125至129、144、130、145、275、131、146、132、133、147、134、148、135、149、136、150、276、137、151、139、140、153、278、251、254、279、252、255、256、280、1、21、2、22、3、23、4、24、5、25、6、26、7、27、8、28、9、29、10、30、11、31、12、32、13、33、14、34、15、35、16、36、17、37、18、38、19、39、20或40或其互补序列中任一之核苷酸序列的基因的昆虫害虫直系同源物，其中所述两个直系同源物基因的序列相似到如下程度：使得当将所述两个基因进行最佳比对和比较时，所述直系同源物的序列与SEQ IDNO 277、138、253、152、121、122、141、273、123、142、274、124、143、125至129、144、130、145、275、131、146、132、133、147、134、148、135、149、136、150、276、137、151、139、140、153、278、251、254、279、252、255、256、280、1、21、2、22、3、23、4、24、5、25、6、26、7、27、8、28、9、29、10、30、11、31、12、32、13、33、14、34、15、35、16、36、17、37、18、38、19、39、20或40中任一所示序列具有至少75％的同一性；或者

(v)选自具有编码如下氨基酸序列的核苷酸序列的基因：当将两条氨基酸序列进行最佳比对和比较时，所述氨基酸序列与由SEQ ID NO 277、138、253、152、121、122、141、273、123、142、274、124、143、125至129、144、130、145、275、131、146、132、133、147、134、148、135、149、136、150、276、137、151、139、140、153、278、251、254、279、252、255、256、280、1、21、2、22、3、23、4、24、5、25、6、26、7、27、8、28、9、29、10、30、11、31、12、32、13、33、14、34、15、35、16、36、17、37、18、38、19、39、20或40中任一所示核苷酸序列编码的氨基酸序列具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的同一性；或者

(vi)选自具有编码如下氨基酸序列的核苷酸序列的基因：当将两条氨基酸序列进行最佳比对和比较时，所述氨基酸序列与由SEQ ID NO285、242、271、226、227、281、228、282、229、230至233、234、283、235、236、237、238、239、240、284、241、243、244、286、269、270、287、288、206至225中任一所示氨基酸序列具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的同一性。

2.权利要求1的干扰RNA，其中所述RNA包含至少一个沉默元件，其中所述沉默元件包含与所述靶基因中靶标核苷酸序列至少部分互补的核苷酸序列或由其组成。

3.权利要求2的干扰RNA，其中所述沉默元件包含与所述靶基因中的靶标核苷酸序列至少部分互补的至少21个连续核苷酸的序列或由其组成。

4.权利要求2或权利要求3的干扰RNA，其中所述沉默元件是包含退火互补链的双链RNA区域，其中一条链包含与所述靶基因中靶标核苷酸序列至少部分互补的核苷酸序列或由其组成。

5.权利要求2至4中任一项的干扰RNA，其中所述RNA包含至少两个沉默元件，其中每个沉默元件包含与所述靶基因中靶标核苷酸序列至少部分互补的核苷酸序列或由其组成。

6.权利要求5的干扰RNA，其中每个所述沉默元件包含与不同靶标核苷酸序列互补的不同核苷酸序列或由其组成。

7.权利要求6的干扰RNA，其中所述不同靶标核苷酸序列来源于单个靶基因。

8.权利要求6的干扰RNA，其中所述不同靶标核苷酸序列来源于不同靶基因。

9.权利要求8的干扰RNA，其中所述不同靶基因来源于相同昆虫害虫物种。

10.权利要求8的干扰RNA，其中所述不同靶基因来源于不同昆虫害虫物种。

11.权利要求1至10中任一项的干扰RNA，其中所述RNA的长度为21至10,000个核苷酸。

12.权利要求1至11中任一项的干扰RNA，其中所述昆虫害虫物种是植物害虫。

13.权利要求12的干扰RNA，其中所述植物害虫选自草盲蝽(Lygus)属或马铃薯甲虫(Leptinotarsa)属。

14.权利要求13的干扰RNA，其中所述植物害虫来自所述草盲蝽属并且是豆荚草盲蝽(Lygus hesperus)，或者其中所述植物害虫来自所述马铃薯甲虫属并且是马铃薯甲虫(Leptinotarsa decemlineata)。

15.权利要求1-14中任一项的干扰RNA，其中所述靶基因是必需害虫基因，从而使得与暴露于靶向非必需基因的干扰核糖核酸或者不下调所述害虫物种中任何基因的干扰核糖核酸的所述害虫物种相比，下调表达导致所述害虫的生长、发育、繁殖或存活降低。

16.分离的多核苷酸，其编码权利要求1至15中任一项的干扰RNA。

17.分离的多核苷酸，其选自

(i)包含SEQ ID NO 277、138、253、152、198至201、121、122、141、154至157、273、123、142、158至161、274、124、143、162至165、125至129、144、166至169、130、145、170至173、275、131、146、174至177、132、133、147、178至181、134、148、182至185、135、149、186至189、136、150、190至193、276、137、151、194至197、139、140、153、202至205、278、251、254、257至260、279、252、255、256、261至268、280、1、21、41至44、2、22、45至48、3、23、49至52、4、24、53至56、5、25、57至60、6、26、61至64、7、27、65至68、8、28、69至72、9、29、73至76、10、30、77至80、11、31、81至84、12、32、85至88、13、33、89至92、14、34、93至96、15、35、97至100、16、36、101至104、17、37、105至108、18、38、109至112、19、39、113至116、20、40、117至120或其互补序列中任一所示核苷酸序列的至少21个连续核苷酸的多核苷酸；或者

(ii)包含SEQ ID NO 277、138、253、152、198至201、121、122、141、154至157、273、123、142、158至161、274、124、143、162至165、125至129、144、166至169、130、145、170至173、275、131、146、174至177、132、133、147、178至181、134、148、182至185、135、149、186至189、136、150、190至193、276、137、151、194至197、139、140、153、202至205、278、251、254、257至260、279、252、255、256、261至268、280、1、21、41至44、2、22、45至48、3、23、49至52、4、24、53至56、5、25、57至60、6、26、61至64、7、27、65至68、8、28、69至72、9、29、73至76、10、30、77至80、11、31、81至84、12、32、85至88、13、33、89至92、14、34、93至96、15、35、97至100、16、36、101至104、17、37、105至108、18、38、109至112、19、39、113至116、20、40、117至120或其互补序列中任一所示核苷酸序列的至少21个连续核苷酸的多核苷酸，当将两条序列进行最佳比对和比较时，所述多核苷酸与SEQ ID NO 277、138、253、152、198至201、121、122、141、154至157、273、123、142、158至161、274、124、143、162至165、125至129、144、166至169、130、145、170至173、275、131、146、174至177、132、133、147、178至181、134、148、182至185、135、149、186至189、136、150、190至193、276、137、151、194至197、139、140、153、202至205、278、251、254、257至260、279、252、255、256、261至268、280、1、21、41至44、2、22、45至48、3、23、49至52、4、24、53至56、5、25、57至60、6、26、61至64、7、27、65至68、8、28、69至72、9、29、73至76、10、30、77至80、11、31、81至84、12、32、85至88、13、33、89至92、14、34、93至96、15、35、97至100、16、36、101至104、17、37、105至108、18、38、109至112、19、39、113至116、20、40、117至120或其互补序列中任一具有至少75％的同一性；或者

(iii)包含SEQ ID NO 277、138、253、152、198至201、121、122、141、154至157、273、123、142、158至161、274、124、143、162至165、125至129、144、166至169、130、145、170至173、275、131、146、174至177、132、133、147、178至181、134、148、182至185、135、149、186至189、136、150、190至193、276、137、151、194至197、139、140、153、202至205、278、251、254、257至260、279、252、255、256、261至268、280、1、21、41至44、2、22、45至48、3、23、49至52、4、24、53至56、5、25、57至60、6、26、61至64、7、27、65至68、8、28、69至72、9、29、73至76、10、30、77至80、11、31、81至84、12、32、85至88、13、33、89至92、14、34、93至96、15、35、97至100、16、36、101至104、17、37、105至108、18、38、109至112、19、39、113至116、20、40、117至120或其互补序列中任一所示核苷酸序列的至少21个连续核苷酸之片段的多核苷酸，并且其中所述片段或所述互补序列具有如下核苷酸序列，当将所述片段与SEQ ID NO277、138、253、152、198至201、121、122、141、154至157、273、123、142、158至161、274、124、143、162至165、125至129、144、166至169、130、145、170至173、275、131、146、174至177、132、133、147、178至181、134、148、182至185、135、149、186至189、136、150、190至193、276、137、151、194至197、139、140、153、202至205、278、251、254、257至260、279、252、255、256、261至268、280、1、21、41至44、2、22、45至48、3、23、49至52、4、24、53至56、5、25、57至60、6、26、61至64、7、27、65至68、8、28、69至72、9、29、73至76、10、30、77至80、11、31、81至84、12、32、85至88、13、33、89至92、14、34、93至96、15、35、97至100、16、36、101至104、17、37、105至108、18、38、109至112、19、39、113至116、20、40、117至120中任一之对应片段进行最佳比对和比较时，所述核苷酸序列与SEQ ID NO 277、138、253、152、198至201、121、122、141、154至157、273、123、142、158至161、274、124、143、162至165、125至129、144、166至169、130、145、170至173、275、131、146、174至177、132、133、147、178至181、134、148、182至185、135、149、186至189、136、150、190至193、276、137、151、194至197、139、140、153、202至205、278、251、254、257至260、279、252、255、256、261至268、280、1、21、41至44、2、22、45至48、3、23、49至52、4、24、53至56、5、25、57至60、6、26、61至64、7、27、65至68、8、28、69至72、9、29、73至76、10、30、77至80、11、31、81至84、12、32、85至88、13、33、89至92、14、34、93至96、15、35、97至100、16、36、101至104、17、37、105至108、18、38、109至112、19、39、113至116、20、40、117至120或其互补序列中任一之所述对应片段具有至少75％的同一性；或者

(iv)编码如下氨基酸序列的多核苷酸，当将两条氨基酸序列进行最佳比对和比较时，所述氨基酸序列与由SEQ ID NO 277、138、253、152、198至201、121、122、141、154至157、273、123、142、158至161、274、124、143、162至165、125至129、144、166至169、130、145、170至173、275、131、146、174至177、132、133、147、178至181、134、148、182至185、135、149、186至189、136、150、190至193、276、137、151、194至197、139、140、153、202至205、278、251、254、257至260、279、252、255、256、261至268、280、1、21、41至44、2、22、45至48、3、23、49至52、4、24、53至56、5、25、57至60、6、26、61至64、7、27、65至68、8、28、69至72、9、29、73至76、10、30、77至80、11、31、81至84、12、32、85至88、13、33、89至92、14、34、93至96、15、35、97至100、16、36、101至104、17、37、105至108、18、38、109至112、19、39、113至116、20、40、117至120中任一所示核苷酸序列编码的氨基酸序列具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的同一性；或者

(v)编码如下氨基酸序列的多核苷酸，当将两条氨基酸序列进行最佳比对和比较时，所述氨基酸序列与由SEQ ID NO 285、242、271、226、227、281、228、282、229、230至233、234、283、235、236、237、238、239、240、284、241、243、244、286、269、270、287、288、206至225中任一所示氨基酸序列具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的同一性；

并且

其中所述多核苷酸不长于10000个核苷酸。

18.DNA构建体，其包含权利要求16或权利要求17的多核苷酸序列。

19.权利要求18的DNA构建体，其中所述构建体是表达构建体并且其中所述多核苷酸序列与至少一个能够驱动所述多核苷酸序列表达的调节序列有效连接。

20.权利要求19的表达构建体，其中所述调节序列选包含下列的组：组成型启动子，例如选自包含CaMV35S启动子、双CaMV35S启动子、泛素启动子、肌动蛋白启动子、核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶启动子、GOS2启动子、玄参花叶病毒(FMV)34S启动子的组中的任意种；或者组织特异性启动子，例如选自包含编码PsMTA、III型壳多糖酶之基因的根特异性启动子，光合作用组织特异性启动子如cab1和cab2、rbcS、gapA、gapB和ST-LS1蛋白的启动子，JAS启动子，查耳酮合酶启动子和来自草莓的启动子RJ39，或双增强CaMV35S启动子的组中的任意种。

21.宿主细胞，其包含权利要求1至15中任一项的干扰RNA、权利要求16或权利要求17的多核苷酸或权利要求18至20中任一项的DNA构建体。

22.权利要求21的宿主细胞，其中所述宿主细胞是原核或真核细胞。

23.权利要求22的宿主细胞，其中所述宿主细胞是细菌细胞或植物细胞。

24.用于预防和/或控制昆虫害虫侵扰的组合物，其包含至少一种干扰核糖核酸(RNA)和至少一种合适的载体、赋形剂或稀释剂，其中所述干扰RNA在被所述害虫摄入后起下调所述害虫中靶基因表达的作用，其中所述靶基因

(ii)选自具有包含SEQ ID NO 277、138、253、152、121、122、141、273、123、142、274、124、143、125至129、144、130、145、275、131、146、132、133、147、134、148、135、149、136、150、276、137、151、139、140、153、278、251、254、279、252、255、256、280、1、21、2、22、3、23、4、24、5、25、6、26、7、27、8、28、9、29、10、30、11、31、12、32、13、33、14、34、15、35、16、36、17、37、18、38、19、39、20或40或其互补序列中任一之至少20个连续核苷酸之片段的核苷酸序列的基因，或具有如下核苷酸序列的基因：当将包含所述片段之所述基因与SEQ ID NO277、138、253、152、121、122、141、273、123、142、274、124、143、125至129、144、130、145、275、131、146、132、133、147、134、148、135、149、136、150、276、137、151、139、140、153、278、251、254、279、252、255、256、280、1、21、2、22、3、23、4、24、5、25、6、26、7、27、8、28、9、29、10、30、11、31、12、32、13、33、14、34、15、35、16、36、17、37、18、38、19、39、20或40中任一进行最佳比对和比较时，所述核苷酸序列与SEQ ID NO 277、138、253、152、121、122、141、273、123、142、274、124、143、125至129、144、130、145、275、131、146、132、133、147、134、148、135、149、136、150、276、137、151、139、140、153、278、251、254、279、252、255、256、280、1、21、2、22、3、23、4、24、5、25、6、26、7、27、8、28、9、29、10、30、11、31、12、32、13、33、14、34、15、35、16、36、17、37、18、38、19、39、20或40或其互补序列中任一具有至少75％的同一性；或者

(iii)选自具有包含SEQ ID NO 277、138、253、152、121、122、141、273、123、142、274、124、143、125至129、144、130、145、275、131、146、132、133、147、134、148、135、149、136、150、276、137、151、139、140、153、278、251、254、279、252、255、256、280、1、21、2、22、3、23、4、24、5、25、6、26、7、27、8、28、9、29、10、30、11、31、12、32、13、33、14、34、15、35、16、36、17、37、18、38、19、39、20或40或其互补序列中任一之至少20个连续核苷酸之片段的核苷酸序列的基因，并且其中当将所述片段与SEQ ID NO277、138、253、152、121、122、141、273、123、142、274、124、143、125至129、144、130、145、275、131、146、132、133、147、134、148、135、149、136、150、276、137、151、139、140、153、278、251、254、279、252、255、256、280、1、21、2、22、3、23、4、24、5、25、6、26、7、27、8、28、9、29、10、30、11、31、12、32、13、33、14、34、15、35、16、36、17、37、18、38、19、39、20或40中任一之对应片段进行最佳比对和比较时，所述片段之所述核苷酸序列与SEQ ID NO277、138、253、152、121、122、141、273、123、142、274、124、143、125至129、144、130、145、275、131、146、132、133、147、134、148、135、149、136、150、276、137、151、139、140、153、278、251、254、279、252、255、256、280、1、21、2、22、3、23、4、24、5、25、6、26、7、27、8、28、9、29、10、30、11、31、12、32、13、33、14、34、15、35、16、36、17、37、18、38、19、39、20或40或其互补序列中任一之所述对应片段具有至少75％的同一性；或者

(iv)是具有包含SEQ ID NO277、138、253、152、121、122、141、273、123、142、274、124、143、125至129、144、130、145、275、131、146、132、133、147、134、148、135、149、136、150、276、137、151、139、140、153、278、251、254、279、252、255、256、280、1、21、2、22、3、23、4、24、5、25、6、26、7、27、8、28、9、29、10、30、11、31、12、32、13、33、14、34、15、35、16、36、17、37、18、38、19、39、20或40或其互补序列中任一之核苷酸序列的基因的昆虫害虫直系同源物，其中所述两个直系同源物基因的序列相似到如下程度：使得当将所述两个基因进行最佳比对和比较时，所述直系同源物的序列与SEQ IDNO 277、138、253、152、121、122、141、273、123、142、274、124、143、125至129、144、130、145、275、131、146、132、133、147、134、148、135、149、136、150、276、137、151、139、140、153、278、251、254、279、252、255、256、280、1、21、2、22、3、23、4、24、5、25、6、26、7、27、8、28、9、29、10、30、11、31、12、32、13、33、14、34、15、35、16、36、17、37、18、38、19、39、20或40中任一具有至少75％的同一性；或者

(vi)选自具有编码如下氨基酸序列的核苷酸序列的基因：当将两条氨基酸序列进行最佳比对和比较时，所述氨基酸序列与由SEQ ID NO 285、242、271、226、227、281、228、282、229、230至233、234、283、235、236、237、238、239、240、284、241、243、244、286、269、270、287、288、206至225中任一所示氨基酸序列具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的同一性。

25.权利要求24的组合物，其中所述组合物用于预防和/或控制植物的害虫侵扰并且其中所述赋形剂是农艺用赋形剂。

26.权利要求24或权利要求25的组合物，其包含权利要求18至20中任一项的DNA构建体，其中所述RNA由所述DNA构建体表达。

27.权利要求24至26中任一项的组合物，其包含权利要求21至23中任一项的宿主细胞，其中所述RNA在所述宿主细胞内表达。

28.权利要求24至27中任一项的组合物在预防和/或控制害虫侵扰中的用途。

29.权利要求24至27中任一项的组合物作为用于植物或用于植物之繁殖或再生材料的杀虫剂的用途。

30.用于预防或控制植物害虫侵扰的组合，其包含权利要求24至27中任一项的组合物和至少一种其他的农艺用药。

31.权利要求30的组合，其中所述组合包含除草剂。

32.权利要求30的组合，其中所述组合包含第二杀虫剂。

33.权利要求32的组合，其中所述第二杀虫剂包含被害虫摄入后起下调所述害虫物种中靶基因表达之作用的干扰核糖核酸。

34.权利要求32或权利要求33的组合，其中所述组合物和所述第二杀虫剂靶向相同的害虫物种。

35.权利要求32或权利要求33的组合，其中所述组合物和所述第二杀虫剂靶向不同的害虫物种。

36.一种用于下调昆虫害虫物种中靶基因表达的方法，其包括使所述害虫物种与有效量的至少一种干扰核糖核酸(RNA)或有效量的包含至少一种干扰核糖核酸(RNA)和至少一种合适载体、赋形剂或稀释剂的组合物相接触，

其中所述干扰RNA在被所述害虫摄入后起下调所述害虫中靶基因表达的作用，并且其中所述靶基因

(i)选自具有包含SEQ ID NO 277、138、253、152、121、122、141、273、123、142、274、124、143、125至129、144、130、145、275、131、146、132、133、147、134、148、135、149、136、150、276、137、151、139、140、153、278、251、254、279、252、255、256、280、1、21、2、22、3、23、4、24、5、25、6、26、7、27、8、28、9、29、10、30、11、31、12、32、13、33、14、34、15、35、16、36、17、37、18、38、19、39、20或40或其互补序列中任一之核苷酸序列的基因，或具有如下核苷酸序列的基因：当将两条序列进行最佳比对和比较时，所述核苷酸序列与SEQ ID NO277、138、253、152、121、122、141、273、123、142、274、124、143、125至129、144、130、145、275、131、146、132、133、147、134、148、135、149、136、150、276、137、151、139、140、153、278、251、254、279、252、255、256、280、1、21、2、22、3、23、4、24、5、25、6、26、7、27、8、28、9、29、10、30、11、31、12、32、13、33、14、34、15、35、16、36、17、37、18、38、19、39、20或40或其互补序列中任一具有至少75％的同一性；或者

37.权利要求36的方法，其中所述干扰RNA如权利要求1至15中任一项所定义或者所述组合物如权利要求24至27中任一项所定义。

38.权利要求36或权利要求37的方法，其中所述下调昆虫害虫物种中靶基因表达用于预防和/或控制害虫侵扰。

39.权利要求38的方法，其中所述下调昆虫害虫物种中靶基因表达用于预防和/或控制基质或材料的害虫侵扰。

40.权利要求38的方法，其中所述下调昆虫害虫物种中靶基因表达用于预防和/或控制植物的害虫侵扰。

41.权利要求38至40中任一项的方法，其中下调昆虫害虫物种中靶基因表达用于，相比于靶向非必需害虫基因或在所述害虫中不表达之靶基因的干扰核糖核酸(RNA)相接触的对照昆虫害虫，获得至少20％的害虫控制或至少20％的害虫死亡率。

42.权利要求36至41中任一项的方法，其中所述干扰RNA由原核或真核宿主细胞或宿主生物表达。

43.权利要求42的方法，其中所述宿主生物是植物或者所述宿主细胞是植物细胞并且所述干扰RNA由对所述害虫物种敏感或被其侵扰的所述植物或细胞表达。

44.用于增加植物作物产量的方法，其包括使所述植物与权利要求1至15中任一项的干扰RNA或权利要求24至27中任一项的组合物相接触。

45.权利要求40至44中任一项的方法，其中所述植物选自包含下列的组：水稻，棉花，油菜，向日葵，高粱，紫御谷，玉米，草莓，大豆，种子作物如苜蓿、马铃薯、番茄、茄子、胡椒和烟草。

46.用于产生对昆虫害虫物种侵扰具有抗性的转基因植物的方法，其包括：

(a)用包含编码干扰核糖核酸(RNA)之多核苷酸序列的DNA构建体转化植物细胞，所述干扰核糖核酸(RNA)在被昆虫害虫物种摄入后起下调所述昆虫害虫物种中靶基因表达的作用，其中所述靶基因

(iv)是具有包含SEQ ID NO 277、138、253、152、121、122、141、273、123、142、274、124、143、125至129、144、130、145、275、131、146、132、133、147、134、148、135、149、136、150、276、137、151、139、140、153、278、251、254、279、252、255、256、280、1、21、2、22、3、23、4、24、5、25、6、26、7、27、8、28、9、29、10、30、11、31、12、32、13、33、14、34、15、35、16、36、17、37、18、38、19、39、20或40或其互补序列中任一之核苷酸序列的基因的昆虫害虫直系同源物，其中所述两个直系同源物基因的序列相似到如下程度：使得当将所述两个基因进行最佳比对和比较时，所述直系同源物的序列与SEQ IDNO 277、138、253、152、121、122、141、273、123、142、274、124、143、125至129、144、130、145、275、131、146、132、133、147、134、148、135、149、136、150、276、137、151、139、140、153、278、251、254、279、252、255、256、280、1、21、2、22、3、23、4、24、5、25、6、26、7、27、8、28、9、29、10、30、11、31、12、32、13、33、14、34、15、35、16、36、17、37、18、38、19、39、20或40中任一具有至少75％的同一性；或者

(vi)选自具有编码如下氨基酸序列的核苷酸序列的基因：当将两条氨基酸序列进行最佳比对和比较时，所述氨基酸序列与SEQ ID NO 285、242、271、226、227、281、228、282、229、230至233、234、283、235、236、237、238、239、240、284、241、243、244、286、269、270、287、288、206至225中任一所示氨基酸序列具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的同一性；

(b)由所述转化植物细胞再生植物；和

(c)在适于从所述重组DNA构建体表达所述干扰RNA的条件下使所述转化植物生长，因此与未转化植物相比所述植物对所述害虫具有抗性。

47.权利要求46的方法，其中所述方法另外包括由所述转化植物产生一个或更多个子代以及测试所述后代对所述昆虫害虫的抗性的步骤。

48.用于产生对昆虫害虫物种侵扰具有抗性的转基因植物的方法，其包括：

(i)使通过权利要求46或权利要求47的方法得到的转基因植物与第二植物杂交，

(ii)选择对所述害虫具有抗性的后代。

49.权利要求48的方法，其还包括以下步骤：使对昆虫害虫物种侵扰具有抗性的所述后代植物与所述第二植物回交，以及进一步选择对所述害虫具有抗性的后代。

50.用于产生对昆虫害虫物种侵扰具有抗性的转基因植物的方法，其包括：

(i)使通过权利要求46或权利要求47的方法得到的转基因植物与缺少对昆虫侵扰之抗性的第二植物性有性杂交，从而产生多株后代植物；

(ii)选择对所述昆虫害虫物种具有抗性的第一后代植物；

(iii)使所述第一后代植物自交，从而产生多株第二后代植物；

(iv)使所述后代再重复自交1、2、3、4或5代；和

(v)从所述后代植物的任何一代中选择对昆虫害虫物种侵扰具有抗性的植物。

51.用于产生对昆虫害虫物种侵扰具有抗性的植物的方法，其包括：

(ii)选择对害虫具有抗性的第一代后代植物；

(iii)使具有害虫抗性的所述后代植物与所述第二亲本植物回交并进一步选择害虫抗性后代。

52.权利要求47至51中任一项的方法，其中通过检测包含编码干扰核糖核酸(RNA)之多核苷酸序列的DNA构建体或干扰RNA的存在来鉴定所述害虫抗性后代，其中所述干扰RNA在被昆虫害虫物种摄入后起下调所述昆虫害虫物种中靶基因表达的作用，其中所述靶基因

(vi)选自具有编码如下氨基酸序列的核苷酸序列的基因：当将两条氨基酸序列进行最佳比对和比较时，所述氨基酸序列与SEQ ID NO 285、242、271、226、227、281、228、282、229、230至233、234、283、235、236、237、238、239、240、284、241、243、244、286、269、270、287、288、206至225中任一所示氨基酸序列具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的同一性。

53.权利要求48至52中任一项的方法，其中所述第二植物在之前被改造为表达异源基因。

54.权利要求53的方法，其中所述异源基因编码对植物害虫物种有毒的蛋白质。

55.权利要求53的方法，其中所述异源基因编码赋予除草剂抗性的蛋白质。

56.权利要求46至55中任一项的方法，其中对昆虫害虫侵扰具有抗性的所述植物选自水稻，棉花，油菜，向日葵，高粱，紫御谷，玉米，草莓，大豆，种子作物如苜蓿、马铃薯、番茄、茄子、胡椒和烟草。

57.转基因植物，其通过权利要求46至56中任一项的方法产生。

58.种子，其由权利要求57的植物产生。

59.杂交种子，其通过使第一近交植物与不同的第二近交植物杂交而产生，其中所述近交植物的至少一种是权利要求57的转基因植物，并且其中所述植物选自水稻，棉花，油菜，向日葵，高粱，紫御谷，玉米，草莓，大豆，种子作物如苜蓿、马铃薯、番茄、茄子、胡椒和烟草。

60.用于产生权利要求59的杂交种子的方法，其中杂交包括步骤：

(i)播种第一和第二近交植物的种子；

(ii)将所述第一和第二近交植物的所述种子培养成开花植物；

(iii)防止所述第一或第二近交植物中至少一种的自花传粉；

(iv)允许所述第一与第二近交植物之间发生异花传粉；和

(v)在所述第一或第二近交植物的至少一种上收获种子，所述种子由所述异花传粉产生。

61.用于预防和/或控制作物植物田地中昆虫害虫侵扰的方法，所述方法包括在所述植物中表达有效量的权利要求1至15中任一项的干扰RNA。

62.转基因植物，或用于转基因植物的再生或繁殖材料或培养的转基因植物细胞，其表达或能够表达至少一种干扰核糖核酸(RNA)，所述干扰核糖核酸(RNA)在被昆虫害虫物种摄入后起下调所述害虫中靶基因表达的作用，其中所述靶基因

(v)选自具有编码如下氨基酸序列的核苷酸序列的基因：当将两条氨基酸序列进行最佳比对和比较时，所述氨基酸序列与由SEQ ID NO277、138、253、152、121、122、141、273、123、142、274、124、143、125至129、144、130、145、275、131、146、132、133、147、134、148、135、149、136、150、276、137、151、139、140、153、278、251、254、279、252、255、256、280、1、21、2、22、3、23、4、24、5、25、6、26、7、27、8、28、9、29、10、30、11、31、12、32、13、33、14、34、15、35、16、36、17、37、18、38、19、39、20或40中任一所示核苷酸序列编码的氨基酸序列具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的同一性；或者

63.种子，其由权利要求62的转基因植物产生。

64.权利要求62的转基因植物，其中所述转基因植物或其细胞在之前被改造为表达异源基因。

65.权利要求64的转基因植物，其中所述异源基因编码对植物害虫物种有害的蛋白质。

66.权利要求64的转基因植物，其中所述异源基因编码赋予除草剂抗性的蛋白质。

67.权利要求1至15中任一项的干扰核糖核酸(RNA)或权利要求18至20中任一项的DNA构建体在预防和/或控制昆虫害虫侵扰中的用途。

68.权利要求67的用途，其中所述干扰核糖核酸(RNA)用于预防和/或控制植物的昆虫害虫侵扰。

69.试剂盒，其包含权利要求1至15中任一项的干扰核糖核酸(RNA)、权利要求18至20中任一项的DNA构建体或权利要求24至27中任一项的组合物，所述试剂盒用于预防和/或控制昆虫害虫侵扰。

70.权利要求69的试剂盒，其中所述试剂盒用于预防和/或控制植物的昆虫害虫侵扰。