JP2007043984A - ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素の基質特異性を向上する方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】ＰＱＱＧＤＨを反応させる工程を含むグルコース測定においてマルトースに対する作用性を低減させる方法を提供する。
【解決手段】ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素を反応させる工程を含むグルコース測定方法において、測定反応時のｐＨを酸性にする工程を含む、ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素を反応させる工程を含むグルコース測定においてマルトースに対する作用性を低減させる方法。
【選択図】なし
【解決手段】ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素を反応させる工程を含むグルコース測定方法において、測定反応時のｐＨを酸性にする工程を含む、ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素を反応させる工程を含むグルコース測定においてマルトースに対する作用性を低減させる方法。
【選択図】なし
Description
本発明は、ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（以下、ピロロキノリンキノンをＰＱＱ、グルコースデヒドロゲナーゼをＧＤＨ、ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼをＰＱＱＧＤＨともそれぞれ記載する。）を反応させる工程を含むグルコース測定においてマルトースに対する作用性を低減させる方法、該マルトースに対する作用性が低減したグルコース測定用組成物、グルコースセンサー、ならびに、それらの製造方法に関する。
ＰＱＱＧＤＨは、ピロロキノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素である。グルコースを酸化してグルコノラクトンを生成する反応を触媒するから、血糖の測定に用いることができる。血中グルコース濃度は、糖尿病の重要なマーカーとして臨床診断上きわめて重要な指標である。現在、血中グルコース濃度の測定はバイオセンサーを用いる方法が主流となっているが、血中グルコース濃度の測定に使用される酵素としてＰＱＱＧＤＨが注目されている。このようなＰＱＱＧＤＨとして例えば、アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ） ＮＣＩＭＢ１１５１７株が、ＰＱＱＧＤＨを産生することを見出し，遺伝子のクローニングならびに高発現系を構築した事例（たとえば、特許文献１を参照。）などが開示されている。
特開平１１−２４３９４９号公報
ＰＱＱＧＤＨは、Ｄ−グルコースを酸化してＤ−グルコノ−１，５−ラクトンを生成する反応を触媒する点、及び反応系の溶存酸素の影響を受けず、補酵素添加を必要としない酵素特性を有する点より、血糖の生化学診断薬はもちろん血糖センサー等幅広い用途が期待される反面、２糖類、特に、マルトースに作用するなどの問題があった。
本発明者らは上記課題を解決するため、その原因について鋭意研究したところ、一般的に血糖センサーで電子のメディエーターとして使用されるフェリシアン化物イオンに対する反応性が低いことがわかった。
我々はこの点についてさらに検討を加え、フェリシアン化物イオンに対して反応性が低い原因は、バッファー条件が中性付近で基質特異性の影響を受けているためであることを明らかにした。
これまでＰＱＱＧＤＨの基質特異性を向上する方策に関する報告としては特許文献２があり、その中では遺伝子レベルでのＰＱＱＧＤＨ改変手段を用いた検討が報告されているが、測定反応条件の観点から基質特異性を向上する手段については、その可能性すら触れられていなかった。
ＷＯ０３／１０６６６８
我々はこの点についてさらに検討を加え、フェリシアン化物イオンに対して反応性が低い原因は、バッファー条件が中性付近で基質特異性の影響を受けているためであることを明らかにした。
これまでＰＱＱＧＤＨの基質特異性を向上する方策に関する報告としては特許文献２があり、その中では遺伝子レベルでのＰＱＱＧＤＨ改変手段を用いた検討が報告されているが、測定反応条件の観点から基質特異性を向上する手段については、その可能性すら触れられていなかった。
本発明者らは、過去の方策とは異なる視点から、より簡便な基質特異性の改良策を探ることとし、さらなる鋭意研究を実施した結果、グルコース測定反応条件のｐＨを酸性にすることによりＰＱＱＧＤＨの基質特異性を向上できることを明らかにし、遂に本発明を完成するに到った。即ち本発明は、
［項１］
ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素を反応させる工程を含むグルコース測定方法において、測定反応時のｐＨを酸性にする工程を含む、ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素を反応させる工程を含むグルコース測定においてマルトースに対する作用性を低減させる方法。
［項２］
さらに組成物としてメディエーターを含む項１に記載のピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素を反応させる工程を含むグルコース測定においてマルトースに対する作用性を低減させる方法。
［項３］
メディエーターがフェリシアン化物塩である項２に記載のピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素を反応させる工程を含むグルコース測定においてマルトースに対する作用性を低減させる方法。
［項４］
ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼが、対応する野生型酵素と比較してマルトース作用性の低下した改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼである、項１に記載のピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素を反応させる工程を含むグルコース測定においてマルトースに対する作用性を低減させる方法。
［項５］
測定反応時のｐＨが６．５以下の酸性である、項１に記載のグルコース測定方法。
［項６］
ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを反応させる工程が、ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを含むグルコース測定用試薬組成物においてなされることを含む、項１に記載のピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素を反応させる工程を含むグルコース測定においてマルトースに対する作用性を低減させる方法。
［項７］
グルコース測定用組成物がメディエーターとしてフェリシアン化物イオンを含む形態をとることを含む、項６に記載のピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素を反応させる工程を含むグルコース測定においてマルトースに対する作用性を低減させる方法。
［項８］
グルコース測定用組成物がグルコースアッセイキットに含まれる形態をとることを含む、項６に記載のピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素を反応させる工程を含むグルコース測定においてマルトースに対する作用性を低減させる方法。
［項９］
グルコースアッセイキットがピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素を含み、かつ、測定反応時のｐＨが６．５以下の酸性である形態をとることを含む、項８に記載のピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素を反応させる工程を含むグルコース測定においてマルトースに対する作用性を低減させる方法。
［項１０］
ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを反応させる工程が、ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを含み、かつ、少なくとも作用極と対極からなる電極を含むグルコースセンサーにおいてなされることを含む、項１に記載のピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素を反応させる工程を含むグルコース測定においてマルトースに対する作用性を低減させる方法。
［項１１］
グルコースセンサーにおける反応が、ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを含む反応溶液に電圧を印加し、メディエーターの酸化電流を測定してなる、項１０に記載のピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素を反応させる工程を含むグルコース測定においてマルトースに対する作用性を低減させる方法。
［項１２］
グルコースセンサーが、ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素を含み、かつ、測定反応時のｐＨが６．５以下の酸性である形態をとることを含む、項１０に記載のピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素を反応させる工程を含むグルコース測定においてマルトースに対する作用性を低減させる方法。
［項１３］
グルコースセンサーが、メディエーターとしてフェリシアン化物イオンを含む、項１０に記載のピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素を反応させる工程を含むグルコース測定においてマルトースに対する作用性を低減させる方法。
［項１４］
アミノ酸配列の改変を施した改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ、および、測定反応時のｐＨを酸性に保つことができる緩衝剤を含む、ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素を用いたグルコース測定用組成物においてマルトースに対する作用性が低減したグルコース測定用組成物。
［項１５］
アミノ酸配列の改変を施した改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ、および、測定反応時のｐＨを酸性に保つことができる緩衝剤を含む、ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを用いたグルコースセンサーにおいてマルトースに対する作用性が低減したグルコースセンサー。
［項１６］
測定反応時のｐＨを酸性に保つことができる緩衝剤を含有させる工程を含む、ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを用いたグルコース測定用組成物においてマルトースに対する作用性が低減したグルコース測定用組成物の製造方法。
［項１７］
測定反応時のｐＨを酸性に保つことができる緩衝剤を含有させる工程を含む、ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを用いたグルコースセンサーにおいてマルトースに対する作用性が低減したグルコースセンサーの製造方法。
である。
［項１］
ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素を反応させる工程を含むグルコース測定方法において、測定反応時のｐＨを酸性にする工程を含む、ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素を反応させる工程を含むグルコース測定においてマルトースに対する作用性を低減させる方法。
［項２］
さらに組成物としてメディエーターを含む項１に記載のピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素を反応させる工程を含むグルコース測定においてマルトースに対する作用性を低減させる方法。
［項３］
メディエーターがフェリシアン化物塩である項２に記載のピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素を反応させる工程を含むグルコース測定においてマルトースに対する作用性を低減させる方法。
［項４］
ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼが、対応する野生型酵素と比較してマルトース作用性の低下した改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼである、項１に記載のピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素を反応させる工程を含むグルコース測定においてマルトースに対する作用性を低減させる方法。
［項５］
測定反応時のｐＨが６．５以下の酸性である、項１に記載のグルコース測定方法。
［項６］
ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを反応させる工程が、ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを含むグルコース測定用試薬組成物においてなされることを含む、項１に記載のピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素を反応させる工程を含むグルコース測定においてマルトースに対する作用性を低減させる方法。
［項７］
グルコース測定用組成物がメディエーターとしてフェリシアン化物イオンを含む形態をとることを含む、項６に記載のピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素を反応させる工程を含むグルコース測定においてマルトースに対する作用性を低減させる方法。
［項８］
グルコース測定用組成物がグルコースアッセイキットに含まれる形態をとることを含む、項６に記載のピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素を反応させる工程を含むグルコース測定においてマルトースに対する作用性を低減させる方法。
［項９］
グルコースアッセイキットがピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素を含み、かつ、測定反応時のｐＨが６．５以下の酸性である形態をとることを含む、項８に記載のピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素を反応させる工程を含むグルコース測定においてマルトースに対する作用性を低減させる方法。
［項１０］
ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを反応させる工程が、ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを含み、かつ、少なくとも作用極と対極からなる電極を含むグルコースセンサーにおいてなされることを含む、項１に記載のピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素を反応させる工程を含むグルコース測定においてマルトースに対する作用性を低減させる方法。
［項１１］
グルコースセンサーにおける反応が、ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを含む反応溶液に電圧を印加し、メディエーターの酸化電流を測定してなる、項１０に記載のピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素を反応させる工程を含むグルコース測定においてマルトースに対する作用性を低減させる方法。
［項１２］
グルコースセンサーが、ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素を含み、かつ、測定反応時のｐＨが６．５以下の酸性である形態をとることを含む、項１０に記載のピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素を反応させる工程を含むグルコース測定においてマルトースに対する作用性を低減させる方法。
［項１３］
グルコースセンサーが、メディエーターとしてフェリシアン化物イオンを含む、項１０に記載のピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素を反応させる工程を含むグルコース測定においてマルトースに対する作用性を低減させる方法。
［項１４］
アミノ酸配列の改変を施した改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ、および、測定反応時のｐＨを酸性に保つことができる緩衝剤を含む、ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素を用いたグルコース測定用組成物においてマルトースに対する作用性が低減したグルコース測定用組成物。
［項１５］
アミノ酸配列の改変を施した改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ、および、測定反応時のｐＨを酸性に保つことができる緩衝剤を含む、ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを用いたグルコースセンサーにおいてマルトースに対する作用性が低減したグルコースセンサー。
［項１６］
測定反応時のｐＨを酸性に保つことができる緩衝剤を含有させる工程を含む、ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを用いたグルコース測定用組成物においてマルトースに対する作用性が低減したグルコース測定用組成物の製造方法。
［項１７］
測定反応時のｐＨを酸性に保つことができる緩衝剤を含有させる工程を含む、ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを用いたグルコースセンサーにおいてマルトースに対する作用性が低減したグルコースセンサーの製造方法。
である。
本発明による基質特異性の向上は、グルコース測定試薬、グルコースアッセイキット及びグルコースセンサーでの測定精度の向上を可能にする。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明において、マルトースに対する作用性とは、ＰＱＱＧＤＨが当該糖基質を脱水素する作用を意味する。
さらに、マルトース以外にも、グルコース以外の少なくとも１つのマルトース以外の選択された糖基質に対する作用性が低下していてもよい。
グルコース以外の少なくとも１つのマルトース以外の選択された糖基質としては、ガラクトース、マンノース、キシロースなどの単糖類、シュクロース、ラクトース、セロビオースなどの二糖類、マルトトリオース、マルトテトラオースなどのオリゴ糖類、イコデキストリン（グルコースポリマー）などの多糖類（オリゴ糖類は２〜１０分子の単糖が、多糖類は１１分子以上の単糖がグリコシド結合などにより結合したものを意味し、それらの結合形態は問わない。）二糖類以上の場合はその構成はホモであってもヘテロであっても良い。）、さらには糖アルコール、２−デオキシ−Ｄ−グルコース、３−ｏ−メチル−Ｄ−グルコースなどそれらの誘導体が該当しうる。
上記の中でも特に、本発明のＰＱＱＧＤＨを糖尿病患者の臨床診断や血糖値コントロール等の目的で行われる血中グルコース濃度測定のために用いる際に問題となりうる、各種糖類が選択されることが好ましい。このような糖としては、マンノース、アロース、キシロース、ガラクトースまたはマルトースなどが挙げられ、さらに好ましくはガラクトース、ラクトースまたはマルトースが例示される。最も好ましくはマルトースが例示される。
さらに、マルトース以外にも、グルコース以外の少なくとも１つのマルトース以外の選択された糖基質に対する作用性が低下していてもよい。
グルコース以外の少なくとも１つのマルトース以外の選択された糖基質としては、ガラクトース、マンノース、キシロースなどの単糖類、シュクロース、ラクトース、セロビオースなどの二糖類、マルトトリオース、マルトテトラオースなどのオリゴ糖類、イコデキストリン（グルコースポリマー）などの多糖類（オリゴ糖類は２〜１０分子の単糖が、多糖類は１１分子以上の単糖がグリコシド結合などにより結合したものを意味し、それらの結合形態は問わない。）二糖類以上の場合はその構成はホモであってもヘテロであっても良い。）、さらには糖アルコール、２−デオキシ−Ｄ−グルコース、３−ｏ−メチル−Ｄ−グルコースなどそれらの誘導体が該当しうる。
上記の中でも特に、本発明のＰＱＱＧＤＨを糖尿病患者の臨床診断や血糖値コントロール等の目的で行われる血中グルコース濃度測定のために用いる際に問題となりうる、各種糖類が選択されることが好ましい。このような糖としては、マンノース、アロース、キシロース、ガラクトースまたはマルトースなどが挙げられ、さらに好ましくはガラクトース、ラクトースまたはマルトースが例示される。最も好ましくはマルトースが例示される。
ある糖類に対する作用性が低下しているかどうかの判断は、次のように行う。
後述の試験例１に記載の活性測定法において、ＰＱＱＧＤＨを用いて、Ｄ−グルコースを基質溶液とした場合のＰＱＱＧＤＨ活性値（ａ）と、Ｄ−グルコースのかわりに当該糖類を基質溶液とした場合のＰＱＱＧＤＨ活性値（ｂ）を測定し、グルコースを基質とした場合の測定値を１００とした場合に対する相対値（（ｂ）／（ａ）×１００）を求める。次いで、条件を変えて同様の操作を行い、その値を比較して判断する。
活性測定は、後述の試験例１に記載の活性測定法により行われる。
後述の試験例１に記載の活性測定法において、ＰＱＱＧＤＨを用いて、Ｄ−グルコースを基質溶液とした場合のＰＱＱＧＤＨ活性値（ａ）と、Ｄ−グルコースのかわりに当該糖類を基質溶液とした場合のＰＱＱＧＤＨ活性値（ｂ）を測定し、グルコースを基質とした場合の測定値を１００とした場合に対する相対値（（ｂ）／（ａ）×１００）を求める。次いで、条件を変えて同様の操作を行い、その値を比較して判断する。
活性測定は、後述の試験例１に記載の活性測定法により行われる。
本発明の方法に適用することができるＰＱＱＧＤＨは、ピロロキノリンキノンを補酵素として配位し、Ｄ−グルコースを酸化してＤ−グルコノ−１，５−ラクトンを生成するという反応を触媒する酵素（ＥＣ１．１．５．２（旧ＥＣ１．１．９９．１７））であり、由来や構造に関しては特に限定するものではない。
本発明に用いるＰＱＱＧＤＨとしては、由来は特に限定されない。例えば微生物では、アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）（例えば、特許文献１を参照。）、アシネトバクター・カルコアセティカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）（例えば、非特許文献１および２を参照。）、シュードモナス・エルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ）（例えば、非特許文献３を参照。）等の酸化細菌やアグロバクテリウム・ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（例えば、非特許文献４を参照。）、クレブシーラ・エーロジーンズ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）等の腸内細菌、ブルクホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｒｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ）などを挙げることができる。
Ａ．Ｍ．Ｃｌｅｔｏｎ−Ｊａｎｓｅｎら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７０，２１２１（１９８８） Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２１７，４３０（１９８９） Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２２９，２０６（１９９１） Ａ．Ｍ．Ｃｌｅｔｏｎ−Ｊａｎｓｅｎら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２，６３０８（１９９０）
Ａ．Ｍ．Ｃｌｅｔｏｎ−Ｊａｎｓｅｎら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７０，２１２１（１９８８） Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２１７，４３０（１９８９） Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２２９，２０６（１９９１） Ａ．Ｍ．Ｃｌｅｔｏｎ−Ｊａｎｓｅｎら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２，６３０８（１９９０）
上記のうち好ましいのは、アシネトバクター属由来のＰＱＱＧＤＨである。これらは可溶型酵素であり水系において易溶である。さらに好ましいのは、アシネトバクター・カルコアセティカスもしくはアシネトバクター・バウマンニのいずれかに由来するＰＱＱＧＤＨである。さらにより好ましいのは、アシネトバクター・バウマンニ ＮＣＩＭＢ １１５１７株由来（例えば、特許文献１を参照。）、アシネトバクター・カルコアセティカス ＬＭＤ７９．４１株由来（例えば、非特許文献１および２を参照。）、もしくは、アシネトバクター・カルコアセティカス ＩＦＯ １２５５２株（例えば、特許文献３を参照。）のＰＱＱＧＤＨである。もっとも好ましいのは、アシネトバクター・バウマンニ ＮＣＩＭＢ １１５１７株由来のＰＱＱＧＤＨである。なお、アシネトバクター・バウマンニＮＣＩＭＢ１１５１７株は、分類当初はＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓとされていた。
特開２００４−１７３５３８
本発明の方法に適用することができるＰＱＱＧＤＨは、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する限り、上記に例示されたものにさらに他のアミノ酸残基の一部が欠失または置換されていてもよく、また他のアミノ酸残基が付加されていてもよい。
このような改変は当該技術分野における公知技術を用いて当業者であれば容易に実施することが出来る。例えば、蛋白質に部位特異的変異を導入するために当該蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列を置換または挿入するための種々の方法が、Ｓａｍｂｒｏｏｋら著、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ； Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ 第２版（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ, Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記載されている。
これらのＰＱＱＧＤＨは、たとえば東洋紡績製ＧＬＤ−３２１など市販のものを用いることが出来る。あるいは、当該技術分野における公知技術を用いて当業者であれば容易に製造することが出来る。
例えば、上記のＰＱＱＧＤＨを生産する天然の微生物、あるいは、天然のＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子をそのまま、あるいは、変異させてから、発現用ベクター（多くのものが当該技術分野において知られている。例えばプラスミド。）に挿入し、適当な宿主（多くのものが当該技術分野において知られている。例えば大腸菌。）に形質転換させた形質転換体を培養し、培養液から遠心分離などで菌体を回収した後、菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また、必要に応じてＥＤＴＡなどのキレート剤や界面活性剤等を添加して可溶化し、ＰＱＱＧＤＨを含む水溶性画分を得ることができる。または適当な宿主ベクター系を用いることにより、発現したＰＱＱＧＤＨを直接培養液中に分泌させることが出来る。
上記のようにして得られたＰＱＱＧＤＨ含有溶液を、例えば減圧濃縮、膜濃縮、さらに硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、あるいは親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈殿法により沈殿せしめればよい。また、加熱処理や等電点処理も有効な精製手段である。また、吸着剤あるいはゲルろ過剤などによるゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーを行うことにより、精製されたＰＱＱＧＤＨを得ることができる。該精製酵素標品は、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）的に単一のバンドを示す程度に純化されていることが好ましい。
上記工程と前後して、全ＧＤＨ酵素タンパク質に対するホロ型ＰＱＱＧＤＨの割合を向上させるために、好ましくは２５〜５０℃、より好ましくは３０〜４５℃の加熱処理を行っても良い。
本発明におけるＰＱＱＧＤＨの濃度は特に制約がない。
ＰＱＱＧＤＨの酵素活性は以下の方法により測定できる。
ＰＱＱＧＤＨ酵素活性の測定方法
（１）測定原理
Ｄ−グルコース＋ＰＭＳ＋ＰＱＱＧＤＨ → Ｄ−グルコノ−１，５−ラクトン ＋ ＰＭＳ（ｒｅｄ）
２ＰＭＳ（ｒｅｄ） ＋ ＮＴＢ → ２ＰＭＳ ＋ ジホルマザン
フェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）（ｒｅｄ）によるニトロテトラゾリウムブルー（ＮＴＢ）の還元により形成されたジホルマザンの存在は、５７０ｎｍで分光光度法により測定した。
（２）単位の定義
１単位は、以下に記載の条件下で１分当たりジホルマザンを０．５ミリモル形成させるＰＱＱＧＤＨの酵素量をいう。
（３）方法
試薬
Ａ．Ｄ−グルコース溶液：０．５Ｍ（０．９ｇ Ｄ−グルコース（分子量１８０．１６）／１０ｍｌ Ｈ２Ｏ）
Ｂ．ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液， ｐＨ６．５：５０ｍＭ（６０ｍＬの水中に懸濁した１．５１ｇのＰＩＰＥＳ（分子量３０２．３６）を、５Ｎ ＮａＯＨに溶解し、２．２ｍｌの１０％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を加える。５Ｎ ＮａＯＨを用いて２５℃でｐＨを６．５±０．０５に調整し、水を加えて１００ｍｌとした。）
Ｃ．ＰＭＳ溶液：３．０ｍＭ（９．１９ｍｇのフェナジンメトサルフェート（分子量８１７．６５）／１０ｍｌＨ２Ｏ）
Ｄ．ＮＴＢ溶液：６．６ｍＭ（５３．９６ｍｇのニトロテトラゾリウムブルー（分子量８１７．６５）／１０ｍｌＨ２Ｏ）
Ｅ．酵素希釈液：１ｍＭ ＣａＣｌ２， ０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００， ０．１％ ＢＳＡを含む５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５）
手順
遮光ビンに以下の反応混合物を調製し、氷上で貯蔵した（用時調製）
１．８ｍｌ Ｄ−グルコース溶液 （Ａ）
２４．６ｍｌ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５） （Ｂ）
２．０ｍｌ ＰＭＳ溶液 （Ｃ）
１．０ｍｌ ＮＴＢ溶液 （Ｄ）
上記アッセイ混合物中の濃度は次のとおり。
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ４２ｍＭ
Ｄ−グルコース ３０ｍＭ
ＰＭＳ ０．２０ｍＭ
ＮＴＢ ０．２２ｍＭ
３．０ｍｌの反応混合液を試験管（プラスチック製）に入れ、３７℃で５分間予備加温した。
０．１ｍｌの酵素溶液を加え、穏やかに反転して混合した。
５７０ｎｍでの水に対する吸光度の増加を３７℃に維持しながら分光光度計で４〜５分間記録し、曲線の初期直線部分からの１分当たりのΔＯＤを計算した（ＯＤテスト）。
同時に、酵素溶液に代えて酵素希釈液（Ｅ）加えることを除いては同一の方法を繰り返し、ブランク（ΔＯＤブランク）を測定した。
アッセイの直前に氷冷した酵素希釈液（Ｅ）で酵素粉末を溶解し、同一の緩衝液で０．１−０．８Ｕ／ｍｌに希釈した（該酵素の接着性のためにプラスチックチューブの使用が好ましい）。
計算
活性を以下の式を用いて計算する：
Ｕ／ｍｌ＝｛ΔＯＤ／ｍｉｎ（ΔＯＤテスト− ΔＯＤブランク）×Ｖｔ×ｄｆ｝／（２０．１×１．０×Ｖｓ）
Ｕ／ｍｇ＝（Ｕ／ｍｌ）×１／Ｃ
Ｖｔ：総体積（３．１ｍｌ）
Ｖｓ：サンプル体積（１．０ｍｌ）
２０．１：ジホルマザンの１／２ミリモル分子吸光係数
１．０：光路長（ｃｍ）
ｄｆ：希釈係数
Ｃ：溶液中の酵素濃度（ｃ ｍｇ／ｍｌ）
ＰＱＱＧＤＨ酵素活性の測定方法
（１）測定原理
Ｄ−グルコース＋ＰＭＳ＋ＰＱＱＧＤＨ → Ｄ−グルコノ−１，５−ラクトン ＋ ＰＭＳ（ｒｅｄ）
２ＰＭＳ（ｒｅｄ） ＋ ＮＴＢ → ２ＰＭＳ ＋ ジホルマザン
フェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）（ｒｅｄ）によるニトロテトラゾリウムブルー（ＮＴＢ）の還元により形成されたジホルマザンの存在は、５７０ｎｍで分光光度法により測定した。
（２）単位の定義
１単位は、以下に記載の条件下で１分当たりジホルマザンを０．５ミリモル形成させるＰＱＱＧＤＨの酵素量をいう。
（３）方法
試薬
Ａ．Ｄ−グルコース溶液：０．５Ｍ（０．９ｇ Ｄ−グルコース（分子量１８０．１６）／１０ｍｌ Ｈ２Ｏ）
Ｂ．ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液， ｐＨ６．５：５０ｍＭ（６０ｍＬの水中に懸濁した１．５１ｇのＰＩＰＥＳ（分子量３０２．３６）を、５Ｎ ＮａＯＨに溶解し、２．２ｍｌの１０％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を加える。５Ｎ ＮａＯＨを用いて２５℃でｐＨを６．５±０．０５に調整し、水を加えて１００ｍｌとした。）
Ｃ．ＰＭＳ溶液：３．０ｍＭ（９．１９ｍｇのフェナジンメトサルフェート（分子量８１７．６５）／１０ｍｌＨ２Ｏ）
Ｄ．ＮＴＢ溶液：６．６ｍＭ（５３．９６ｍｇのニトロテトラゾリウムブルー（分子量８１７．６５）／１０ｍｌＨ２Ｏ）
Ｅ．酵素希釈液：１ｍＭ ＣａＣｌ２， ０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００， ０．１％ ＢＳＡを含む５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５）
手順
遮光ビンに以下の反応混合物を調製し、氷上で貯蔵した（用時調製）
１．８ｍｌ Ｄ−グルコース溶液 （Ａ）
２４．６ｍｌ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５） （Ｂ）
２．０ｍｌ ＰＭＳ溶液 （Ｃ）
１．０ｍｌ ＮＴＢ溶液 （Ｄ）
上記アッセイ混合物中の濃度は次のとおり。
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ４２ｍＭ
Ｄ−グルコース ３０ｍＭ
ＰＭＳ ０．２０ｍＭ
ＮＴＢ ０．２２ｍＭ
３．０ｍｌの反応混合液を試験管（プラスチック製）に入れ、３７℃で５分間予備加温した。
０．１ｍｌの酵素溶液を加え、穏やかに反転して混合した。
５７０ｎｍでの水に対する吸光度の増加を３７℃に維持しながら分光光度計で４〜５分間記録し、曲線の初期直線部分からの１分当たりのΔＯＤを計算した（ＯＤテスト）。
同時に、酵素溶液に代えて酵素希釈液（Ｅ）加えることを除いては同一の方法を繰り返し、ブランク（ΔＯＤブランク）を測定した。
アッセイの直前に氷冷した酵素希釈液（Ｅ）で酵素粉末を溶解し、同一の緩衝液で０．１−０．８Ｕ／ｍｌに希釈した（該酵素の接着性のためにプラスチックチューブの使用が好ましい）。
計算
活性を以下の式を用いて計算する：
Ｕ／ｍｌ＝｛ΔＯＤ／ｍｉｎ（ΔＯＤテスト− ΔＯＤブランク）×Ｖｔ×ｄｆ｝／（２０．１×１．０×Ｖｓ）
Ｕ／ｍｇ＝（Ｕ／ｍｌ）×１／Ｃ
Ｖｔ：総体積（３．１ｍｌ）
Ｖｓ：サンプル体積（１．０ｍｌ）
２０．１：ジホルマザンの１／２ミリモル分子吸光係数
１．０：光路長（ｃｍ）
ｄｆ：希釈係数
Ｃ：溶液中の酵素濃度（ｃ ｍｇ／ｍｌ）
本発明の方法においては測定時のｐＨは酸性である。ｐＨが酸性とは７．０未満を指し特に限定されないが、本発明において好ましい上限はｐＨ６．５以下、さらに好ましくはｐＨ３．５〜５．５である。
本発明の方法において測定時のｐＨを酸性にするために、種々のバッファーを用いることが出来る。そのようなバッファーとしては、ｐＨを酸性に保つことができる緩衝能を持つものであれば特に限定されない。一般に使用することができるバッファー種としては、トリス塩酸、ホウ酸、リン酸、酢酸、クエン酸、コハク酸、フタル酸、マレイン酸、グリシン及びそれらの塩などやＭＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ等のグット緩衝液などがあげられる。
カルシウムと不溶性の塩を形成しない緩衝液が好ましい。
これらのうち１種のみを適用してもよいし、２種以上を用いてもよい。さらには上記以外を含む１種以上の複合組成であってもよい。
また、これらの添加濃度としては、緩衝能を持つ範囲であれば特に限定されないが、好ましい上限は１００ｍＭ以下、より好ましくは５０ｍＭ以下である。好ましい下限は５ｍＭ以上である。
凍結乾燥物中においては緩衝剤の含有量は、特に限定されるものではないが、好ましくは０．１％（重量比）以上、特に好ましくは０．１〜３０％（重量比）の範囲で使用される。
これらは、種々の市販の試薬を用いることが出来る。
カルシウムと不溶性の塩を形成しない緩衝液が好ましい。
これらのうち１種のみを適用してもよいし、２種以上を用いてもよい。さらには上記以外を含む１種以上の複合組成であってもよい。
また、これらの添加濃度としては、緩衝能を持つ範囲であれば特に限定されないが、好ましい上限は１００ｍＭ以下、より好ましくは５０ｍＭ以下である。好ましい下限は５ｍＭ以上である。
凍結乾燥物中においては緩衝剤の含有量は、特に限定されるものではないが、好ましくは０．１％（重量比）以上、特に好ましくは０．１〜３０％（重量比）の範囲で使用される。
これらは、種々の市販の試薬を用いることが出来る。
これらのバッファーは測定時に添加してもよいし、後記するグルコース測定用試薬、グルコースアッセイキットあるいはグルコースセンサーを作製するときに予め含有させておくこともできる。なお、その際には、液体状態、乾燥状態などの形態は問われず、測定時に機能するようにしておけばよい。
本発明でいう基質特異性の向上とは、ＰＱＱＧＤＨ酵素のグルコースに対する反応性がグルコース以外の糖類に対する反応性よりも向上することを意味する。グルコース以外の糖類としては、特に二糖類のマルトース、シュクロース、ラクトース、セロビオースなどが例示され、特にマルトースが例示される。本願発明では、二糖類に対する作用性が低下したことも、基質特異性の向上と表現する。
二糖類に対する作用性が低下しているかどうかの判断は、次のように行う。
後述の試験例１に記載の活性測定法において、ＰＱＱＧＤＨ酵素を用いて、Ｄ−グルコースを基質溶液とした場合のＰＱＱＧＤＨ活性値（ａ）と、Ｄ−グルコースのかわりに当該二糖類を基質溶液とした場合のＰＱＱＧＤＨ活性値（ｂ）を測定し、グルコースを基質とした場合の測定値を１００とした場合に対する相対値（（ｂ）／（ａ）×１００）を求める。
後述の試験例１に記載の活性測定法において、ＰＱＱＧＤＨ酵素を用いて、Ｄ−グルコースを基質溶液とした場合のＰＱＱＧＤＨ活性値（ａ）と、Ｄ−グルコースのかわりに当該二糖類を基質溶液とした場合のＰＱＱＧＤＨ活性値（ｂ）を測定し、グルコースを基質とした場合の測定値を１００とした場合に対する相対値（（ｂ）／（ａ）×１００）を求める。
本発明の効果は、メディエーターを含む系においてより顕著なものとなる。本発明の方法に適用できるメディエーターは特に限定されないが、フェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）と２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＰＩＰ）との組み合わせ、ＰＭＳとニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）との組み合わせ、ＤＣＰＩＰ単独、フェリシアン化物イオン（化合物としてはフェリシアン化カリウムなど）単独、フェロセン単独などが挙げられる。中でもフェリシアン化物イオン（化合物としてはフェリシアン化カリウムなど）が好ましい。
これらの各メディエーターは感度に様々な違いが存在するするために、添加濃度を一律に規定する必要性はないが、一般的には１ｍＭ以上の添加が望ましい。
これらの各メディエーターは感度に様々な違いが存在するするために、添加濃度を一律に規定する必要性はないが、一般的には１ｍＭ以上の添加が望ましい。
これらのメディエーターは測定時に添加してもよいし、後記するグルコース測定用試薬、グルコースアッセイキットあるいはグルコースセンサーを作製するときに予め含有させておくこともできる。なお、その際には、液体状態、乾燥状態などの形態は問われず、測定時に反応時に解離してイオンの状態になるようにしておけばよい。
本発明においてはさらに必要に応じて種々の成分を共存させることが出来る。例えば、界面活性剤、安定化剤、賦形剤などを添加しても良い。
例えば、カルシウムイオンまたはその塩、およびグルタミン酸、グルタミン、リジン等のアミノ酸類、さらに血清アルブミン等を添加することによりＰＱＱＧＤＨをより安定化することができる。
例えば、カルシウムイオンまたはカルシウム塩を含有させることにより、ＰＱＱＧＤＨを安定化させることができる。カルシウム塩としては、塩化カルシウムまたは酢酸カルシウムもしくはクエン酸カルシウム等の無機酸または有機酸のカルシウム塩などが例示される。また、水性組成物において、カルシウムイオンの含有量は、１×１０-4〜１×１０-2Ｍであることが好ましい。
カルシウムイオンまたはカルシウム塩を含有させることによる安定化効果は、グルタミン酸、グルタミンおよびリジンからなる群から選択されたアミノ酸を含有させることにより、さらに向上する。グルタミン酸、グルタミンおよびリジンからなる群から選択されるアミノ酸は、１種または２種以上であってもよい。ここにさらに牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、卵白アルブミン（ＯＶＡ）を含有させてもよい。
あるいは、（１）アスパラギン酸、グルタミン酸、α−ケトグルタル酸、リンゴ酸、α−ケトグルコン酸、α−サイクロデキストリンおよびそれらの塩からなる群から選ばれた１種または２種以上の化合物および（２）アルブミンを共存せしめることにより、ＰＱＱＧＤＨを安定化することができる。
本発明においては以下の種々の方法によりグルコースを測定することができる。
本発明のグルコース測定用試薬、グルコースアッセイキット、グルコースセンサーは、液状（水溶液、懸濁液等）、真空乾燥やスプレードライなどにより粉末化したもの、凍結乾燥など種々の形態をとることができる。凍結乾燥法としては、特に制限されるものではなく常法に従って行えばよい。本発明の酵素を含む組成物は凍結乾燥物に限られず、凍結乾燥物を再溶解した溶液状態であってもよい。
本発明のグルコース測定用試薬、グルコースアッセイキット、グルコースセンサーは、液状（水溶液、懸濁液等）、真空乾燥やスプレードライなどにより粉末化したもの、凍結乾燥など種々の形態をとることができる。凍結乾燥法としては、特に制限されるものではなく常法に従って行えばよい。本発明の酵素を含む組成物は凍結乾燥物に限られず、凍結乾燥物を再溶解した溶液状態であってもよい。
グルコース測定用試薬
本発明のグルコース測定用試薬は、典型的には、ＰＱＱＧＤＨ、緩衝液、メディエーターなど測定に必要な試薬、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液、ならびに使用の指針を含む。本発明のキットは、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。好ましくは本発明のＰＱＱＧＤＨはホロ化した形態で提供されるが、アポ酵素の形態で提供し、使用時にホロ化することもできる。
本発明のグルコース測定用試薬は、典型的には、ＰＱＱＧＤＨ、緩衝液、メディエーターなど測定に必要な試薬、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液、ならびに使用の指針を含む。本発明のキットは、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。好ましくは本発明のＰＱＱＧＤＨはホロ化した形態で提供されるが、アポ酵素の形態で提供し、使用時にホロ化することもできる。
グルコースアッセイキット
本発明のグルコースアッセイキットは、典型的には、ＰＱＱＧＤＨ、緩衝液、メディエーターなど測定に必要な試薬、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液、ならびに使用の指針を含む。本発明のキットは、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。好ましくは本発明のＰＱＱＧＤＨはホロ化した形態で提供されるが、アポ酵素の形態で提供し、使用時にホロ化することもできる。
本発明のグルコースアッセイキットは、典型的には、ＰＱＱＧＤＨ、緩衝液、メディエーターなど測定に必要な試薬、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液、ならびに使用の指針を含む。本発明のキットは、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。好ましくは本発明のＰＱＱＧＤＨはホロ化した形態で提供されるが、アポ酵素の形態で提供し、使用時にホロ化することもできる。
グルコースセンサー
本発明のグルコースセンサーは、電極としては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上にＰＱＱＧＬＤを固定化する。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどを用いる方法があり、あるいはフェロセンあるいはその誘導体に代表される電子メディエーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。好ましくは本発明のＰＱＱＧＤＨはホロ化した形態で電極上に固定化するが、アポ酵素の形態で固定化し、ＰＱＱを別の層としてまたは溶液中で供給することも可能である。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて本発明のＰＱＱＧＤＨをカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングする。
本発明のグルコースセンサーは、電極としては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上にＰＱＱＧＬＤを固定化する。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどを用いる方法があり、あるいはフェロセンあるいはその誘導体に代表される電子メディエーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。好ましくは本発明のＰＱＱＧＤＨはホロ化した形態で電極上に固定化するが、アポ酵素の形態で固定化し、ＰＱＱを別の層としてまたは溶液中で供給することも可能である。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて本発明のＰＱＱＧＤＨをカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングする。
グルコース濃度の測定は、以下のようにして行うことができる。恒温セルに緩衝液を入れ、ＣａＣｌ2、およびメディエーターを加えて一定温度に維持する。メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルフェートなどを用いることができる。作用電極として本発明のＰＱＱＧＤＨを固定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。
以下、本発明を実施例に基づきより詳細に説明するが、本発明は実施例によって限定されることはない。
実施例１
グルコース測定系を用いた基質特異性の確認
測定原理
ＰＱＱＧＤＨ
Ｄ−グルコース＋フェリシアン化物イオン→
Ｄ−グルコノ−１，５−ラクトン ＋ フェロシアン化物イオン
Ｄ−グルコースの部分を他の糖類に変更して、それぞれの基質に対する特異性を測定する。フェリシアン化物イオンの還元により生じたフェロシアン化物イオンの存在は、分光光度法により波長４２０ｎｍでの吸光度の減少を測定することで確認した。
（２）方法
試薬
Ａ．各種緩衝液， ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液ｐＨ６．５：５０ｍＭ（６０ｍＬの水中に懸濁した１．５１ｇのＰＩＰＥＳ（分子量３０２．３６）を、５Ｎ ＮａＯＨを添加して溶解し、２．２ｍｌの１０％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を加える。更に、５Ｎ ＮａＯＨを用いて２５℃でｐＨを６．５±０．０５に調整し、水を加えて１００ｍｌとした。ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液ｐＨ６．５、フタル酸−ＮａＯＨ緩衝液ｐＨ６．５、シトラコン酸−ＮａＯＨ緩衝液ｐＨ６．５、グルタル酸−ＮａＯＨ緩衝液ｐＨ６．５の各種緩衝液もＰＩＰＥＳの時と同様の方法で作製した。）
Ｂ．フェリシアン化カリウム溶液：５０ｍＭ（０．１６５ｇ フェリシアン化カリウム（分子量３２９．２５）を １０ｍｌ 蒸留水にて溶解した）
Ｃ．ＰＱＱＧＤＨ溶液：８０００Ｕ／ｍｌ（約１００ｍｇ ＰＱＱＧＤＨ（東洋紡績社製：ＧＬＤ−３２１）を蒸留水１０ｍｌに溶解した）
サンプル
Ｄ−グルコース溶液：各々１５０，３００，４５０，６００，７５０，９００，１０５０，１２００，１３５０及び１５００ｍＭの各濃度（２７０ｇ Ｄ−グルコース（分子量１８０．１６）／１０００ｍｌＨ2Ｏにて調製した１５００ｍＭグルコース溶液を基準にして、１／１０，２／１０，３／１０，４／１０，５／１０，６／１０，７／１０，８／１０，９／１０水希釈して作成した）
マルトース溶液：各々１５０，３００，４５０，６００，７５０，９００，１０５０，１２００，１３５０及び１５００ｍＭの各濃度（２７０ｇ Ｄ−グルコース（分子量１８０．１６）／１０００ｍｌＨ2Ｏにて調製した１５００ｍＭグルコース溶液を基準にして、１／１０，２／１０，３／１０，４／１０，５／１０，６／１０，７／１０，８／１０，９／１０水希釈して作成した）
手順
１．遮光ビンに以下の反応混合物を調製し、氷上で貯蔵した（用時調製）
４９．６ｍｌ 各種緩衝液（ｐＨ６．５） （Ａ）
４．０ｍｌ フェリシアン化カリウム溶液 （Ｂ）
５．６ｍｌ （Ｃ）
２． ３．０ｍｌの反応混合液を試験管（プラスチック製）に入れ、３７℃で５分間予備加温した。
３． ０．１ｍｌのグルコース溶液を加え、穏やかに混合した。
４． ４２０ｎｍでの水に対する吸光度の減少を３７℃に維持しながら分光光度計で１〜３分間記録し、曲線の初期直線部分からの１分間当たりのΔＯＤを計算した（ΔＯＤテスト）。同時に、グルコース溶液に代えて蒸留水を加えることを除いては同一の方法を実施し、ブランク（ΔＯＤブランク）を測定した。
上記操作を、各１５０ｍＭ〜１５００ｍＭの各濃度のグルコース溶液またはマルトース溶液を用いて実施した。
グルコース測定系を用いた基質特異性の確認
測定原理
ＰＱＱＧＤＨ
Ｄ−グルコース＋フェリシアン化物イオン→
Ｄ−グルコノ−１，５−ラクトン ＋ フェロシアン化物イオン
Ｄ−グルコースの部分を他の糖類に変更して、それぞれの基質に対する特異性を測定する。フェリシアン化物イオンの還元により生じたフェロシアン化物イオンの存在は、分光光度法により波長４２０ｎｍでの吸光度の減少を測定することで確認した。
（２）方法
試薬
Ａ．各種緩衝液， ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液ｐＨ６．５：５０ｍＭ（６０ｍＬの水中に懸濁した１．５１ｇのＰＩＰＥＳ（分子量３０２．３６）を、５Ｎ ＮａＯＨを添加して溶解し、２．２ｍｌの１０％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を加える。更に、５Ｎ ＮａＯＨを用いて２５℃でｐＨを６．５±０．０５に調整し、水を加えて１００ｍｌとした。ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液ｐＨ６．５、フタル酸−ＮａＯＨ緩衝液ｐＨ６．５、シトラコン酸−ＮａＯＨ緩衝液ｐＨ６．５、グルタル酸−ＮａＯＨ緩衝液ｐＨ６．５の各種緩衝液もＰＩＰＥＳの時と同様の方法で作製した。）
Ｂ．フェリシアン化カリウム溶液：５０ｍＭ（０．１６５ｇ フェリシアン化カリウム（分子量３２９．２５）を １０ｍｌ 蒸留水にて溶解した）
Ｃ．ＰＱＱＧＤＨ溶液：８０００Ｕ／ｍｌ（約１００ｍｇ ＰＱＱＧＤＨ（東洋紡績社製：ＧＬＤ−３２１）を蒸留水１０ｍｌに溶解した）
サンプル
Ｄ−グルコース溶液：各々１５０，３００，４５０，６００，７５０，９００，１０５０，１２００，１３５０及び１５００ｍＭの各濃度（２７０ｇ Ｄ−グルコース（分子量１８０．１６）／１０００ｍｌＨ2Ｏにて調製した１５００ｍＭグルコース溶液を基準にして、１／１０，２／１０，３／１０，４／１０，５／１０，６／１０，７／１０，８／１０，９／１０水希釈して作成した）
マルトース溶液：各々１５０，３００，４５０，６００，７５０，９００，１０５０，１２００，１３５０及び１５００ｍＭの各濃度（２７０ｇ Ｄ−グルコース（分子量１８０．１６）／１０００ｍｌＨ2Ｏにて調製した１５００ｍＭグルコース溶液を基準にして、１／１０，２／１０，３／１０，４／１０，５／１０，６／１０，７／１０，８／１０，９／１０水希釈して作成した）
手順
１．遮光ビンに以下の反応混合物を調製し、氷上で貯蔵した（用時調製）
４９．６ｍｌ 各種緩衝液（ｐＨ６．５） （Ａ）
４．０ｍｌ フェリシアン化カリウム溶液 （Ｂ）
５．６ｍｌ （Ｃ）
２． ３．０ｍｌの反応混合液を試験管（プラスチック製）に入れ、３７℃で５分間予備加温した。
３． ０．１ｍｌのグルコース溶液を加え、穏やかに混合した。
４． ４２０ｎｍでの水に対する吸光度の減少を３７℃に維持しながら分光光度計で１〜３分間記録し、曲線の初期直線部分からの１分間当たりのΔＯＤを計算した（ΔＯＤテスト）。同時に、グルコース溶液に代えて蒸留水を加えることを除いては同一の方法を実施し、ブランク（ΔＯＤブランク）を測定した。
上記操作を、各１５０ｍＭ〜１５００ｍＭの各濃度のグルコース溶液またはマルトース溶液を用いて実施した。
計算
ΔＯＤ／ｍｉｎ（ΔＯＤテスト− ΔＯＤブランク）を算出することにより、単位時間当たりの吸光度変化を求めた。
グラフの横軸に反応液中のグルコース濃度、縦軸に各グルコース濃度に対応するΔＯＤ／ｍｉｎをプロットする。
グルコース以外の糖類に対する作用性が低下しているかどうかの判断は、Ｄ−グルコースを基質溶液とした場合のΔＯＤ／ｍｉｎ（ａ）と、Ｄ−グルコースのかわりにその他の糖類を基質溶液とした場合のΔＯＤ／ｍｉｎ（ｂ）を測定し、グルコースを基質とした場合の測定値を１００とした場合に対する相対値（（ｂ）／（ａ）×１００）を求め、行った。
ΔＯＤ／ｍｉｎ（ΔＯＤテスト− ΔＯＤブランク）を算出することにより、単位時間当たりの吸光度変化を求めた。
グラフの横軸に反応液中のグルコース濃度、縦軸に各グルコース濃度に対応するΔＯＤ／ｍｉｎをプロットする。
グルコース以外の糖類に対する作用性が低下しているかどうかの判断は、Ｄ−グルコースを基質溶液とした場合のΔＯＤ／ｍｉｎ（ａ）と、Ｄ−グルコースのかわりにその他の糖類を基質溶液とした場合のΔＯＤ／ｍｉｎ（ｂ）を測定し、グルコースを基質とした場合の測定値を１００とした場合に対する相対値（（ｂ）／（ａ）×１００）を求め、行った。
実施例２
グルコース測定系のｐＨ条件を変更することによる基質特異性改良の検討
実施例１の手法に基づき、バッファーのｐＨを６．５から５．５に変更して実施した。 各種緩衝液（Ａ）は、緩衝液の組成による影響よりもｐＨに対する影響が大きいことを確かめるため、グッドバッファー（ＰＩＰＥＳ、ＭＥＳ）、酸バッファー（フタル酸、シトラコン酸、グルタル酸）などの複数の緩衝液で検討した。その他の条件は全て実施例１に従った。図１〜３０の内、奇数番号は緩衝液ｐＨ５．５での結果、偶数番号は緩衝液ｐＨ６．５の結果を示す。図１〜１０は野生型ＰＱＱＧＬＤの結果、図１１〜２０は基質特異性が向上した改変体Ａの結果、図２１〜３０は同じく基質特異性が向上した改変体Ｂの結果を示す。図１，２，１１，１２，２１，２２はＰＩＰＥＳ緩衝液の結果、図３，４，１３，１４，２３，２４はＭＥＳ緩衝液の結果、図５，６，１５，１６，２５，２６はフタル酸緩衝液の結果、図７，８，１７，１８，２７，２８はシトラコン酸緩衝液の結果、図９，１０，１９，２０，２９，３０はグルタル酸緩衝液の結果を示す。
図１〜１０の野生型ＰＱＱＧＬＤの結果を比べた場合、緩衝液の組成に関わらず、緩衝液のｐＨを下げることにより、マルトースに対する作用性が向上してＰＱＱＧＬＤのグルコースに対する特異性は低下する傾向が見られた。一方、グルコースに対する基質特異性が向上した改変体Ａ，Ｂでは、野生型ＰＱＱＧＬＤとは異なり、緩衝液の組成に関わらず、緩衝液のｐＨを下げることにより、グルコースに対する作用性が向上してＰＱＱＧＬＤのグルコースに対する特異性が向上する傾向が見られた。各基質濃度でのマルトースに対する作用性（％）を表１〜３に示す。
グルコース測定系のｐＨ条件を変更することによる基質特異性改良の検討
実施例１の手法に基づき、バッファーのｐＨを６．５から５．５に変更して実施した。 各種緩衝液（Ａ）は、緩衝液の組成による影響よりもｐＨに対する影響が大きいことを確かめるため、グッドバッファー（ＰＩＰＥＳ、ＭＥＳ）、酸バッファー（フタル酸、シトラコン酸、グルタル酸）などの複数の緩衝液で検討した。その他の条件は全て実施例１に従った。図１〜３０の内、奇数番号は緩衝液ｐＨ５．５での結果、偶数番号は緩衝液ｐＨ６．５の結果を示す。図１〜１０は野生型ＰＱＱＧＬＤの結果、図１１〜２０は基質特異性が向上した改変体Ａの結果、図２１〜３０は同じく基質特異性が向上した改変体Ｂの結果を示す。図１，２，１１，１２，２１，２２はＰＩＰＥＳ緩衝液の結果、図３，４，１３，１４，２３，２４はＭＥＳ緩衝液の結果、図５，６，１５，１６，２５，２６はフタル酸緩衝液の結果、図７，８，１７，１８，２７，２８はシトラコン酸緩衝液の結果、図９，１０，１９，２０，２９，３０はグルタル酸緩衝液の結果を示す。
図１〜１０の野生型ＰＱＱＧＬＤの結果を比べた場合、緩衝液の組成に関わらず、緩衝液のｐＨを下げることにより、マルトースに対する作用性が向上してＰＱＱＧＬＤのグルコースに対する特異性は低下する傾向が見られた。一方、グルコースに対する基質特異性が向上した改変体Ａ，Ｂでは、野生型ＰＱＱＧＬＤとは異なり、緩衝液の組成に関わらず、緩衝液のｐＨを下げることにより、グルコースに対する作用性が向上してＰＱＱＧＬＤのグルコースに対する特異性が向上する傾向が見られた。各基質濃度でのマルトースに対する作用性（％）を表１〜３に示す。
このように、グルコースに対する基質特異性が向上した改変体では、バッファーのｐＨを中性付近から酸性側へ移行することにより、１．５〜６．５倍基質特異性を更に向上できることが明らかとなった。
本発明による基質特異性の改良は、グルコース測定試薬、グルコースアッセイキット及びグルコースセンサでの測定精度を向上することができる。
Claims (17)
- ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素を反応させる工程を含むグルコース測定方法において、測定反応時のｐＨを酸性にする工程を含む、ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素を反応させる工程を含むグルコース測定においてマルトースに対する作用性を低減させる方法。
- さらに組成物としてメディエーターを含む請求項１に記載のピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素を反応させる工程を含むグルコース測定においてマルトースに対する作用性を低減させる方法。
- メディエーターがフェリシアン化物塩である請求項２に記載のピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素を反応させる工程を含むグルコース測定においてマルトースに対する作用性を低減させる方法。
- ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼが、対応する野生型酵素と比較してマルトース作用性の低下した改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼである、請求項１に記載のピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素を反応させる工程を含むグルコース測定においてマルトースに対する作用性を低減させる方法。
- 測定反応時のｐＨが６．５以下の酸性である、請求項１に記載のグルコース測定方法。
- ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを反応させる工程が、ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを含むグルコース測定用試薬組成物においてなされることを含む、請求項１に記載のピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素を反応させる工程を含むグルコース測定においてマルトースに対する作用性を低減させる方法。
- グルコース測定用組成物がメディエーターとしてフェリシアン化物イオンを含む形態をとることを含む、請求項６に記載のピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素を反応させる工程を含むグルコース測定においてマルトースに対する作用性を低減させる方法。
- グルコース測定用組成物がグルコースアッセイキットに含まれる形態をとることを含む、請求項６に記載のピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素を反応させる工程を含むグルコース測定においてマルトースに対する作用性を低減させる方法。
- グルコースアッセイキットがピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素を含み、かつ、測定反応時のｐＨが６．５以下の酸性である形態をとることを含む、請求項８に記載のピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素を反応させる工程を含むグルコース測定においてマルトースに対する作用性を低減させる方法。
- ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを反応させる工程が、ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを含み、かつ、少なくとも作用極と対極からなる電極を含むグルコースセンサーにおいてなされることを含む、請求項１に記載のピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素を反応させる工程を含むグルコース測定においてマルトースに対する作用性を低減させる方法。
- グルコースセンサーにおける反応が、ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを含む反応溶液に電圧を印加し、メディエーターの酸化電流を測定してなる、請求項１０に記載のピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素を反応させる工程を含むグルコース測定においてマルトースに対する作用性を低減させる方法。
- グルコースセンサーが、ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素を含み、かつ、測定反応時のｐＨが６．５以下の酸性である形態をとることを含む、請求項１０に記載のピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素を反応させる工程を含むグルコース測定においてマルトースに対する作用性を低減させる方法。
- グルコースセンサーが、メディエーターとしてフェリシアン化物イオンを含む、請求項１０に記載のピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素を反応させる工程を含むグルコース測定においてマルトースに対する作用性を低減させる方法。
- アミノ酸配列の改変を施した改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ、および、測定反応時のｐＨを酸性に保つことができる緩衝剤を含む、ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素を用いたグルコース測定用組成物においてマルトースに対する作用性が低減したグルコース測定用組成物。
- アミノ酸配列の改変を施した改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ、および、測定反応時のｐＨを酸性に保つことができる緩衝剤を含む、ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを用いたグルコースセンサーにおいてマルトースに対する作用性が低減したグルコースセンサー。
- 測定反応時のｐＨを酸性に保つことができる緩衝剤を含有させる工程を含む、ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを用いたグルコース測定用組成物においてマルトースに対する作用性が低減したグルコース測定用組成物の製造方法。
- 測定反応時のｐＨを酸性に保つことができる緩衝剤を含有させる工程を含む、ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを用いたグルコースセンサーにおいてマルトースに対する作用性が低減したグルコースセンサーの製造方法。
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