JP2006280360A - Ｐｑｑｇｄｈの基質阻害を回避する方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素の基質阻害を回避する方法の提供。
【解決手段】ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素を含む系においてグルコースを測定する方法において、測定反応時のｐＨが酸性であることを特徴とする、グルコース測定における基質阻害を低減する方法。
【選択図】なし
【解決手段】ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素を含む系においてグルコースを測定する方法において、測定反応時のｐＨが酸性であることを特徴とする、グルコース測定における基質阻害を低減する方法。
【選択図】なし
Description
本発明は、ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素の基質阻害を回避する方法に関するものである。
ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素（本願では、ＰＱＱＧＤＨとも記載する。）は、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）を補酵素とするグルコース脱水素酵素（ＧＤＨ）である。グルコースを酸化してグルコノラクトンを生成する反応を触媒するから、血糖の測定に用いることができる。血中グルコース濃度は、糖尿病の重要なマーカーとして臨床診断上きわめて重要な指標である。現在、血中グルコース濃度の測定はバイオセンサーを用いる方法が主流となっているが、血中グルコース濃度の測定に使用される酵素としてピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素が注目されている。このようなＰＱＱＧＤＨとして例えば、アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ） ＮＣＩＭＢ１１５１７株が、ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素を産生することを見出し，遺伝子のクローニングならびに高発現系を構築した事例（たとえば、特許文献１を参照。）などが開示されている。
特開平１１−２４３９４９号公報
ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素は、Ｄ−グルコースを酸化してＤ−グルコノ−１，５−ラクトンを生成する反応を触媒する点、及び反応系の溶存酸素の影響を受けず、補酵素添加を必要としない酵素特性を有する点より、血糖の生化学診断薬はもちろん血糖センサー等幅広い用途が期待される反面、センサーへの適用検討にあたっては感度低下の問題の指摘があった。
本発明者らは上記課題を解決するため、その原因について鋭意研究したところ、一般的に血糖センサーで電子のメディエーターとして使用されるフェリシアン化物イオンに対する反応性が低いことがわかった。
我々はこの点についてさらに検討を加え、フェリシアン化物イオンに対して反応性が低い原因は、バッファー条件が中性付近で基質阻害の影響を受けているためであることを明らかにした。
これまでＰＱＱＧＤＨの基質阻害を回避する方策に関する報告としては特許文献２があり、その中では遺伝子レベルでのＰＱＱＧＤＨ改変手段を用いた検討が報告されているが、その基質阻害のメカニズムについては開示も示唆もされておらず、測定反応条件の観点から基質阻害を解決する手段については、その可能性にすら触れられていなかった。
ＷＯ０３／１０６６６８
我々はこの点についてさらに検討を加え、フェリシアン化物イオンに対して反応性が低い原因は、バッファー条件が中性付近で基質阻害の影響を受けているためであることを明らかにした。
これまでＰＱＱＧＤＨの基質阻害を回避する方策に関する報告としては特許文献２があり、その中では遺伝子レベルでのＰＱＱＧＤＨ改変手段を用いた検討が報告されているが、その基質阻害のメカニズムについては開示も示唆もされておらず、測定反応条件の観点から基質阻害を解決する手段については、その可能性にすら触れられていなかった。
本発明者らは、過去の方策とは異なる視点から、より簡便な基質阻害の回避策を探ることとし、さらなる鋭意研究を実施した結果、グルコース測定反応条件のｐＨを酸性にすることによりＰＱＱＧＤＨの基質阻害を回避することができることを明らかにし、遂に本発明を完成するに到った。即ち本発明は、
項１．ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素を含む系においてグルコースを測定する方法において、測定反応時のｐＨが酸性であることを特徴とする、グルコース測定における基質阻害を低減する方法
項２．メディエーターとしてフェリシアン化物イオンを含む、項１に記載のグルコース測定方法
項３．ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素を含み、かつ、測定反応時のｐＨが酸性であることを特徴とする、基質阻害を低減したグルコース測定試薬
項４．メディエーターとしてフェリシアン化物イオンを含む、項３に記載のグルコース測定試薬
項５．ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素を含み、かつ、測定反応時のｐＨが酸性であることを特徴とする、基質阻害を低減したグルコースアッセイキット
項６．メディエーターとしてフェリシアン化物イオンを含む、項５に記載のグルコースアッセイキット
項７．ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素を含み、かつ、測定反応時のｐＨが酸性であることを特徴とする、基質阻害を低減したグルコースセンサー
項８．メディエーターとしてフェリシアン化物イオンを含む、項７に記載のグルコースセンサー
である。
項１．ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素を含む系においてグルコースを測定する方法において、測定反応時のｐＨが酸性であることを特徴とする、グルコース測定における基質阻害を低減する方法
項２．メディエーターとしてフェリシアン化物イオンを含む、項１に記載のグルコース測定方法
項３．ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素を含み、かつ、測定反応時のｐＨが酸性であることを特徴とする、基質阻害を低減したグルコース測定試薬
項４．メディエーターとしてフェリシアン化物イオンを含む、項３に記載のグルコース測定試薬
項５．ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素を含み、かつ、測定反応時のｐＨが酸性であることを特徴とする、基質阻害を低減したグルコースアッセイキット
項６．メディエーターとしてフェリシアン化物イオンを含む、項５に記載のグルコースアッセイキット
項７．ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素を含み、かつ、測定反応時のｐＨが酸性であることを特徴とする、基質阻害を低減したグルコースセンサー
項８．メディエーターとしてフェリシアン化物イオンを含む、項７に記載のグルコースセンサー
である。
本発明による基質阻害回避は、グルコース測定試薬、グルコースアッセイキット及びグルコースセンサでの高濃度グルコース測定を可能にする。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の方法に適用することができるＰＱＱＧＤＨは、ピロロキノリンキノンを補酵素として配位し、Ｄ−グルコースを酸化してＤ−グルコノ−１，５−ラクトンを生成するという反応を触媒する酵素（ＥＣ１．１．５．２（旧ＥＣ１．１．９９．１７））であり、由来や構造に関しては特に限定するものではない。
本発明の方法に適用することができるＰＱＱＧＤＨは、例えば、アシネトバクター・カルコアセティカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）ＬＭＤ７９．４１由来のもの（Ａ．Ｍ．Ｃｌｅｔｏｎ−Ｊａｎｓｅｎら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７０，２１２１（１９８８）およびＭｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２１７，４３０（１９８９））、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来のもの（Ａ．Ｍ．Ｃｌｅｔｏｎ−Ｊａｎｓｅｎら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２，６３０８（１９９０））、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ）由来のもの（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２２９，２０６（１９９１））、及び、特許文献１で報告されているアシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉ） ＮＣＩＭＢ１１５１７由来のものなどが例示できる。
ただし、エシェリヒア・コリなどに存在する膜型酵素を改変して可溶型にすることは困難であり、起源としてはアシネトバクター・カルコアセティカスもしくはアシネトバクター・バウマンニなどの可溶性ＰＱＱＧＤＨを選択することが好ましい。
なお、アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）ＮＣＩＭＢ１１５１７株は、以前、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓに分類されていた。
ただし、エシェリヒア・コリなどに存在する膜型酵素を改変して可溶型にすることは困難であり、起源としてはアシネトバクター・カルコアセティカスもしくはアシネトバクター・バウマンニなどの可溶性ＰＱＱＧＤＨを選択することが好ましい。
なお、アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）ＮＣＩＭＢ１１５１７株は、以前、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓに分類されていた。
本発明の方法に適用することができるＰＱＱＧＤＨは、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する限り、上記に例示されたものにさらに他のアミノ酸残基の一部が欠失または置換されていてもよく、また他のアミノ酸残基が付加されていてもよい。
このような改変は当該技術分野における公知技術を用いて当業者であれば容易に実施することが出来る。例えば、蛋白質に部位特異的変異を導入するために当該蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列を置換するための種々の方法が、Ｓａｍｂｒｏｏｋら著、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ； Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ 第２版（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ, Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記載されている。
このような改変は当該技術分野における公知技術を用いて当業者であれば容易に実施することが出来る。例えば、蛋白質に部位特異的変異を導入するために当該蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列を置換するための種々の方法が、Ｓａｍｂｒｏｏｋら著、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ； Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ 第２版（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ, Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記載されている。
これらのＰＱＱＧＤＨは、たとえば東洋紡績製ＧＬＤ−３２１など市販のものを用いることが出来る。あるいは、当該技術分野における公知技術を用いて当業者であれば容易に製造することが出来る。
例えば、上記のＰＱＱＧＤＨを生産する天然の微生物、あるいは、天然のＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子をそのまま、あるいは、変異させてから、発現用ベクター（多くのものが当該技術分野において知られている。例えばプラスミド。）に挿入し、適当な宿主（多くのものが当該技術分野において知られている。例えば大腸菌。）に形質転換させた形質転換体を培養し、培養液から遠心分離などで菌体を回収した後、菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また、必要に応じてＥＤＴＡなどのキレート剤や界面活性剤等を添加して可溶化し、ＰＱＱＧＤＨを含む水溶性画分を得ることができる。または適当な宿主ベクター系を用いることにより、発現したＰＱＱＧＤＨを直接培養液中に分泌させることが出来る。
上記のようにして得られたＰＱＱＧＤＨ含有溶液を、例えば減圧濃縮、膜濃縮、さらに硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、あるいは親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈殿法により沈殿せしめればよい。また、加熱処理や等電点処理も有効な精製手段である。また、吸着剤あるいはゲルろ過剤などによるゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーを行うことにより、精製されたＰＱＱＧＤＨを得ることができる。該精製酵素標品は、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）的に単一のバンドを示す程度に純化されていることが好ましい。
上記工程と前後して、全ＧＤＨ酵素タンパク質に対するホロ型ＰＱＱＧＤＨの割合を向上させるために、好ましくは２５〜５０℃、より好ましくは３０〜４５℃の加熱処理を行っても良い。
本発明におけるＰＱＱＧＤＨの濃度は特に制約がない。
ＰＱＱＧＤＨの酵素活性は以下の方法により測定できる。
ＰＱＱＧＤＨ酵素活性の測定方法
（１）測定原理
Ｄ−グルコース＋ＰＭＳ＋ＰＱＱＧＤＨ → Ｄ−グルコノ−１，５−ラクトン ＋ ＰＭＳ（ｒｅｄ）
２ＰＭＳ（ｒｅｄ） ＋ ＮＴＢ → ２ＰＭＳ ＋ ジホルマザン
フェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）（ｒｅｄ）によるニトロテトラゾリウムブルー（ＮＴＢ）の還元により形成されたジホルマザンの存在は、５７０ｎｍで分光光度法により測定した。
（２）単位の定義
１単位は、以下に記載の条件下で１分当たりジホルマザンを０．５ミリモル形成させるＰＱＱＧＤＨの酵素量をいう。
（３）方法
試薬
Ａ．Ｄ−グルコース溶液：０．５Ｍ（０．９ｇ Ｄ−グルコース（分子量１８０．１６）／１０ｍｌ Ｈ２Ｏ）
Ｂ．ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液， ｐＨ６．５：５０ｍＭ（６０ｍＬの水中に懸濁した１．５１ｇのＰＩＰＥＳ（分子量３０２．３６）を、５Ｎ ＮａＯＨに溶解し、２．２ｍｌの１０％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を加える。５Ｎ ＮａＯＨを用いて２５℃でｐＨを６．５±０．０５に調整し、水を加えて１００ｍｌとした。）
Ｃ．ＰＭＳ溶液：３．０ｍＭ（９．１９ｍｇのフェナジンメトサルフェート（分子量８１７．６５）／１０ｍｌＨ２Ｏ）
Ｄ．ＮＴＢ溶液：６．６ｍＭ（５３．９６ｍｇのニトロテトラゾリウムブルー（分子量８１７．６５）／１０ｍｌＨ２Ｏ）
Ｅ．酵素希釈液：１ｍＭ ＣａＣｌ２， ０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００， ０．１％ ＢＳＡを含む５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５）
手順
遮光ビンに以下の反応混合物を調製し、氷上で貯蔵した（用時調製）
１．８ｍｌ Ｄ−グルコース溶液 （Ａ）
２４．６ｍｌ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５） （Ｂ）
２．０ｍｌ ＰＭＳ溶液 （Ｃ）
１．０ｍｌ ＮＴＢ溶液 （Ｄ）
上記アッセイ混合物中の濃度は次のとおり。
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ４２ｍＭ
Ｄ−グルコース ３０ｍＭ
ＰＭＳ ０．２０ｍＭ
ＮＴＢ ０．２２ｍＭ
３．０ｍｌの反応混合液を試験管（プラスチック製）に入れ、３７℃で５分間予備加温した。
０．１ｍｌの酵素溶液を加え、穏やかに反転して混合した。
５７０ｎｍでの水に対する吸光度の増加を３７℃に維持しながら分光光度計で４〜５分間記録し、曲線の初期直線部分からの１分当たりのΔＯＤを計算した（ＯＤテスト）。
同時に、酵素溶液に代えて酵素希釈液（Ｅ）加えることを除いては同一の方法を繰り返し、ブランク（ΔＯＤブランク）を測定した。
アッセイの直前に氷冷した酵素希釈液（Ｅ）で酵素粉末を溶解し、同一の緩衝液で０．１−０．８Ｕ／ｍｌに希釈した（該酵素の接着性のためにプラスチックチューブの使用が好ましい）。
計算
活性を以下の式を用いて計算する：
Ｕ／ｍｌ＝｛ΔＯＤ／ｍｉｎ（ΔＯＤテスト− ΔＯＤブランク）×Ｖｔ×ｄｆ｝／（２０．１×１．０×Ｖｓ）
Ｕ／ｍｇ＝（Ｕ／ｍｌ）×１／Ｃ
Ｖｔ：総体積（３．１ｍｌ）
Ｖｓ：サンプル体積（１．０ｍｌ）
２０．１：ジホルマザンの１／２ミリモル分子吸光係数
１．０：光路長（ｃｍ）
ｄｆ：希釈係数
Ｃ：溶液中の酵素濃度（ｃ ｍｇ／ｍｌ）
ＰＱＱＧＤＨ酵素活性の測定方法
（１）測定原理
Ｄ−グルコース＋ＰＭＳ＋ＰＱＱＧＤＨ → Ｄ−グルコノ−１，５−ラクトン ＋ ＰＭＳ（ｒｅｄ）
２ＰＭＳ（ｒｅｄ） ＋ ＮＴＢ → ２ＰＭＳ ＋ ジホルマザン
フェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）（ｒｅｄ）によるニトロテトラゾリウムブルー（ＮＴＢ）の還元により形成されたジホルマザンの存在は、５７０ｎｍで分光光度法により測定した。
（２）単位の定義
１単位は、以下に記載の条件下で１分当たりジホルマザンを０．５ミリモル形成させるＰＱＱＧＤＨの酵素量をいう。
（３）方法
試薬
Ａ．Ｄ−グルコース溶液：０．５Ｍ（０．９ｇ Ｄ−グルコース（分子量１８０．１６）／１０ｍｌ Ｈ２Ｏ）
Ｂ．ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液， ｐＨ６．５：５０ｍＭ（６０ｍＬの水中に懸濁した１．５１ｇのＰＩＰＥＳ（分子量３０２．３６）を、５Ｎ ＮａＯＨに溶解し、２．２ｍｌの１０％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を加える。５Ｎ ＮａＯＨを用いて２５℃でｐＨを６．５±０．０５に調整し、水を加えて１００ｍｌとした。）
Ｃ．ＰＭＳ溶液：３．０ｍＭ（９．１９ｍｇのフェナジンメトサルフェート（分子量８１７．６５）／１０ｍｌＨ２Ｏ）
Ｄ．ＮＴＢ溶液：６．６ｍＭ（５３．９６ｍｇのニトロテトラゾリウムブルー（分子量８１７．６５）／１０ｍｌＨ２Ｏ）
Ｅ．酵素希釈液：１ｍＭ ＣａＣｌ２， ０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００， ０．１％ ＢＳＡを含む５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５）
手順
遮光ビンに以下の反応混合物を調製し、氷上で貯蔵した（用時調製）
１．８ｍｌ Ｄ−グルコース溶液 （Ａ）
２４．６ｍｌ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５） （Ｂ）
２．０ｍｌ ＰＭＳ溶液 （Ｃ）
１．０ｍｌ ＮＴＢ溶液 （Ｄ）
上記アッセイ混合物中の濃度は次のとおり。
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ４２ｍＭ
Ｄ−グルコース ３０ｍＭ
ＰＭＳ ０．２０ｍＭ
ＮＴＢ ０．２２ｍＭ
３．０ｍｌの反応混合液を試験管（プラスチック製）に入れ、３７℃で５分間予備加温した。
０．１ｍｌの酵素溶液を加え、穏やかに反転して混合した。
５７０ｎｍでの水に対する吸光度の増加を３７℃に維持しながら分光光度計で４〜５分間記録し、曲線の初期直線部分からの１分当たりのΔＯＤを計算した（ＯＤテスト）。
同時に、酵素溶液に代えて酵素希釈液（Ｅ）加えることを除いては同一の方法を繰り返し、ブランク（ΔＯＤブランク）を測定した。
アッセイの直前に氷冷した酵素希釈液（Ｅ）で酵素粉末を溶解し、同一の緩衝液で０．１−０．８Ｕ／ｍｌに希釈した（該酵素の接着性のためにプラスチックチューブの使用が好ましい）。
計算
活性を以下の式を用いて計算する：
Ｕ／ｍｌ＝｛ΔＯＤ／ｍｉｎ（ΔＯＤテスト− ΔＯＤブランク）×Ｖｔ×ｄｆ｝／（２０．１×１．０×Ｖｓ）
Ｕ／ｍｇ＝（Ｕ／ｍｌ）×１／Ｃ
Ｖｔ：総体積（３．１ｍｌ）
Ｖｓ：サンプル体積（１．０ｍｌ）
２０．１：ジホルマザンの１／２ミリモル分子吸光係数
１．０：光路長（ｃｍ）
ｄｆ：希釈係数
Ｃ：溶液中の酵素濃度（ｃ ｍｇ／ｍｌ）
本発明の方法においては測定時のｐＨは酸性である。ｐＨが酸性とは７．０未満を指し特に限定されないが、本発明において好ましい上限はｐＨ６．５以下、さらに好ましくはｐＨ６．０以下、さらに好ましくはｐＨ５．５以下である。本発明において好ましい下限はｐＨ３．０以上、さらに好ましくはｐＨ３．５以上である。さらに本発明において好ましい範囲はｐＨ３．５〜５．５である。
本発明の方法において測定時のｐＨを酸性にするために、種々のバッファーを用いることが出来る。そのようなバッファーとしては、ｐＨを酸性に保つことができる緩衝能を持つものであれば特に限定されない。一般に使用することができるバッファー種としては、トリス塩酸、ホウ酸、リン酸、酢酸、クエン酸、コハク酸、フタル酸、マレイン酸、グリシン及びそれらの塩などやＭＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ等のグット緩衝液などがあげられる。
カルシウムと不溶性の塩を形成しない緩衝液が好ましい。
これらのうち１種のみを適用してもよいし、２種以上を用いてもよい。さらには上記以外を含む１種以上の複合組成であってもよい。
また、これらの添加濃度としては、緩衝能を持つ範囲であれば特に限定されないが、好ましい上限は１００ｍＭ以下、より好ましくは５０ｍＭ以下である。好ましい下限は５ｍＭ以上である。
凍結乾燥物中においては緩衝剤の含有量は、特に限定されるものではないが、好ましくは０．１％（重量比）以上、特に好ましくは０．１〜３０％（重量比）の範囲で使用される。
これらは、種々の市販の試薬を用いることが出来る。
カルシウムと不溶性の塩を形成しない緩衝液が好ましい。
これらのうち１種のみを適用してもよいし、２種以上を用いてもよい。さらには上記以外を含む１種以上の複合組成であってもよい。
また、これらの添加濃度としては、緩衝能を持つ範囲であれば特に限定されないが、好ましい上限は１００ｍＭ以下、より好ましくは５０ｍＭ以下である。好ましい下限は５ｍＭ以上である。
凍結乾燥物中においては緩衝剤の含有量は、特に限定されるものではないが、好ましくは０．１％（重量比）以上、特に好ましくは０．１〜３０％（重量比）の範囲で使用される。
これらは、種々の市販の試薬を用いることが出来る。
これらのバッファーは測定時に添加してもよいし、後記するグルコース測定用試薬、グルコースアッセイキットあるいはグルコースセンサーを作製するときに予め含有させておくこともできる。なお、その際には、液体状態、乾燥状態などの形態は問われず、測定時に機能するようにしておけばよい。
本発明でいう基質阻害とは、測定対象であるサンプルのグルコース（基質）濃度を上げていった際に、一定濃度を境に反応速度が低下する現象をさす。種々のグルコース濃度のサンプルを測定した場合、反応速度が低下する直前のグルコース濃度を「基質阻害が起こらない最高濃度」とみなす。
また、「基質阻害を低減する」とは、「基質阻害が起こらない最高濃度」を上げることであるが、実際的には、正常血糖値が５ｍＭ（９０ｍｇ／ｄｌ）程度、高血糖値が１０ｍＭ（１８０ｍｇ／ｄｌ）程度であることから判断して、それらより有意に高値である３０ｍＭ（５４０ｍｇ／ｄｌ）まで基質阻害が認められなければ（すなわち「基質阻害が起こらない最高濃度」が３０ｍＭ以上であれば）実用上十分である。
なお、グルコースの測定範囲は「基質阻害が起こらない最高濃度の上限」とは全く異なるものである。
なお、グルコースの測定範囲は「基質阻害が起こらない最高濃度の上限」とは全く異なるものである。
本発明の効果は、メディエーターを含む系においてより顕著なものとなる。本発明の方法に適用できるメディエーターは特に限定されないが、フェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）と２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＰＩＰ）との組み合わせ、ＰＭＳとニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）との組み合わせ、ＤＣＰＩＰ単独、フェリシアン化物イオン（化合物としてはフェリシアン化カリウムなど）単独、フェロセン単独などが挙げられる。中でもフェリシアン化物イオン（化合物としてはフェリシアン化カリウムなど）が好ましい。
これらの各メディエーターは感度に様々な違いが存在するするために、添加濃度を一律に規定する必要性はないが、一般的には１ｍＭ以上の添加が望ましい。
これらの各メディエーターは感度に様々な違いが存在するするために、添加濃度を一律に規定する必要性はないが、一般的には１ｍＭ以上の添加が望ましい。
これらのメディエーターは測定時に添加してもよいし、後記するグルコース測定用試薬、グルコースアッセイキットあるいはグルコースセンサーを作製するときに予め含有させておくこともできる。なお、その際には、液体状態、乾燥状態などの形態は問われず、測定時に反応時に解離してイオンの状態になるようにしておけばよい。
本発明においてはさらに必要に応じて種々の成分を共存させることが出来る。例えば、界面活性剤、安定化剤、賦形剤などを添加しても良い。
例えば、カルシウムイオンまたはその塩、およびグルタミン酸、グルタミン、リジン等のアミノ酸類、さらに血清アルブミン等を添加することによりＰＱＱＧＤＨをより安定化することができる。
例えば、カルシウムイオンまたはカルシウム塩を含有させることにより、ＰＱＱＧＤＨを安定化させることができる。カルシウム塩としては、塩化カルシウムまたは酢酸カルシウムもしくはクエン酸カルシウム等の無機酸または有機酸のカルシウム塩などが例示される。また、水性組成物において、カルシウムイオンの含有量は、１×１０-4〜１×１０-2Ｍであることが好ましい。
カルシウムイオンまたはカルシウム塩を含有させることによる安定化効果は、グルタミン酸、グルタミンおよびリジンからなる群から選択されたアミノ酸を含有させることにより、さらに向上する。グルタミン酸、グルタミンおよびリジンからなる群から選択されるアミノ酸は、１種または２種以上であってもよい。ここにさらに牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、卵白アルブミン（ＯＶＡ）を含有させてもよい。
あるいは、（１）アスパラギン酸、グルタミン酸、α−ケトグルタル酸、リンゴ酸、α−ケトグルコン酸、α−サイクロデキストリンおよびそれらの塩からなる群から選ばれた１種または２種以上の化合物および（２）アルブミンを共存せしめることにより、ＰＱＱＧＤＨを安定化することができる。
本発明においては以下の種々の方法によりグルコースを測定することができる。
本発明のグルコース測定用試薬、グルコースアッセイキット、グルコースセンサーは、液状（水溶液、懸濁液等）、真空乾燥やスプレードライなどにより粉末化したもの、凍結乾燥など種々の形態をとることができる。凍結乾燥法としては、特に制限されるものではなく常法に従って行えばよい。本発明の酵素を含む組成物は凍結乾燥物に限られず、凍結乾燥物を再溶解した溶液状態であってもよい。
本発明のグルコース測定用試薬、グルコースアッセイキット、グルコースセンサーは、液状（水溶液、懸濁液等）、真空乾燥やスプレードライなどにより粉末化したもの、凍結乾燥など種々の形態をとることができる。凍結乾燥法としては、特に制限されるものではなく常法に従って行えばよい。本発明の酵素を含む組成物は凍結乾燥物に限られず、凍結乾燥物を再溶解した溶液状態であってもよい。
グルコース測定用試薬
本発明のグルコース測定用試薬は、典型的には、ＰＱＱＧＤＨ、緩衝液、メディエーターなど測定に必要な試薬、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液、ならびに使用の指針を含む。本発明のキットは、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。好ましくは本発明のＰＱＱＧＤＨはホロ化した形態で提供されるが、アポ酵素の形態で提供し、使用時にホロ化することもできる。
本発明のグルコース測定用試薬は、典型的には、ＰＱＱＧＤＨ、緩衝液、メディエーターなど測定に必要な試薬、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液、ならびに使用の指針を含む。本発明のキットは、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。好ましくは本発明のＰＱＱＧＤＨはホロ化した形態で提供されるが、アポ酵素の形態で提供し、使用時にホロ化することもできる。
グルコースアッセイキット
本発明のグルコースアッセイキットは、典型的には、ＰＱＱＧＤＨ、緩衝液、メディエーターなど測定に必要な試薬、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液、ならびに使用の指針を含む。本発明のキットは、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。好ましくは本発明のＰＱＱＧＤＨはホロ化した形態で提供されるが、アポ酵素の形態で提供し、使用時にホロ化することもできる。
本発明のグルコースアッセイキットは、典型的には、ＰＱＱＧＤＨ、緩衝液、メディエーターなど測定に必要な試薬、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液、ならびに使用の指針を含む。本発明のキットは、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。好ましくは本発明のＰＱＱＧＤＨはホロ化した形態で提供されるが、アポ酵素の形態で提供し、使用時にホロ化することもできる。
グルコースセンサー
本発明のグルコースセンサーは、電極としては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上にＰＱＱＧＬＤを固定化する。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどを用いる方法があり、あるいはフェロセンあるいはその誘導体に代表される電子メディエーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。好ましくは本発明のＰＱＱＧＤＨはホロ化した形態で電極上に固定化するが、アポ酵素の形態で固定化し、ＰＱＱを別の層としてまたは溶液中で供給することも可能である。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて本発明のＰＱＱＧＤＨをカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングする。
本発明のグルコースセンサーは、電極としては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上にＰＱＱＧＬＤを固定化する。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどを用いる方法があり、あるいはフェロセンあるいはその誘導体に代表される電子メディエーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。好ましくは本発明のＰＱＱＧＤＨはホロ化した形態で電極上に固定化するが、アポ酵素の形態で固定化し、ＰＱＱを別の層としてまたは溶液中で供給することも可能である。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて本発明のＰＱＱＧＤＨをカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングする。
グルコース濃度の測定は、以下のようにして行うことができる。恒温セルに緩衝液を入れ、ＣａＣｌ2、およびメディエーターを加えて一定温度に維持する。メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルフェートなどを用いることができる。作用電極として本発明のＰＱＱＧＤＨを固定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。
以下、本発明を実施例に基づきより詳細に説明するが、本発明は実施例によって限定されることはない。
実施例１
グルコース測定系を用いた基質阻害の確認
測定原理
ＰＱＱＧＤＨ
Ｄ−グルコース＋フェリシアン化物イオン→
Ｄ−グルコノ−１，５−ラクトン ＋ フェロシアン化物イオン
フェリシアン化物イオンの還元により生じたフェロシアン化物イオンの存在は、分光光度法により波長４２０ｎｍでの吸光度の減少を測定することで確認した。
（２）方法
試薬
Ａ．ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液， ｐＨ６．５：５０ｍＭ（６０ｍＬの水中に懸濁した１．５１ｇのＰＩＰＥＳ（分子量３０２．３６）を、５Ｎ ＮａＯＨに溶解し、２．２ｍｌの１０％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を加える。５Ｎ ＮａＯＨを用いて２５℃でｐＨを６．５±０．０５に調整し、水を加えて１００ｍｌとした。）
Ｂ．フェリシアン化カリウム溶液：５０ｍＭ（０．１６５ｇ フェリシアン化カリウム（分子量３２９．２５）を １０ｍｌ 蒸留水にて溶解した）
Ｃ．ＰＱＱＧＤＨ溶液：８０００U／ｍｌ（約１００ｍｇ ＰＱＱＧＤＨ（東洋紡績社製：ＧＬＤ−３２１）を蒸留水１０ｍｌに溶解した）
サンプル
Ｄ−グルコース溶液：各々１５０，３００，４５０，６００，７５０，９００，１０５０，１２００，１３５０及び１５００ｍＭの各濃度（２７０ｇ Ｄ−グルコース（分子量１８０．１６）／１０００ｍｌＨ２Ｏにて調製した１５００ｍＭグルコース溶液を基準にして、１／１０，２／１０，３／１０，４／１０，５／１０，６／１０，７／１０，８／１０，９／１０水希釈して作成した）
手順
１．遮光ビンに以下の反応混合物を調製し、氷上で貯蔵した（用時調製）
４９．６ｍｌ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５） （Ａ）
４．０ｍｌ フェリシアン化カリウム溶液 （Ｂ）
５．６ｍｌ （Ｃ）
２． ３．０ｍｌの反応混合液を試験管（プラスチック製）に入れ、３７℃で５分間予備加温した。
３． ０．１ｍｌのグルコース溶液を加え、穏やかに混合した。
４． ４２０ｎｍでの水に対する吸光度の減少を３７℃に維持しながら分光光度計で１〜３分間記録し、曲線の初期直線部分からの１分間当たりのΔＯＤを計算した（ΔＯＤテスト）
同時に、グルコース溶液に代えて蒸留水を加えることを除いては同一の方法を実施し、ブランク（ΔＯＤブランク）を測定した。
上記操作を、各１５０ｍＭ〜１５００ｍＭの各濃度のグルコース溶液を用いて実施した。
グルコース測定系を用いた基質阻害の確認
測定原理
ＰＱＱＧＤＨ
Ｄ−グルコース＋フェリシアン化物イオン→
Ｄ−グルコノ−１，５−ラクトン ＋ フェロシアン化物イオン
フェリシアン化物イオンの還元により生じたフェロシアン化物イオンの存在は、分光光度法により波長４２０ｎｍでの吸光度の減少を測定することで確認した。
（２）方法
試薬
Ａ．ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液， ｐＨ６．５：５０ｍＭ（６０ｍＬの水中に懸濁した１．５１ｇのＰＩＰＥＳ（分子量３０２．３６）を、５Ｎ ＮａＯＨに溶解し、２．２ｍｌの１０％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を加える。５Ｎ ＮａＯＨを用いて２５℃でｐＨを６．５±０．０５に調整し、水を加えて１００ｍｌとした。）
Ｂ．フェリシアン化カリウム溶液：５０ｍＭ（０．１６５ｇ フェリシアン化カリウム（分子量３２９．２５）を １０ｍｌ 蒸留水にて溶解した）
Ｃ．ＰＱＱＧＤＨ溶液：８０００U／ｍｌ（約１００ｍｇ ＰＱＱＧＤＨ（東洋紡績社製：ＧＬＤ−３２１）を蒸留水１０ｍｌに溶解した）
サンプル
Ｄ−グルコース溶液：各々１５０，３００，４５０，６００，７５０，９００，１０５０，１２００，１３５０及び１５００ｍＭの各濃度（２７０ｇ Ｄ−グルコース（分子量１８０．１６）／１０００ｍｌＨ２Ｏにて調製した１５００ｍＭグルコース溶液を基準にして、１／１０，２／１０，３／１０，４／１０，５／１０，６／１０，７／１０，８／１０，９／１０水希釈して作成した）
手順
１．遮光ビンに以下の反応混合物を調製し、氷上で貯蔵した（用時調製）
４９．６ｍｌ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５） （Ａ）
４．０ｍｌ フェリシアン化カリウム溶液 （Ｂ）
５．６ｍｌ （Ｃ）
２． ３．０ｍｌの反応混合液を試験管（プラスチック製）に入れ、３７℃で５分間予備加温した。
３． ０．１ｍｌのグルコース溶液を加え、穏やかに混合した。
４． ４２０ｎｍでの水に対する吸光度の減少を３７℃に維持しながら分光光度計で１〜３分間記録し、曲線の初期直線部分からの１分間当たりのΔＯＤを計算した（ΔＯＤテスト）
同時に、グルコース溶液に代えて蒸留水を加えることを除いては同一の方法を実施し、ブランク（ΔＯＤブランク）を測定した。
上記操作を、各１５０ｍＭ〜１５００ｍＭの各濃度のグルコース溶液を用いて実施した。
計算
ΔＯＤ／ｍｉｎ（ΔＯＤテスト− ΔＯＤブランク）を算出することにより、単位時間当たりの吸光度変化を求めた。
グラフの横軸に反応液中のグルコース濃度、縦軸に各グルコース濃度に対応するΔＯＤ／ｍｉｎをプロットする。
図１に示すように、本条件ではグルコース濃度１０ｍＭを上限としてΔＯＤ／ｍｉｎ、すなわち反応速度が伸びず、高値グルコース濃度にいくに従い反応速度が低下することから、基質阻害の影響が確認できる。
ΔＯＤ／ｍｉｎ（ΔＯＤテスト− ΔＯＤブランク）を算出することにより、単位時間当たりの吸光度変化を求めた。
グラフの横軸に反応液中のグルコース濃度、縦軸に各グルコース濃度に対応するΔＯＤ／ｍｉｎをプロットする。
図１に示すように、本条件ではグルコース濃度１０ｍＭを上限としてΔＯＤ／ｍｉｎ、すなわち反応速度が伸びず、高値グルコース濃度にいくに従い反応速度が低下することから、基質阻害の影響が確認できる。
実施例２
グルコース測定系のｐＨ条件を変更することによる基質阻害回避の確認
実施例１の手法に基き、バッファーのｐＨを６．５から５．５に変更して実施した。その他の条件は全て実施例１に従った。
図２に示すように、バッファーのｐＨを中性付近から酸性側へ移行することにより、１０ｍＭで頭打ちとなっていた反応速度が高値グルコース濃度まで伸び続け、４０ｍＭまで上昇することが明らかになった。またその後も同速度を維持し、反応速度低下は認められなかった。また全体として反応速度自体の伸びも認められた。
このように、バッファーのｐＨを中性付近から酸性側へ移行することにより、基質阻害を回避することができることが明らかとなった。
グルコース測定系のｐＨ条件を変更することによる基質阻害回避の確認
実施例１の手法に基き、バッファーのｐＨを６．５から５．５に変更して実施した。その他の条件は全て実施例１に従った。
図２に示すように、バッファーのｐＨを中性付近から酸性側へ移行することにより、１０ｍＭで頭打ちとなっていた反応速度が高値グルコース濃度まで伸び続け、４０ｍＭまで上昇することが明らかになった。またその後も同速度を維持し、反応速度低下は認められなかった。また全体として反応速度自体の伸びも認められた。
このように、バッファーのｐＨを中性付近から酸性側へ移行することにより、基質阻害を回避することができることが明らかとなった。
実施例３
実施例１，２の手法に基き、バッファー種として２−ケトグルタル酸、リンゴ酸、こはく酸、グルタル酸、フマル酸を用いた場合、またグットバッファーであるＭＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＭＯＰＳを用いた場合の確認を実施した。なお、グットバッファーに関しては、それぞれのもつｐＨ緩衝域を参考にし、ＭＯＰＳＯはｐＨ７．０とｐＨ６．５で、またＭＯＰＳはｐＨ７．５とｐＨ６．５で確認を実施した。
図３〜図１８に示すとおり、その他のバッファー種においてもｐＨを酸性側へ移行することにより、基質阻害を低減できることを確認することが出来た。これにより、本効果は特定のバッファー種に限定されることなく、一般的に認められる効果であると言える。
実施例１，２の手法に基き、バッファー種として２−ケトグルタル酸、リンゴ酸、こはく酸、グルタル酸、フマル酸を用いた場合、またグットバッファーであるＭＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＭＯＰＳを用いた場合の確認を実施した。なお、グットバッファーに関しては、それぞれのもつｐＨ緩衝域を参考にし、ＭＯＰＳＯはｐＨ７．０とｐＨ６．５で、またＭＯＰＳはｐＨ７．５とｐＨ６．５で確認を実施した。
図３〜図１８に示すとおり、その他のバッファー種においてもｐＨを酸性側へ移行することにより、基質阻害を低減できることを確認することが出来た。これにより、本効果は特定のバッファー種に限定されることなく、一般的に認められる効果であると言える。
本発明による基質阻害回避は、グルコース測定試薬、グルコースアッセイキット及びグルコースセンサでの高濃度グルコース測定を可能にする。
Claims (8)
- ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素を含む系においてグルコースを測定する方法において、測定反応時のｐＨが酸性であることを特徴とする、グルコース測定における基質阻害を低減する方法
- メディエーターとしてフェリシアン化物イオンを含む、請求項１に記載のグルコース測定方法
- ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素を含み、かつ、測定反応時のｐＨが酸性であることを特徴とする、基質阻害を低減したグルコース測定試薬
- メディエーターとしてフェリシアン化物イオンを含む、請求項３に記載のグルコース測定試薬
- ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素を含み、かつ、測定反応時のｐＨが酸性であることを特徴とする、基質阻害を低減したグルコースアッセイキット
- メディエーターとしてフェリシアン化物イオンを含む、請求項５に記載のグルコースアッセイキット
- ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素を含み、かつ、測定反応時のｐＨが酸性であることを特徴とする、基質阻害を低減したグルコースセンサー
- メディエーターとしてフェリシアン化物イオンを含む、請求項７に記載のグルコースセンサー
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|---|---|---|---|
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|---|---|---|---|
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| Publication Number | Publication Date |
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2005
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2006
- 2006-03-08 WO PCT/JP2006/304440 patent/WO2006095758A1/ja active Application Filing
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