JP4381369B2 - 可溶性補酵素結合型のグルコースデヒドロゲナーゼ（ｇｄｈ）を含む組成物の熱安定性を向上する方法 - Google Patents

Description

本発明は、フラビン化合物を補酵素とするグルコースデヒドロゲナーゼなどの可溶性補酵素結合型のグルコースデヒドロゲナーゼ（本書ではグルコースデヒドロゲナーゼをＧＤＨとも記載する。）を含む組成物の熱安定性を向上する方法および該方法を用いた組成物に関するものである。

血糖自己測定は、糖尿病患者が通常の自分の血糖値を把握し治療に生かすために重要である。血糖自己測定に用いられるセンサにはグルコースを基質とする酵素が利用されている。そのような酵素の例としては例えばグルコースオキシダーゼ（ＥＣ １．１．３．４）が挙げられる。グルコースオキシダーゼはグルコースに対する特異性が高く、熱安定性に優れているという利点を有していることから血糖センサ用酵素として古くから利用されており、その最初の発表は実に４０年ほど前に遡る。グルコースオキシダーゼを利用した血糖センサにおいては、グルコースを酸化してＤ−グルコノ−δ−ラクトンに変換する過程で生じる電子がメディエーターを介して電極に渡されることで測定がなされるが、グルコースオキシダーゼは反応で生じたプロトンを酸素に渡しやすいため溶存酸素が測定値に影響してしまうという問題があった。

このような問題を回避するために、例えばＮＡＤ（Ｐ）依存型グルコースデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．４７）あるいはピロロキノリンキノン（本書ではピロロキノリンキノンをＰＱＱとも記載する。）依存型グルコースデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．５．２（旧ＥＣ１．１．９９．１７））が血糖センサ用酵素として用いられている。これらは溶存酸素の影響を受けない点で優位であるが、前者のＮＡＤ（Ｐ）依存型グルコースデヒドロゲナーゼ（本書ではＮＡＤ（Ｐ）依存型グルコースデヒドロゲナーゼをＮＡＤＧＤＨとも記載する。）は安定性の乏しさや補酵素の添加が必要という煩雑性がある。一方後者のＰＱＱ依存型グルコースデヒドロゲナーゼ（本書ではＰＱＱ依存型グルコースデヒドロゲナーゼをＰＱＱＧＤＨとも記載する。）は、基質特異性に乏しく、マルトースやラクトースといったグルコース以外の糖類にも作用するため測定値の正確性を損ねてしまうという欠点がある。

また、特許文献１にはアスペルギルス属由来フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ（本書ではフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼをＦＡＤＧＤＨとも記載する。）が開示されている。本酵素は基質特異性に優れかつ溶存酸素の影響を受けない点で優位である。熱安定性については５０℃１５分処理で８９％程度の活性残存率であり安定性についても優れているとされている。しかし、センサーチップ作製の工程において加熱処理を要する場合があることを考えれば決して十分な安定性とはいえない。
ＷＯ ２００４／０５８９５８

本発明の目的は、上述のような公知の血糖センサ用酵素の熱安定性に関する欠点を克服して、より実用面において有利な血糖値測定用試薬に使用可能な組成物を提供することである。

本発明者らは、これまでのＰＱＱＧＤＨの研究で、該酵素の基質特異性を改善した多重変異体を多数取得したが、その一部には、野生型ＰＱＱＧＤＨと比べて熱安定性が低減した変異体が見られた。そこで、この課題を解決するため、その原因について鋭意研究したところ、本特許で提示した該酵素にある種の化合物を添加することにより、ＰＱＱＧＤＨの立体構造が安定に維持され安定性が改善できることがわかった。
本発明者らはさらに検討を加え、ＦＡＤＧＤＨ、ＮＡＤＧＤＨについても同様の効果があることを見出し本願発明を完成させた。
これまでＰＱＱＧＤＨの安定性を向上する方策に関する報告としては特許文献２があり、その中では遺伝子レベルでのＰＱＱＧＤＨ改変手段を用いた検討が報告されているが、酵素の改変を用いずに安定性を増大させる手段については、その可能性すら触れられていなかった。
ＷＯ０２／０７２８３９

また、本発明者らは、鋭意研究を実施した結果、フラビン化合物を含有するＧＤＨを含む組成物のｐＨで酸性側ｐＨを保持することにより、該組成物が加熱乾燥可能なレベルの高い熱安定性が得られることを見出した。

加熱乾燥可能なレベルとは、５０℃、１５分処理後の残存活性が１０％以上存在する状態であり、好ましくは４５％以上の残存活性が得られる状態であり、更に好ましくは、７０％以上の残存活性が得られる状態である。

さらに、本発明者らは、過去の方策とは異なる視点から、より簡便な熱安定性の改良策を探ることとし、さらなる鋭意研究を実施した結果、ＧＤＨを含む組成物で酸性側のｐＨを利用して、なおかつ、１種類以上のジカルボン酸、塩化合物を共存させることにより組成物全体の安定性を向上できることを明らかにして、遂に本発明を完成するに到った。

すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
［項１］
ＦＡＤ結合型のグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）を含む組成物において、該酵素と牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を共存させる工程を含む、ＢＳＡを共存させない場合と比べてＧＤＨの熱安定性を向上させる方法。
［項２］
ＢＳＡの終濃度が０．１％以上である項１記載のＧＤＨの熱安定性を向上させる方法。
［項３］
ＦＡＤ結合型のＧＤＨおよびＢＳＡを含む、ＢＳＡを共存させない場合と比べて熱安定性が向上した、ＦＡＤ結合型のＧＤＨを含む組成物。
［項４］
ＢＳＡの終濃度が０．１％以上である項３記載のＧＤＨを含む組成物。
［項５］
項３または４記載の組成物を用いるグルコース濃度の測定方法。
［項６］
項３または４記載の組成物を含むグルコースセンサ。
［項７］
ＦＡＤ結合型のＧＤＨを含む組成物において、該酵素とＢＳＡを共存させる工程を含む、ＢＳＡを共存させない場合と比べてＧＤＨの熱安定性が向上した組成物の製造方法。

本発明による熱安定性の向上は、グルコース測定試薬、グルコースアッセイキット及びグルコースセンサー作製時の酵素の熱失活を低減して、該酵素の使用量低減や測定精度の向上を可能にする。また、保存安定性に優れたＧＤＨを用いた血糖値測定試薬の提供を可能にする。

ＧＤＨは、以下の反応を触媒する酵素である。
Ｄ−グルコース ＋ 電子伝達物質（酸化型）
→ Ｄ−グルコノ−δ−ラクトン ＋ 電子伝達物質（還元型）
Ｄ−グルコースを酸化してＤ−グルコノ−１，５−ラクトンを生成するという反応を触媒する酵素であり、由来や構造に関しては特に限定するものではない。

本発明の方法に適用することができるＧＤＨは、可溶性の補酵素結合型のグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）であれば特に限定されない。
補酵素としては、例えばフラビン化合物をとることができる。

本発明の方法に適用することができる、補酵素としてＦＡＤをとるＧＤＨ（ＦＡＤ結合型ＧＤＨ）としては、特に限定されるものではないが、例えば、真核生物の範疇に属する糸状菌のペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属などの微生物に由来するものが挙げられる。これら微生物菌株は各菌株保存機関より分譲を依頼することにより容易に入手することができる。例えば、ペニシリウム属のペニシリウム・リラシノエキヌラタムは、寄託番号ＮＢＲＣ６２３１として製品評価
技術基盤機構・生物資源部門に登録されている。

本発明の方法に適用することができるＧＤＨは、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する限り、上記に例示されたものにさらに他のアミノ酸残基の一部が欠失または置換されていてもよく、また他のアミノ酸残基が付加されていてもよい。
このような改変は当該技術分野における公知技術を用いて当業者であれば容易に実施することが出来る。例えば、蛋白質に部位特異的変異を導入するために当該蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列を置換または挿入するための種々の方法が、Ｓａｍｂｒｏｏｋら著、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ； Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ 第２版（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記載されている。

例えば、上記のＧＤＨを生産する天然の微生物、あるいは、天然のＧＤＨをコードする遺伝子をそのまま、あるいは、変異させてから、発現用ベクター（多くのものが当該技術分野において知られている。例えばプラスミド。）に挿入し、適当な宿主（多くのものが当該技術分野において知られている。例えば大腸菌。）に形質転換させた形質転換体を培養し、培養液から遠心分離などで菌体を回収した後、菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また、必要に応じてＥＤＴＡなどのキレート剤や界面活性剤等を添加して可溶化し、ＧＤＨを含む水溶性画分を得ることができる。または適当な宿主ベクター系を用いることにより、発現したＧＤＨを直接培養液中に分泌させることが出来る。

上記のようにして得られたＧＤＨ含有溶液を、例えば減圧濃縮、膜濃縮、さらに硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、あるいは親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈殿法により沈殿せしめればよい。また、加熱処理や等電点処理も有効な精製手段である。また、吸着剤あるいはゲルろ過剤などによるゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーを行うことにより、精製されたＧＤＨを得ることができる。該精製酵素標品は、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）的に単一のバンドを示す程度に純化されていることが好ましい。

上記工程と前後して、全ＧＤＨ酵素タンパク質に対するホロ型ＧＤＨの割合を向上させるために、好ましくは２５〜５０℃、より好ましくは３０〜４５℃の加熱処理を行っても良い。

本発明におけるＧＤＨの濃度は特に制約がない。用いる酵素の特性等によって適切な範囲は異なるが、実用上、当該酵素を用いてグルコースを十分な信頼性をもって測定できると当業者が判断できる濃度であればよい。
例えば、本発明におけるＦＡＤＧＤＨの濃度は特に制約がないが、溶液中の場合、好ましくは、０．０１〜１００Ｕ／ｍＬ、さらに好ましくは、０．１〜５０Ｕ／ｍＬ、さらに好ましくは０．２〜１０Ｕ／ｍＬである。粉末あるいは凍結乾燥物中でも同程度の濃度が望ましいが、粉末標品を調製する目的では、１００Ｕ／ｍＬ以上の濃度にすることができる。

上記微生物を培養する培地としては、微生物が生育し、かつ本発明に示すＧＤＨを生産しうるものであれば特に限定されないが、より好適には微生物の生育に必要な炭素源、無機窒素源及び／または有機窒素源を含有するものがよく、さらに好ましくは通気攪拌に適した液体培地であるのがよい。液体培地の場合、炭素源としては例えばグルコース、デキストラン、可溶性デンプン、蔗糖などが、窒素源としては、例えばアンモニウム塩類、硝酸塩類、アミノ酸、コーンスティープリカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、脱脂大豆、バレイショ抽出液などが例示される。また所望により他の栄養素（例えば塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム等の無機塩、ビタミン類等）を含んでいてもよい。

培養方法は、当分野において知られている常法に従う。例えば上記栄養素を含む液体培地に微生物の胞子もしくは生育状態の菌体を植菌し、静置もしくは通気攪拌により菌体を増殖させるが、好ましくは通気攪拌により培養するのがよい。培養液のｐＨは好ましくは５〜９であり、さらに好ましくは６〜８である。温度は通常１４〜４２℃、より好ましくは２０℃〜４０℃で行うのがよい。通常は１４〜１４４時間培養を継続するが、好ましくは各々の培養条件においてＧＤＨの発現量が最大となる時点で培養を終了するのがよい。このような時点を見極める方策としては、培養液のサンプリングを行って培養液中のＧＤＨ活性を測定することでその変化をモニタリングし、経時的なＧＤＨ活性の上昇がなくなった時点をピークとみなして培養停止すればよい。

上記の培養液からＧＤＨを抽出する方法としては、菌体内に蓄積したＧＤＨを回収する場合にあっては遠心分離もしくはろ過等の操作によって菌体のみを集め、この菌体を溶媒、好ましくは水もしくは緩衝液に再懸濁する。再懸濁した菌体は公知の方法により破砕することで菌体中のＧＤＨを溶媒中に抽出することができる。破砕方法としては、溶菌酵素を用いることもでき、また物理的破砕方法を用いてもよい。溶菌酵素としては、真菌細胞壁を消化する能力を有するものであれば特に限定しないが、適用可能な酵素の例としてはシグマ社製「Ｌｙｔｉｃａｓｅ」等が挙げられる。また、物理的破砕の方法としては例えば超音波破砕、ガラスビーズ破砕、フレンチプレス破砕等が挙げられる。破砕処理後の溶液は、遠心分離もしくはろ過により残渣を取り除いてＧＤＨ粗抽出溶液を得ることができる。

また本発明における培養方法としては固体培養によることもできる。好ましくは温度や湿度等を適宜制御の上で小麦等のふすま上に本発明のＧＤＨ生産能を有する真核微生物を生育させる。このとき、培養は静置により行ってもよく、また培養物を攪拌する等して混合してもよい。ＧＤＨの抽出は、培養物に溶媒、このましくは水もしくは緩衝液を加えてＧＤＨを溶解させ、遠心分離もしくはろ過により菌体やふすま等の固形物を取り除くことでなされる。

ＧＤＨの精製は、ＧＤＨ活性の存在する画分に応じて通常使用される種々の分離技術を適宜組み合わせることにより行うことができる。上記ＧＤＨ抽出液から、例えば塩析、溶媒沈殿、透析、限外ろ過、ゲルろ過、非変性ＰＡＧＥ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、イオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、アフィニティークロマト
グラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、等電点電気泳動などの公知の分離方法を適当に選択して行うことができる。

本発明のＧＤＨの熱安定性を向上させる方法の一形態は、可溶性の補酵素結合型のグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）を含む組成物において、（１）該酵素、と、（２）糖アルコール、カルボキシル基含有化合物、アルカリ金属含有化合物、アルカリ土類金属化合物、アンモニウム塩、硫酸塩、タンパク質からなる群より選ばれるいずれか１つ以上の化合物、を共存させる工程を含む。
添加する化合物として好ましいものとして、マンニトール、イノシトール、アラビトール、アドニトール、ガラクチトール、バリン、ヒスチジン、フェニルアラニン、ロイシン、イノシトール、グリセリン酸カルシウム、コハク酸、塩化カリウム、塩化アンモニウム、クエン酸水素二アンモニウム、フマル酸、マロン酸、ピメリン酸、３−３’ジメチルグルタル酸、リジン、フタル酸、マレイン酸、グルタル酸、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、塩化ナトリウム、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）からなる群より選ばれるいずれか１つ以上を挙げることができる。
これらの共存させる各化合物の濃度は特に限定されるものではないが、溶液中の場合、好ましくは、０．００１〜３０重量％、さらに好ましくは、０．０１〜５％、さらに好ましくは０．０１〜１％である。粉末あるいは凍結乾燥物中でも同程度の濃度が望ましいが、粉末あるいは凍結乾燥物中では、溶液中の場合と比べて、更に低濃度の化合物添加で有効性を発揮する傾向にある。
なお、実施例で記載されている化合物の濃度は、ＧＤＨ酵素と共存して保存する時の終濃度である。好ましい組合せとしては、性質が近似する塩化合物中での組合せや、カルボン酸含有化合物同士での組合せなどが挙げられるが、例えば、塩化合物とカルボン酸含有化合物などを組み合わせて、お互いの効果を相補するものが好ましい。
上記形態においてさらに熱安定性を向上させるため、組成物のｐＨをｐＨ７以下の酸性側で保持させることができる。あるいは、コハク酸、マロン酸、グルタル酸、フタル酸、マレイン酸などのジカルボン酸、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、クエン酸三ナトリウム、硫酸アンモニウムなどの塩化合物を含有することができる。

本発明のＧＤＨの熱安定性を向上させる方法の別の一形態は、可溶性の補酵素結合型のグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）を含む組成物において、該組成物のｐＨをｐＨ７以下の酸性側で保持させる工程を含む、該組成物をｐＨ７．３以上にした場合と比べて該組成物の熱安定性を向上させる方法である。
あるいは、本発明のＧＤＨの熱安定性を向上させる方法のさらに別の一形態は、可溶性の補酵素結合型のグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）を含む組成物において、該組成物のｐＨをｐＨ３．１〜７．０に保持させる工程を含む、該組成物をｐＨ７．４にした場合と比べて該組成物の熱安定性を向上させる方法である。
ｐＨは、好ましくは３．１〜７．０、さらに好ましくは４．０〜６．５、さらに好ましくは４．０〜６．０である。
上記の組成物は、４℃で保存した該組成物と比べて、５０℃、１５分処理した場合でも、１０％以上のＧＤＨ活性を残存する。あるいは、フラビン化合物を補酵素とするグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）を含む組成物において、４℃で保存した該組成物と比べて、５０℃、１５分処理した場合でも、４５％以上のＧＤＨ活性を残存する。
上記形態においては、組成物中に、１種類以上のジカルボン酸、塩化合物を含有することが好ましい。ジカルボン酸としてはコハク酸、マロン酸、グルタル酸、フタル酸、マレイン酸、塩化合物としては塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、クエン酸三ナトリウム、硫酸アンモニウムなどが挙げられる。本発明では、これらのうち１種類以上の化合物を含有することができる。
これらの共存させる各化合物の濃度は特に限定されるものではないが、溶液中の場合、好ましくは、１ｍＭ〜１０Ｍ、さらに好ましくは、５ｍＭ〜５Ｍ、さらに好ましくは２０
ｍＭ〜１Ｍである。粉末あるいは凍結乾燥物を作製する場合には、溶液中の場合と同程度の化合物濃度を含有する組成にて乾燥処理を施すことにより同様の効果を持った乾燥標品を取得することができる。
なお、実施例で記載されている化合物の濃度は、ＧＤＨ酵素と共存して保存する時の終濃度である。好ましい組合せとしては、性質が近似する塩化合物中での組合せや、カルボン酸含有化合物同士での組合せなどが挙げられるが、例えば、塩化合物とカルボン酸含有化合物などを組み合わせて、お互いの効果を相補するものが好ましい。
上記形態においてさらに熱安定性を向上させるため、糖アルコール、カルボキシル基含有化合物、アルカリ金属含有化合物、アルカリ土類金属化合物、アンモニウム塩、硫酸塩、タンパク質、例えば、マンニトール、イノシトール、アラビトール、アドニトール、ガラクチトール、バリン、ヒスチジン、フェニルアラニン、ロイシン、イノシトール、グリセリン酸カルシウム、コハク酸、塩化カリウム、塩化アンモニウム、クエン酸水素二アンモニウム、フマル酸、マロン酸、ピメリン酸、３−３’ジメチルグルタル酸、リジン、フタル酸、マレイン酸、グルタル酸、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、塩化ナトリウム、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）などの化合物を含有することができる。

また本発明のＧＤＨを含む組成物は液状で供することもできるが、凍結乾燥、真空乾燥あるいはスプレードライ等により粉末化することができる。このとき、ＧＤＨは緩衝液等に溶解したものを用いることができ、さらに賦形剤あるいは安定化剤として本発明で用いる上記化合物以外の糖・糖アルコール類、アミノ酸、タンパク質、ペプチド等を添加することができる。また、粉末化後さらに造粒することもできる。このような物質の例としては例えばトレハロース・スクロース・ソルビトール・エリスリトール、グリセロール等に代表される糖・糖アルコール類・グルタミン酸・アルギニン等に代表されるアミノ酸、牛血清アルブミン・卵白アルブミンや各種シャペロン等に代表されるタンパク質・ペプチド類等を挙げることができる。

上記に示すＧＤＨの抽出・精製・粉末化、および安定性試験に用いる緩衝液の組成は特に限定しないが、好ましくはｐＨ５〜８の範囲で緩衝能を有するものであればよく、例えばホウ酸、トリス塩酸、リン酸カリウム等の緩衝剤や、ＢＥＳ、Ｂｉｃｉｎｅ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＣＨＥＳ、ＥＰＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＨＥＰＰＳＯ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、ＰＩＰＥＳ、ＰＯＰＳＯ、ＴＡＰＳ、ＴＡＰＳＯ、ＴＥＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅといったグッド緩衝剤が挙げられる。
これらのうち１種のみを適用してもよいし、２種以上を用いてもよい。さらには上記以外を含む１種以上の複合組成であってもよい。
また、これらの添加濃度としては、緩衝能を持つ範囲であれば特に限定されないが、好ましい上限は１００ｍＭ以下、より好ましくは５０ｍＭ以下である。好ましい下限は５ｍＭ以上である。
粉末あるいは凍結乾燥物中においては緩衝剤の含有量は、特に限定されるものではないが、好ましくは０．１％（重量比）以上、特に好ましくは０．１〜３０％（重量比）の範囲で使用される。
これらは、種々の市販の試薬を用いることが出来る。

上記に示す種々の化合物は測定時に添加してもよいし、後記するグルコース測定用試薬、グルコースアッセイキットあるいはグルコースセンサを作製するときに予め含有させておくこともできる。また、ＧＤＨの抽出・精製・粉末化などの各製造工程において工程液に添加することもできる。なお、その際には、液体状態、乾燥状態などの形態は問われず、測定時に機能するようにしておけばよい。

本発明でいう熱安定性の向上とは、ＧＤＨ酵素を含む組成物をある一定の温度で、一定時間熱処理した後、維持されているＧＤＨ酵素の残存率（％）が増大することを意味する
。本願発明では、ほぼ完全に活性が維持される４℃保存のサンプルを１００％として、これと一定温度で一定時間熱処理した後のＧＤＨ溶液の活性値を比較して、その酵素の残存率を算出している。この残存率が該化合物無添加のものと比べて増大していた場合、ＧＤＨの熱安定性が向上したと判断した。

具体的に、安定性が向上しているかどうかの判断は、次のように行った。
後述のＧＤＨ酵素活性の測定方法に記載の活性測定法において、４℃保存した溶液のＧＤＨ活性値（ａ）と、一定温度で一定時間熱処理した後のＧＤＨ活性値（ｂ）を測定し、測定値（ａ）を１００とした場合に対する相対値（（ｂ）／（ａ）×１００）を求めた。この相対値を残存率（％）とした。そして、該化合物の添加の有無を比較して、添加により残存率が増大した場合、熱安定性が向上したと判断した。

本発明の効果は、メディエーターを含む系においてより顕著なものとなる。本発明の方法に適用できるメディエーターは特に限定されないが、フェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）と２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＰＩＰ）との組み合わせ、ＰＭＳとニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）との組み合わせ、ＤＣＰＩＰ単独、フェリシアン化物イオン（化合物としてはフェリシアン化カリウムなど）単独、フェロセン単独などが挙げられる。中でもフェリシアン化物イオン（化合物としてはフェリシアン化カリウムなど）が好ましい。
これらの各メディエーターは感度に様々な違いが存在するために、添加濃度を一律に規定する必要性はないが、一般的には１ｍＭ以上の添加が望ましい。
これらのメディエーターは測定時に添加してもよいし、後記するグルコース測定用試薬、グルコースアッセイキットあるいはグルコースセンサを作製するときに予め含有させておくこともできる。なお、その際には、液体状態、乾燥状態などの形態は問われず、測定時に反応時に解離してイオンの状態になるようにしておけばよい。

本発明においてはさらに必要に応じて種々の成分を共存させることが出来る。例えば、界面活性剤、安定化剤、賦形剤などを添加しても良い。
例えば、グルタミン酸、グルタミンおよびリジンからなる群から選択されるアミノ酸は、１種または２種以上であってもよい。ここにさらに、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、卵白アルブミン（ＯＶＡ）を含有させてもよい。

本発明においては以下の種々の方法によりグルコースを測定することができる。
本発明のグルコース測定用試薬、グルコースアッセイキット、グルコースセンサは、液状（水溶液、懸濁液等）、真空乾燥やスプレードライなどにより粉末化したもの、凍結乾燥など種々の形態をとることができる。乾燥法としては、特に制限されるものではなく常法に従って行えばよい。本発明の酵素を含む組成物は凍結乾燥物に限られず、乾燥物を再溶解した溶液状態であってもよい。
本発明においては以下の種々の方法によりグルコースを測定することができる。

グルコース測定用試薬
本発明のグルコース測定用試薬は、典型的には、ＧＤＨ、緩衝液、メディエーターなど測定に必要な試薬、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液、ならびに使用の指針を含む。本発明のキットは、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。好ましくは本発明のＧＤＨはホロ化した形態で提供されるが、アポ酵素の形態で提供し、使用時にホロ化することもできる。

グルコースアッセイキット
本発明はまた、本発明に従うＧＤＨを含むグルコースアッセイキットを特徴とする。本発明のグルコースアッセイキットは、本発明に従うＧＤＨを少なくとも１回のアッセイに十分な量で含む。典型的には、キットは、本発明のＧＤＨに加えて、アッセイに必要な緩衝液、メディエーター、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液、ならびに使用の指針を含む。本発明に従うＧＤＨは種々の形態で、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。好ましくは本発明のＧＤＨはホロ化した形態で提供されるが、アポ酵素の形態で提供し、使用時にホロ化することもできる。

グルコースセンサ
本発明はまた、本発明に従うＧＤＨを用いるグルコースセンサを特徴とする。電極としては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上に本発明の酵素を固定化する。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどがあり、あるいはメディエーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。好ましくは本発明のＧＤＨはホロ化した形態で電極上に固定化するが、アポ酵素の形態で固定化し、補酵素を別の層としてまたは溶液中で供給することも可能である。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて本発明のＧＤＨをカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングする。

グルコース濃度の測定は、以下のようにして行うことができる。恒温セルに緩衝液を入れ、メディエーターを加えて一定温度に維持する。作用電極として本発明のＧＤＨを固定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。

以下、本発明を実施例に基づきより詳細に説明する。

実施例１：ＦＡＤ依存型ＧＤＨ標品の調製
ＦＡＤ依存型ＧＤＨ生産菌としてＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ亜種とＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｌｉｌａｃｉｎｏｅｃｈｉｎｕｌａｔｕｍ ＮＢＲＣ６２３１（独立行政法人製品評価技術基盤機構より購入）を用い、それぞれのＬ乾標本をポテトデキストロース寒天培地（Ｄｉｆｃｏ製）に植菌し２５℃でインキュベートすることにより復元した。復元させたプレート上の菌糸を寒天ごと回収してフィルター滅菌水に懸濁した。２基の１０Ｌ容ジャーファーメンター中に生産培地（１％麦芽エキス、１．５％大豆ペプチド、０．１％ＭｇＳＯ４・７水和物、２％グルコース、ｐＨ６．５）６Ｌを調製し、１２０℃１５分オートクレーブ滅菌後に上記の菌糸懸濁液をそれぞれ投入、培養を開始した。培養条件は、温度３０℃、通気量２Ｌ／分、攪拌数３８０ｒｐｍで行った。培養開始から６４時間後に培養を停止し、ヌッチェろ過器を用いて吸引ろ過によりろ紙上にそれぞれの菌株の菌体を集めた。培養液５Ｌを分子量１０，０００カットの限外ろ過用中空糸モジュールで１／１０量に濃縮し、濃縮液にそれぞれ硫酸アンモニウムを終濃度が６０％飽和（４５６ｇ／Ｌ）となるように添加、溶解した。続いて日立高速冷却遠心機で８０００ｒｐｍ１５分遠心し残渣を沈殿させたのち、上清をＯｃｔｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに吸着させ、硫酸アンモニウム濃度０．６〜０．０飽和でグラジエント溶出してＧＤＨ活性のある画分を回収した。得られたＧＤＨ溶液を、Ｇ−２５セファロースカラムでゲルろ過を行ってタンパク質画分を回収することで脱塩を行い、脱塩液に０．６飽和相当の硫酸アンモニウムを添加して溶解した。これをＰｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに吸着させ、硫酸アンモニウム濃度０．６〜０．０飽和でグラジエント溶出してＧＤＨ活性のある画分を回収した。さらに、得られたＧＤＨ溶液を、Ｇ−２５セファロースカラムでゲルろ過を行ってタンパク質画分を回収し、取得した精製酵素をＦＡＤ依存型ＧＬＤ評価標品として使用した。

本発明のグルコース測定用組成物、グルコースアッセイキット、グルコースセンサ、あるいはグルコース測定方法に用いるメディエーターは、特に制限されるものではないが、好ましくは、２，６−ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌ−ｉｎｄｏｐｈｅｎｏｌ（略称ＤＣＰＩＰ）、フェロセンあるいはそれらの誘導体（例えばフェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルフェートなど）を用いるのがよい。これらのメディエーターは市販のものを入手することができる。

試験例１：ＦＡＤ依存型ＧＤＨ活性の測定方法
本発明において、ＦＡＤ依存型ＧＤＨの活性測定は以下の条件で行う。
＜試薬＞
５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ緩衝液ｐＨ６．５（０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む）
１４ｍＭ ２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＰＩＰ）溶液
１Ｍ Ｄ−グルコース溶液
上記ＰＩＰＥＳ緩衝液１５．８ｍｌ、ＤＣＰＩＰ溶液０．２ｍｌ、Ｄ―グルコース溶液４ｍｌを混合して反応試薬とする。

＜測定条件＞
反応試薬２．９ｍｌを３７℃で５分間予備加温する。ＧＤＨ溶液０．１ｍｌを添加しゆるやかに混和後、水を対照に３７℃に制御された分光光度計で、６００ｎｍの吸光度変化を５分記録し、直線部分から１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤＴＥＳＴ）を測定する。盲検はＧＤＨ溶液の代わりにＧＤＨを溶解する溶媒を試薬混液に加えて同様に１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤＢＬＡＮＫ）を測定する。これらの値から次の式に従ってＧＤＨ活性を求める。ここでＧＤＨ活性における１単位（Ｕ）とは、濃度２００ｍＭのＤ−グルコース存在下で１分間に１マイクロモルのＤＣＰＩＰを還元する酵素量として定義している。

活性（Ｕ／ｍｌ）＝
｛−（ΔＯＤＴＥＳＴ−ΔＯＤＢＬＡＮＫ）×３．０×希釈倍率｝／｛１６．３×０．１×１．０｝

なお、式中の３．０は反応試薬＋酵素溶液の液量（ｍｌ）、１６．３は本活性測定条件におけるミリモル分子吸光係数（ｃｍ^２／マイクロモル）、０．１は酵素溶液の液量（ｍｌ）、１．０はセルの光路長（ｃｍ）を示す。

３種類の異なる補酵素を利用するＧＤＨは、各々、異なる条件で熱安定性の向上を検討している。例えば、以下の実施例２において、ＦＡＤＧＤＨでは、ｐＨ７．２の緩衝液で５Ｕ／ｍｌに調製した酵素液を５０℃または５５℃で、１５〜３０分間熱処理した後、残存するＦＡＤＧＤＨ活性を比較して、熱安定性の向上を確認した。

また、以下の実施例３および４においては、５０ｍＭの各種緩衝液で調製した酵素液組成物（０．４〜５．１Ｕ／ｍｌ）のｐＨを実測した後、５０℃、１５分間、または、５０℃、３０分間、または、５５℃、１５分間、または、５５℃、３０分間の熱処理を行い、ＧＤＨ活性を測定して活性残存率（％）を算出した。この活性残存率を比較することにより、熱安定性の向上を確認した。

実施例２：グルコース測定系を用いた熱安定性の確認
検討は、先述の試験例１のＦＡＤＧＤＨ活性の測定方法に準じて行った。
まず、実施例１で所得したＦＡＤＧＬＤを約１０Ｕ／ｍｌになるように酵素希釈液（５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２））にて溶解したものを５０ｍｌ用意した。この酵素溶液０．５ｍｌに、１％，０．５％のＢＳＡを０．５ｍｌ添加して、合計容量を１．０ｍｌとしたものを２本用意した。また、表２、３に記載の各２倍濃度のコハク酸、マロン酸、フタル酸、マレイン酸、グルタル酸、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、クエン酸三ナトリウム、硫酸アンモニウムを用意して、同様に０．５ｍｌ添加して、合計容量を１．０ｍｌとしたものを２本用意した。コントロールには、各種化合物の代わりに蒸留水０．１ｍｌを添加したものを２本用意した。
２本のうち、１本は４℃で保存し、もう１本は、５０℃、３０分間処理を施した。処理後、各サンプルを酵素希釈液にて２１倍希釈した後、ＦＡＤＧＤＨ活性を測定した。各々、４℃で保存したものの酵素活性を１００として、５０℃、１時間処理後の活性値を比較して活性残存率（％）として算出した。
これらの検討の結果、タンパク質性の安定化剤（ＢＳＡ）を添加することにより、ＦＡＤ−ＧＬＤの熱安定性が増大することが明らかとなった（表１）。また、各種ジカルボン酸化合物あるいは各種塩化合物の添加でＦＡＤ−ＧＬＤの熱安定性の向上効果が見られ、ジカルボン酸化合物の中ではコハク酸、マロン酸が、塩化合物の中では硫酸ナトリウムが最大の効果が見られた（表２、３）。コハク酸、マロン酸、硫酸ナトリウムにおいては、数モル程度の添加でも安定性向上効果が見られるものと思われる。また、塩化ナトリウムのような単純な塩化合物でも十分な効果が見られていることから、ＦＡＤ−ＧＬＤにおいては、単純にイオン強度を上げるだけで熱安定化することがはじめて見出された。
表１は、タンパク質性の安定化剤を共存させたＦＡＤＧＤＨ組成物の５０℃，３０分間処理後のＦＡＤＧＤＨ活性の残存率（％）を示す。
表２は、ジカルボン酸化合物を共存させたＦＡＤＧＤＨ組成物の５０℃，３０分間処理後のＦＡＤＧＤＨ活性の残存率（％）を示す。
表３は、塩化合物を共存させたＦＡＤＧＤＨ組成物の５０℃，１５分間処理後のＦＡＤＧＤＨ活性の残存率（％）を示す。

実施例３：酸性側のｐＨを保持させたＧＤＨ組成物の熱安定性の向上効果の検討
検討は、先述の試験例１のＦＡＤＧＤＨ活性の測定方法に準じて行った。
まず、実施例１で所得した２種類のＦＡＤＧＤＨをそれぞれ約１０Ｕ／ｍｌになるように酵素希釈液（５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５））にて溶解したものを１０ｍｌ用意した。この酵素溶液０．２ｍｌに、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ４．３）、または、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ５．６）、または、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を１．８ｍｌ添加して、合計容量を２．０ｍｌにした。それぞれの酵素溶液のｐＨを実測したところ、ｐＨ５．６、６．０、７．２付近に変動していた。１ｍｌずつ分注したものを２本用意して、１本は４℃で保存し、もう１本は、５０℃にて熱処理を施した。処理後、各サンプルを酵素希釈液にて２倍希釈した後、ＦＡＤＧＤＨ活性を測定した。各々、４℃で保存したものの酵素活性を１００％として、５０℃、１５分間あるいは３０分間処理後の活性値を比較してＧＤＨ活性残存率（％）を算出した。
これらの検討の結果、ＧＤＨ含有組成物のｐＨを酸性側で保持するとＦＡＤＧＬＤ含有組成物の熱安定性が増大することが明らかとなった（表４）。
更に、細かくｐＨ条件を検討するため、先の方法と同様に、表５記載の各種バッファーにて酵素液を１０倍希釈して、実測ｐＨを確認した後に５０℃、１５分間熱処理を行い、ＧＤＨ活性を測定して、その残存率（％）を算出した。
その結果、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ亜種とＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｌｉｌａｃｉｎｏｅｃｈｉｎｕｌａｔｕｍ ＮＢＲＣ６２３１株のいずれの由来のＦＡＤＧＬＤを含有する組成物でも、ｐＨ３．１４ 〜 ６．９７の範囲でｐＨ７．４付近の場合と比べて、熱安定性が向上することが明らかになった（表５、図１、図２）。
ＧＤＨ組成物の汎用用途であるグルコースセンサのセンサチップ作製時には、加熱乾燥する工程があり、ＦＡＤＧＤＨ含有組成物を酸性側で維持することにより該組成物自体の安定性を向上させることは、ＦＡＤＧＤＨを用いたセンサチップ製品の安定性、測定精度を高める上で、非常に重要である。

実施例４：酸性側のｐＨを保持させたＧＤＨ組成物に１種類以上の塩化合物あるいはジカルボン酸を共存させることにより得られる該組成物の熱安定性向上効果の検討
検討は、先述の試験例１のＦＡＤＧＤＨ活性の測定方法に準じて行った。
まず、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）にて、硫酸ナトリウム、クエン酸三ナトリウム、硫酸アンモニウムを、それぞれ１Ｍとなるように溶解した各種化合物溶液を作製した。また、実施例１で所得した２種類のＦＡＤＧＤＨをそれぞれ約１０Ｕ／ｍｌになるように酵素希釈液（５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５））にて溶解したものを２０ｍｌ用意した。４種類の化合物溶液のそれぞれに、２種類のＦＡＤＧＤＨを１：１で混合した８種類の酵素液サンプル（２ｍｌ）を用意した。また、化合物溶液を添加しないコントロールとして、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液にてｐＨ６．２５、６．６５付近に調製したコントロール酵素液サンプルも用意した。それぞれの酵素液サンプルの実測ｐＨを測定して程近いｐＨが維持されていることを確認した。酵素液サンプルを１ｍｌずつ分注したものを２本用意して、１本は４℃で保存し、もう１本は、５５℃、３０分間熱処理を施した。処理後、各サンプルを酵素希釈液にて１０倍希釈した後、ＦＡＤＧＤＨ活性を測定した。各々、４℃で保存したものの酵素活性を１００％として、５５℃、３０分間処理後の活性値を比較してＧＤＨ活性残存率（％）を算出した。
これらの検討の結果、ＧＤＨ含有組成物のｐＨを酸性側で保持し、なおかつ、硫酸ナトリウム、クエン酸三ナトリウム、硫酸アンモニウムなどの塩化合物を添加することにより、ｐＨを酸性側に保持したコントロール酵素液サンプル以上の熱安定性が得られることが明らかになった（表６）。
次に、先の２種類のＦＡＤＧＤＨをコハク酸バッファーにてｐＨ５．３に調製した酵素液サンプル（５Ｕ／ｍｌ）に、等量の２Ｍ塩化ナトリウム、または、１Ｍ硫酸ナトリウム、または、１Ｍクエン酸三ナトリウム、または、１Ｍ硫酸アンモニウムを添加して、８種類の酵素液サンプル（２ｍｌ）を用意した。また、化合物溶液を添加しないコントロールとして、５０ｍＭコハク酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．３）にて２倍希釈したコントロール酵素液サンプルも用意した。それぞれの酵素液サンプルの実測ｐＨを測定して、コントロールに程近いｐＨが維持されていることを確認した。酵素液サンプルを１ｍｌずつ分注したものを２本用意して、１本は４℃で保存し、もう１本は、５５℃、３０分間熱処理を施した。処理後、各サンプルを酵素希釈液にて５倍希釈した後、ＦＡＤＧＤＨ活性を測定した。各々、４℃で保存したものの酵素活性を１００％として、５５℃、３０分間処理後の活性値を比較してＧＤＨ活性残存率（％）を算出した。
これらの検討の結果、ｐＨ５前後の低いｐＨにおいても、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、クエン酸三ナトリウム、硫酸アンモニウムなどの塩化合物を添加することにより熱安定性が向上できることを確認できた。塩化ナトリウムのようなあまり特徴のない化合物においても添加効果が認められたことは、広く塩化合物全般において、それらを共存させることにより、ＦＡＤＧＤＨ組成物の熱安定性を向上させることができるものと推測する（表７）。
また、コハク酸バッファーを使用した時に、リン酸カリウムバッファーをベースとした場合よりも熱安定性が向上する傾向が見られていたことから、コハク酸バッファーが含まれるジカルボン酸化合物が、先の塩化合物と同じく、熱安定性を向上させる効果があるものと推測した。そこで、ＧＤＨ含有組成物のｐＨを酸性側で保持し、なおかつ、ジカルボン酸化合物を添加することにより、熱安定性が変動するか検討した。
まず、ベースバッファーとして、１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）と１００ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ５．６）を準備した。また、実施例１で所得した２種類のＦＡＤＧＤＨをそれぞれ約１０Ｕ／ｍｌになるように酵素希釈液（５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５））にて溶解したものを２０ｍｌ用意した。次に、０．４Ｍコハク酸（ｐＨ７．０にＮａＯＨで調整）、０．４Ｍマロン酸（ｐＨ７．０にＮａＯＨで調整）、０．４Ｍグルタル酸（ｐＨ７．０にＮａＯＨで調整）を調製した。
ベースバッファー０．８ｍｌと酵素液（１０Ｕ／ｍｌ）０．２ｍｌを混合させた後、各種ジカルボン酸化合物１ｍｌを添加して、それぞれのｐＨを実測した。また、化合物溶液を添加しないコントロールとして、ジカルボン酸化合物の代わりに蒸留水を添加して、各サンプルのｐＨ実測値付近に調整したものを準備した。酵素液サンプルを１ｍｌずつ分注したものを２本用意して、１本は４℃で保存し、もう１本は、５５℃にて熱処理を施した。処理後、各サンプルを酵素希釈液にて２倍希釈した後、ＦＡＤＧＤＨ活性を測定した。各々、４℃で保存したものの酵素活性を１００％として、５５℃、１５分間または３０分間処理後の活性値を比較してＧＤＨ活性残存率（％）を算出した。
これらの検討の結果、ｐＨ５．５あるいは６．０前後のｐＨにおいて、コハク酸、マロン酸、グルタル酸などのジカルボン酸化合物を添加することにより熱安定性が向上できることを確認できた。以上の結果から、広くジカルボン酸化合物全般において、それらを共存させることにより、ＦＡＤＧＤＨ組成物の熱安定性を向上させることができるものと推測する（表８）

本発明による熱安定性の改良は、グルコース測定試薬、グルコースアッセイキット及びグルコースセンサの保存安定性、測定精度を向上することができる。

Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ亜種に由来するＦＡＤＧＤＨの熱安定性のｐＨ依存性 Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｌｉｌａｃｉｎｏｅｃｈｉｎｕｌａｔｕｍ ＮＢＲＣ６２３１株に由来するＦＡＤＧＤＨの熱安定性のｐＨ依存性

Claims (9)

1. Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属の微生物由来のＦＡＤ結合型のグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）を含む組成物において、該酵素と牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を共存させる工程を含む、ＢＳＡを共存させない場合と比べてＧＤＨの熱安定性を向上させる方法。
2. Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属の微生物がＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓである請求項１に記載の方法。
3. ＢＳＡの終濃度が０．１％以上である請求項１または２に記載の方法。
4. Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属の微生物由来のＦＡＤ結合型のＧＤＨおよびＢＳＡを含む、ＢＳＡを共存させない場合と比べて熱安定性が向上した、ＦＡＤ結合型のＧＤＨを含む組成物。
5. Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属の微生物がＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓである請求項４に記載の組成物。
6. ＢＳＡの終濃度が０．１％以上である請求項４または５に記載の組成物。
7. 請求項４〜６のいずれかに記載の組成物を用いるグルコース濃度の測定方法。
8. 請求項４〜６のいずれかに記載の組成物を含むグルコースセンサ。
9. Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属の微生物由来のＦＡＤ結合型のＧＤＨを含む組成物において、該酵素とＢＳＡを共存させる工程を含む、ＢＳＡを共存させない場合と比べてＧＤＨの熱安定性が向上した組成物の製造方法。