KR20230078697A - 플라빈 의존성 락트산 데히드로게나제를 포함하는 조성물의 안정성을 향상시키는 방법 - Google Patents

플라빈 의존성 락트산 데히드로게나제를 포함하는 조성물의 안정성을 향상시키는 방법 Download PDF

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Abstract

플라빈 의존성 락트산 데하이드로게나제(LDH)를 포함하는 조성물의 열안정성을 향상시키는 방법을 제공한다.
LDH를 포함하는 조성물에서, 모노카르복실산, 디카르복실산, 트리카르복실산, 테트라카르복실산, 폴리카르복실산, 인산, 황산 또는 이들의 염으로 이루어진 군으로부터 선택된 음이온, 단당, 이당, 비이온성 폴리머, 이온성 폴리머를 1종 이상 공존시킨다.
락트산 측정 시약, 락트산 어세이 키트, 락트산 센서, 연료 전지 제작시 및 보존시에서의 LDH의 실활을 저감할 수 있어, LDH의 사용량을 저감할 수 있음과 동시에 측정 시약, 어세이 키트, 센서의 열안정성이나 보존 안정성의 향상 및 측정 정밀도의 향상이 가능해진다.

Description

플라빈 의존성 락트산 데히드로게나제를 포함하는 조성물의 안정성을 향상시키는 방법
본 개시내용은 플라빈 의존성 데히드로게나제를 포함하는 조성물의 안정성을 향상시키는 방법 및 상기 방법을 사용하여 수득된 조성물에 관한 것이다.
혈중 락트산 농도와 땀 중에서의 락트산 농도는 피로와 신체 상태를 반영하는 마커로 알려져 있다. 락트산은 주요 대사 산물이며 건강 관리의 지표일 뿐만 아니라 심각한 질병 및/또는 수술 환자를 포함하는 건강 평가에 있어서 중요하다고 인식되고 있으며, 체액 중의 락트산 값은 순환 부전, 간 장애와 같은 다양한 병태에 대한 지표가 될 수 있다. 락트산 모니터링은 패혈증, 저산소증, 및 암 조직의 존재를 검출하기 위해 사용될 수 있다(비특허문헌 1).
질병 상태의 사람에 한정되지 않는 컨디션 관리의 목적에 관해서도, 스포츠 선수나 일상적으로 운동하는 것에 관심이 높은 사람이 행하는 트레이닝의 적절성을 모니터링하기 위한 한 지표로서, 락트산 모니터링이 행해지고 있다(비특허문헌 2).
또한, 락트산을 기질로 하는 효소로서는 플라빈 의존성 락트산 데히드로게나제(이하, LDH)가 알려져 있다. 비특허문헌 3에는 지금까지 알려져 있는 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) 유래 LDH는 안정성에 과제가 있다는 것이 기재되어 있다. 또한, 락트산 데히드로게나제에는 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 의존성 락트산 데히드로게나제도 알려져 있지만, 이것은 플라빈 의존성 락트산 데히드로게나제(LDH)에 포함되지 않는다. 따라서, 본 명세서에서 플라빈 의존성 락트산 데히드로게나제, 혹은 LDH인 경우, 특별히 달리 언급하지 않는 한, 이것은 니코틴아미드 의존성 락트산 데히드로게나제를 포함하지 않는 것으로 한다.
[비특허문헌 1] 일본판 패혈증 진료 가이드 라인 2016, PNAS September 15, 2015, 112 (37), 11642-11647 [비특허문헌 2] 스포츠 성능 연구, 3, 31-48, 2011 [비특허문헌 3] Methods Enzymol. , 53,238-56,1978
본 개시내용은 LDH를 포함하는 조성물의 안정성을 향상시키는 방법 및 상기 방법을 사용하여 얻을 수 있는 충분한 안정성을 갖는 락트산 측정용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한, 특정 실시형태에 있어서 본 개시내용은 LDH를 전극에 도포할 때의, 락트산 데히드로게나제의 활성 저하 또는 실활을 억제하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 과제를 해결하기 위해서, 본 개시자들은 예의 검토를 거듭한 결과, LDH를 포함하는 조성물에 다양한 화합물을 공존시킴으로써 LDH의 안정성이 향상되는 것을 발견하고, 또한 전극에 도포하는 LDH의 실활을 억제할 수 있는 것을 발견하고, 이들 실시형태를 포함하는 본 개시를 완성하였다.
즉, 본 발명은 이하의 실시형태를 제공한다.
[1] 플라빈 화합물을 보조효소로 하는 락트산 데히드로게나제를 포함하는 조성물에 모노카르복실산, 디카르복실산, 트리카르복실산, 테트라카르복실산, 폴리카르복실산, 인산, 황산 또는 이들의 염(황산암모늄을 제외함)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 음이온, 단당, 이당, 폴리에틸렌글리콜, 혹은 이온성 폴리머를 1종 이상 공존시키는 공정을 포함하는 락트산 데히드로게나제 함유 조성물의 열안정성을 향상시키는 방법.
[2] 락트산 데히드로게나제가 사카로마이세스속, 피키아속, 칸디다속, 오가타에아속, 브레타노마이세스속, 시베르린드넬라속, 한세니아스포라속, 카자투타니아속, 클루이베로마이세스속, 라찬세아속, 나우모보지마속, 테트라피시스포라속, 토루라스포라속, 반데르발트지마속, 자이고사카로마이세스속, 자이고토루라스포라속, 마이셀리오프토라속, 써모세로마이세스속, 카에토뮴속, 또는 마두렐라속 유래의 락트산 데히드로게나제인, [1]에 기재된 방법.
[3] 락트산 데히드로게나제가 이하의 (i) 및/또는 (ii)인, [1]에 기재된 락트산 데히드로게나제 함유 조성물의 열안정성을 향상시키는 방법:
(i) 서열번호 1, 서열번호 4, 서열번호 7, 또는 서열번호 10에 나타내는 아미노산 서열과의 동일성이 70% 이상 또는 80% 이상의 아미노산 서열을 갖는 락트산 데히드로게나제,
(ii) 서열번호 4의 제138~140위, 186~194위, 217~222위, 243~245위, 271~278위, 280~283위, 355~367위, 398~401위, 403~401위, 403~406위 및 425~433위의 아미노산 서열로 이루어진 상동성 영역에서의 아미노산 서열과 해당 락트산 데히드로게나제의 대응하는 위치의 상동성 영역에서의 아미노산 서열이 80% 이상 또는 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 락트산 데히드로게나제.
[4] 모노카르복실산은 글루콘산, 류신산, 3-페닐락트산, 글리신, 라이신, 히스티딘 및 아르기닌으로 이루어진 군으로부터 선택되고,
디카르복실산이 말산, 숙신산, 말레산, 푸마르산, 말론산, 메틸말론산, 옥살로아세트산, 타르타르산, 옥살산, 숙신산, 글루타르산, α-케토글루타르산, 아디프산, 피메르산, 수베르산, 아젤라산, 세바스산, 프탈산, 이소프탈산, 테레프탈산, 글루타콘산, 타르트론산, 무콘산, 메사콘산, 시트라콘산, 메콘산, 3-3' 디메틸글루타르산, 이타콘산, 글루탐산, 아스파라르트산, 및 3-히드록시아스파라긴으로 이루어진 군으로부터 선택되고,
트리카르복실산은 시트르산, 이소시트르산, 아코니트산, 트리메신산, 1,2,3-프로판트리카르복실산, 및 2-포스포노부탄-1,2,4-트리카르복실산으로 이루어진 군으로부터 선택되고,
테트라카르복실산은 에틸렌디아민 테트라아세트산으로부터 선택되고,
인산은 인산염 및 피로인산염으로 이루어진 군에서 선택되고,
황산이 황산염으로부터 선택되고,
단당은 myo-이노시톨로 이루어진 군으로부터 선택되고,
이당은 수크로오스, 트레할로스, 및 말토오스로 이루어진 군으로부터 선택되거고, 또는 폴리에틸렌글리콜,
또는
이온성 폴리머가 음이온성 폴리머이거나, 또는 양이온성 폴리머이고,
음이온성 폴리머가 폴리아크릴산, 히알루론산, 및 카르복시메틸셀룰로오스 혹은 이들의 염으로 이루어지는 군으로부터 선택되거나, 혹은
양이온성 폴리머가 폴리라이신, 폴리에틸렌이민, 메틸글리콜 키토산 및 폴리 (염화디알릴디메틸암모늄)으로부터 선택되는, [1]~[3] 중 어느 하나에 기재된 락트산 데히드로게나제 함유 조성물의 열안정성을 향상시키는 방법.
[5] 모노카르복실산, 디카르복실산, 트리카르복실산, 테트라카르복실산, 폴리카르복실산, 인산, 황산 또는 이들의 염으로 이루어진 군으로부터 선택된 음이온, 단당, 이당, 음이온성 폴리머 또는 양이온성 폴리머가 용액 중에서 0.01 중량% 내지 30 중량%의 범위로 포함되는, [1]~[4] 중 어느 하나에 기재된 락트산 데히드로게나제 함유 조성물의 열안정성을 향상시키는 방법.
[6] 플라빈 화합물을 보조효소로 하는 락트산 데히드로게나제 및 모노카르복실산, 디카르복실산, 트리카르복실산, 테트라카르복실산, 폴리카르복실산, 인산, 황산 또는 이들의 염(황산암모늄을 제외함)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 음이온, 단당, 이당, 폴리에틸렌글리콜, 이온성 폴리머 중 어느 한 종류 이상의 화합물을 포함하는 락트산 측정용 조성물.
[7] 락트산 데히드로게나제가 사카로마이세스속, 피키아속, 칸디다속, 오가타에아속, 브레타노마이세스속, 시베르린드넬라속, 한세니아스포라속, 카자투타니아속, 클루이베로마이세스속, 라찬세아속, 나우모보지마속, 테트라피시스포라속, 토루라스포라속, 반데르발트지마속, 자이고사카로마이세스속, 자이고토루라스포라속, 마이셀리오프토라속, 써모세로마이세스속, 카에토뮴속, 또는 마두렐라속 유래의 락트산 데히드로게나제인, [6]에 기재된 락트산 측정용 조성물.
[8] 락트산 데히드로게나제가 이하 (i) 및/또는 (ii)인, [6]에 기재된 조성물:
(i) 서열번호 1, 서열번호 4, 서열번호 7, 또는 서열번호 10에 나타내는 아미노산 서열과의 동일성이 70% 이상 또는 80% 이상의 아미노산 서열을 갖는 락트산 데히드로게나제,
(ii) 서열번호 4의 제138~140위, 186~194위, 217~222위, 243~245위, 271~278위, 280~283위, 355~367위, 398~401위, 403~401위, 403~406위 및 425~433위의 아미노산 서열로 이루어진 상동성 영역에서의 아미노산 서열과 해당 락트산 데히드로게나제의 대응하는 위치의 상동성 영역에서의 아미노산 서열이 80% 이상 또는 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 락트산 데히드로게나제.
[9] 모노카르복실산은 글루콘산, 류신산, 3-페닐락트산, 글리신, 라이신, 히스티딘 및 아르기닌으로 이루어진 군으로부터 선택되고,
디카르복실산이 말산, 숙신산, 말레산, 푸마르산, 말론산, 메틸말론산, 옥살로아세트산, 타르타르산, 옥살산, 숙신산, 글루타르산, α-케토글루타르산, 아디프산, 피메르산, 수베르산, 아젤라산, 세바스산, 프탈산, 이소프탈산, 테레프탈산, 글루타콘산, 타르트론산, 무콘산, 메사콘산, 시트라콘산, 메콘산, 3-3' 디메틸글루타르산, 이타콘산, 글루탐산, 아스파르트산, 및 3-히드록시아스파라긴으로 이루어진 군으로부터 선택되고,
트리카르복실산은 시트르산, 이소시트르산, 아코니트산, 트리메신산, 1,2,3-프로판트리카르복실산, 및 2-포스포노부탄-1,2,4-트리카르복실산으로 이루어진 군으로부터 선택되고,
테트라카르복실산은 에틸렌디아민 테트라아세트산으로부터 선택되고,
인산은 인산염 및 피로인산염으로 이루어진 군에서 선택되고,
황산이 황산염으로부터 선택되고,
단당은 myo-이노시톨로 이루어진 군으로부터 선택되고,
이당은 수크로오스, 트레할로스, 및 말토오스로 이루어진 군으로부터 선택되거고, 또는
폴리에틸렌글리콜,
또는
이온성 폴리머가 음이온성 폴리머이거나, 또는 양이온성 폴리머이고,
음이온성 폴리머가 폴리아크릴산, 히알루론산, 및 카르복시메틸셀룰로오스 혹은 이들의 염으로 이루어지는 군으로부터 선택되고,
양이온성 폴리머가 폴리라이신, 폴리에틸렌이민, 메틸글리콜 키토산 및 폴리 (염화디알릴디메틸암모늄)으로부터 선택되는, [6]~[8] 중 어느 하나에 기재된 락트산 측정용 조성물.
[10] 모노카르복실산, 디카르복실산, 트리카르복실산, 테트라카르복실산, 폴리카르복실산, 인산, 황산 또는 이들 염(황산암모늄을 제외함)으로 이루어진 군으로부터 선택된 음이온, 단당, 이당, 폴리에틸렌글리콜 혹은 음이온성 폴리머 또는 양이온성 폴리머가 용액 중에서 0.01 중량% 내지 30 중량%의 범위로 포함되는, [6]~[9] 중 어느 하나에 기재된 락트산 측정 용 조성물.
[11] [6]~[10] 중 어느 한 하나에 기재된 조성물을 포함하는 락트산 측정용 키트.
[12] 플라빈 화합물을 보조효소로 하는 락트산 데히드로게나제 및, 모노카르복실산, 디카르복실산, 트리카르복실산, 테트라카르복실산, 폴리카르복실산, 인산, 황산 또는 이들의 염으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 음이온, 단당, 이당, 폴리에틸렌글리콜, 이온성 폴리머 중 어느 한 종류 이상의 화합물을 포함하는 조성물을 포함하는 전극.
[13] [12]에 기재된 전극을 포함하는 락트산 센서.
[14] [12]에 기재된 전극을 포함하는 연료 전지.
[15] 락트산 데히드로게나제를 전극에 도포하는 공정을 포함하는 전극의 제조 방법에 있어서, 락트산 데히드로게나제의 활성 저하 또는 실활을 억제하는 방법으로서,
i) 락트산 데하이드로게나제를 포함하는 용액을 준비하는 공정,
ii) 상기 용액에 모노카르복실산, 디카르복실산, 트리카르복실산, 테트라카르복실산, 폴리카르복실산, 인산, 황산 또는 이들의 염으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 음이온, 단당, 이당, 폴리에틸렌글리콜, 이온성 폴리머로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상의 안정화제를 첨가하는 공정,
iii) 상기 락트산 데하이드로게나제 및 상기 안정화제를 포함하는 용액을 전극에 도포하는 공정,
iv) 도포한 상기 용액을 건조시키는 공정
을 포함하는 상기 방법.
[16] 락트산 데히드로게나제를 도포한 전극이 락트산 센서에 포함되는, [15]에 기재된 제조 방법.
본 명세서는 본원의 우선권의 기초가 되는 일본 특허출원번호 2020-163631호의 개시 내용을 포함한다.
본 개시내용에 의하여, 락트산 측정 시약, 락트산 분석 키트 및 락트산 센서 제작시 및 보존시에 있어서의 LDH의 실활을 저감할 수 있고, 그에 의해 제조에 필요한 LDH의 사용량을 저감할 수 있음과 함께, 제품으로서 완성된 시약이나 키트, 센서 등의 보존 안정성 및 측정 정밀도를 향상시킬 수 있다.
도 1은 락트산 데히드로게나제의 데히드로게나제 반응의 일 양태를 나타내는 도면이다.
본 개시내용은 임의의 LDH에 대해 임의의 첨가 성분을 공존시킴으로써 LDH 함유 조성물의 열안정성을 향상시킬 수 있다는 것을 특징으로한다. LDH 자체를 개변하여 열안정성을 향상시키는 시도는 알려져 있지 않고, 또한, LDH에 대하여 효과적인 열안정성 향상제나, 조성물로서 열안정성이 향상되어 있는 LDH 함유 조성물의 지견은 부족했다. 어떤 실시형태에서, 본 개시내용은 LDH를 포함하는 조성물의 안정성을 향상시키는 방법을 제공한다. 본 개시내용의 LDH를 포함하는 조성물의 안정성을 향상시키기 위해 첨가하는 화합물로서 음이온 또는 당, 이온성 폴리머가 유효하다는 것을 발견하였다. 즉, 본 개시내용은 어떤 실시형태에서 LDH를 포함하는 조성물의 안정성을 향상시키는 안정화제를 제공한다. LDH를 포함하는 조성물의 안정성을 향상시키는 안정화제는 음이온, 당 및/또는 이온성(양이온성, 음이온성, 쌍성 이온) 폴리머를 포함할 수 있다.
본 개시의 음이온으로서는 본 개시의 LDH 함유 조성물의 열안정성을 향상시키는 것이면 특별히 제한은 없고, 예를 들면, 카르복실기 함유 화합물, 할로겐 화합물, 인산염, 질산염, 황산염, 단백질, 펩티드, 아미노산 등을 들 수 있다. 카르복실기 함유 화합물로서는 모노카르복실산, 디카르복실산, 트리카르복실산, 테트라카르복실산, 폴리카르복실산 화합물 등을 들 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 특히, 본 발명에 사용되는 바람직한 음이온은 하나 이상의 디카르복실산 또는 트리카르복실산, 테트라카르복실산, 폴리카르복실산 또는 이들의 염이지만, 이에 한정되지 않는다. 비이온성 폴리머로서 폴리에틸렌 글리콜이 있을 수 있다. 이온성 폴리머로서 양이온성 폴리머, 음이온성 폴리머 또는 쌍성 이온성 폴리머가 있을 수 있다. 양이온성 폴리머는 폴리라이신, 폴리에틸렌이민, 메틸글리콜키토산, 및 폴리(염화디알릴디메틸암모늄) 등을 들 수 있지만 이에 한정되지 않는다. 음이온성 폴리머로서는 히알루론산, 셀룰로오스 유도체(예를 들면, 카르복시메틸셀룰로오스), 폴리아크릴산 유도체(예를 들면, 폴리아크릴산)), 폴리메타크릴산 유도체(예를 들면, 폴리메타크릴산메틸이나 폴리메타크릴산히드록시메틸) 등을 들 수 있지만 이것에 한정되지 않는다. 쌍성 이온 폴리머로서는 예를 들면 일본 공개특허공보 2017-527669호 기재의 폴리(카르복시베타인메타크릴레이트) 등을 들 수 있지만, 이것에 한정되지 않는다. 특정 실시형태에서, LDH를 포함하는 조성물의 안정성을 향상시키기 위해 첨가되는 화합물을 LDH 안정화제, 혹은 단순한 안정화제로 표현할 수 있다. 다만, 이것은 LDH 안정화제가 다른 화합물을 포함하는 것을 방해하지 않는다. 즉, 별도의 실시형태에서는 LDH를 포함하는 조성물의 안정성을 향상시키기 위해 첨가되는 안정화제는 LDH를 안정화시키는 화합물을 포함한다. 또한, 안정화제는 다른 화합물을 포함할 수 있다. 본 개시내용의 조성물과 관련하여, 특정 실시형태에서는 황산염으로부터 황산암모늄, 특히 50 중량% 이상의 황산암모늄이 제거된다.
어떤 실시형태에서, 본 개시내용에서 사용하는 모노카르복실산은 본 개시내용의 LDH를 포함하는 조성물의 안정성을 향상시키는 것이라면 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어 글루콘산, 류신산, 3-페닐락트산, 글리신, 아르기닌, 라이신, 히스티딘이 바람직한 모노카르복실산으로서 예시된다. 어떤 실시형태에서, 본 개시내용에 사용되는 모노카르복실산은 주쇄 탄소수가 7 이하일 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 발명에 사용하는 바람직한 디카르복실산은 말산, 숙신산, 말레산, 푸마르산, 말론산, 메틸말론산, 옥살로아세트산, 타르타르산, 옥살산, 숙신산, 글루타르산, α-케토글루타르산, 아디프산, 피메르산, 수베르산, 아젤라산, 세바스산, 프탈산, 이소프탈산, 테레프탈산, 글루타콘산, 타르트론산, 무콘산, 메사콘산, 시트라콘산, 메콘산, 3-3'디메틸글루타르산, 이타콘산, 글루탐산, 아스파르트산, 3-히드록시아스파르트산 등을 들 수 있다. 어떤 실시형태에서, 본 개시내용에 사용되는 바람직한 트리카르복실산으로는 시트르산, 이소시트르산, 아코니트산, 트리메신산, 1,2,3-프로판트리카르복실산, 2-포스포노부탄-1,2,4-트리카르복실산 등을 들 수 있다. 어떤 실시형태에서, 본 개시에서 사용하는 바람직한 테트라카르복실산은 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 등을 포함한다. 어떤 실시형태에서, 본 개시내용에 사용되는 바람직한 당으로서는 단당, 이당, 올리고당 등 본 발명의 LDH를 포함하는 조성물의 안정성을 향상시키는 것이라면 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어 수크로오스, 트레할로스, 말토오스, myo-이노시톨 등을 들 수 있다. 어떤 실시형태에서, 본 개시내용에서 사용하는 바람직한 폴리에틸렌글리콜의 분자량은 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어 평균 분자량이 300 ~ 100,000인 것이 바람직하고, 특히 7,300 ~ 9,300인 것이 바람직하다. 어떤 실시형태에서, 본 개시내용에서 사용하는 바람직한 양이온성 폴리머로서는 예를 들어, 폴리라이신, 폴리에틸렌이민, 메틸글리콜키토산, 및 폴리(염화디알릴디메틸암모늄)를 들 수 있고, 폴리라이신으로서는 α-폴리라이신 또는 ε-폴리라이신을 들 수 있다. 폴리라이신의 분자량에는 특별히 제한은 없지만, 예를 들면 평균 분자량이 300 ~ 100,000의 폴리라이신이 바람직하고, 나아가 3,500 ~ 6,000, 예를 들면 3,000 ~ 5,000, 예를 들면 3,500 ~ 4, 500의 폴리라이신이 바람직하지만 이에 한정되지 않는다. 폴리에틸렌이민은 직쇄형이어도 분지형이어도 된다. 폴리에틸렌이민의 분자량에는 특별히 제한은 없지만, 예를 들어 평균 분자량이 300 ~ 100,000, 예를 들어 3000 ~ 20,000, 예를 들어 3500 ~ 10,000의 폴리에틸렌이민을 사용할 수 있다. 어떤 실시형태에서, 본 개시내용에서 사용하는 바람직한 음이온성 폴리머로서는 폴리아크릴산이나 폴리스티렌술폰산, 히알루론산 혹은 그의 염, 및 카르복시메틸셀룰로오스 혹은 그의 염을 들 수 있다. 폴리아크릴산의 분자량에는 특별히 제한은 없지만, 예를 들면 평균 분자량이 1000 ~ 1,250,000의 폴리 아크릴산이 바람직하지만 이것에 한정되지 않는다. 폴리스티렌 술폰산의 분자량에는 특별히 제한은 없지만, 예를 들면 평균 분자량이 1000 ~ 1,000,000의 폴리스티렌 술폰산이 바람직하지만 이것에 한정되지 않는다. 어떤 실시형태에서, 본 개시내용에서 사용하는 바람직한 질산염으로서는 질산나트륨, 질산 암모늄, 질산 마그네슘, 질산 칼륨, 질산 칼슘, 질산 리튬 등을 들 수 있다. 어떤 실시형태에서, 본 개시내용에서 사용하는 바람직한 황산염으로서는 황산나트륨, 황산 암모늄, 황산 마그네슘, 황산 칼륨, 황산 칼슘, 황산 리튬 등을 들 수 있다. 어떤 실시형태에서, 본 개시내용에서 사용하는 바람직한 인산염으로서는 인산 나트륨, 인산 암모늄, 인산 마그네슘, 인산 칼륨, 인산 칼슘, 인산 리튬 등을 들 수 있다. 어떤 실시형태에서, 본 개시내용에서 사용하는 바람직한 음이온 또는 당은 하나 이상의 카르복실기 함유 화합물, 할로겐 화합물, 인산염, 질산염, 황산염, 단백질, 펩티드, 아미노산 또는 이들의 염, 또는 당이다.
별도의 실시형태에서는 본 개시내용의 안정화제로부터, 글루콘산, 류신산, 3-페닐락트산, 글리신, 아르기닌, 라이신, 히스티딘, 말산, 숙신산, 말레산, 푸마르산, 말론산, 메틸말론산, 옥살로아세트산, 타르타르산, 옥살산, 숙신산, 글루타르산, α-케토글루타르산, 아디프산, 피메르산, 수베르산, 아젤라산, 세바신산, 프탈산, 이소프탈산, 테레프탈산, 글루타콘산, 타르트론산, 무콘산, 메사콘산, 시트라콘산, 메콘산, 3-3'디메틸글루타르산, 이타콘산, 글루탐산, 아스파르트산, 3-히드록시아스파르트산, 시트르산, 이소시트르산, 아코니트산, 트리메신산, 1,2,3-프로판트리카르복실산, 2-포스포노부탄-1,2,4-트리카르복실산, 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 히알루론산 혹은 그의 염, 및 카르복시메틸셀룰로오스 혹은 그의 염, 수크로스, 트레할로스, 말토오스, myo-이노시톨, 폴리에틸렌글리콜, 폴리라이신, α-폴리라이신, ε-폴리라이신, 폴리에틸렌이민, 메틸글리콜키토산, 및 폴리(염화디알릴디메틸암모늄), 폴리아크릴산 혹은 그의 염, 폴리스티렌술폰산 또는 그의 염, 질산 나트륨, 질산 암모늄, 질산 마그네슘, 질산 칼륨, 질산 칼슘, 질산 리튬, 황산나트륨, 황산 암모늄, 황산 마그네슘, 황산 칼륨, 황산 칼슘, 황산 리튬, 인산 나트륨, 인산 암모늄, 인산 마그네슘, 인산 칼륨, 인산 칼슘, 인산 리튬, 하나 이상의 카르복실기 함유 화합물, 할로겐 화합물, 인산염, 질산염, 황산염, 단백질, 펩티드, 아미노산 또는 이들의 염으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물을 제외할 수 있다.
본 개시내용의 안정화제가 류신산을 포함하는 경우, 류신산은 L체 및 D체, 또는 L체와 D체의 혼합물, 예를 들어 라세미체로서 제공되어도 된다. 본 명세서에 있어서, 어느 광학 활성 화합물에 대해서 L체란, 예를 들면 광학 순도 90 ~ 100%ee, 예를 들면 95 ~ 100%ee, 예를 들면 97 ~ 100%ee로 L체가 존재하는 것을 말한다. 예를 들어, L-류신산은 광학 순도 90 ~ 100%ee, 예를 들어 95 ~ 100%ee, 예를 들어 97 ~ 100%ee의 것일 수 있다. 또한, 본 명세서에서 라세미체를 나타낼 때는 화합물의 명칭 전에 DL-로 표기하고 있다.
본 개시내용의 안정화제가 3-페닐락트산을 포함하는 경우, 3-페닐락트산은 L체 및 D체, 혹은 L체 및 D체의 혼합물, 예를 들어 라세미체로서 제공되어도 된다. 본 명세서에 있어서, 어느 광학 활성인 화합물에 대해서 L체란, 예를 들면 광학 순도 90 ~ 100%ee, 예를 들면 95 ~ 100%ee, 예를 들면 97 ~ 100%ee로 L체가 존재하는 것을 말한다. 예를 들어, L-3-페닐락트산은 광학 순도 90 ~ 100%ee, 예를 들어 95 ~ 100%ee, 예를 들어 97 ~ 100%ee인 것일 수 있다. 또한, 본 명세서에서 라세미체를 나타낼 때는 화합물의 명칭 전에 DL-로 표기하고 있다.
본 개시내용의 안정화제가 아르기닌을 포함하는 경우, 아르기닌은 L-체 및 D-체, 혹은 L-체와 D-체의 혼합물, 예를 들어 라세미체로서 제공되어도 된다. 본 명세서에 있어서, 어느 광학 활성 화합물에 대해서 L체란, 예를 들면 광학 순도 90 ~ 100%ee, 예를 들면 95 ~ 100%ee, 예를 들면 97 ~ 100%ee로 L체가 존재하는 것을 말한다. 예를 들어, L-아르기닌은 광학 순도 90 ~ 100%ee, 예를 들어 95 ~ 100%ee, 예를 들어 97 ~ 100%ee일 수 있다. 또한, 본 명세서에서 라세미체를 나타낼 때는 화합물의 명칭 전에 DL-로 표기하고 있다.
본 개시내용의 안정화제가 라이신을 포함하는 경우, 라이신은 L체 및 D체, 혹은 L체와 D체의 혼합물, 예를 들어 라세미체로서 제공되어도 된다. 본 명세서에 있어서, 어느 광학 활성 화합물에 대해서 L체란, 예를 들면 광학 순도 90 ~ 100%ee, 예를 들면 95 ~ 100%ee, 예를 들면 97 ~ 100%ee로 L체가 존재하는 것을 말한다. 예를 들어, L-라이신은 광학 순도 90 ~ 100%ee, 예를 들어 95 ~ 100%ee, 예를 들어 97 ~ 100%ee의 것일 수 있다. 또한, 본 명세서에서 라세미체를 나타낼 때는 화합물의 명칭 전에 DL-로 표기하고 있다.
본 개시내용의 안정화제가 히스티딘을 포함하는 경우, 히스티딘은 L체 및 D체, 혹은 L체와 D체의 혼합물, 예를 들어 라세미체로서 제공되어도 된다. 본 명세서에 있어서, 어느 광학 활성 화합물에 대해서 L체란, 예를 들면 광학 순도 90 ~ 100%ee, 예를 들면 95 ~ 100%ee, 예를 들면 97 ~ 100%ee로 L체가 존재하는 것을 말한다. 예를 들어, L-히스티딘은 광학 순도 90 ~ 100%ee, 예를 들어 95 ~ 100%ee, 예를 들어 97 ~ 100%ee의 것일 수 있다. 또한, 본 명세서에서 라세미체를 나타낼 때는 화합물의 명칭 전에 DL-로 표기하고 있다.
본 개시내용의 안정화제가 말산을 포함하는 경우, 말산은 L체 및 D체, 또는 L체와 D체의 혼합물, 예를 들어 라세미체로서 제공되어도 된다. 본 명세서에 있어서, 어느 광학 활성 화합물에 대해서 L체란, 예를 들면 광학 순도 90 ~ 100%ee, 예를 들면 95 ~ 100%ee, 예를 들면 97 ~ 100%ee로 L체가 존재하는 것을 말한다. 예를 들어 L-말산은 광학 순도 90 ~ 100%ee, 예를 들어 95 ~ 100%ee, 예를 들어 97 ~ 100%ee의 것일 수 있다. 또한, 본 명세서에서 라세미체를 나타낼 때에는 화합물의 명칭 전에 DL-로 표기하고 있다.
본 개시내용의 안정화제가 타르타르산을 포함하는 경우, 타르타르산은 L체 및 D체, 혹은 L체와 D체의 혼합물, 예를 들어 라세미체로서 제공되어도 된다. 본 명세서에 있어서, 어느 광학 활성 화합물에 대해서 L체란, 예를 들면 광학 순도 90 ~ 100%ee, 예를 들면 95 ~ 100%ee, 예를 들면 97 ~ 100%ee로 L체가 존재하는 것을 말한다. 예를 들어, L-타르타르산은 광학 순도 90 ~ 100%ee, 예를 들어 95 ~ 100%ee, 예를 들어 97 ~ 100%ee의 것일 수 있다. 또한, 본 명세서에서 라세미체를 나타낼 때는 화합물의 명칭 전에 DL-로 표기하고 있다.
본 개시내용의 안정화제가 글루탐산을 포함하는 경우, 글루탐산은 L체 및 D체, 혹은 L체 및 D체의 혼합물, 예를 들어 라세미체로서 제공되어도 된다. 본 명세서에 있어서, 어느 광학 활성 화합물에 대해서 L체란, 예를 들면 광학 순도 90 ~ 100%ee, 예를 들면 95 ~ 100%ee, 예를 들면 97 ~ 100%ee에서 L체가 존재하는 것을 말한다. 예를 들어, L-글루탐산은 광학 순도 90 ~ 100%ee, 예를 들어 95 ~ 100%ee, 예를 들어 97 ~ 100%ee의 것일 수 있다. 또한, 본 명세서에서 라세미체를 나타낼 때에는 화합물의 명칭 전에 DL-로 표기하고 있다.
본 개시내용의 안정화제가 아스파르트산을 포함하는 경우, 아스파르트산은 L체 및 D체, 혹은 L체와 D체의 혼합물, 예를 들어 라세미체로서 제공되어도 된다. 본 명세서에 있어서, 어느 광학 활성 화합물에 대해서 L체란, 예를 들면 광학 순도 90 ~ 100%ee, 예를 들면 95 ~ 100%ee, 예를 들면 97 ~ 100%ee로 L체가 존재하는 것을 말한다. 예를 들어, L-아스파르트산은 광학 순도 90 ~ 100%ee, 예를 들어 95 ~ 100%ee, 예를 들어 97 ~ 100%ee의 것일 수 있다. 또한, 본 명세서에서 라세미체를 나타낼 때는 화합물의 명칭 전에 DL-로 표기하고 있다.
본 개시내용의 안정화제가 3-히드록시아스파르트산을 포함하는 경우, 3-히드록시아스파르트산은 L체 및 D체, 혹은 L체와 D체의 혼합물, 예를 들어 라세미체로서 제공되어도 된다. 본 명세서에 있어서, 어느 광학 활성 화합물에 대해서 L체란, 예를 들면 광학 순도 90 ~ 100%ee, 예를 들면 95 ~ 100%ee, 예를 들면 97 ~ 100%ee로 L체가 존재하는 것을 말한다. 예를 들어, L-3-히드록시아스파르트산은 광학 순도 90 ~ 100%ee, 예를 들어 95 ~ 100%ee, 예를 들어 97 ~ 100%ee의 것일 수 있다. 또한, 본 명세서에서 라세미체를 나타낼 때에는 화합물의 명칭 전에 DL-로 표기하고 있다.
본 개시내용의 LDH를 포함하는 조성물의 안정성을 향상시키기 위해 첨가하는 안정화제는 LDH를 포함하는 조성물 중의 화합물(유효성분)의 최종 농도가 0.1mM ~ 1000mM, 예를 들어 0.1mM ~ 900mM, 0.1mM ~ 800mM, 0.1mM ~ 700mM, 0.1mM ~ 600mM, 0.1mM ~ 500mM, 0.1mM ~ 400mM, 0.1mM ~ 300mM, 0.1mM ~ 200mM, 0.1mM ~ 100mM, 0.1mM ~ 90mM, 0.1mM ~ 80mM, 0.1mM ~ 70mM, 0.1mM ~ 60mM, 0.1mM ~ 50mM, 0.1mM ~ 40mM, 0.1mM ~ 30mM, 0.2mM ~ 20mM, 0.25 mM ~ 10 mM, 예를 들어 300 mM이되도록 락트산 측정 시약 또는 락트산 측정 조성물에 배합 될 수 있다. 어떤 실시형태에서, 본 개시내용의 안정성을 향상시키기 위해 첨가되는 안정제 및 LDH를 포함하는 수용액을 전극에 도포하고 건조시킬 수 있다. 이 경우, 건조시에 안정화제(조성물에 포함되어도 됨)가 농축되어, 건조 전의 종(終)농도보다 높은 농도가 되는 것이 상정된다. 이러한 건조 후의 고농도에서의 LDH 안정화제 및 상기 안정화제가 도포된 전극도 본 개시내용에 포함된다. 또한, 안정화제를 함유하는 조성물을 포함하는 전극도 본 발명에 의해 제공된다. 또한, 안정화제를 함유하는 조성물을 전극에 도포하는 실시형태도 제공된다. 특정 실시형태에서, 본 개시내용의 안정성을 향상시키기 위해 첨가하는 안정화제는 LDH의 제조 공정에서 임의의 시간에 첨가될 수 있다. 예를 들면, 안정화제를 정제 공정의 초기 단계에 첨가해도 되고, 추출·정제 공정의 도중에 첨가해도 되고, 제조 공정의 후반, 예를 들면 동결 건조·분말화·규격 조정의 단계에서 첨가해도 된다. 본 개시내용에서는 LDH의 안정화 효과를 손상시키지 않는 범위에서, 예를 들어 완충제, 계면활성제, 안정화제, 부형제 등, LDH를 포함하는 조성물의 제조에 필요한 기타 각종 성분을 공존시킬 수도 있다. 이러한 다른 성분은 안정화제에 포함시켜도 되고, 안정화제 이외의 락트산 측정 시약에 포함시켜도 되고 또는, 락트산 측정 시약의 사용시에 별도로 계에 첨가해도 된다.
어떤 실시형태에서, 본 개시내용은 LDH를 포함하는 조성물의 안정성을 향상시키기 위해 첨가되는 안정화제 및 LDH를 포함하는 락트산 측정 조성물 또는 락트산 측정 시약을 제공한다. 어떤 실시형태에서, 락트산 측정 시약은 용액 형태 또는 건조 형태일 수 있다. 어떤 실시형태에서, 락트산 측정 시약 중의 LDH 안정화제 및 LDH는 개별 시약으로서 포함될 수 있다. 별도의 실시형태에서, 락트산 측정 시약 중 LDH를 포함하는 조성물의 안정성을 향상시키기 위해 첨가되는 화합물 및 LDH는 동일한 시약에 포함될 수 있다. 추가적인 실시형태에서, 락트산 측정 시약은 LDH를 포함하지 않으며, 이 경우 LDH는 락트산 측정 시에 측정 용액에 첨가될 수 있다. 별도의 실시형태에서는 락트산 측정 시약은 LDH 안정화제를 포함하지 않으며, 이 경우 안정화제는 락트산 측정 시에 측정 용액에 첨가될 수 있다.
어떤 실시형태에서, 본 개시내용은 LDH를 포함하는 조성물의 안정성을 향상시키기 위해 첨가하는 안정화제 및 LDH를 사용한 락트산 측정 방법을 제공한다. 어떤 실시형태에서는 락트산 측정 방법은 락트산의 농도를 측정하는 방법일 수 있다. 별도의 실시형태에서는 락트산 측정 방법은 락트산의 농도를 정량하는 방법일 수 있다. 측정되는 시료는 락트산을 포함하는 것일 수 있다. LDH를 포함하는 조성물의 안정성을 향상시키기 위해 첨가하는 안정화제는 락트산 측정 시약에 미리 포함시켜도 되고, 락트산 측정시에 측정 용액에 첨가되어도 된다.
어떤 실시형태에서, 본 발명의 락트산 측정 방법에서는 측정시에 LDH를 포함하는 조성물의 안정성을 향상시키기 위해 첨가하는 안정화제에 포함되는 화합물은 0.001중량% ~ 50중량%, 예를 들어 0.001중량% ~ 25중량%, 0.001중량% ~ 20중량%, 0.001중량% ~ 15중량%, 0.001중량% ~ 10중량%, 0.001중량% ~ 9중량%, 0.001중량% ~ 8중량%, 0.001중량% ~ 7중량%, 0.001중량% ~ 6중량%, 0.001중량% ~ 5중량%, 0.001중량% ~ 4중량%, 0.001중량% ~ 3중량%, 0.1중량% ~ 2.5중량%, 0.001중량% ~ 2중량%, 0.001중량% ~ 1중량%, 0.001중량% ~ 0. 5중량%, 0.01중량% ~ 10중량%, 0.1중량% ~ 10중량%, 1중량% ~ 10중량%, 2중량% ~ 10중량%, 예를 들어 3중량% ~ 10중량%의 종농도에서 측정 용액에 포함될 수 있다.
어떤 실시형태에서, 본 개시의 락트산 측정 방법에서는 측정시에 LDH를 포함하는 조성물의 안정성을 향상시키기 위해 첨가하는 안정화제에 포함되는 화합물이 0.1 mM ~ 2,000 mM, 예를 들어 0.1mM ~ 1,500mM, 0.1mM ~ 1,000mM, 0.1mM ~ 750mM, 0.1mM ~ 500mM, 0.1mM ~ 400mM, 0.1mM ~ 300mM, 0.1mM ~ 200mM, 0.1mM ~ 100mM 0.1mM ~ 90mM, 0.1mM ~ 80mM, 0.1mM ~ 70mM, 0.1mM ~ 60mM, 0.1mM ~ 50mM, 0.1mM ~ 40mM, 0.1mM ~ 30mM, 0.2mM ~ 20mM, 0.25mM ~ 10mM, 예를 들어 300 mM의 종농도로 측정 용액에 포함될 수 있다.
어떤 실시형태에서, 본 개시내용의 락트산 측정 방법에서는 상기 안정화제는 락트산 측정 용액에 포함되어도 된다. 이 경우, 락트산 측정 용액에 LDH 및 시료를 첨가하여 측정을 개시해도 된다. 혹은 LDH를 전극에 고정화하고, 해당 락트산 측정 용액 및 샘플을 전극에 접촉시켜 락트산 측정을 행해도 된다.
별도의 실시형태에서는 본 개시내용의 LDH를 포함하는 조성물의 안정성을 향상시키기 위해 첨가되는 안정화제는 미리 락트산 측정 시약에 포함되어도 된다. 이 측정 시약은 LDH를 포함하는 것이어도 되고, 또는 포함하지 않는 것일 수 있다. 측정 시약이 LDH를 포함하는 경우, 여기에 샘플을 첨가하여 락트산 측정을 시작할 수 있다. 측정 시약이 LDH를 포함하지 않는 경우, 여기에 샘플 및 LDH를 (임의의 순서로) 첨가하여 락트산 측정을 시작할 수 있다. 혹은 LDH를 전극에 고정화하고, 해당 측정 시약 및 시료를 전극과 접촉시키고, 락트산 측정을 행해도 된다.
어떤 실시형태에서, 본 발명의 LDH를 포함하는 조성물의 안정성을 향상시키기 위해 첨가하는 화합물은 LDH를 침전시키지 않는다. 어떤 실시형태에서, LDH를 포함하는 조성물의 안정성을 향상시키기 위해 첨가되는 화합물로서, 종농도 50 ~ 70% 황산 암모늄은 제외된다. 또한, 종농도 50% ~ 100%의 황산암모늄은 제외된다. LDH를 함유하는 용액에 황산암모늄을 고농도로 첨가하고, LDH를 침전시켰을 때에는 상기 용액의 상청을 이용하여 락트산을 측정할 수 없다.
(본 개시내용을 적용할 수 있는 LDH)
본 개시내용에 적용되는 LDH는 공지된 야생형 또는 변이형 LDH와 마찬가지로 전자 수용체 존재 하에서 락트산의 수산기를 산화시켜 피루브산을 생성하는 반응을 촉매한다. 달리 언급하지 않는 한, LDH의 기질은 락트산이며, 이는 L체 및 D체의 혼합물, 예를 들어 라세미체로서 제공되어도 되고, 또는 L체로서 제공되어도 된다.
LDH의 활성은 이 작용원리를 이용하고, 예를 들어 도 1에 나타낸 바와 같이 전자수용체로서 페나진메트설페이트(PMS) 및 2,6-디클로로인도페놀(DCIP)을 이용한 이하의 측정계를 이용하여 측정할 수 있다.
(반응 1) L-락트산 + PMS(산화형)
→ 피루브산 + PMS(환원형)
(반응 2) PMS(환원형) + DCIP(산화형)
→ PMS(산화형) + DCIP(환원형)
구체적으로는 우선 (반응 1)에서, L-락트산의 산화에 동반하여 PMS(환원형)가 생성된다. 그리고 계속해서 진행하는 (반응 2)에 의해, PMS (환원형)가 산화됨에 동반하여 DCIP가 환원된다. 이 「DCIP(산화형)」의 소실 정도를 파장 520nm에서의 흡광도의 변화량으로서 검지하고, 이 변화량에 기초하여 효소 활성을 구할 수 있다.
구체적으로는, LDH의 활성은 이하의 절차에 따라 측정할 수 있다. 1M 인산칼륨 완충액(pH 7.5) 170μL, 50mM L-락트산 용액 300μL 및 1.8mM DCIP 용액 250μL, 초순수 680μL를 혼합하고, 37℃에서 2분 이상 보온한다. 또한, L-락트산으로서는 예를 들면 Sigma-Aldrich사 제조(제품 번호 L1750)를 사용할 수 있고, L-락트산 대신에 DL-락트산(예를 들어, 후지필름와코쥰야쿠사 제조, 제품 번호 128-00056)을 사용할 수도 있다. 이어서, 30 mM PMS 용액 50μL 및 효소 샘플 용액 50μL를 첨가하여 반응을 개시한다. 반응 개시시, 및 경시적인 흡광도를 측정하고, 효소 반응의 진행에 동반하는 520nm에서의 흡광도의 1분간당의 감소량(ΔA520)을 구하고, 다음 수학식 1에 따라, LDH 활성을 산출한다. 이 때, LDH 활성은 37℃에서 농도 10mM의 L-락트산 존재하에서 1분간에 1μmol의 DCIP를 환원하는 효소량을 1U로 정의한다.
Figure pct00001
또한, 식 중의 1.5는 반응 시약 + 효소 시약의 액량(mL), 6.8은 본 활성 측정 조건에서의 DCIP의 밀리몰 분자 흡광 계수(mM-1cm-1), 0.05는 효소 용액의 액량(mL), 1.0은 셀의 광로 길이(cm), ΔA520, blank는 0.15%(w/v)의 소 혈청 알부민을 포함하는 10mM 인산칼륨 완충액(pH6.0)을 효소 샘플 용액 대신에 첨가하여 반응을 개시한 경우의 520nm에서의 흡광도의 1분당의 감소량, Df는 희석 배수를 나타낸다.
(LDH의 열안정성의 평가 방법)
LDH의 열안정성은 소정의 온도에서 소정 시간만큼 LDH를 가열하고, 가열 전후의 활성을 비교함으로써 평가할 수 있다. 구체적으로는 LDH를 포함한 종농도로서 0.15%(w/v) 소 혈청 알부민을 포함하는 150mM 인산칼륨 완충액(pH 7.5)을 얼음 위에 정치하고, 소정의 온도(예를 들면 45℃, 50℃, 55℃, 60℃일 수 있음)에서 15분간 각각 가열한 후, LDH 활성을 측정한다. 가열 처리를 하지 않고, 얼음 위에 정치해 둔 LDH 용액의 LDH 활성을 100으로 하여 가열 후의 LDH 용액의 활성을 산출하고, 잔존 활성률(활성 잔존율)(%)을 측정할 수 있다.
(LDH의 안정성의 향상)
본 개시에서 말하는 「안정성의 향상」이란 「용액 상태에서의 열안정성의 향상」뿐만 아니라, 「건조 상태에서의 열안정성의 향상」, 또는 「건조 공정에서의 열안정성의 향상」, 또는 「용액 상태에서의 보존 안정성(장기 안정성)의 향상」이나, 「건조 상태에서의 보존 안정성(장기 안정성)의 향상」도 포함한다.
즉, 본 개시에서 말하는 「안정성이 향상되었다」란, LDH를 포함하는 조성물을 특정의 안정화제와 공존시킨 상태에서, 일정한 온도 조건하, 일정 시간 열처리 후, 혹은 장기 보존 후에 유지되는 LDH의 잔존 활성률(%)이 상기의 안정화제를 공존시키지 않는 경우와 비교하여 증대하고 있는 것을 말한다.
구체적으로는 잔존 활성률(%)은 열처리 전 또는 장기 보존 전의 용액의 LDH 활성값(a)과, 열처리 후 또는 장기 보존 후의 LDH 활성값(b)을 각각 측정하고, (( b)/(a)×100)을 계산함으로써 얻어진다. 특정의 안정화제 후보의 화합물과 공존시킨 상태에서의 열처리 후 혹은 장기 보존 후의 잔존 활성률(%)을 산출하고, 이것을 A로 하고, 안정화제 후보의 화합물과 공존시키지 않고 같은 처리에 제공하여 산출한 잔존 활성률(%)을 B로 한 경우에 A > B가 되었을 경우, LDH의 안정성이 향상되었다고 평가하고, 이 때 공존시킨 화합물은 LDH의 안정성의 향상에 기여했다고 평가한다.
안정화제에 의한 LDH의 안정성 향상 효과는 예를 들면, 안정화제 후보의 화합물과 공존시키지 않는 경우의 잔존 활성률(%)이 10%인 것에 대조적으로, 안정화제 후보의 화합물과 공존시킨 경우의 잔존 활성률(%)이 15%이었을 경우, 5% 향상했다고 한다. 안정화제에 의한 LDH의 안정성 향상 효과는 바람직하게는 2% 이상, 3% 이상, 4% 이상, 5% 이상, 더욱 바람직하게는 10% 이상, 15% 이상, 더욱 바람직하게는 20% 이상, 보다 바람직하게는 30% 이상, 더욱 바람직하게는 50% 이상, 더욱 바람직하게는 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상일 수 있다.
안정화제에 의한 LDH의 안정성 향상 효과는 안정화제 후보의 화합물과 공존시키지 않는 경우의 잔존 활성률(%)을 100으로 했을 때, 바람직하게는 안정화제 후보의 화합물과 공존시킨 경우의 잔존 활성의 상대값이 110 이상이고, 더욱 바람직하게는 130 이상, 150 이상, 200 이상, 250 이상, 300 이상, 350 이상일 수 있다.
(본 개시내용을 적용할 수 있는 LDH의 유래)
본 개시내용의 방법에 적용될 수 있는 LDH의 유래는 특별히 한정되지 않고, 원핵생물 유래, 진핵생물 유래, 미생물 유래, 진균 유래, 식물 유래, 또는 동물 유래의 것을 사용할 수 있다. 본 개시내용을 적용할 수 있는 LDH는 플라빈 의존성이고, 보조효소인 플라빈 화합물은 플라빈 모노뉴클레오티드(FMN) 혹은 플라빈 아데닌 디뉴클레오티드(FAD)일 수 있다.
예를 들어, 미생물 유래의 LDH로서는 자낭균문(Ascomycota), 바람직하게는 사카로마이세스강(Saccharomyceta), 보다 바람직하게는 사카로마이세스목(Saccharomycetales), 더욱 바람직하게는 사카로마이세스과(Saccharomycetaceae), 피키아과(Pichiacea에 유래하는 것을 들 수 있지만 이것에 한정되지 않는다. 예를 들면, 효모인 사카로마이세스(Saccharomyces)속, 피키아(Pichia)속, 칸디다(Candida)속, 오가타에아(Ogataea)속, 브레타노마이세스(Brettanomyces)속, 시베르린드네라(Cyberlindnera)속, 한세니아스포라(Hanseniaspora)속, 카자츠타니아(Kazachstania)속, 크루이베로마이세스(Kluyveromyces)속, 라찬세아(Lachancea)속, 나무모보지마(Naumovozyma)속, 테트라피시스포라(Tetrapisispora)속, 토룰라스포라(Torulaspora)속, 반데르발트지마(Vanderwaltozyma)속, 자이고사카로마이세스(Zygosaccharomyces)속, 자이고토루라스포라(Zygotorulaspora)속 등 미생물에서 유래하는 LDH를 들 수 있지만 이에 국한되지 않는다. 사카로마이세스속으로 분류되는 미생물로서 구체적으로 바람직한 미생물의 예로는 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이세스 파스토리아누스(Saccharomyces pastorianus), 사카로마이세스 파라독스(Saccharomyces paradoxus), 사카로마이세스 유바야누스(Saccharomyces eubayanus)를 들 수 있다. 피키아속으로 분류되는 미생물로서 구체적으로 바람직한 미생물의 예로는 피키아 쿠드리아브제비(Pichia kudriavzevii), 피키아 멤브라니파시엔스(Pichia membranifaciens), 피키아 캅술라타(Pichia capsulata)를 들 수 있다. 칸디다속으로 분류되는 미생물로서, 구체적인 바람직한 미생물의 예로는 칸디다 인콘스피쿠아(Candida inconspicua), 칸디다 보이디니(Candida boidinii)를 들 수 있다. 오가타에아속으로 분류되는 미생물로서 구체적으로 바람직한 미생물의 예로는 오가타에 폴리모르파(Ogataea polymorpha), 오가타에 파라폴리모르파(Ogataea parapolymorpha) DL-1을 들 수 있다. 브레타노마이세스속으로 분류되는 미생물로서, 구체적으로 바람직한 미생물의 예로는 브레타노마이세스 나아르데넨시스(Brettanomyces Naardenensis), 브레타노마이세스 브룩셀렌시스(Brettanomyces bruxellensis)를 들 수 있다. 예를 들어 미생물 유래 LDH로는 자낭균문(Ascomycota), 소르다리오마이세테스강(Sordariomycetes), 예를 들어 소르다리아레스목(Sordariales), 예를 들어 카에토미아세아과(Chaetomiaceae, 케타마카비과), 예를 들어 미셀리옵토라속(Myceliophthora), 또는 써모셀로마이세데스속(thermothelomyces)을 들 수 있지만 이에 한정되지 않는다. 카에토미아세아과(Chaetomiaceae, 케타마카비과)로는 예를 들어 카에토미움속(Chaetomium, 케타마카비속)을 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 소르다리알레스목(Sordariales)으로서는 예를 들어 마두렐라(Madurealla)를 들 수 있지만 이에 한정되지 않는다. 본 개시내용은 이들 LDH를 구성하는 도메인의 조합을 포함한다.
한편 미생물 분류는 어디까지나 편의적인 것이며, 특정 미생물이 어떤 분류에서 별개의 분류로 옮겨지는 경우가 있다. 또한, 하나의 속이 2개로 나누어지거나, 2개의 속이 1개의 속으로 통합되는 경우도 있다. 본 개시내용에서 본질적인 것은 LDH를 생산하는 미생물이며, 반드시 변경된 학술상의 명칭이나 분류는 아니다. 따라서, 나중에 상기 미생물의 학술 분류가 변경된 경우라도 상기 개시내용은 본원의 출원시의 미생물 분류를 기준으로 판단되는 것으로 한다. 예를 들어, 마두렐라 속 (Madurealla)의 과가 본원의 출원시에 반드시 명확하게 정해지지 않고, 출원 후에 과가 분류학적으로 결정된 경우, 어느 과에 속하게 되었다고 해도 본원의 출원시에 마두렐라 속(Madurealla)에 속하는 것으로 여겨지는 미생물은 상기 기재된 마두렐라속(Madurealla)에 포함되는 것으로 한다.
본 개시내용의 방법에 적용할 수 있는 LDH는 락트산 데하이드로게나제 활성을 갖는 한, 상기에 예시된 것에 추가로 다른 아미노산 잔기의 일부가 결실 또는 치환되어도 되며, 또한 다른 아미노산 잔기가 부가되어 있어도 된다. 상기에 예시된 바와 같은 LDH 생산 생물로부터 공지된 유전자 공학적 수법에 의해 취득한 LDH를 코딩하는 유전자를 이용하고, 필요에 따라 그것을 일부 개변하고, 적당한 숙주 미생물에 각종 공지의 수법에 의해 도입하여 제조된 재조합 LDH에도 본 개시내용을 적용할 수 있다.
본 발명을 바람직하게 적용할 수 있는 LDH의 일례로서, 플라빈 의존성 락트산 데히드로게나제, 더욱 바람직하게는 서열번호 1, 4, 7, 10에 나타내는 아미노산 서열 또는 그것과 70% 이상, 71% 이상, 72% 이상, 73% 이상, 74% 이상, 75% 이상, 76% 이상, 77% 이상, 78% 이상, 79% 이상, 80% 이상, 81% 이상, 82% 이상, 83% 이상, 84% 이상, 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 또는 95% 이상, 예를 들면 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 예를 들어 99% 이상의 전체길이 아미노산 서열 동일성을 갖는 락트산 데하이드로게나제를 들 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.
또한, 서열번호 1, 4, 7, 10은 신호 서열을 절단한 후의 아미노산 서열이다. 또한, 서열번호 1에서의 1 ~ 92위의 아미노산 서열, 서열번호 4에서의 1 ~ 96위의 아미노산 서열, 서열번호 7에서의 1 ~ 99위의 아미노산 서열 또는 서열번호 10에서의 1 ~ 98위의 아미노산 서열의 아미노산 서열을 포함하는 영역에 대해서는 서열 동일성은 낮고, 락트산 데하이드로게나제가 락트산과 반응하는 경우에는 중요성이 낮다고 할 수 있다. 따라서, 전체길이의 아미노산 서열 중, 서열번호 1에서 93 ~ 506위의 아미노산 서열, 서열번호 4에서 97 ~ 502위의 아미노산 서열, 서열번호 7에서 100 ~ 505위의 아미노산 서열, 서열번호 10에서 99 ~ 503위의 아미노산 서열 또는 그것과 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 락트산 데히드로게나제인 것이 바람직하고, 서열번호 1에서 1 ~ 92위의 아미노산 서열, 서열번호 4에서 1 ~ 96위의 아미노산 서열, 서열번호 7에서 1 ~ 99위의 아미노산 서열 또는 서열번호 10에서 1 ~ 98위의 아미노산 서열을 포함하는 영역에 대해서는 서열 동일성이 각각 45% 이상, 50% 이상, 60% 또는 70% 이상이면 되고, 또는 이 영역은 결실되어 있어도 된다. 또는 부분적으로 결실되어 있어도 되고, 예를 들어 N-말단 서열로부터 1 내지 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 15개의 아미노산이 결실되어 있어도 된다. 예를 들어, 서열번호 4에서 위치 2 ~ 10위의 아미노산이 결실되어 있어도 된다. 결실되어 있는 경우에는 적절하게는 메티오닌을 서열의 제일 처음에 부가할 수 있다. 이와 같이, 서열번호 4의 상류 부분을 개변, 결실했다고 해도, Pichia kudriavzevii 유래 락트산 데히드로게나제라고 부르는 것으로 한다. 다른 미생물 유래의 LDH에 대해서도 마찬가지이다.
LDH는 일반적으로 신호 서열, 시토크롬 도메인 및 촉매 도메인을 갖는다. 신호 서열은 통상 절단되어 효소 활성과 관련이 없기 때문에 서열 동일성을 비교하는 경우에는 특별히 언급하지 않는 한 고려하지 않는 것으로 한다. 시토크롬 도메인은 서열 동일성이 낮은 경우가 많고, 락트산 데하이드로게나제가 락트산과 반응함에 있어서는 중요성이 낮다. 따라서, 서열 동일성을 비교할 때에는, 달리 언급하지 않는 한, 시토크롬 도메인은 고려하지 않는다. 그러나, 이것은 LDH가 시토크롬 도메인을 포함하는 것을 배제하는 것은 아니다. 어떤 실시형태에서, 본 개시내용의 LDH는 시토크롬 도메인을 갖는다. 별도의 실시형태에서, 본 개시내용의 LDH는 시토크롬 도메인을 갖지 않거나 시토크롬 도메인의 부분 서열만을 갖는다. 또한, 유래가 상이한 LDH에 대해, 시토크롬 도메인을 교환해도 효소 활성이 발휘되는 것을 본 발명자들은 확인하였다. 따라서, 상기 미생물 유래의 LDH에 관하여, 제1 미생물 유래 LDH로부터의 촉매 도메인과 제2 미생물 유래 LDH로부터의 시토크롬 도메인을 연결할 수도 있다. 본 개시내용은 상기 미생물에 유래하는 LDH에 관한 것으로, 이러한 조합 및 융합 단백질을 포함한다.
(상동성 영역에 대해서)
아미노산 서열의 동일성 또는 유사성은 GENETYX Ver.11(제네틱스사 제조)의 맥시멈매칭이나 서치호몰로지 등의 프로그램 또는 DNASIS Pro(히타치솔루션즈사 제조)의 맥시멈매칭이나 멀티플얼라인먼트 등의 프로그램에 의해 계산할 수 있다. 아미노산 서열 동일성을 계산하기 위해서 2 개 이상의 LDH가 정렬(alignment)되었을 때, 그 2 개 이상의 LDH에서 동일한 아미노산의 위치를 조사할 수 있다. 이러한 정보를 기초로 아미노산 서열 중의 동일한 영역을 결정할 수 있다.
또한, 2 이상의 LDH에서 유사한 아미노산의 위치를 조사할 수도 있다. 예를 들면, CLUSTALW를 이용하여 복수의 아미노산 서열을 정렬할 수 있고, 이 경우 알고리즘으로서 Blosum62를 사용하고, 복수의 아미노산 서열을 정렬했을 때에 유사라고 판단되는 아미노산을 유사 아미노산이라고 부르는 경우가 있다. 본 개시내용의 변이체에서 아미노산 치환은 이러한 유사 아미노산 사이의 치환에 의한 것일 수 있다. 이러한 정렬에 의해 복수의 아미노산 서열에 대해 아미노산 서열이 동일한 영역 및 유사 아미노산에 의해 차지되는 위치를 조사할 수 있다. 이러한 정보를 바탕으로 아미노산 서열의 상동성 영역(보존 영역)을 결정할 수 있다.
예를 들어, 서열번호 4로 표시되는 락트산 데히드로게나제를 기준으로, 138 ~ 140위, 186 ~ 194위, 217 ~ 222위, 243 ~ 245위, 271 ~ 278위, 280 ~ 283위, 355 ~ 367위, 398 ~401위, 403 ~ 406위, 425 ~ 433위는 상동성 영역에 해당할 수 있다. 또한, 본 개시내용의 락트산 데히드로게나제의 상동성 영역에서의 아미노산 서열은 서열번호 4의 상동성 영역의 아미노산 서열과 75% 이상, 예를 들어 76% 이상, 77% 이상, 78% 이상, 79% 이상, 80% 이상, 81% 이상, 82% 이상, 83% 이상, 84% 이상, 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 예를 들어 99% 이상의 서열 동일성을 가질 수 있다.
상기와 같은 LDH를 인위적으로 취득하려고 하는 경우에는 각각을 코딩하는 DNA 정보에 기초하여, 공지의 단백질공학적 수법을 이용할 수 있다.
단백질공학적 수법을 구사하는 방법으로서는 일반적으로 Site-Specifique Mutagenesis로 알려진 수법을 사용할 수 있다. 예를 들어, Kramer 법 (Nucleic Acids Res., 12, 9441 (1984) : Methods Enzymol., 154, 350 (1987) : Gene, 37, 73 (1985)), Eckstein법(Nucleic Acids Res., 13,8749 (1985) : Nucleic Acids Res., 13,8765 (1985) : Nucleic Acids Res, 14,9679 (1986)), Kunkel법(Proc. Natl. Acid. Sci. U.S.A., 82,488(1985) : Methods Enzymol., 154, 367 (1987)) 등을 들 수 있다. ＤＮＡ중의 염기서열을 변환하는 구체적인 방법으로서는 예를 들면 시판되는 키트(Transformer Mutagenesis Kit; Clonetech사, EXOIII/Mug Bean Deletion Kit; Stratagen 제조, Quick Change Site Directed Mutagenesis Kit; Stratagen 제조 등)의 이용을 들 수 있다.
LDH의 아미노산 서열은 인위적으로 개변해도 되고 무작위로 개변해도 된다. 인위적으로 아미노산 서열을 개변하는 경우는 특정 부위에 보존적 아미노산 치환을 도입해도 된다. 보존적 아미노산 치환이란 어떤 아미노산 잔기를 유사한 측쇄를 갖는 별개의 아미노산 잔기로 치환하는 것을 말한다. 예를 들어, 라이신, 아르기닌, 및 히스티딘은 모두 염기성 측쇄를 갖는다. 예를 들어, 아스파르트산 및 글루탐산은 산성 측쇄를 갖는다. 예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 및 시스테인은 모두 비하전극성 측쇄를 갖는다. 예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판은 모두 비극성 측쇄를 갖는다. 예를 들어, 트레오닌, 발린, 및 이소류신은 모두 β 분지 측쇄를 갖는다. 예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘은 모두 방향족 측쇄를 갖는다. 이들은 모두 상호 보존적 아미노산 치환의 대상이 될 수 있다.
인위적으로 아미노산 서열을 개변하는 경우, 특정의 실시형태에서는 LDH의 활성 중심 잔기나 기질의 인식에 관여하는 잔기, 보조효소와 상호작용하는 잔기 등 LDH가 기능하는데 중요한 아미노산 잔기는 치환하지 않아도 되거나 또는 치환하지 않는다. LDH가 기능하는데 중요한 아미노산 잔기나 서열 모티프는 공지되어 있고, 서열번호 1을 기준으로 한 경우는 예를 들면 139위의 티로신, 249위의 티로신, 368위의 히스티딘, 371위의 아르기닌, 193위의 알라닌, 및 225위의 류신을 들 수 있다(예를 들어, Biochem., 39, 3266-3275, 2000을 참조할 것.). 이들의 위치나 모티프 서열은 치환하지 않아도 된다.
또한, 인위적 아미노산 치환과 무작위 아미노산 치환을 조합할 수도 있다. 나아가, 아미노산 치환의 도입을 배치 단위로 나누어 복수회 행할 수도 있다. 예를 들어, 제1 라운드로서 1 ~ 5개 또는 1 ~ 10개의 인위적인 아미노산 치환을 LDH에 도입할 수 있다. 이어서, 경우에 따라 1 ~ 5개 또는 1 ~ 10개의 무작위 아미노산 치환을 LDH에 도입할 수 있다. 이것을 여러 번 반복할 수 있다. 각 라운드마다 LDH 변이체의 활성을 확인함으로써 활성을 잃지 않고, 원래의 서열과 많은 위치에 있어서, 예를 들면 10개소 이상, 20개소 이상, 30개소 이상, 40개소 이상, 50개소 이상, 60개소 이상, 70개소 이상, 80개소 이상, 90개소 이상, 100개소 이상, 110개소 이상, 120개소 이상, 130개소 이상, 140개소 이상, 예를 들어 150개소 이상의 위치에서 상이한 배열을 갖는 LDH 변이체를 관용적인 방법을 반복함으로써 간편하게 제조할 수 있다. 또한, 인위적 아미노산 치환 및 무작위의 아미노산 치환은 제1 세트로서 LDH의 특정 영역에 도입해도 되며, 이것을 단회 또는 복수 회 반복할 수 있다. 이어서 LDH 변이체가 활성을 갖는 것을 확인한 후, 제2 세트로서 LDH의 별도의 영역에 아미노산 치환을 단회 또는 복수회 도입해도 된다.
(대량신속처리(high throughput) 스크리닝)
LDH는 또한 기능성 변이체를 얻기 위해 대량신속처리 스크리닝을 제공할 수 있다. 예를 들어, 변이 도입된 LDH 유전자를 갖는 형질전환 또는 형질도입주의 라이브러리를 제작하고, 이것을 마이크로타이터 플레이트에 기초한 대량신속처리 스크리닝에 제공해도 되고, 또는 액적형 미세유체에 기초한 초대량신속처리 스크리닝에 제공해도 된다. 예로서는, 변이(variant)를 코딩하는 변이 유전자의 조합 라이브러리(combinatorial library)를 구축하고, 이어서 파지 디스플레이(예를 들면 Chem.Rev.105(11):4056-72, 2005), 이스트 디스플레이(예를 들면 Comb Chem High Throughput Screen.2008;11(2):127-34), 박테리얼 디스플레이 (예를 들면 Curr Opin Struct Biol 17:474-80, 2007) 등을 사용하여 변이 LDH의 큰 집단을 스크리닝하는 방법을 들 수 있다. 또한 Agresti et al, "Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution" Proceedings of the National Academy of Sciences 107(9):4004-4009 (Mar, 2010)을 참조할 것. 아마도리아 LDH 변이(variant)의 스크리닝에 사용할 수 있는 초대량신속처리 스크리닝 수법에 대한 같은 문헌의 기재는 참조에 의해 본 명세서에 포함된다. 예를 들어, Error-Prone PCR법에 의해 라이브러리를 구축할 수 있다. 또한, 포화 돌연변이 유발을 사용하여, 본 명세서에 기재된 위치 또는 이에 대응하는 위치를 표적으로 하여 변이 도입하여 라이브러리를 구축해도 된다. 라이브러리를 사용하여 전기 competent EBY-100 세포 등의 적당한 세포를 형질 전환하여 약 10의 7승의 변이체를 얻을 수 있다(107). 이것을 10회 반복하면 약 10의 8승의 변이체를 얻을 수 있다(108). 해당 라이브러리로 형질전환한 효모 세포를 이어서 셀 소팅에 제공할 수 있다. 표준 소프트리토그래피법을 사용하여 제작한 폴리디메톡실실록산(PDMS) 미세 유체 장치를 사용해도 된다. 유동 초점 장치(flow focus device)를 사용하여 단분산의 액적을 형성할 수 있다. 개별 변이체를 함유하는 형성된 액적은 적당한 소팅 장치에 제공할 수 있다. 세포를 선별할 때에는 데히드로게나제 활성의 유무를 이용할 수 있다. 변이 도입 및 선별은 복수회 반복해도 된다.
(본 개시내용을 적용할 수 있는 LDH의 입수)
본 개시내용을 적용할 수 있는 LDH는 공지 문헌에 기초하여 입수가능하다. 예를 들어, 상기 LDH를 생산하는 유래 미생물을 배양함으로써, 또는 천연 LDH를 코딩하는 유전자를 그대로, 혹은 변이시킨 후, 적당한 발현용 벡터에 삽입하여 적당한 숙주(예를 들면, 대장균, 효모, 누룩균)에 형질전환시킨 형질전환체를 배양하고, 배양액으로부터 원심분리 등으로 균체를 회수한 후, 그 배양물로부터 LDH를 채취하는 방법을 들 수 있다.
상기 숙주 세포를 배양하는 배지로서는 예를 들면, 효모 엑기스, 트립톤, 펩톤, 고기 엑기스, 옥수수 스티프리커 혹은 대두 또는 밀 밀기울의 침출액 등의 1종 이상의 질소원에 염화나트륨, 인산제1칼륨, 인산제2칼륨, 황산마그네슘, 염화마그네슘, 염화제2철, 황산제2철 또는 황산망간 등의 무기 염류의 1종 이상을 첨가하고, 또한 필요에 따라 당질 원료, 비타민 등을 적절히 첨가한 것을 사용할 수 있다.
배지의 처음 pH는 한정되지 않지만, 예를 들면, pH 6 ~ 9로 조정할 수 있다.
배양은 10 ~ 42℃의 배양 온도, 바람직하게는 25℃ 전후의 배양 온도에서 4 ~ 24시간, 더욱 바람직하게는 25℃ 전후의 배양 온도에서 4 ~ 8시간, 통기 교반 심부 배양, 진탕 배양, 정치 배양 등에 의해 실시하면 된다.
배양 종료 후, 그 배양물로부터 LDH를 채취한다. 이것에는 통상의 공지의 효소 채취 수단을 이용하면 된다. 예를 들면, 통상의 방법에 의해 균체를 초음파 파괴 처리, 마쇄 처리 등을 하거나 리소자임 등의 용균 효소를 사용하여 본 효소를 추출하거나 또는 톨루엔 등의 존재하에 진탕 또는 방치하여 용균을 수행하여 본 효소를 균체 밖으로 배출시킬 수 있다. 그리고, 이 용액을 여과, 원심분리 등 하여 고형 부분을 제거하고, 필요에 따라 스트렙토마이신 황산염, 프로타민 황산염, 또는 황산망간 등에 의해 핵산을 제거한 후, 이것에 황산암모늄, 알코올, 아세톤 등을 첨가하고 분획하여 침전물을 채취하여 LDH의 조(粗) 효소를 얻는다.
LDH의 조 효소를 공지된 임의의 수단을 사용하여 추가로 정제될 수 있다. 정제된 효소 표품을 얻기 위해서는 예를 들어, 세파덱스, 울트로겔 또는 바이오겔 등을 이용하는 겔 여과법; 이온 교환체를 이용하는 흡착 용출법; 폴리아크릴아미드 겔 등을 이용하는 전기영동법; 히드록시아파타이트를 이용하는 흡착용출법; 자당 밀도 구배 원심법 등의 침강법; 친화성 크로마토그래피법; 분자체막 또는 중공사막 등을 이용하는 분획법 등을 적절히 선택하거나 또는 이들을 조합하여 실시함으로써 정제된 본 개시내용의 LDH 효소 표품를 얻을 수 있다. 또는 적당한 숙주 벡터 시스템을 사용함으로써 발현된 LDH를 직접 배양액 중으로 분비시킬 수 있다.
(LDH의 농도)
본 개시내용에서의 LDH 농도에는 특별한 제한이 없다. 사용하는 효소의 특성 등에 따라 적절한 범위는 다르지만, 실용상 해당 효소를 이용하여 락트산을 충분한 신뢰성으로 측정할 수 있다고 통상의 기술자가 판단할 수 있는 농도이면 된다.
예를 들어, 본 개시내용에서의 LDH의 농도는 특별히 제한되지 않지만, 용액 중의 경우 바람직하게는 0.01 ~ 1,000U/mL, 더욱 바람직하게는 0.1 ~ 100U/mL, 더욱 바람직하게는 0.1 ~ 10U/mL이다. 분말 또는 동결건조물 중에서도 같은 정도의 농도가 바람직하지만, 분말표품을 조제할 목적으로는 100U/mL 이상의 농도로 할 수 있다.
본 개시내용의 LDH를 포함하는 조성물은 액상으로 제공할 수도 있지만, 동결 건조, 진공 건조 혹은 스프레이 드라이 등에 의해 분말화할 수 있다. LDH의 추출·정제·분말화 및 안정성 시험에 사용하는 완충액의 조성은 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 pH 4 ~ 9의 범위에서 완충능을 갖는 것이면 되고, 예를 들면 붕산, 트리스 염산, 인산칼륨 등, 공지의 시판의 완충제나, BES, Bicine, Bis-Tris, CHES, EPPS, HEPES, HEPPSO, MES, MOPS, MOPSO, PIPES, POPSO, TAPS, TAPSO, TES, Tricine 등의 시판되는 굿 완충제를 들 수 있다. 상기와 같은 완충제는 어느 1종을 사용해도 되고, 2종 이상을 사용해도 된다.
완충제의 농도는 필요한 완충능을 갖는 범위이면 특별히 한정되지 않지만, 바람직한 상한은 100mM 이하, 보다 바람직하게는 50mM 이하이다. 바람직한 하한은 5mM 이상이다. 분말 혹은 동결건조물 중에 있어서는 완충제의 함유량은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 바람직하게는 0.1%(중량비) 이상, 특히 바람직하게는 0.1 ~ 30%(중량비)의 범위에서 사용된다.
어떤 실시형태에서, 본 개시내용은 LDH의 안정성을 향상시키는 안정화제의 스크리닝 방법을 제공한다. 이 방법은
i) LDH를 준비하는 공정,
ii) LDH에 35 ~ 70℃에서 열처리를 5 ~ 60분간 행하는 공정,
iii) 상기 ii) 후, LDH의 잔류 활성을 결정하는 공정,
iv) ii)에서 LDH 단독이 아니라 대신에 LDH를 후보 물질의 존재하에 열처리 한 후, LDH의 잔존 활성을 결정하는 공정 및
v) 상기 iii)에서의 잔존 활성과 iv)에서의 후보 물질의 존재 하에서의 잔존 활성을 비교하는 공정
을 포함할 수 있다. 상기 iii)에서의 잔존 활성보다도 iv)에서의 후보 물질의 존재하에서의 잔존 활성이 증가하고 있는 경우에는 후보 물질은 LDH의 안정성을 향상시키는 안정화제로 할 수 있다.
(LDH를 함유하는 조성물의 제조)
상술한 바와 같은 LDH의 안정성을 향상시키는 각종 안정화제를 LDH와 공존시킴으로써 LDH의 안정성이 향상된 조성물을 제조할 수 있다. 본 개시내용의 효소를 포함하는 조성물은 동결건조물에 한정되지 않고, 건조물을 재용해한 용액 상태여도 된다. 구체적으로는 본 발명의 조성물은 LDH와 각종 안정제를 임의의 방식으로 공존시켜도 된다. 예를 들면, 양자가 용액 상태인 경우에는 이것을 혼합함으로써 조성물을 제조할 수 있고, 양자가 분말 상태인 경우에는 분말 상태로 이들을 혼합함으로써 조성물을 제조할 수 있다. LDH를 분말화하고, 그 후의 조립(造粒) 공정에서 안정화제를 첨가할 수도 있다. 또한, 복수종의 안정화제를 일부는 LDH의 제조 공정에서 공존시키고, 나머지는 락트산 측정 시약의 조정 단계나 락트산 센서에의 고정화 공정에서 공존시킬 수도 있다.
어떤 실시형태에서, 본 개시내용은 LDH를 함유하는 조성물의 제조 방법을 제공한다.
이 방법은
i) LDH를 준비하는 공정,
ii) LDH에 35 ~ 70℃에서 열처리를 5 ~ 60분간 행하는 공정,
iii) 상기 ii) 후, LDH의 잔존 활성을 결정하는 단계,
iv) ii)에서 LDH 단독이 아니라, 대신에 LDH를 후보 물질의 존재하에서 열처리를 행한 후, LDH의 잔존 활성을 결정하는 공정,
v) 상기 iii)의 잔존 활성과 iv)의 후보 물질의 존재 하에서의 잔존 활성을 비교하는 단계,
vi) 상기 iii)에서의 잔존 활성보다 iv)에서의 후보 물질의 존재하에서의 잔존 활성이 증가하고 있는 경우에는 후보 물질을 LDH와 공존시킴으로써 LDH의 안정성이 향상된 조성 물건을 제조하는 공정
을 포함할 수 있다.
어떤 실시형태에서, 본 개시내용은 락트산 데히드로게나제를 전극에 도포하는 공정을 포함하는 전극의 제조 방법에서 락트산 데히드로게나제의 활성 저하 또는 비활성화를 억제하는 방법을 제공한다. 이 방법은
i) 락트산 데하이드로게나제를 포함하는 용액을 준비하는 공정,
ii) 상기 용액에 모노카르복실산, 디카르복실산, 트리카르복실산, 테트라카르복실산, 폴리카르복실산, 인산, 황산 또는 이들의 염으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 음이온, 단당, 이당, 폴리에틸렌글리콜, 및 이온성 폴리머로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상의 안정화제를 첨가하는 공정,
iii) 상기 락트산 데하이드로게나제 및 상기 안정화제를 포함하는 용액을 전극에 도포하는 공정,
iv) 도포한 상기의 용액을 건조시키는 공정
을 포함할 수 있다. 어떤 실시형태에서, 락트산 데히드로게나제를 도포한 전극은 락트산 센서에 포함될 수 있다.
(매개체(mediator))
어떤 실시형태에서는 LDH를 전극에 고정화하여 이용하는 경우, 또는 LDH를 고정화하지 않고 이용하는 경우, 매개체로서 공지된 매개체, 예를 들어 1-메톡시-5-메틸페나디늄 메틸설페이트(mPMS) , 5-메틸페나디늄메틸설페이트(PMS), 5-에틸페나디늄메틸설페이트(PES) 등의 페나진계 화합물, 페노티아진계 화합물, 페리시안화칼륨 등의 페리시안화물, 페로센, 디메틸페로센, 페로센 카르복실산 등의 페로센계 화합물, 나프토퀴논, 안트라퀴논, 하이드로퀴논, 피롤로퀴놀린 퀴논 등의 퀴논계 화합물, 시토크롬계 화합물, 벤질비오로겐이나 메틸비오로겐 등의 비올로겐계 화합물, 디클로로페놀인도페놀 등의 인도페놀계 화합물, 염화헥사암민루테늄 등의 루테늄 착체, 오스뮴-2,2'-비피리딘 등의 오스뮴 착체, p-페닐렌디아민, N-이소프로필-N'-페닐-p-페닐렌디아민 등의 페닐렌디아민계 화합물을 사용할 수 있다.
또한, 이들 매개체는 폴리비닐이미다졸, 폴리에틸렌이민, 폴리아크릴산 등의 폴리머에 수식되어 사용될 수도 있다. 또한, 이들 매개체는 GDH에 가교 시약 등을 사용하여 고정화할 수도 있다. 참고로 이들의 전체 내용을 본 명세서에 통합시킨다. 또한, 이들 매개체는 전극 표면을 산 처리 등으로 활성화시킨 후에 전극에 고정화 할 수도 있다. 전극은 탄소, 금, 백금 등의 소재 등을 사용할 수 있다.
시료 용액에 첨가하는 매개체의 종농도는 특별히 한정되지 않고, 예를 들면, 1pM ~ 1M, 1pM ~ 100mM, 1pM ~ 20mM, 1pM ~ 10mM, 1pM ~ 5mM, 2pM ~ 1mM, 3pM ~ 800μM, 4pM ~ 600μM, 5pM ~ 500μM, 6pM ~ 400μM, 7pM ~ 300μM, 8pM ~ 200μM, 9pM ~ 100μM, 10pM ~ 50μM의 범위일 수 있다. 또한, 매개체와 다른 시약의 첨가 순서는 제한되지 않고, 동시에 또는 순차적으로 첨가해도 된다.
(락트산 측정용 시약, 락트산 어세이 키트, 락트산 센서)
본 개시내용의 LDH를 함유하는 조성물을 사용하여, LDH의 안정성이 향상된 락트산 측정용 시약, 락트산 어세이 키트, 락트산 센서를 제조할 수 있고, 이것을 사용하여 락트산의 측정을 행할 수 있다.
본 개시내용의 락트산 측정용 시약은 전형적으로는 LDH, 완충액, 매개체 등 측정에 필요한 시약, 캘리브레이션 곡선 제작을 위한 락트산 표준 용액, 및 사용 설명서를 포함하며, LDH의 안정성을 향상시키는 것에 기여하는 안정화제를 포함한다.
본 발명의 락트산 측정 시약은 예를 들어 동결건조된 시약으로서, 또는 적절한 보존 용액 중의 용액으로서 제공될 수 있다. 본 개시내용의 락트산 측정용 시약은 종래의 락트산 측정용 시약과 동일하게 사용하여 락트산을 측정할 수 있고, 본 개시내용의 락트산 측정용 시약을 사용한 경우에는 LDH의 안정성이 향상되어 있는 것으로부터 본 개시내용의 락트산 측정 시약은 보다 우수한 열안정성 및 보존 안정성을 나타낸다.
(락트산 어세이 키트)
본 개시내용의 락트산 분석 키트에는 전형적으로 적어도 1회의 락트산 측정에 충분한 양의 LDH와, 어세이에 필요한 완충액, 매개체, 캘리브레이션 곡선 제작을 위한 락트산 표준 용액을 포함하고, LDH의 안정성을 향상시키는데 기여하는 안정화제를 포함한다. 본 개시내용의 락트산 분석 키트는 종래의 락트산 어세이 키트와 동일하게 사용하여 락트산을 측정할 수 있고, 본 개시내용의 락트산 어세이 키트를 사용한 경우에는 LDH의 안정성이 향상되어 본 개시내용의 락트산 어세이용 키트는 보다 우수한 열안정성 및 보존 안정성을 나타낸다.
(락트산 센서)
어떤 실시형태에서, 본 개시내용은 또한 LDH의 열안정성이 향상되어 있는 락트산 센서를 제공한다. 어떤 실시형태에서, 센서는 전극을 갖는다. 어떤 실시형태에서, 센서는 전극으로서 작용극, 대극을 갖는다. 어떤 실시형태에서, 센서는 전극으로서 작용극, 대극 및 참조극을 갖는다. 어떤 실시형태에서, LDH는 전극에 고정화되어 있다. 작용극으로서는 탄소 전극, 금 전극, 백금 전극 등을 이용하여, 이 전극 상에 본 개시내용의 효소를 고정화할 수 있다. 고정화 방법으로서는 가교 시약을 이용하는 방법, 고분자 매트릭스 중에 봉입하는 방법, 투석막으로 피복하는 방법, 광 가교성 폴리머, 도전성 폴리머, 산화 환원 폴리머를 사용하는 방법 등이 있고, 혹은 매개체와 함께 폴리머 중에 고정되거나 전극 상에 흡착 고정하여도 되고, 또한 이들을 조합하여 사용해도 된다. 전형적으로는, 글루타르알데히드를 사용하여 본 개시내용의 LDH를 탄소 전극 상에 고정화한 후, 아민기를 갖는 시약으로 처리하여 글루타르알데히드를 차단한다. 본 개시내용의 안정화제를 포함하는 조성물 또는 시약은 LDH를 고정화한 전극, 또는 효소 센서 등과 함께 포텐쇼스타트나 갈바노스타트 등을 사용하여 다양한 전기화학적 측정에 사용할 수 있다. 전기화학적 측정법으로서는 암페로메트리, 예를 들어 크로노암페로메트리, 포텐셜스텝·크로노암페로메트리, 볼타메트리, 예컨대 사이클릭볼타메트리, 미분펄스볼타메트리, 포텐쇼메트리, 쿨로메트리 등의 다양한 수법을 들 수 있다. 예를 들면, 락트산 측정에서는 암페로메트리법에 의해 락트산이 환원될 때의 전류를 측정함으로써 시료 중의 락트산 농도를 산출할 수 있다. 인가 전압은 조건이나 장치의 설정에 따라 다르지만, 예를 들면 -1,000mV ~ +1,000mV(vs. Ag/AgCl) 등으로 할 수 있다.
전극으로서 인쇄 전극을 사용할 수도 있다. 이것에 의해 측정에 필요한 용액량을 저감할 수 있다. 전극은 절연 기판 상에 형성할 수 있다. 구체적으로는 포토리소그래피 기술이나, 스크린 인쇄, 그라비아 인쇄, 플렉소 인쇄 등의 인쇄 기술에 의해 전극을 기판 상에 형성시킬 수 있다. 절연 기판의 소재로서는 실리콘, 유리, 세라믹, 폴리염화비닐, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르 등을 들 수 있고, 각종 용매나 약품에 대한 내성이 강한 것을 사용할 수 있다. 또한, 전극의 기초로서 카본 클로스, 카본 페이퍼, 버키 페이퍼를 사용할 수도 있다. 작용극의 면적은 원하는 응답 전류에 따라 설정될 수 있다. 예를 들어 어떤 실시형태에서는 작용극의 면적을 1mm2 이상, 1.5mm2 이상, 2mm2 이상, 2.5mm2 이상, 3mm2 이상, 4mm2 이상, 5mm2 이상, 6mm2 이상, 7mm2 이상, 8mm2 이상, 9mm2 이상, 10mm2 이상, 12mm2 이상, 15mm2 이상, 20mm2 이상, 30mm2 이상, 40mm2 이상, 50mm2 이상, 1cm2 이상, 2cm2 이상, 3cm2 이상, 4cm2 이상, 5cm2 이상, 예를 들면 10cm2 이상으로 할 수 있다. 어떤 실시형태에서는 작용극의 면적을 10cm2 이하, 5cm2 이하, 예를 들어 1cm2 이하로 할 수 있다. 대극도 마찬가지이다. 또한, 작용극 상에 카본 나노 튜브나 그래핀, 케첸 블랙 등을 고정화하여, 겉보기 표면적을 크게 할 수도 있다. 이 경우 겉보기 면적은 10배 이상, 50배 이상, 100배 이상, 1000배 이상 증가할 수 있다.
락트산 농도의 측정은 예를 들면 이하와 같이 하여 크로노암페로메트리에 의해 행할 수 있다. 항온 셀에 완충액을 넣고 매개체를 첨가하여 일정 온도로 유지한다. 작용 전극으로서 본 개시내용의 LDH를 고정화한 전극을 사용하고, 대극(예를 들면 백금 전극) 및 참조 전극(예를 들면 Ag/AgCl 전극)을 사용한다. 탄소 전극에 일정한 전압을 인가하여 전류가 일정하게 된 후, 락트산을 포함하는 시료를 가하여 전류의 증가를 측정한다. 표준 농도의 락트산 용액에 의해 제작된 캘리브레이션 곡선에 따라, 샘플 중의 락트산 농도를 계산할 수 있다.
본 개시내용의 락트산 센서는 종래의 락트산 센서와 마찬가지로 사용하여 락트산을 측정할 수 있고, 본 개시내용의 락트산 센서를 사용한 경우에는 LDH의 안정성이 향상되어 있기 때문에 본 개시내용의 락트산 센서용 키트는 보다 우수한 열안정성 및 보존 안정성을 나타낸다. 또한, 센서에 LDH를 고정화하는 공정에서도 고정화시의 열에 의한 실활의 정도를 저감할 수 있기 때문에 고정화에 사용하는 LDH의 양을 저감할 수 있다는 효과를 발휘한다.
(본 개시내용의 애노드 전극)
어떤 실시형태에서, 본 개시내용은 열안정성이 향상되어 있는 LDH 조성물을 포함하는 애노드 전극을 제공한다. 어떤 실시형태에서, LDH는 전지가 갖는 전극에 고정화되어도 된다. 어떤 실시형태에서, 본 개시내용의 애노드 전극은 캐소드 전극과 저항을 결합하여 전지를 제공할 수 있다. 어떤 실시형태에서, 본 개시내용은 상기 전지를 사용하는 발전 방법을 제공한다. 또 다른 실시형태에서는 본 개시내용의 열안정성이 향상되어 있는 LDH 조성물을 포함하는 전지가 제공된다.
(본 개시내용의 연료 전지)
어떤 실시형태에서, 본 개시내용은 연료 전지용 애노드 또는 캐소드 및 이 애노드 또는 캐소드를 구비한 연료 전지를 제공한다. 이 연료 전지는 본 개시내용의 열안정성이 향상되어 있는 LDH 조성물을 포함한다. 어떤 실시형태에서, 본 개시내용은 상기 열안정성이 향상되어 있는 LDH 조성물을 포함하는 전지를 사용한 발전 방법, 및 LDH를 애노드 전극에 고정화하고, LDH에 대응하는 기질, 예를 들어 락트산을 연료로 하여 발전을 행하는 방법을 제공한다.
어떤 실시형태에서, 본 개시내용의 연료 전지는 상기 열안정성이 향상되어 있는 LDH 조성물을 포함하는 애노드, 연료조, 캐소드, 및 전해질을 포함한다. 애노드 또는 캐소드에는 인공 전자 매개체를 흡착시켜도 된다. 인공 전자 매개체로서는 상기 기재된 공지의 매개체나, 특허 제6484741호 및 특허 6484742호에 기재된 페닐렌디아민계 화합물을 들 수 있지만, 이것에 한정되지 않는다. 또한, 본 개시내용의 연료 전지는 필요에 따라 애노드와 캐소드 사이에 부하 저항을 배치할 수 있고, 이를 위한 배선을 구비할 수 있다. 어떤 실시형태에서, 부하 저항은 본 개시내용의 연료 전지의 일부이다. 어떤 실시형태에서, 부하 저항은 본 개시내용의 연료 전지의 일부가 아니며, 본 개시내용의 연료 전지는 적당한 부하 저항에 접속할 수 있도록 구성되어 있다.
본 개시내용의 연료전지에서 산화환원효소(LDH)는 애노드의 일부를 구성한다. 예를 들어, 산화 환원 효소는 애노드에 근접하거나 접촉하고 있어도 되고, 고정화되거나 흡착되어 있어도 된다. 연료조는 전극에 고정화된 산화환원효소의 기질이 되는 화합물을 포함한다. 어떤 실시형태에서, 본 개시내용의 연료 전지는 애노드와 캐소드를 분리하는 이온 교환막을 가질 수 있다. 이온 교환막은 1nm ~ 20nm의 기공을 가질 수 있다. 애노드는 탄소 전극과 같은 일반적인 전극일 수 있다. 예를 들면, 카본 블랙, 흑연, 활성탄 등의 도전성 탄소질로 이루어지는 전극이나, 금, 백금 등의 금속으로 이루어지는 전극을 사용할 수 있다. 구체적으로는 카본 페이퍼, 카본 클로스, 그래시 카본, HOPG(고배향성 열분해 흑연) 등을 들 수 있다. 쌍을 이루는 캐소드로서는 예를 들면, 백금이나 백금 합금 등, 연료 전지에서 일반적으로 사용되고 있는 전극 촉매를 카본 블랙, 흑연, 활성탄과 같은 탄소질 재료, 또는 금, 백금 등으로 이루어지는 도전체에 담지시킨 전극이나, 백금이나 백금 합금 등의 전극 촉매 그 자체로 이루어지는 도전체를 캐소드 전극으로서 사용하고, 산화제(캐소드측 기질, 산소 등)를 전극 촉매에 공급하는 형태로 할 수 있다.
별도의 실시형태에서, 상기한 바와 같은 기질 산화형 효소 전극으로 구성된 애노드와 쌍을 이루는 캐소드로서 기질 환원형 효소 전극을 사용할 수 있다. 산화제를 환원하는 산화 환원 효소로서는 락카아제나 빌리루빈 옥시타제 등 공지의 효소를 들 수 있다. 산화제를 환원하는 촉매로서 산화 환원 효소를 사용하는 경우에는 필요에 따라 공지의 전자 전달 매개체를 사용해도 된다. 산화제로서는 산소 등을 들 수 있다.
어떤 실시형태에서, 캐소드에서 전극 반응을 방해하는 불순물 (아스코르브 산, 요산 등)에 의한 영향을 회피하기 위해 산소선택성의 막(예를 들어, 디메틸폴리실록산의 막)을 캐소드 전극의 주위에 배치할 수 있다.
본 개시내용의 발전 방법은 산화 환원 효소를 갖는 애노드에 연료가 되는 산화 환원 효소의 기질이 되는 화합물을 공급하는 공정을 포함한다. 산화 환원 효소를 갖는 애노드에 연료가 공급되면 기질이 산화되고 동시에 생성된 전자를 산화 환원 효소는 해당 산화 효소와 전극 사이의 전자 전달을 중개하는 전자 전달 매개체, 예를 들어 페닐렌디아민계 화합물로 전달되고, 그 전자 전달 매개체에 의해 전도성 기재(애노드 전극)로 전자가 전달된다. 애노드 전극으로부터 배선(외부 회로)을 통해 전자가 캐소드 전극에 도달함으로써 전류가 발생한다.
상기 과정에서 발생하는 양성자(H+)는 전해질 용액 내를 캐소드 전극까지 이동한다. 그리고, 캐소드 전극에서는 전해질 용액 내를 애노드로부터 이동해 온 양성자와, 외부 회로를 거쳐 애노드측으로부터 이동해 온 전자와, 산소나 과산화수소 등의 산화제(캐소드측 기질)가 반응하여 물이 생성된다. 이것을 이용하여 발전을 행할 수 있다.
이하, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다. 단, 본 개시내용의 기술적 범위는 그러한 예에 의해 전혀 한정되는 것은 아니다.
[실 시 예]
1. LDH 발현용 플라스미드의 제작
각종 재조합체 플라스미드의 제조
Biochem. J. 258, 255-259(1989)에 기재된 바와 같이, 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cereviciae) 유래 락트산 데히드로게나제 (ScLDH)의 아미노산 서열인 591개의 아미노산 중 1 ~ 85위의 아미노산을 제거한 서열번호 1에 나타낸 506개의 아미노산을 코딩하는 서열번호 2로 표시되는 1521bp의 유전자(종지 코돈 TAA를 포함)를, 정법(定法)인 유전자 단편의 PCR에 의해 이중 가닥 DNA로서 취득하였다. 플라스미드 pKK223-3의 다중 클로닝 사이트에 대상 유전자인 ScLDH 유전자를 통상의 방법으로 삽입시킨 DNA 구조물을 제작하였다. 구체적으로는 pKK223-3의 멀티클로닝 사이트에 있는 In-Fusion Cloning Site에서 ScLDH 유전자를 In-Fusion HD Cloning Kit(클론텍사 제조)를 사용하고 키트에 부착된 프로토콜에 따라 연결하여 발현용 플라스미드(pKK223-3-ScLDH)를 얻었다. 또한, 이들 플라스미드를 이용하여 대장균 JM109를 형질전환하고, 대장균 JM109(pKK223-3-ScLDH)주를 3 mL의 LB-amp 배지[1%(w/v) 박토트립톤, 0.5%(w/v) 펩톤, 0.5%(w/v) NaCl, 50㎍/mL 암피실린]에 접종하여 37℃에서 16시간 진탕 배양하여 배양물을 얻었다. 이 배양물을 10,000×g으로 1분간 원심분리함으로써 집균하여 균체를 얻었다. 이 균체로부터 GenElute Plasmid Miniprep Kit (Sigma-Aldrich사 제조)를 이용하여 재조합체 플라스미드 pKK223-3-ScLDH를 얻었다.
이어서, 피키아 쿠드리아브제비(Pichia kudriavzevii) 유래 락트산 데히드로게나제(PkLDH)의 아미노산 서열인 서열번호 3으로 표시되는 578 아미노산과 ScLDH를 비교하여 2 ~ 77위를 제거한 서열번호 4로 표시되는 502 아미노산을 코딩하는 서열번호 5로 표시되는 1509bp의 유전자(종지 코돈 TAA를 포함)를, 정법인 유전자 단편의 PCR에 의해 이중 가닥 DNA로서 취득하였다. 마찬가지로 하여 칸디다 인콘스피쿠아(Candida inconspicua) 유래 락트산 데히드로게나제(CaLDH)의 아미노산 서열인 서열번호 6으로 표시되는 571개 아미노산 중 2 ~ 67위를 제거한 서열번호 7로 표시되는 505개 아미노산을 코딩하는 서열번호 8로 표시되는 1518bp의 유전자(종지 코돈 TAA를 포함)를, 정법인 유전자 단편의 PCR에 의해 이중 가닥 DNA로서 취득하였다. 마찬가지로 하여 오가타에 파라폴리모르파(Ogataea parapolymorpha) 유래 락트산 데히드로게나제(OgLDH)의 아미노산 서열인 서열번호 9로 표시되는 558개 아미노산 중 2 ~ 56위를 제거한 서열번호 10으로 표시되는 503개 아미노산을 코딩하는 서열번호 11 로 표시되는 1512bp의 유전자(종지 코돈 TAA를 포함)를, 정법인 유전자 단편의 PCR에 의해, 이중 가닥 DNA로서 취득하였다. 이들 3종의 유전자는 ScLDH 발현용 플라스미드 제작시와 동일한 수법으로 플라스미드 pKK223-3의 멀티클로닝 사이트에 대상 유전자를 통상의 방법에 의해 삽입시켜, 재조합체 플라스미드 pKK223-3-PkLDH, pKK223-3- CaLDH, pKK223-3-OgLDH를 각각 얻었다.
2. 각종 LDH 표품의 정제
LDH 생산균으로서 대장균 BL21주를 사용하였다. 우선, pKK223-3-ScLDH를 형질도입한 대장균 BL21(pKK223-3-ScLDH)주는 미리 LB 플레이트 배지(100㎍/mL 암피실린 포함) 상에서 배양한 균주의 콜로니를 이쑤시개로 쑤셔, LB 배지 2mL(100㎍/mL 암피실린 포함)을 넣은 작은 시험관에서 25℃, 160rpm으로 24 시간 진탕 배양 하였다. 이 배양액 전량을 LB 배지 250mL(50㎍/mL 암피실린, 1mM 이소프로필-β-티오갈락토피라노시드(이하 IPTG) 포함)를 넣은 0.5L 용량의 긴목(자카구치) 플라스크에 옮기고, 25℃, 130rpm에서 30시간 진탕 배양했다. 마찬가지로, pKK223-3-PkLDH를 형질도입한 대장균 BL21(pKK223-3-PkLDH)주를 LB 배지 2mL(100㎍/mL 암피실린)을 넣은 소시험관으로 30℃, 160rpm에서 밤새 진탕 배양했다. 이 배양액 전량을 LB 배지 250mL(50㎍/mL 암피실린, 1mM IPTG 포함)를 넣은 0.5L 용량 긴목 플라스크에 옮기고, 37℃, 130rpm에서 30시간 진탕 배양하였다. 마찬가지로 pKK223-3-CaLDH 또는 pKK223-3-OgLDH를 형질도입한 대장균 BL21(pKK223-3-CaLDH)주, 대장균 BL21(pKK223-3-OgLDH)주를 LB 배지 2mL(100㎍/mL 암피실린)를 넣은 소시험관에서 30℃, 160rpm로 밤새 진탕 배양하였다. 이 배양액 전량을 LB 배지 250mL(50㎍/mL 암피실린, 1mM IPTG 포함)를 넣은 0.5L 용량 긴목 플라스크에 옮기고, 30℃, 130rpm에서 30시간 진탕 배양하였다.
배양 종료 후, 배양액을 6,000rpm, 25℃에서 5분 원심분리하여 상청을 제거하고, 균체를 회수하였다. 이어서, 생성된 균체를 20mM 인산칼륨 완충액(pH 7.5)에 현탁시켰다.
상기의 균체 현탁액을 초음파 호모지나이저 US-150E(일본정기제작소 제조)를 사용하여 현탁액이 반투명이 될 때까지 초음파 파쇄를 행하고, 9,000rpm, 4℃에서 10분 원심분리하여 상청을 회수했다. ScLDH를 제외한 각종 LDH를 포함하는 균체 파쇄액의 상청에 대해서 음이온 교환 크로마토그래피 정제를 행하였다. 구체적으로는 우선 20mM 인산칼륨 완충액(pH 7.5)을 사용하여 평형화한 10mL의 Q Sepharose Fast Flow(Cytiva사 제조)에 대하여 각종 LDH를 포함하는 상청액을 수지에 첨가하였다. 이어서, 0 ~ 500 mM NaCl을 포함하는 20 mM 인산칼륨 완충액(pH 7.5)을 첨가하여 LDH 활성이 높은 분획을 회수하였다. 생성된 LDH 활성을 나타내는 분획을 Amicon (등록 상표) Ultra-15 Centrifugal Filters Ultracel(등록 상표)-30K를 사용하여 농축시켰다. 이어서, Hiscreen Capto Q Impres 컬럼(Cytiva사 제조)에 흡착시키고, PkLDH는 250mM 내지 450mM NaCl/20 mM 인산칼륨 완충액(pH 7.0)의 구배(gradient)에 의해 LDH 활성을 나타내는 분획을 회수했다. CaLDH, OgLDH의 정제에 있어서는 150mM 내지 350mM NaCl/20mM 인산칼륨 완충액(pH 7.0)까지의 구배에 의해 LDH 활성을 나타내는 분획을 회수하였다. 이어서, 회수한 분획을 각각 150mM 염화나트륨을 포함하는 10mM 인산칼륨 완충액(PkLDH는 pH 7.0, CaLDH, OgLDH는 pH 7.5)로 평형화한 HiLoad 26/600 Superdex 200pg 컬럼(Cytiva사 제조)에 제공하고, 얻어진 분획을 SDS-PAGE에 의해 분석하고, 단일 밴드를 나타내면서 또한 LDH 활성을 나타내는 분획을 회수하여, 각종 LDH의 정제 표품으로 하였다.
4. 다양한 화합물 첨가에 의한 LDH의 안정성 향상 효과 검증 1
상기에서 취득한 PkLDH 정제 표품을 이용하여 상기 LDH의 열안정성의 평가 방법에 준하여 LDH의 안정화제의 첨가 유무에 있어서의 잔존 활성률(%)을 비교함으로써 안정화제의 탐색을 행하였다.
LDH의 열안정성은 소정의 온도에서 소정 시간 만큼 LDH를 가열하고, 가열 전후의 활성을 비교함으로써 평가하였다. 구체적으로는 LDH를 포함한 종농도로서 0.15%(w/v) 소 혈청 알부민을 포함하는 150mM 인산칼륨 완충액(pH 7.5)을 얼음 위에 정치하고, 소정의 온도(예를 들면 45℃, 50℃, 55℃, 60℃일 수 있음)에서 15분간 각각 가열한 후, LDH 활성을 측정하였다. 또한, 가열 처리를 하지 않고, 얼음 위에 정치해 둔 LDH 용액의 LDH 활성을 측정하고, 그 활성을 100으로 하여 가열 후의 LDH 용액의 활성을 산출하고, 잔존 활성률(%)을 측정했다. 구체적으로는 잔존 활성률(%)은 열처리 전 혹은 장기 보존 전의 용액의 LDH 활성값(a)과, 열처리 후 또는 장기 보존 후의 LDH 활성값(b)을 각각 측정하고, (( b)/(a)×100)을 계산함으로써 산출하였다.
다양한 화합물을 첨가함으로써 LDH의 안정성 향상 효과의 정도는 다양한 화합물을 LDH와 각각 공존시킨 상태에서 LDH 용액을 조제하고, 가열 처리에 제공하여 각각의 잔존 활성률(%)을 측정하고, 그것을 화합물끼리, 또는 화합물을 첨가하지 않은 경우의 활성 잔존율(%)과 비교함으로써 평가하였다.
LDH의 활성은 이하의 수순에 따라 측정하였다. 1M 인산칼륨 완충액(pH 7.5) 170μL, 50mM DL-락트산(후지필름와코쥰야쿠사 제조, 제품 번호 128-00056) 용액 300μL 및 1.8mM DCIP 용액 250μL, 초순수 680μL를 혼합하고 37℃에서 2분간 이상 보온하였다. 이어서, 30 mM PMS 용액 50 μL 및 효소 샘플 용액 50 μL를 첨가하여 반응을 개시하였다. 반응 개시시, 및 경시적인 흡광도를 측정하고, 효소 반응의 진행에 수반하는 520nm에서의 흡광도의 1분간당의 감소량(ΔA520)을 구하고, 다음 식의 수학식 2에 따라 LDH 활성을 산출하였다. 이 때 LDH 활성은 37℃에서 농도 10mM의 L-락트산 존재하에서 1분간에 1μmol의 DCIP를 환원하는 효소량을 1U로 정의하였다.
Figure pct00002
또한, 식 중의 1.5는 반응 시약 + 효소 시약의 액량(mL), 6.8은 본 활성 측정 조건에서의 DCIP의 밀리몰 분자 흡광 계수(mM-1cm-1), 0.05는 효소 용액의 액량(mL), 1.0은 셀의 광로 길이(cm), ΔA520, blank는 0.15%(w/v)의 소 혈청 알부민을 포함하는 10mM 인산칼륨 완충액(pH6.0)을 효소 샘플 용액 대신에 첨가하여 반응을 개시한 경우의 520nm에서의 흡광도의 분당 감소량, Df는 희석 배수를 나타낸다.
상기의 열안정성의 평가 방법에 따라, 150mM의 인산칼륨 완충액, 300mM의 각종 화합물과 0.15%(w/v) 소 혈청 알부민(BSA)을 포함하는 LDH 용액(2U/mL)을 사용하여 LDH의 잔류 활성률을 산출하였다. 상기 PkLDH 용액은 각종 화합물을 각각 첨가한 후에 pH 7.5가 되도록 조정을 행하였다. 가열 처리는 55℃, 15분간 행하였다. 비교예로서 각종 화합물을 첨가하지 않고 조제한 LDH 용액을 사용한 경우에도 마찬가지로 시험을 행하였다. 또한, 이후 특별히 언급하지 않는 한, 시약은 도쿄화성공업사로부터 구입한 것을 사용했다.
이들 검토의 결과, 표 1에 나타내는 바와 같이, 황산나트륨, 황산암모늄, 트레할로스 이수화물, 수크로스, D-(-)-타르타르산, L-말산, 시트르산나트륨, 글루콘산나트륨, 숙신산, 말레산, 푸마르산, L-아스파르트산나트륨, L-글루탐산, L-아르기닌 염산염을 첨가함으로써 LDH의 열안정성이 향상되는 것이 밝혀졌다. 이들 안정화제에 의한 LDH의 안정성 향상 효과는 10% 이상이 되어 높은 안정성 향상 효과가 확인되었다.
특히, 황산암모늄, L-말산, 글루콘산나트륨, 숙신산, L-아스파르트산나트륨, L-글루탐산, L-아르기닌 염산염을 첨가한 경우에는 안정화제 첨가 없는 PkLDH의 활성 잔존율( %)가 30%인 반면, 활성 잔존율(%)이 50% 이상이 되었다. 즉, 이들 안정화제에 의한 LDH의 안정성 향상 효과는 20% 이상이 되어 높은 안정성 향상 효과가 확인되었다. 특히, L-말산을 첨가했을 때에는 LDH의 활성 잔존율(%)은 78%로 되었다. 즉, L-말산에 의한 LDH의 안정성은 대폭 향상되어 현저하게 높은 안정성 향상 효과가 밝혀졌다.
Figure pct00003
5. 말산의 유사 화합물 첨가에 의한 LDH의 안정성 향상 효과의 검증 2
L-말산과 구조가 유사한 화합물에 대해서도 마찬가지로 상기 4.에 기재된 방법에 따라 안정성 평가 시험을 행하였다. 비교예로서 각종 화합물을 첨가하지 않고 조제한 PkLDH 용액(pH를 7.5로 조정한 150mM 인산칼륨 완충액, 0.15%(w/v) BSA를 포함)을 사용한 경우에도 마찬가지로 시험을 행하였다. L-말산 유사 화합물로서는 표 2에 나타내는 바와 같이, D-말산, DL-류신산, DL-3-히드록시아스파르트산, DL-3-페닐락트산, 옥살로아세트산, D-(-)-타르타르산 , L-(+)-타르타르산을 첨가하였다.
이들 검토의 결과, 표 2에 나타내는 바와 같이 D-말산, DL-3-히드록시아스파르트산, 옥살로아세트산, D-(-)-타르타르산, L-(+)-타르타르산을 첨가했을 때에 LDH의 안정성이 향상되는 것이 분명해졌다. 특히, DL-3-히드록시아스파르트산, D-(-)-타르타르산, L-(+)-타르타르산을 첨가한 경우에는 화합물 첨가 없는 활성 잔존율(%)이 30%인 것에 대조적으로 활성 잔존율(%)이 50%를 초과하여 높은 안정성이 확인되었다. 그 중에서도 DL-3-히드록시아스파르트산, DL-류신산, DL-페닐락트산은 활성 잔존율(%)이 각각 77%, 92%, 87%가 되었다. 즉, DL-3-히드록시아스파르트산, DL-류신산, DL-페닐락트산을 첨가함으로써 현저하게 높은 LDH의 안정성 향상 효과가 밝혀졌다.
Figure pct00004
6. 말산 첨가에 의한 다양한 LDH의 안정성 향상 효과의 검증 3
다양한 LDH에 대한 말산의 안정성 향상 효과에 관한 안정성 평가 시험을 행하였다. 상기에서 취득한 LDH 표품(PkLDH, CaLDH, OgLDH)을 각각 효소 농도가 2U/mL가 되도록 효소 희석액(150mM 인산칼륨 완충액 중, 종농도 300mM가 되도록 L-말산을 첨가하고, NaOH를 사용하여 pH 7.5로 조정한 후, 종농도 0.15%(w/v)가 되도록 소 혈청 알부민을 첨가하여 조제)를 사용하여 희석하였다. 이 각각의 희석된 효소 용액(효소와 L- 말산의 혼합 조성물, LDH 농도: 2U/mL, L-말산 농도: 300mM)을 사용하여 상기 4.에 기재된 열안정성의 평가 방법에 따라 PkLDH는 55℃에서, CaLDH와 OgLDH는 50℃에서 15분 가열 처리 후의 활성 잔존율(%)을 가열 전의 활성을 100으로 하여 산출했다. 비교예로서 효소 희석액 중에 L-말산을 첨가하지 않은 것에 대해서 동일한 시험을 행하고 양자의 활성 잔존율을 비교하였다.
그 결과, 표 3에 나타내는 바와 같이 3종의 LDH 전부에 있어서 L-말산을 첨가함으로써 LDH의 안정성이 향상되는 것이 확인되었다.
Figure pct00005
7. 말산 첨가에 의한 LDH의 안정성 향상 효과의 검증 4
말산 첨가에 의한 안정화 효과의 농도 의존성을 조사하였다. 상기에서 취득한 LDH 표품(PkLDH)을 효소 농도가 2U/mL가 되도록 효소 희석액(150mM 인산칼륨 완충액 중, 종농도 10mM, 30mM, 100mM, 300mM, 500mM이 되도록 L-말산을 첨가하고, NaOH를 사용하여 pH 7.5로 조정한 후, 종농도 0.15%(w/v)가 되도록 소 혈청 알부민을 첨가하여 조제)를 사용하여 희석하였다. 이 희석된 효소 용액(효소와 L- 말산의 혼합 조성물, LDH 농도: 2U/mL, L-말산 농도: 10mM, 30mM, 100mM, 300mM, 500mM)에 대해 상기 4.에 기재된 방법에 따라 55℃에서 15분 가열 처리하였다. 가열 처리 후의 활성 잔존율(%)을 가열 전의 활성을 100으로 하여 산출했다.
그 결과, 표 4에 나타내는 바와 같이 첨가하는 말산의 농도를 높임으로써 LDH의 안정성이 향상되는 경향이 확인되었다.
Figure pct00006
8. 다양한 화합물 첨가에 의한 LDH의 안정성 향상 효과의 검증 2
상기에서 얻은 CaLDH 정제 표품을 사용하여 상기 4.에 기재된 LDH의 열안정성의 평가 방법에 따라 LDH의 안정화제의 첨가 유무에 있어서의 잔존 활성률을 비교함으로써 안정화제의 탐색을 행하였다.
150mM의 인산칼륨 완충액, 300mM의 각종 화합물(말토스 일수화물, 에틸렌디아민테트라아세트산)과 0.15%(w/v) 소 혈청 알부민(BSA)을 포함하는 LDH 용액(2U/mL)을 사용하여 LDH의 잔류 활성률을 산출하였다. 상기 각종 LDH 용액은 각종 화합물을 각각 첨가한 후에 pH 7.5가 되도록 조정을 행하였다. 가열 처리는 50℃, 15분간 행하였다. 비교예로서 각종 화합물을 첨가하지 않고 조제한 LDH 용액(pH를 7.5로 조정한 150mM 인산칼륨 완충액, 0.15%(w/v) BSA를 포함)을 사용한 경우에도 마찬가지로 시험을 행하였다.
그 결과, 말토스 일수화물에 의한 LDH의 안정성 향상 효과는 5%이고, 에틸렌디아민테트라아세트산에 의한 LDH의 안정성 향상 효과는 56%였다. 즉, 말토오스 일수화물이나 에틸렌디아민테트라아세트산을 첨가함으로써 LDH의 열안정성이 향상되는 것이 밝혀졌다.
9. 다양한 화합물 첨가에 의한 LDH의 안정성 향상 효과의 검증 3
상기에서 얻은 OgLDH 정제 표품을 사용하여 상기 4.에 기재된 LDH의 열안정성의 평가 방법에 따라 LDH의 안정화제의 첨가 유무에 있어서의 잔존 활성률을 비교함으로써 안정화제의 탐색을 행하였다.
150mM의 인산칼륨 완충액, 300mM의 각종 화합물(글리신, L-라이신 염산염, L-히스티딘, 말론산이나트륨)과 0.15%(w/v) BSA를 포함하는 LDH 용액(2U/mL)를 사용하여 LDH의 잔존 활성률을 산출하였다. 상기 각종 LDH 용액은 각종 화합물을 각각 첨가한 후에 pH 7.5가 되도록 조정을 행하였다. 가열 처리는 50℃, 15분간 행하였다. 비교예로서 각종 화합물을 첨가하지 않고 조제한 LDH 용액(pH를 7.5로 조정한 150mM 인산칼륨 완충액, 0.15%(w/v) BSA를 포함)을 사용한 경우에도 마찬가지로 시험을 행하였다.
그 결과, 글리신에 의한 LDH의 안정성 향상 효과는 11%, L-라이신 염산염에 의한 LDH의 안정성 향상 효과는 66%, L-히스티딘에 의한 LDH의 안정성 향상 효과는 27%, 말론산이나트륨에 의한 LDH의 안정성 향상 효과는 96%였다. 즉, 글리신, L-라이신염산염, L-히스티딘이나 말론산이나트륨을 첨가함으로써 LDH의 열안정성이 향상되는 것이 밝혀졌다. 그 중에서도 특히 말론산이나트륨의 LDH의 안정성 향상 효과가 높았다.
10. 다양한 화합물 첨가에 의한 LDH의 안정성 향상 효과 검증 4
상기에서 취득한 ScLDH의 균체 파쇄액 상청을 이용하여, 상기 4.에 기재된 LDH의 열안정성의 평가 방법에 따라 LDH의 안정화제의 첨가 유무에 있어서의 잔존 활성률을 비교함으로써 안정화제의 탐색을 행하였다.
150mM 인산칼륨 완충액, 300mM 각종 화합물(L-말산, 말론산이나트륨, 황산암모늄)과 0.15%(w/v) BSA를 포함하는 LDH 용액(2U/mL)을 사용하여 LDH의 잔존 활성률을 산출하였다. 상기 각종 LDH 용액은 각종 화합물을 각각 첨가한 후에 pH 7.5가 되도록 조정을 행하였다. 가열 처리는 40℃, 15분간 행하였다. 비교예로서 각종 화합물을 첨가하지 않고 조제한 LDH 용액(pH를 7.5로 조정한 150mM 인산칼륨 완충액, 0.15%(w/v) BSA를 포함)을 사용한 경우에도 마찬가지로 시험을 행하였다.
그 결과, L-말산에 의한 ScLDH의 안정성 향상 효과는 41%, 말론산이나트륨에 의한 ScLDH의 안정성 향상 효과는 26%, 황산암모늄에 의한 LDH의 안정성 향상 효과는 24%였다. 즉, PkLDH, CaLDH, OgLDH와 마찬가지로 ScLDH도 L-말산, 말론산이나트륨, 황산암모늄을 첨가함으로써 열안정성이 향상되는 것이 밝혀졌다.
11. 다양한 화합물 첨가에 의한 LDH의 안정성 향상 효과의 검증 5
상기에서 얻은 PkLDH 정제 표품을 사용하여 또한 마찬가지로 상기 4.에 기재된 LDH의 열안정성의 평가 방법에 준하여 안정화제의 탐색을 행하였다. 단, 완충액을 인산칼륨 완충액으로부터 150 mM의 HEPES 완충액으로 바꾸어 실시하였다. 표 5에 기재된 300mM의 각종 화합물과 0.15%(w/v) 소 혈청 알부민(BSA)을 포함하는 LDH 용액(2U/mL)을 사용하여 상기 열안정성의 평가 방법에 따라 LDH의 잔존 활성률을 계산하였다. 단, 폴리에틸렌글리콜, 폴리라이신의 경우만 종농도를 2%가 되도록 첨가하였다. 상기 각종 LDH 용액은 각종 화합물을 각각 첨가한 후에 pH 7.5가 되도록 조정을 행하였다. 가열 처리는 55℃, 15분간 행하였다. 비교예로서 각종 화합물을 첨가하지 않고 조제한 LDH 용액(pH를 7.5로 조정한 150mM HEPES 완충액, 0.15%(w/v) BSA를 포함)을 사용한 경우에도 마찬가지로 시험을 행하였다.
그 결과, 인산칼륨, 폴리에틸렌글리콜, ε폴리라이신을 첨가했을 때에 LDH의 안정성이 향상되는 것이 밝혀졌다(표 5). 특히, 인산칼륨, 폴리라이신을 첨가한 경우에는 화합물 첨가 없는 활성 잔존율(%)이 27%인 것에 대조적으로, 활성 잔존율(%)이 70%를 초과하여 현저하게 높은 안정성 확인되었다. 또한, L-말산과 말론 산 이나트륨과 같은 지금까지 발견된 안정제는 인산염 완충액뿐만 아니라 HEPES 완충액에 첨가했을 때에도 안정화 효과를 발휘하여 완충액 종류에 관계없이 안정화제로서 유효한 것을 알 수 있었다. 이로부터 상기에서 발견된 각종 안정화 향상에 기여하는 화합물이 완충액의 종류에 관계없이 효과를 발휘할 수 있다는 것이 시사된다.
Figure pct00007
12. 다양한 화합물 첨가에 의한 LDH의 안정성 향상 효과의 검증 6
상기에서 취득한 PkLDH 정제 표품을 사용하여 또한 마찬가지로 상기 4.에 기재된 LDH의 열안정성의 평가 방법에 준하여 안정화제의 탐색을 행하였다. 표 6에 기재된 2%(w/v)의 각종 화합물과 0.15%(w/v) 소 혈청 알부민(BSA)을 포함하는 LDH 용액(3U/mL)을 사용하여 상기 열안정성의 평가 방법에 따라 LDH의 잔존 활성률을 산출했다. 상기 각종 LDH 용액은 각종 화합물을 각각 첨가한 후 pH 7.5가 되도록 조정을 행하였다. 가열 처리는 55℃, 15분간 행하였다. 비교예로서 각종 화합물을 첨가하지 않고 조제한 LDH 용액(pH를 7.5로 조정한 150mM 인산칼륨 완충액, 0.15%(w/v) BSA를 포함)을 사용한 경우에도 마찬가지로 시험을 행하였다.
다양한 안정화제를 첨가함으로써 LDH의 안정성 향상 효과의 정도는 다양한 안정화제를 첨가한 후의 LDH의 잔존 활성률(%)을 측정하고, 안정화제를 첨가하지 않은 조건에서의 잔류 활성률(%)과 비교함으로써 평가하였다. 구체적으로는 비교로 하는 안정화를 첨가하고 있지 않을 때의 잔존 활성률을 100으로 했을 때의, 안정화제를 첨가한 조건에서의 잔존 활성률의 상대값을 산출하고 이것이 100보다도 큰 것을 안정성 향상 효과가 있다고 평가했다. 예를 들면, 비교로 하는 안정화제를 첨가하지 않은 조건의 잔존 활성률이 30%이고, 안정화제를 첨가한 조건의 잔존 활성률이 45%였던 경우 잔존 활성의 상대값은 150이 된다.
시험의 결과, α폴리라이신이나 평균 분자량이나 측쇄의 구조가 상이한 2종류의 폴리에틸렌이민을 첨가했을 때에 LDH의 안정성이 향상되는 것이 밝혀졌다(표 6). 특히, 분지형 폴리에틸렌이민을 첨가한 경우에는 화합물 첨가 없는 잔존 활성의 상대값을 100으로 했을 때에 잔존 활성의 상대값이 290을 초과하여 현저하게 높은 안정성이 확인되었다. 또한, 폴리라이신이나 폴리에틸렌이민과 같은 양이온 폴리머는 그 분자량에 관계없이 안정화 효과를 발휘하고, 양이온성의 측쇄가 상이해도 안정화제로서 유효하다는 것을 알 수 있었다. 이것으로부터 상기에서 발견한 각종 안정화 향상에 기여하는 폴리머 화합물이 분자량에 관계없이 효과를 발휘할 수 있다는 것이 시사된다.
Figure pct00008
13. 다양한 화합물 첨가에 의한 LDH의 안정성 향상 효과의 검증 7
상기에서 취득한 PkLDH 정제 표품을 사용하여 또한 마찬가지로 상기 4.에 기재된 LDH의 열안정성의 평가 방법에 준하여, 안정화제의 탐색을 행하였다. 표 7에 기재된 질량 퍼센트 농도 또는 몰 농도의 각종 화합물과 0.15%(w/v) 소 혈청 알부민(BSA)을 포함하는 LDH 용액(3U/mL)을 사용하여, 상기 열안정성의 평가 방법에 따라 LDH의 잔류 활성률을 산출하였다. 상기 각종 LDH 용액은 각종 폴리머 화합물을 각각 첨가한 후에 pH 7.5가 되도록 조정을 행하였다. 가열 처리는 55℃, 15분간 행하였다. 비교예로서 각종 화합물을 첨가하지 않고 조제한 LDH 용액(pH를 7.5로 조정한 150mM 인산칼륨 완충액, 0.15%(w/v) BSA를 포함)을 사용한 경우에도 마찬가지로 시험을 행하였다.
그 결과, 히알루론산나트륨, 메틸글리콜키토산, 카르복시메틸셀룰로오스나트륨, 폴리(염화디알릴디메틸암모늄)을 첨가했을 때에 LDH의 안정성이 향상되는 것이 밝혀졌다(표 7). 또한, 안정화제로서 기능할 수 있는 폴리머는 측쇄의 관능기에 카르복시기 등의 음이온성의 것이나, 아미노기 등의 양이온성의 것을 갖고 있으면 어떠한 구조이어도 되고, 그 구조에 관계없이 안정화 효과를 발휘한다는 것이 시사된다.
Figure pct00009
14. LDH를 도포한 인쇄 전극을 이용한 전류 측정에서의 안정화제 첨가 효과의 검증 1
상기에서 얻어진 PkLDH 정제 표품을 이용하여 효소 전극을 제작하고, 크로노암페로메트리 측정을 행하였다. 각종 화합물을 효소 용액에 미리 첨가함으로써 건조 공정에서 효소의 안정화 효과를 볼 수 있는지 검토하였다. 표 8에 기재된 농도(0.2%(w/v), 2%(w/v) 또는 50mM)의 각종 화합물을 포함하는 1U의 LDH 용액을 스크린 인쇄 카본 전극 C110(Metrohm-Dropsens사 제조)에 4μL 도포하고, 40℃, 60분간 건조시켰다. 각종 화합물을 첨가하지 않고 조제한 LDH 용액을 사용한 경우에도 마찬가지로 행하였다. 제작된 전극은 전용 커넥터 (Drop Sense사 제조, DRP-CAC)를 사용하여 ALS 전기 화학 분석기 814D (BAS사 제조)에 접속하였다. 이어서, 100㎕의 2mM mPMS/PBS 용액을 적가하고, 건조시킨 LDH를 용해시켰다. 인가 전압은 +200mV(vs Ag/Ag+)로 하였다. L-락트산나트륨 용액을 첨가하고, 측정 개시로부터 5초 후의 응답 전류값을 기록하였다. 그 결과, 표 8에 나타내는 바와 같이, 어느 화합물을 첨가했을 경우에 화합물을 첨가하지 않은 경우와 비교하여 전류값이 커졌다. 또한, 상기와 마찬가지로 하여 1% 폴리아크릴산을 포함하는 1U의 LDH 용액을 스크린 인쇄 카본 전극에 도포, 건조시키고, 100㎕의 2mM mPMS/PBS 용액을 적하하고, 건조시킨 LDH를 용해시켰다. 종농도 2 ~ 10mM이 되도록 L-락트산나트륨 용액을 첨가하고, 측정 개시로부터 5초 후의 응답 전류값을 기록하였다. 그 결과, 종농도 10mM L-락트산나트륨 첨가시의 전류값은 20μA였다. 폴리아크릴산을 첨가하지 않았을 때의 전류값은 14μA이고, 폴리아크릴산을 첨가한 쪽이 높은 전류값이었다. 또한, 종농도 2 ~ 10mM L-락트산나트륨 첨가시의 전류값을 종축, 락트산 농도를 횡축으로 한 그래프를 제작했을 때의 직선성은 R2=0.97이며, L-락트산을 정량할 수 있는 것으로 나타났다. 이 결과로부터, 액상 시험에서의 결과로 효과가 있었던 화합물은 전극을 제작할 때의 건조 공정에서 효소의 실활을 억제할 수 있고, 효소의 안정화 효과를 발휘한다는 것이 시사되었다.
Figure pct00010
15. LDH를 도포한 인쇄 전극을 이용한 전류 측정에 있어서의 안정화제 첨가 효과의 검증 2
안정화제로서 첨가하는 화합물, 및 기질로서 사용하는 L-락트산나트륨의 농도를 바꾸어 전항에서 행한 크로노암페로메트리 측정의 실험을 행하였다. 전항과 동일한 수순으로 작성한 전극에 100μL의 5mM mPMS/PBS 용액을 적하하고, 건조시킨 LDH를 용해시켰다. 인가 전압은 +200mV(vs Ag/Ag+)로 하였다. L-락트산나트륨 용액을 첨가하고, 측정 개시로부터 5초 후의 응답 전류값을 기록하였다. 그 결과, 표 9에 나타내는 바와 같이 말산나트륨이나 myo-이노시톨을 첨가한 경우에도 화합물을 첨가하지 않은 경우와 비교하여 전류값이 커졌다. 또한, 첨가하는 폴리머의 농도를 희석해도 화합물을 첨가하지 않은 경우와 비교하여 전류값이 커졌다. 또한, 지금까지 안정성 향상 효과가 보여진 화합물은 락트산 농도가 0 ~ 10 mM의 어느 범위에서 사용해도 마찬가지로 안정성 향상 효과를 나타냈다. 이 결과로부터 액상 시험에서의 결과로 효과가 있던 화합물은 전극을 제작할 때의 건조 공정에서 그 농도에 관계없이 효소의 실활을 억제할 수 있고 효소의 안정화 효과를 발휘하는 것으로 나타났다. 또한, LDH가 전극상에서 0 ~ 10mM의 락트산과 반응할 때에 첨가한 화합물과 공존하고 있어도 충분히 활성을 나타내는 것이 밝혀졌다.
Figure pct00011
또한, 표 중에는 나타내지 않았지만, 락트산이 10mM 존재하는 경우에도 락트산 5mM의 경우와 마찬가지로 LDH 안정성 향상 효과가 확인되었다.
본 명세서에 인용된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 그대로 인용에 의해 본 명세서에 통합되는 것으로 한다.
서열의 설명
서열번호 1 Saccharomyces cereviciae 유래 락트산 데히드로게나제 (ScLDH) (단, 야생형의 1 ~ 85위는 제거)
서열번호 2 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열
서열번호 3 Pichia kudriavzevii 유래 락트산 데히드로게나제(PkLDH)의 아미노산 서열
서열번호 4 서열번호 3의 2 ~ 77위의 서열을 제거한 서열
서열번호 5 서열번호 4의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열
서열번호 6 Candida inconspica 유래의 락트산 데히드로게나제 (CaLDH)의 아미노산 서열
서열번호 7 서열번호 6의 2 ~ 67위를 제거한 서열
서열번호 8 서열번호 7의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열
서열번호 9 Ogataea parapolymorpha 유래의 락트산 데히드로게나제 (OgLDH)의 아미노산 서열
서열번호 10 서열번호 9의 2 ~ 56위를 제거한 서열
서열번호 11 서열번호 10의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열
SEQUENCE LISTING <110> Kikkoman Corporation <120> A method for improving the stability of a composition containing flavin-dependent lactate dehydrogenase <130> PH-9027-PCT <150> JP 2020-163631 <151> 2020-09-29 <160> 11 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 506 <212> PRT <213> enzyme <400> 1 Met Asn Lys Gln Lys Ile Ser Pro Ala Glu Val Ala Lys His Asn Lys 1 5 10 15 Pro Asp Asp Cys Trp Val Val Ile Asn Gly Tyr Val Tyr Asp Leu Thr 20 25 30 Arg Phe Leu Pro Asn His Pro Gly Gly Gln Asp Val Ile Lys Phe Asn 35 40 45 Ala Gly Lys Asp Val Thr Ala Ile Phe Glu Pro Leu His Ala Pro Asn 50 55 60 Val Ile Asp Lys Tyr Ile Ala Pro Glu Lys Lys Leu Gly Pro Leu Gln 65 70 75 80 Gly Ser Met Pro Pro Glu Leu Val Cys Pro Pro Tyr Ala Pro Gly Glu 85 90 95 Thr Lys Glu Asp Ile Ala Arg Lys Glu Gln Leu Lys Ser Leu Leu Pro 100 105 110 Pro Leu Asp Asn Ile Ile Asn Leu Tyr Asp Phe Glu Tyr Leu Ala Ser 115 120 125 Gln Thr Leu Thr Lys Gln Ala Trp Ala Tyr Tyr Ser Ser Gly Ala Asn 130 135 140 Asp Glu Val Thr His Arg Glu Asn His Asn Ala Tyr His Arg Ile Phe 145 150 155 160 Phe Lys Pro Lys Ile Leu Val Asp Val Arg Lys Val Asp Ile Ser Thr 165 170 175 Asp Met Leu Gly Ser His Val Asp Val Pro Phe Tyr Val Ser Ala Thr 180 185 190 Ala Leu Cys Lys Leu Gly Asn Pro Leu Glu Gly Glu Lys Asp Val Ala 195 200 205 Arg Gly Cys Gly Gln Gly Val Thr Lys Val Pro Gln Met Ile Ser Thr 210 215 220 Leu Ala Ser Cys Ser Pro Glu Glu Ile Ile Glu Ala Ala Pro Ser Asp 225 230 235 240 Lys Gln Ile Gln Trp Tyr Gln Leu Tyr Val Asn Ser Asp Arg Lys Ile 245 250 255 Thr Asp Asp Leu Val Lys Asn Val Glu Lys Leu Gly Val Lys Ala Leu 260 265 270 Phe Val Thr Val Asp Ala Pro Ser Leu Gly Gln Arg Glu Lys Asp Met 275 280 285 Lys Leu Lys Phe Ser Asn Thr Lys Ala Gly Pro Lys Ala Met Lys Lys 290 295 300 Thr Asn Val Glu Glu Ser Gln Gly Ala Ser Arg Ala Leu Ser Lys Phe 305 310 315 320 Ile Asp Pro Ser Leu Thr Trp Lys Asp Ile Glu Glu Leu Lys Lys Lys 325 330 335 Thr Lys Leu Pro Ile Val Ile Lys Gly Val Gln Arg Thr Glu Asp Val 340 345 350 Ile Lys Ala Ala Glu Ile Gly Val Ser Gly Val Val Leu Ser Asn His 355 360 365 Gly Gly Arg Gln Leu Asp Phe Ser Arg Ala Pro Ile Glu Val Leu Ala 370 375 380 Glu Thr Met Pro Ile Leu Glu Gln Arg Asn Leu Lys Asp Lys Leu Glu 385 390 395 400 Val Phe Val Asp Gly Gly Val Arg Arg Gly Thr Asp Val Leu Lys Ala 405 410 415 Leu Cys Leu Gly Ala Lys Gly Val Gly Leu Gly Arg Pro Phe Leu Tyr 420 425 430 Ala Asn Ser Cys Tyr Gly Arg Asn Gly Val Glu Lys Ala Ile Glu Ile 435 440 445 Leu Arg Asp Glu Ile Glu Met Ser Met Arg Leu Leu Gly Val Thr Ser 450 455 460 Ile Ala Glu Leu Lys Pro Asp Leu Leu Asp Leu Ser Thr Leu Lys Ala 465 470 475 480 Arg Thr Val Gly Val Pro Asn Asp Val Leu Tyr Asn Glu Val Tyr Glu 485 490 495 Gly Pro Thr Leu Thr Glu Phe Glu Asp Ala 500 505 <210> 2 <211> 1521 <212> DNA <213> enzyme <400> 2 atgaacaaac agaaaatctc cccggcggaa gtggctaaac ataacaaacc ggatgactgc 60 tgggtggtga tcaacggcta tgtgtacgat ctgacccgtt ttctgccgaa ccacccgggc 120 ggtcaggatg ttatcaaatt caacgccggt aaagacgtca cggctatctt cgaaccgctg 180 catgcgccga atgtgattga taaatatatc gccccggaga aaaaactggg cccgctgcag 240 ggttctatgc cgccagaact ggtttgcccg ccgtacgcac cgggcgaaac caaagaagat 300 attgctcgca aagaacaact gaaatcgctg ctgccgccgc tggataacat catcaacctg 360 tacgacttcg aatacctggc gagccagacc ctgacgaaac aagcgtgggc ctattacagc 420 tctggcgcga acgatgaagt gacccatcgt gaaaaccaca atgcctatca tcgcattttc 480 tttaaaccga aaatcctggt cgatgtgcgt aaagtggata tttccaccga catgctgggt 540 tcacacgttg acgtcccgtt ctatgtttct gcaacggctc tgtgcaaact gggcaatccg 600 ctggaaggtg aaaaagatgt ggcccgcggc tgtggtcagg gcgtgaccaa agttccgcaa 660 atgattagta cgctggccag ttgttccccg gaagaaatta tcgaagcggc cccgtctgat 720 aaacagattc aatggtatca gctgtacgtt aacagtgacc gtaaaatcac cgatgacctg 780 gtcaaaaatg tggaaaaact gggcgtcaaa gcactgtttg tgacggttga tgctccgtcc 840 ctgggtcagc gcgaaaaaga catgaaactg aaattctcaa acaccaaagc aggcccgaaa 900 gctatgaaga aaaccaatgt ggaagaatca cagggtgcgt cgcgtgccct gagcaaattt 960 attgatccga gcctgacctg gaaagacatc gaagaactga aaaagaaaac caaactgccg 1020 attgttatca aaggtgtcca gcgcaccgaa gatgtcatta aagcagctga aatcggcgtg 1080 tctggtgtgg ttctgagtaa ccatggcggt cgtcagctgg actttagccg cgcgccgatt 1140 gaagttctgg ccgaaaccat gccgatcctg gaacaacgta atctgaaaga taaactggaa 1200 gtctttgtgg atggcggtgt gcgtcgcggt accgatgttc tgaaagcgct gtgcctgggt 1260 gccaaaggtg tcggcctggg tcgtccgttc ctgtatgcaa actcctgtta cggccgcaat 1320 ggtgtggaaa aagctattga aatcctgcgt gatgaaattg aaatgtcgat gcgtctgctg 1380 ggcgtgacca gcattgcaga actgaaaccg gatctgctgg acctgagtac cctgaaagca 1440 cgcacggttg gtgtcccgaa tgatgtcctg tataacgaag tgtatgaagg cccgaccctg 1500 acggaatttg aagatgcgta a 1521 <210> 3 <211> 578 <212> PRT <213> enzyme <400> 3 Met Leu Leu Arg Ser Leu Asn Ser Ser Ala Arg Cys Val Lys Gln Thr 1 5 10 15 Thr Arg Thr Lys Val Arg Tyr Leu Ser His Val Ser Gly Ala Ser Met 20 25 30 Ala Lys Pro Thr Leu Lys Asn Asn Ser Arg Glu Ser Asn Lys Ser Arg 35 40 45 Asn Tyr Leu Ile Ala Ala Val Thr Ala Leu Ala Val Ser Thr Ser Ile 50 55 60 Gly Val Ala Val His Val Lys Asp Pro Leu Tyr Asn Asp Ala Thr Gly 65 70 75 80 Ser Asp Ser Pro Arg Ser Ile Ser Val Asp Glu Phe Val Lys His Asn 85 90 95 Ser Gln Asn Asp Cys Trp Ile Ala Ile Asn Gly Lys Val Tyr Asp Phe 100 105 110 Thr Asp Phe Ile Pro Asn His Pro Gly Gly Val Pro Pro Leu Val Asn 115 120 125 His Ala Gly Tyr Asp Gly Thr Lys Leu Tyr Glu Lys Leu His Pro Lys 130 135 140 Gly Thr Ile Glu Lys Phe Leu Pro Lys Asp Lys Phe Leu Gly Val Leu 145 150 155 160 Asp Gly Glu Ala Pro Lys Leu Glu Ala Asp Tyr Leu Val Asp Asp Asp 165 170 175 Glu Gln Glu Arg Leu Asp Tyr Leu Asn Asn Leu Pro Pro Leu Ser Ser 180 185 190 Ile Gln Asn Val Tyr Asp Phe Glu Tyr Leu Ala Lys Lys Ile Leu Pro 195 200 205 Lys Asp Ala Trp Ala Tyr Tyr Ser Cys Gly Ala Asp Asp Glu Ile Thr 210 215 220 Met Arg Glu Asn His Tyr Ala Tyr Gln Arg Val Tyr Phe Arg Pro Arg 225 230 235 240 Ile Cys Val Asp Val Lys Glu Val Asp Thr Ser Tyr Glu Met Leu Gly 245 250 255 Thr Lys Thr Ser Val Pro Phe Tyr Val Ser Ala Thr Ala Leu Ala Lys 260 265 270 Leu Gly His Pro Asp Gly Glu Cys Ser Ile Ala Arg Gly Ala Gly Lys 275 280 285 Glu Gly Val Val Gln Met Ile Ser Thr 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cagggggtgt cccacccctg gtgaatcacg ccggttacga cggtacgaaa 180 ctgtatgaaa aactgcatcc taaaggtacc attgaaaaat ttttaccgaa agataaattt 240 cttggcgtgt tagacggcga ggctccgaag ctggaggcgg attacctggt tgacgacgac 300 gaacaggaaa gactggacta cttgaacaat ttgccgcctt tatccagtat tcagaatgtc 360 tacgacttcg agtatttggc aaaaaagatt ctgcctaagg atgcttgggc ctactacagc 420 tgcggtgcag atgacgagat aacgatgcgc gaaaaccatt atgcgtatca acgcgtttac 480 ttccgtccgc gcatttgcgt tgatgtgaag gaagttgata ctagctatga aatgctgggt 540 actaaaacca gcgtgccgtt ttatgttagt gccaccgcat tggcgaaact gggtcatccc 600 gatggtgagt gctcaattgc acgtggcgct ggtaaggaag gtgtcgttca gatgatttca 660 actctgtcat caatgagtct ggatgaaata gcggcggcac ggattccagg ggcgacccag 720 tggtttcagc tgtatattaa tgaggatcgt aatgtcgcta agggtctggt taaacatgca 780 gaagacctgg gtatgaaggc aatttttata accgtggacg caccgtcctt aggcaatcgt 840 gagaaggata agcgtctgaa atttgttaac gacacggatg tagatctggg ggactcagcc 900 gaccgtaatt cgggagcgtc caaggctctg agttcgttta tagatgcaag tgtttcttgg 960 aacgatgtga aagccgtgaa gtcgtggacc aaattacccg tgctggttaa aggagttcag 1020 accgtggaag atgtaataga agcctatgat gcaggttgtc agggggtcgt actgtctaac 1080 catggagggc gccaactgga cactgcccca ccaccgatcg aacttctggc agagacggtg 1140 ccgacattga aacgtttagg caaattacgc ccggattttg aaatcttaat cgatggcggc 1200 gtgaaacgtg ggacagacat attaaaagcc gtggcgatcg gcggccaaga tgtaagagta 1260 tctgtaggca tgggacgccc atttttatat gctaactctt gttatggaga ggcgggagtc 1320 cggaaattga tccaaaattt gaaagatgag cttgaaatgg atatgcgcct tcttggcgtc 1380 acaaaaatgg atcaactttc ttctaaacat gtagatacaa aacggcttat cggacgggat 1440 gctatcaact atctttatga taatgtatat tcccctatcg aaacagtcaa atttaataat 1500 gaagattaa 1509 <210> 6 <211> 571 <212> PRT <213> enzyme <400> 6 Met Ile Lys Asn Ser Phe Val Lys Thr Thr Gly Cys Ile Cys Lys Ser 1 5 10 15 His Ser Thr Thr Leu Ala Arg Lys Tyr Gln Phe Arg Ser Leu Thr Thr 20 25 30 Thr Ser Asn Val Gly Lys Arg Tyr Ser Asn Asn Gly Lys Asn Thr Ile 35 40 45 Lys Phe Ser Phe Thr Phe Ile Ile Ala Ser Ala Leu Ala Leu Val Thr 50 55 60 Thr His Lys Val Thr Asn 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ctgttggatc gcaataaacg gtaaggtgtt tgacgttaca 120 gaatttattc ctgaccaccc tggtggcgag attccgttga tcagccacgc tggttacgat 180 ggtaccaaag tctacgagaa aattcatccg aaaggaacca tagagaagtt tttaccggaa 240 gacaaattcc tgggcatact tgacggtgac gcaccgaagc tggaggcgga ctatctgata 300 gacgacgatg aggaggagcg ccttaagtat atagagaaca tccctccgat tagtaatatc 360 caaaacagtt atgattttga gtatatcgcc aagcatattt tgccaaaaga cgcctgggcc 420 tactattcat gcggttcaga cgacgaaatc tcaatgcgcg agaatcatta cgcatatcag 480 cgcgtttatt ttcgcccgcg catatgcgtt aatgtgaaag aggttgacac tagtacaaca 540 ctgcttggaa cacctacaag tgttccgttt tatgtatctg cgaccgccct ggctaagctg 600 ggtcatccgg atggcgaatg ttctatcgcc cgtggcgccg gtaaagaagg tgttattcag 660 atgatatcca ccttgtcttc taactctctg gaggaaatcg cccaagccag aattccaggc 720 gcaacccaat ggtttcaact ttatataaat gaaaatcgtg aaactgctaa acgcatggtt 780 aaagaagcgg aagaccttgg gatgaaagcg atattcatca ccgttgatgc tccgtccctg 840 gggaaccgcg aaaaagacaa aagagaaaaa ttcgtggatg acactgatgt cgatttaggg 900 gacggagttg atcgtaacag cggcgcgagc aaggcactga gcgcgtttat tgattgcagc 960 gttgattgga atgatgtgaa agaagtaaag tcctggacga aactgcctgt gttaattaaa 1020 ggtgtgcaga ccgtggaaga tgtgatcgaa gcgtacgatg ctggctgtca gggtgtggta 1080 ctgtccaatc atggcggtag acagctggat actgctcccc ccccaattga actgcttgct 1140 gaaactgtcc ccgtgatgaa gaaattaaac aaactgagac ccgattttga aattctgtta 1200 gatggcggtg tcaaacgtgg cacggatatt ctgaaagcgg tagcaatcgg aggcaaagat 1260 attcgtgtgg gagtgggact ggggcgtcca tttctgtatg caaattcgtg ttatggggaa 1320 gatggagtcc gtaaactgat tcagatttta aaagatgaac ttgaaatgga tatgcggtta 1380 ttaggggtca cgaaaatttc ggatttgacg ccaaaattcg tagatacgcg tcggttgatt 1440 gggcgggaag cagtcaacta tttgtacgat gatgtataca atcatattcc aacggtcaaa 1500 ttccggaatg atgattaa 1518 <210> 9 <211> 558 <212> PRT <213> enzyme <400> 9 Met Trp Arg Thr Ser Tyr Arg Ala Phe Thr Thr Gly Lys Lys Pro Leu 1 5 10 15 Pro Arg Leu Ser Arg Thr Leu Ala Ser Ser Ala Lys Arg Phe Pro Arg 20 25 30 Arg Ser Leu Gly Ala Ala Ile Val Ala Gly Leu Gly Ala Ala Leu Val 35 40 45 Cys Thr Gln Leu Pro Gly Arg 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tgactgctgg gttgcgatac ggggtcaggt ttatgatatg 120 acggagttcc tgccgcacca tcctggcggt cagagcccta ttatacgtta ttcaggccac 180 gatgcaacgg agcttttcga acaattgcat cctaagggta caattgaaaa gcatttaccg 240 aaagagaagc atttgggcca actggatggt ccggccccta ccctggaagt cgccgaagac 300 gaattcgaag aagaacgtct ggagaatgta gctaatatgc ctaatgttaa tgaagttatg 360 aacttgcatg attttgagta tatagcaaag aagattctgc cgaagggtgc ctgggcgtat 420 tatagcagtg gtgctgatga cgaggttagc atgcgtgaaa atcactatgc ctaccaacgc 480 atttattttc gtccgagagt tttagttgat gttagcaaag ttgatacgag cactaccctt 540 ttgggtacgc ccacaagtgt tcctttttat gtttcggcca ccgctttagc aaagcttggc 600 cacccggacg gtgaatgtag catagcacgg ggcgccggta aagagggtgt gatacagatg 660 atttctaccc tggcatctaa ttcgctggaa gaaattgccg cggcacgggt tccgggtgca 720 acgcaatggt tccagctgta cgtcaatgaa gatcgcaatg tggctttcga aatggttaaa 780 aaagctgaga agttaggcat taaagcgatt ttcgtaactg tggatgcacc gtcactgggc 840 aaccgtgaaa aagacgctcg tgttaaattt gaaggtgagt cagatgtgca aaaatcaaac 900 gaggtggtac ggagtcaggg tgcgagtcgc gcgctgtctt cgtttatcga cacacgttta 960 acctgggatg atgtgaaaaa aatcaaacag tctactaaac tgccagtgtt aattaaaggc 1020 gtacagcgtc tggaagacgt cgtacaggca gtagatgacg gatttgatgg ggtggtgctg 1080 tccaaccatg gcgggcggca gctggatacc gcaccgcctc cggtcgaact tctggctgag 1140 gtggtgccgg aactgaaacg tcgtaataaa ctgcgtccag actttgagat ctttatcgac 1200 ggaggcgtcc gcagagggac tgacatcctg aaagcgttag cgctgggcgg acagaacgta 1260 cgcgtcggag tggggctggg gcgcccattt ctgtatgcca attcctccta cggagagaat 1320 ggggtgagaa aagccatcca gttgttaaaa gatgaacttg aaatggatat gcgcttgtta 1380 ggagtgagaa acttacgcga attggatgaa acctttgtcg atacacgccg cttgatcgga 1440 cgcgatgcgc cagatgaact ttacaaccag ctttactccc cacttaaaac agtcaaattt 1500 agaaacgaat aa 1512

Claims (16)

  1. 플라빈 화합물을 보조효소로 하는 락트산 데히드로게나제를 포함하는 조성물에 모노카르복실산, 디카르복실산, 트리카르복실산, 테트라카르복실산, 폴리카르복실산, 인산, 황산 또는 이들의 염(황산암모늄을 제외함)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 음이온, 단당, 이당, 폴리에틸렌글리콜, 혹은 이온성 폴리머를 1종 이상 공존시키는 공정을 포함하는 락트산 데히드로게나제 함유 조성물의 열안정성을 향상시키는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 락트산 데히드로게나제가 사카로마이세스속, 피키아속, 칸디다속, 오가타에아속, 브레타노마이세스속, 시베르린드넬라속, 한세니아스포라속, 카자투타니아속, 클루이베로마이세스속, 라찬세아속, 나우모보지마속, 테트라피시스포라속, 토루라스포라속, 반데르발트지마속, 자이고사카로마이세스속, 자이고토루라스포라속, 마이셀리오프토라속, 써모세로마이세스속, 카에토뮴속, 또는 마두렐라속 유래의 락트산 데히드로게나제인 방법.
  3. 청구항 1에 있어서, 락트산 데히드로게나제가 이하의 (i) 및/또는 (ii)인, 락트산 데히드로게나제 함유 조성물의 열안정성을 향상시키는 방법:
    (i) 서열번호 1, 서열번호 4, 서열번호 7, 또는 서열번호 10에 나타내는 아미노산 서열과의 동일성이 70% 이상 또는 80% 이상의 아미노산 서열을 갖는 락트산 데히드로게나제,
    (ii) 서열번호 4의 제138 ~ 140위, 186 ~ 194위, 217 ~ 222위, 243 ~ 245위, 271 ~ 278위, 280 ~ 283위, 355 ~ 367위, 398 ~ 401위, 403 ~ 401위, 403 ~ 406위 및 425 ~ 433위의 아미노산 서열로 이루어진 상동성 영역에서의 아미노산 서열과 해당 락트산 데히드로게나제의 대응하는 위치의 상동성 영역에서의 아미노산 서열이 80% 이상 또는 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 락트산 데히드로게나제.
  4. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서, 모노카르복실산은 글루콘산, 류신산, 3-페닐락트산, 글리신, 라이신, 히스티딘 및 아르기닌으로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    디카르복실산이 말산, 숙신산, 말레산, 푸마르산, 말론산, 메틸말론산, 옥살로아세트산, 타르타르산, 옥살산, 숙신산, 글루타르산, α-케토글루타르산, 아디프산, 피메르산, 수베르산, 아젤라산, 세바스산, 프탈산, 이소프탈산, 테레프탈산, 글루타콘산, 타르트론산, 무콘산, 메사콘산, 시트라콘산, 메콘산, 3-3' 디메틸글루타르산, 이타콘산, 글루탐산, 아스파르트산, 및 3-히드록시아스파라긴으로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    트리카르복실산은 시트르산, 이소시트르산, 아코니트산, 트리메신산, 1,2,3-프로판트리카르복실산, 및 2-포스포노부탄-1,2,4-트리카르복실산으로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    테트라카르복실산은 에틸렌디아민 테트라아세트산으로부터 선택되고,
    인산은 인산염 및 피로인산염으로 이루어진 군에서 선택되고,
    황산이 황산염으로부터 선택되고,
    단당은 myo-이노시톨로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    이당은 수크로오스, 트레할로스, 및 말토오스로 이루어진 군으로부터 선택되거고, 또는 폴리에틸렌글리콜,
    이온성 폴리머가 음이온성 폴리머이거나, 또는 양이온성 폴리머이고,
    음이온성 폴리머가 폴리아크릴산, 히알루론산, 및 카르복시메틸셀룰로오스 혹은 이들의 염으로 이루어지는 군으로부터 선택되거나, 혹은
    양이온성 폴리머가 폴리라이신, 폴리에틸렌이민, 메틸글리콜 키토산 및 폴리 (염화디알릴디메틸암모늄)으로부터 선택되는 락트산 데히드로게나제 함유 조성물의 열안정성을 향상시키는 방법.
  5. 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서, 모노카르복실산, 디카르복실산, 트리카르복실산, 테트라카르복실산, 폴리카르복실산, 인산, 황산 또는 이들의 염으로 이루어진 군으로부터 선택된 음이온, 단당, 이당, 음이온성 폴리머 또는 양이온성 폴리머가 용액 중에서 0.01중량% 내지 30중량%의 범위로 포함되는, 락트산 데히드로게나제 함유 조성물의 열안정성을 향상시키는 방법.
  6. 플라빈 화합물을 보조효소로 하는 락트산 데히드로게나제 및 모노카르복실산, 디카르복실산, 트리카르복실산, 테트라카르복실산, 폴리카르복실산, 인산, 황산 또는 이들의 염(황산암모늄을 제외함)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 음이온, 단당, 이당, 폴리에틸렌글리콜, 이온성 폴리머 중 어느 한 종류 이상의 화합물을 포함하는 락트산 측정용 조성물.
  7. 청구항 6에 있어서,
    락트산 데히드로게나제가 사카로마이세스속, 피키아속, 칸디다속, 오가타에아속, 브레타노마이세스속, 시베르린드넬라속, 한세니아스포라속, 카자투타니아속, 클루이베로마이세스속, 라찬세아속, 나우모보지마속, 테트라피시스포라속, 토루라스포라속, 반데르발트지마속, 자이고사카로마이세스속, 자이고토루라스포라속, 마이셀리오프토라속, 써모세로마이세스속, 카에토뮴속, 또는 마두렐라속 유래의 락트산 데히드로게나제인, 락트산 측정용 조성물.
  8. 청구항 6에 있어서, 락트산 데히드로게나제가 이하 (i) 및/또는 (ii)인, 조성물:
    (i) 서열번호 1, 서열번호 4, 서열번호 7, 또는 서열번호 10에 나타내는 아미노산 서열과의 동일성이 70% 이상 또는 80% 이상의 아미노산 서열을 갖는 락트산 데히드로게나제,
    (ii) 서열번호 4의 제138 ~ 140위, 186 ~ 194위, 217 ~ 222위, 243 ~ 245위, 271 ~ 278위, 280 ~ 283위, 355 ~ 367위, 398 ~ 401위, 403 ~ 401위, 403 ~ 406위 및 425 ~ 433위의 아미노산 서열로 이루어진 상동성 영역에서의 아미노산 서열과 해당 락트산 데히드로게나제의 대응하는 위치의 상동성 영역에서의 아미노산 서열이 80% 이상 또는 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 락트산 데히드로게나제.
  9. 청구항 6 내지 청구항 8 중 어느 한 항에 있어서, 모노카르복실산은 글루콘산, 류신산, 3-페닐락트산, 글리신, 라이신, 히스티딘 및 아르기닌으로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    디카르복실산이 말산, 숙신산, 말레산, 푸마르산, 말론산, 메틸말론산, 옥살로아세트산, 타르타르산, 옥살산, 숙신산, 글루타르산, α-케토글루타르산, 아디프산, 피메르산, 수베르산, 아젤라산, 세바스산, 프탈산, 이소프탈산, 테레프탈산, 글루타콘산, 타르트론산, 무콘산, 메사콘산, 시트라콘산, 메콘산, 3-3' 디메틸글루타르산, 이타콘산, 글루탐산, 아스파르트산, 및 3-히드록시아스파라긴으로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    트리카르복실산은 시트르산, 이소시트르산, 아코니트산, 트리메신산, 1,2,3-프로판트리카르복실산, 및 2-포스포노부탄-1,2,4-트리카르복실산으로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    테트라카르복실산은 에틸렌디아민 테트라아세트산으로부터 선택되고,
    인산은 인산염 및 피로인산염으로 이루어진 군에서 선택되고,
    황산이 황산염으로부터 선택되고,
    단당은 myo-이노시톨로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    이당은 수크로오스, 트레할로스, 및 말토오스로 이루어진 군으로부터 선택되거고, 또는 폴리에틸렌글리콜,
    이온성 폴리머가 음이온성 폴리머이거나, 또는 양이온성 폴리머이고,
    음이온성 폴리머가 폴리아크릴산, 히알루론산, 및 카르복시메틸셀룰로오스 혹은 이들의 염으로 이루어지는 군으로부터 선택되거나, 혹은
    양이온성 폴리머가 폴리라이신, 폴리에틸렌이민, 메틸글리콜 키토산 및 폴리 (염화디알릴디메틸암모늄)으로부터 선택되는 락트산 측정용 조성물.
  10. 청구항 6 내지 청구항 9 중 어느 한 항에 있어서, 모노카르복실산, 디카르복실산, 트리카르복실산, 테트라카르복실산, 폴리카르복실산, 인산, 황산 또는 이들 염(황산암모늄을 제외함)으로 이루어진 군으로부터 선택된 음이온, 단당, 이당, 폴리에틸렌글리콜 혹은 음이온성 폴리머 또는 양이온성 폴리머가 용액 중에서 0.01중량% 내지 30중량%의 범위로 포함되는 락트산 측정용 조성물.
  11. 청구항 6 내지 청구항 10 중 어느 한 항에 기재된 조성물을 포함하는 락트산 측정용 키트.
  12. 플라빈 화합물을 보조효소로 하는 락트산 데히드로게나제 및, 모노카르복실산, 디카르복실산, 트리카르복실산, 테트라카르복실산, 폴리카르복실산, 인산, 황산 또는 이들의 염으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 음이온, 단당, 이당, 폴리에틸렌글리콜, 이온성 폴리머 중 어느 한 종류 이상의 화합물을 포함하는 조성물을 포함하는 전극.
  13. 청구항 12에 기재된 전극을 포함하는 락트산 센서.
  14. 청구항 12에 기재된 전극을 포함하는 연료 전지.
  15. 락트산 데히드로게나제를 전극에 도포하는 공정을 포함하는 전극의 제조 방법에 있어서, 락트산 데히드로게나제의 활성 저하 또는 실활을 억제하는 방법으로서,
    i) 락트산 데하이드로게나제를 포함하는 용액을 준비하는 공정,
    ii) 상기 용액에 모노카르복실산, 디카르복실산, 트리카르복실산, 테트라카르복실산, 폴리카르복실산, 인산, 황산 또는 이들의 염으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 음이온, 단당, 이당, 폴리에틸렌글리콜, 이온성 폴리머로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상의 안정화제를 첨가하는 공정,
    iii) 상기 락트산 데하이드로게나제 및 상기 안정화제를 포함하는 용액을 전극에 도포하는 공정,
    iv) 도포한 상기 용액을 건조시키는 공정
    을 포함하는 상기 방법.
  16. 청구항 15에 있어서, 락트산 데히드로게나제를 도포한 전극이 락트산 센서에 포함되는 제조 방법.
KR1020237011749A 2020-09-29 2021-09-29 플라빈 의존성 락트산 데히드로게나제를 포함하는 조성물의 안정성을 향상시키는 방법 KR20230078697A (ko)

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