JPH04271785A - 酵素固形製剤及びその製造方法 - Google Patents

酵素固形製剤及びその製造方法

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JPH04271785A
JPH04271785A JP3440091A JP3440091A JPH04271785A JP H04271785 A JPH04271785 A JP H04271785A JP 3440091 A JP3440091 A JP 3440091A JP 3440091 A JP3440091 A JP 3440091A JP H04271785 A JPH04271785 A JP H04271785A
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JP
Japan
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enzyme
solid
disaccharides
disaccharide
preparation
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JP3440091A
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English (en)
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Naoto Yamada
直人 山田
Yutaka Ikuga
裕 生賀
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Kao Corp
Original Assignee
Kao Corp
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
    • C11D3/16—Organic compounds
    • C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
    • C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
    • C11D3/38672—Granulated or coated enzymes

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は熱安定性の高い酵素固形
製剤及びその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】酵素は、近年医薬品や食品だけでなく、
繊維、皮革、洗剤等の様々な分野で利用されている。酵
素は、一般に熱運動による構造変化やタンパク分解酵素
においては酵素相互の分解などによって失活しやすいと
いう欠点を有する。従って、酵素は水溶液の状態で流通
させるよりも、粉末、顆粒等の固形製剤として流通させ
て利用するのが望ましい。
【０００３】かかる酵素固形製剤の製造方法としては、
一般に凍結乾燥及び噴霧乾燥を利用する方法が挙げられ
る。このうち、凍結乾燥法は、大量生産には不向きであ
ることから、工業的に大量生産するには噴霧乾燥法が最
適である。また、洗剤用の酵素固形製剤においては、安
定性及び作業者や消費者が酵素を吸入した場合の安全性
等を考慮して顆粒状にする必要があることから、噴霧乾
燥が多用されている。
【０００４】ところで、噴霧乾燥を利用して酵素固形製
剤を製造する場合、通常、酵素水溶液を５０℃以上の高
温にさらすことになり、得られた酵素固形製剤の活性が
低下するという問題があった。このような高温下におけ
る酵素製剤の安定性を高める方法として、ソルビトール
を利用する方法が提案されている（米国特許第３５１５
６４２　号）が、この方法では高々４０℃における酵素
製剤の安定化が実現できたにすぎず、５０℃以上という
噴霧乾燥条件における安定化については未だ充分な方法
は見出されていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】従って本発明の目的は
、熱安定性の高い酵素固形製剤及び噴霧乾燥を利用した
酵素活性の低下しない酵素固形製剤の製造方法を提供す
ることにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】そこで、本発明者らは、
上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、酵素水溶液中
に２糖類を共存せしめれば通常の噴霧乾燥処理を行って
も酵素がほとんど失活せず、更にかくして得られた２糖
類を含有する酵素固形製剤は極めて熱安定性が優れてい
ることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】すなわち、本発明は２糖類を含有すること
を特徴とする酵素固形製剤を提供するものである。
【０００８】また、本発明は２糖類を含有する酵素水溶
液を噴霧乾燥して固形化することを特徴とする酵素固形
製剤の製造方法をも提供するものである。
【０００９】本発明に用いられる２糖類としては、特に
制限されないが、マルトース型２糖類及びトレハロース
型２糖類から選ばれる１種又は２種以上を挙げることが
できる。マルトース型２糖類としては麦芽糖、セロビオ
ース、ゲンチオビオース、メリビオース、乳糖、ツラノ
ース、ソホロース等が挙げられ、トレハロース型２糖類
としてはトレハロース、イソトレハロース、ショ糖、イ
ソサッカロースなどが挙げられる。このうち、マルトー
ス型２糖類が好ましく、特に乳糖が好ましい。２糖類の
酵素固形製剤への配合量は、酵素の種類等によっても異
なるが、酵素に対し１〜１００重量％（以下、％と略す
）、特に１０〜１００％が好ましい。
【００１０】本発明に用いられる酵素としては、特に制
限されないが、リパーゼ、セルラーゼ、プロテアーゼ、
アミラーゼ、エステラーゼ、デキストラナーゼ等が挙げ
られ、これらは単独で又は２種以上を混合して用いても
よい。このうち、セルラーゼ及びプロテアーゼが好まし
く、特にアルカリプロテアーゼＫ−１６が好ましい。
【００１１】このアルカリプロテアーゼＫ−１６は、バ
チルス・エスピー　　ＫＳＭ−１６（微工研菌寄第１１
４１８　号）が産生する酵素である。当該ＫＳＭ−１６
の菌学的性質は以下の通りである。
【００１２】〔菌学的性質〕 （Ａ）形態的性質 （ａ）細胞の形及び大きさ：桿菌　０．８〜１．０　μ
ｍ　×　２．２〜２５μｍ　 （ｂ）多形性：無し。 （ｃ）運動性：周鞭毛を有し、運動性あり。 （ｄ）胞子〔大きさ、形、位置〕：　１．０〜１．２　
μｍ　×１．４〜２．２　μｍ　、楕円形、中央準端、
胞子嚢の膨潤ややあり。 （ｅ）グラム染色：陽性 （ｆ）抗酸性：陰性 （ｇ）肉汁寒天平板上での発育形態：円形、葉状、表面
円滑、淡黄色、半透明のコロニー。 （ｈ）肉汁寒天斜面上での生育：不規則な葉状、表面少
しだけ粗な円滑、淡黄色、半透明のコロニー。 （ｉ）肉汁液体培養：生育良好で混濁あり菌膜無し。 （ｊ）肉汁ゼラチン穿刺培養：生育良好で液化する。 （ｋ）リトマスミルク：ペプトン化するが、ミルクの凝
固なし、リトマスの変化なし。
【００１３】（Ｂ）生理的性質 （ａ）硝酸塩の還元：陽性 （ｂ）脱窒反応：陰性 （ｃ）ＭＲテスト：陰性 （ｄ）ＶＰテスト：陽性 （ｅ）インドール生成：陰性 （ｆ）硫化水素生成：陰性 （ｇ）澱粉加水分解：陽性 （ｈ）クエン酸の利用：陽性 （ｉ）無機窒素源の利用：硝酸塩を利用するが、アンモ
ニウム塩は利用しない。 （ｊ）色素の生成：陰性 （ｋ）ウレアーゼ：陰性 （ｌ）オキシダーゼ：陽性 （ｍ）カタラーゼ：陽性 （ｎ）生育の温度範囲：５５℃以下 （ｏ）生育のｐＨ範囲：ｐＨ　６．６〜１０．３で生育
可能。 （ｐ）酸素に対する態度：好気的 （ｑ）ＯＦテスト：酸化型（Ｏ型） （ｒ）塩化ナトリウムに対する耐性：１０％塩化ナトリ
ウム存在下で生育する。 （ｓ）糖からの酸生成及びガス生成
【００１４】
【表１】
【００１５】アルカリプロテアーゼＫ−１６は、例えば
当該ＫＳＭ−１６を後記参考例に従って培養し、培養液
より採取することにより製造される。
【００１６】本発明酵素固形製剤中の酵素の含有量は、
特に制限されないが、一般に０．０１〜２０％が好まし
い。
【００１７】本発明酵素固形製剤には、必要に応じて、
製剤の比活性を一定に保つための希釈剤（例えば増量剤
、充填剤等）、乾燥促進剤、緩衝剤等を配合することが
できる。乾燥促進剤としては、例えば塩化カルシウム、
硫酸ナトリウム等が挙げられる。増量剤又は充填剤とし
ては例えば硫酸塩、ハロゲン化物、炭酸塩、リン酸塩、
ケイ酸塩、ホウ酸塩が挙げられる。より具体的には以下
の化合物が挙げられる。 硫酸塩：硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸カルシウ
ム、硫酸マグネシウム、硫酸亜鉛、硫酸第１鉄、チオ硫
酸ナトリウム、硫酸アルミニウム ハロゲン化物：塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カ
ルシウム、塩化マグネシウム、臭化カリウム炭酸塩：炭
酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウム、炭
酸カルシウム、炭酸マグネシウムリン酸塩：リン酸ナト
リウム、リン酸水素ナトリウム、リン酸２水素ナトリウ
ム、リン酸カリウム、リン酸水素カリウム、リン酸２水
素カリウム、ピロリン酸ナトリウム ケイ酸塩：ケイ酸ナトリウム、メタケイ酸ナトリウム、
ケイ酸カリウム、ケイ酸カルシウム ホウ酸（塩）：ホウ砂、ホウ酸カリウム、ホウ酸等が例
示できる。これらは単独或いは２種以上を混合して使用
される。更には造粒又は酵素剤の分野で公知の着色剤、
安定剤等も適宜使用でき、又、賦香剤、消香剤、帯電防
止剤等の添加もできる。
【００１８】本発明の酵素固形製剤は、例えば２糖類を
含有する酵素水溶液を常法に従って噴霧乾燥して固形化
することにより製造される。ここで原料となる２糖類を
含有する酵素水溶液中には、目的とする酵素固形製剤の
組成に必要な成分が全て配合されていることが好ましい
。
【００１９】本発明方法を実施するには、上記酵素水溶
液を常法に従って、すなわち、通常の噴霧乾燥機を用い
て、乾燥すればよい。噴霧乾燥機には、通常ノズル型と
ディスク型とがあるが、目的とする酵素固形製剤の粒径
により使い分けることができる。小さい粒径の製剤を得
る場合は、ノズル型が好ましく、大きい粒径の製剤を得
る場合はディスク型が好ましい。このようにして粉末状
、細粒状、顆粒状のいずれの製剤をも得ることができる
。
【００２０】乾燥に用いる熱風温度は、１００〜２００
℃、特に１３０〜１７０℃が好ましく、排風温度（酵素
水溶液の温度に相当する）は、５０〜１００℃、特に６
０〜１００℃が好ましい。
【００２１】
【発明の効果】本発明によれば、噴霧乾燥によって酵素
がほとんど失活せず、比活性の高い酵素固形製剤が得ら
れる。また、得られた本発明酵素固形製剤は、長時間熱
処理しても失活せず、熱安定性に優れたものである。更
には機械的圧力に対しても優れた耐性を有するものであ
る。
【００２２】
【実施例】次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明する
が、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２３】参考例１ プロテアーゼ産生菌株の分離、採取： （１）土壌のサンプルの約１ｇを滅菌生理食塩水１０ｍ
ｌに懸濁し、８０℃にて２０分間放置し熱処理した。熱
処理上清液　０．１ｍｌをケラチンハロー寒天培地へ接
種し、３０℃で４８時間静置培養した。用いたケラチン
ハロー寒天培地の組成は以下に示す通りである。 グルコース　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　１％酵母エキス　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．２％獣
毛ケラチン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　１％カルボキシメチルセルロース　　　
　　　　　　　　　　１％リン酸第一カリウム　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　０．１％硫酸マグ
ネシウム・７水塩　　　　　　　　　　　　　　　０．
０２％寒天　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　１．５％
【００２４】
（２）上記培地組成物に、別滅菌を施した１０％炭酸ナ
トリウムを１％添加し、最終ｐＨを１０．５に調整後、
平板培地を作製した。培養後、生育したコロニーの周囲
にハローを生じたものを選抜し、同培地で２〜３回純化
し、均一のプロテアーゼ生産菌を得た。
【００２５】（３）上記（２）で得たこれらの菌株を以
下に示す液体培地へ接種し、３０℃で好気的に４８時間
振盪培養を行った。 グルコース　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　２．０％ポリペプトンＳ　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１．０％酵
母エキス　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　０．０５％リン酸第一カリウム　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．１％硫酸マ
グネシウム・７水塩　　　　　　　　　　　　　　　０
．０２％炭酸ナトリウム（別滅菌）　　　　　　　　　
　　　　　　１．０％ｐＨ　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０．５培
養終了後、得られた培養物を遠心分離（３０００ｒｐｍ
；１０分間）して菌を除去し、得られた培養上清を酵素
液とした。
【００２６】（４）上記（３）で得られた酵素液から凍
結乾燥により粗酵素サンプルを調製し、市販液体洗剤中
における４０℃での保存安定性評価を行った。そのなか
から、最も安定性に優れる酵素を生産するものの一菌株
としてバチルス・エスピー　　ＫＳＭ−Ｋ１６株を得た
。
【００２７】参考例２ 菌体の培養、アルカリプロテアーゼＫ−１６の精製：（
１）参考例１で得られた好アルカリ性細菌、バチルス・
エスピー　　ＫＳＭ−Ｋ１６を以下の液体培地（３．０
ｌ）　に接種し、３０℃で好気的に４８時間振盪培養を
行い、アルカリプロテアーゼＫ−１６を生産させた。 グルコース　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　２．０％魚肉エキス　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１．０
％大豆粉　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　１．０％硫酸マグネシウム　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．０
２％リン酸第一カリウム　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　０．１％ｐＨ　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０．０
【００２８】（２）培養終了後、得られた培養物３ｌ　
を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ；５分間）して菌を除
去し、その上清液を凍結乾燥した。凍結乾燥粉末２ｇを
イオン交換水１０ｍｌに溶解（粗酵素液）した後、同溶
液を透析膜を用いて１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（２ｍ
Ｍ　Ｃａ２＋添加、ｐＨ７．５　）に対して一晩透析し
、２６ｍｌの透析処理液（活性３．１５Ｐ．Ｕ．／ｍｌ
、比活性１．９７Ｐ．Ｕ．／ｍｇ蛋白）を得た。次に、
１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（２ｍＭ　Ｃａ２＋添加、
ｐＨ７．５　）で平衡化したＣＭ−５２セルロース担体
を充填したカラムにかけ、同緩衝液でカラム内を洗浄し
た後、０〜０．１５Ｍ　塩化ナトリウムを含む同緩衝液
でアルカリプロテアーゼＫ−１６を溶出させた。この活
性画分を集めたところ全量は１５ｍｌ、活性は１．１２
Ｐ．Ｕ．／ｍｌ、比活性は５．７５Ｐ．Ｕ．／ｍｇ蛋白
であった。そして、当溶液を５０ｍＭトリス−塩酸緩衝
液（１０ｍＭＣａ２＋　、０．２Ｍ塩化ナトリウム添加
、ｐＨ８．０　）に対して一晩透析した後、限外濾過（
アミコン社製、分画分子量　５，０００）により濃縮し
、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（１０ｍＭ　Ｃａ２＋、
０．２Ｍ塩化ナトリウム添加、ｐＨ８．０　）で平衡化
したセファデックスＧ−５０（ファルマシア社製）のゲ
ル濾過クロマトグラフィーにかけ同緩衝液にて展開させ
た。ここで得られた活性画分は全量１１．５ｍｌ、活性
は　０．９Ｐ．Ｕ．／ｍｌ、比活性は６．０３Ｐ．Ｕ．
／ｍｇ蛋白であった。当溶液を、イオン交換水に対して
一晩透析後、活性０．５６Ｐ．Ｕ．／ｍｌ、比活性５．
６０Ｐ．Ｕ．／ｍｇ蛋白の溶液を得た。
【００２９】斯くして得られたアルカリプロテアーゼＫ
−１６は、以下に示すような酵素学的性質を有する。 尚、以下において、酵素活性の測定は次の如くして行っ
た。
【００３０】カゼイン１％を含む５０ｍＭホウ酸−Ｎａ
ＯＨ緩衝液（ｐＨ１０）１ｍｌを　０．１ｍｌの酵素溶
液と混合し、４０℃、１０分間反応させた後、反応停止
液（０．１２３Ｍトリクロロ酢酸−０．２４６Ｍ酢酸ナ
トリウム−０．３６９Ｍ酢酸）２ｍｌを加え、３０℃、
２０分間放置した。次に濾紙（ワットマン社製、Ｎｏ．
２）で濾過し、濾液中の蛋白分解物をフォーリン・ロー
リー法の改良法によって測定した。
【００３１】また１Ｐ．Ｕ．は、上記反応条件下におい
て１分間に１ｍｍｏｌｅ　のチロシンを遊離する酵素量
とした。
【００３２】（１）作用 高アルカリ性条件下で各種蛋白質に対して作用する。
【００３３】（２）基質特異性 アルカリプロテアーゼＫ−１６の各種基質に対する特異
性を、他の市販プロテアーゼと比較した。用いた基質は
、カゼイン、尿素変性ヘモグロビン、獣毛ケラチン、エ
ラスチンでこれらに対する分解活性を測定した。５０ｍ
Ｍホウ酸−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０．０）に各基質を
１％（尿素変性ヘモグロビンは　２．２％）加え、各酵
素液　０．５×１０−４Ｐ．Ｕ．（エラスチンは　３．
５×１０−４Ｐ．Ｕ．）を添加し、４０℃、１０分間反
応を行った。各々の基質におけるアルカリプロテアーゼ
Ｋ−１６の活性を１００とした時の各酵素の活性を表２
に示す。
【００３４】
【表２】
【００３５】この結果からも明らかなように、アルカリ
プロテアーゼＫ−１６は水可溶性及び水不溶性の蛋白質
を良好に分解し、現在洗剤用酵素として良く用いられて
いる市販酵素Ａ、市販酵素Ｂと比較して、特にエラスチ
ンに対して優れた作用を示す。
【００３６】（３）至適ｐＨ 各種ｐＨ緩衝液（５０ｍＭ）中に最終濃度０．９１％と
なるようにカゼインを加え、アルカリプロテアーゼＫ−
１６を　５．２×１０−５Ｐ．Ｕ．加えて４０℃、１０
分間反応して活性を測定した。その結果、アルカリプロ
テアーゼＫ−１６の至適ｐＨは１１．０〜１２．３であ
る。尚、使用した各種緩衝液、及びそのｐＨ範囲は次の
とおりである。 酢酸緩衝液　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｐ
Ｈ３．９〜５．７　リン酸緩衝液　　　　　　　　　　
　　　　　　　ｐＨ６．６〜８．３　炭酸緩衝液　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　ｐＨ９．２〜１０．
９リン酸−ＮａＨＯ緩衝液　　　　　　　　　　　ｐＨ
１０．９〜１２．７ＫＣｌ−ＮａＯＨ緩衝液　　　　　
　　　　　　　　　ｐＨ１０．９　〜１２．６
【００３
７】（４）ｐＨ安定性 （３）で用いたのと同じ緩衝液（２０ｍＭ）中に　７．
９×１０−３Ｐ．Ｕ．のアルカリプロテアーゼＫ−１６
を加え、２５℃で４８時間放置した。この処理液を５０
ｍＭホウ酸−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０．０）で４０倍
に希釈後、活性を測定した。その結果、アルカリプロテ
アーゼＫ−１６は、Ｃａ２＋非存在下ではその安定領域
がｐＨ　５．５〜１２．０であり、２ｍＭ　Ｃａ２＋存
在下ではその安定域はｐＨ５．０　〜１２．０であった
。
【００３８】（５）至適温度 基質として０．９１％のカゼインを含む５０ｍＭホウ酸
−ＮａＨＯ緩衝液（ｐＨ１０．０）に３．１　×１０−
５Ｐ．Ｕ．のアルカリプロテアーゼＫ−１６を加え、１
０分間各温度で反応を行った。４０℃での活性を１００
％として各温度での相対活性を求めた。その結果、アル
カリプロテアーゼＫ−１６の至適温度は、Ｃａ２＋非存
在下では５５℃であり、５ｍＭ　Ｃａ２＋存在下では７
０℃であった。
【００３９】（６）耐熱性 ２０ｍＭホウ酸−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．５　）に　
１．６×１０−３Ｐ．Ｕ．のアルカリプロテアーゼＫ−
１６を加え、各温度で１０分間熱処理し、氷冷後、５０
ｍＭホウ酸−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０．０）で５倍希
釈した。そして０．９１％カゼインを基質として活性を
測定した。未処理時の活性を１００％として各処理温度
での相対活性を求めた。その結果、Ｃａ２＋非存在下で
５０℃、５ｍＭ　Ｃａ２＋存在下では６０℃まで上記熱
処理条件下で、９０％以上の活性が維持された。
【００４０】（７）分子量 アルカリプロテアーゼＫ−１６の分子量をドデシル硫酸
ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動法により調べた。分子量マーカーには低分子量用マー
カーキット（バイオラッド）すなわち、ホスホリラーゼ
ｂ（分子量：９７，４００）、牛血清アルブミン（分子
量：６６，２００）、卵白アルブミン（分子量：４２，
７００）、カルボニックアンヒドラーゼ（分子量：３１
，０００）、大豆トリプシンインヒビター（分子量：２
１，５００）、リゾチーム（分子量：１４，４００）を
用いた。この方法によりアルカリプロテアーゼＫ−１６
の分子量は２８，０００±１，０００　と決定した。
【００４１】（８）等電点 アルカリプロテアーゼＫ−１６の等電点を等電点電気泳
動法により調べた。カラム用の両性担体にはサーバライ
ト９−１１を用いた。この方法によりアルカリプロテア
ーゼＫ−１６の等電点は１０．５以上であることがわか
った。
【００４２】（９）金属イオンの影響 各種金属イオンについて、アルカリプロテアーゼＫ−１
６に対して与える影響を調べた。まず、２０ｍＭホウ酸
−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．５　）に各種金属塩を１ｍ
Ｍの濃度で添加し、そこに　３．９×１０−３Ｐ．Ｕ．
の酵素を加えて３０℃、２０分間放置した。その後、５
０ｍＭホウ酸−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０．０）で５倍
に希釈して残存活性を測定した。 残存活性は、金属塩無添加で同様に処理した酵素活性に
対する相対値で表した。結果を表３に示した。この結果
から明らかなように、アルカリプロテアーゼＫ−１６は
、Ｈｇ２＋及びＣｕ２＋により活性が阻害されることが
わかる。また、前記（５）及び（６）の結果よりＣａ２
＋により熱安定性が向上することがわかる。
【００４３】
【表３】
【００４４】（１０）阻害剤の影響 一般的な酵素阻害剤について、アルカリプロテアーゼＫ
−１６に対して与える影響を調べた。１０ｍＭリン酸緩
衝液（ｐＨ７．０　）に各種阻害剤を所定濃度になるよ
うに加え、そこにアルカリプロテアーゼＫ−１６　７．
９×１０−３Ｐ．Ｕ．を添加し、３０℃で２０分間放置
した。その後、該処理液をイオン交換水にて２０倍希釈
し、残存活性を測定した。残存活性は、阻害剤無添加で
同様に処理した酵素活性に対する相対値で表した。結果
を表４に示した。この結果から明らかなように、アルカ
リプロテアーゼＫ−１６は、セリンプロテアーゼの阻害
剤であるジイソプロピルフルオロリン酸（ＤＦＰ）、フ
ェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、キモ
スタチンで活性が阻害されることから、活性中心にセリ
ン残基を有するプロテアーゼであることがわかる。
【００４５】
【表４】
【００４６】（１１）界面活性剤の影響６．６　×１０
−２Ｐ．Ｕ．の酵素液を、所定濃度の各種界面活性剤を
溶かした５ｍｌの０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９
．０　、エタノールを１０％含む）に加え４０℃で４時
間放置し、その後５０ｍＭホウ酸−ＮａＯＨ緩衝液（ｐ
Ｈ１０．０）で２０倍希釈後、残存活性を測定した。処
理時間０分での活性を１００％とし残存活性を相対値で
表した。結果を表５に示した。この結果から明らかなよ
うにアルカリプロテアーゼＫ−１６は、各種界面活性剤
が高濃度（１〜１０％）存在しても高い安定性を示すも
のであった。
【００４７】
【表５】
【００４８】実施例１ （１）酵素水溶液として参考例１で得られたアルカリプ
ロテアーゼＫ−１６粗酵素５％、塩化カルシウム０．２
　％、硫酸ナトリウム２．５　％を含む水溶液を用いた
。この酵素水溶液に、０．５　〜　５．０％となるよう
に乳糖を添加し、サンプル１〜４を調製した。 （２）コントロール（乳糖末添加）及びサンプル１〜４
をアトマイザー式噴霧乾燥機にて、１５０℃の熱風を用
い、排風温度６０℃で噴霧乾燥し、顆粒状酵素固形製剤
を得た。 （３）酵素活性を測定し、固形製剤化前後の酵素活性収
率を求めた。その結果を表６に示す。
【表６】 表６より、酵素水溶液に乳糖を添加した場合、噴霧乾燥
によって酵素の失活が防止された。
【００４９】実施例２ 噴霧乾燥条件として、排風温度を６０〜７０℃に変化さ
せる以外は実施例１と同様にして、顆粒状酵素固形製剤
を調製し、その酵素活性収率を測定した。その結果を表
７に示す。
【表７】 表７より、酵素水溶液に乳糖を添加すると、噴霧乾燥条
件が苛酷でも酵素の失活が防止できることがわかる。
【００５０】実施例３ 実施例１で得た顆粒状酵素固形製剤を９０℃の条件下に
１時間放置して残存活性率を測定し、熱安定性を評価し
た。その結果を表８に示す。
【表８】 表８より、本発明方法により得られた製剤は、固形状に
おける熱安定性に優れていることがわかる。

Claims (20)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】　　２糖類を含有することを特徴とする酵
    素固形製剤。
  2. 【請求項２】　　２糖類が、マルトース型２糖類及びト
    レハロース型２糖類から選ばれる１種又は２種以上であ
    る請求項１記載の酵素固形製剤。
  3. 【請求項３】　　マルトース型２糖類が乳糖である請求
    項２記載の酵素固形製剤。
  4. 【請求項４】　　２糖類の含量が、酵素に対し１〜１０
    ０重量％である請求項１〜３のいずれかの項記載の酵素
    固形製剤。
  5. 【請求項５】　　２糖類の含量が、酵素に対し１０〜１
    ００重量％である請求項１〜３のいずれかの項記載の酵
    素固形製剤。
  6. 【請求項６】　　酵素がリパーゼ、セルラーゼ、プロテ
    アーゼ、アミラーゼ、エステラーゼ及びデキストラナー
    ゼから選ばれる１種又は２種以上である請求項１記載の
    酵素固形製剤。
  7. 【請求項７】　　酵素が、セルラーゼ及び／又はプロテ
    アーゼである請求項６記載の酵素固形製剤。
  8. 【請求項８】　　酵素が、アルカリプロテアーゼＫ−１
    ６である請求項６又は７記載の酵素固形製剤。
  9. 【請求項９】　　酵素の含量が、酵素固形製剤中０．０
    １〜２０重量％である請求項１、６〜８いずれかの項記
    載の酵素固形製剤。
  10. 【請求項１０】　　２糖類を含有する酵素水溶液を噴霧
    乾燥して固形化することを特徴とする酵素固形製剤の製
    造方法。
  11. 【請求項１１】　　２糖類が、マルトース型２糖類及び
    トレハロース型２糖類から選ばれる１種又は２種以上で
    ある請求項１０記載の製造方法。
  12. 【請求項１２】　　マルトース型２糖類が、乳糖である
    請求項１１記載の製造方法。
  13. 【請求項１３】　　酵素水溶液中の２糖類の含有量が、
    酵素に対し１〜１００重量％である請求項１０〜１２記
    載の製造方法。
  14. 【請求項１４】　　酵素水溶液中の２糖類の含有量が、
    酵素に対し１０〜１００重量％である請求項１３記載の
    製造方法。
  15. 【請求項１５】　　噴霧乾燥が、５０℃以上の条件下で
    行われるものである請求項１０記載の製造方法。
  16. 【請求項１６】　　噴霧乾燥が、１００〜２００℃の熱
    風を用いて行われるものである請求項１０記載の製造方
    法。
  17. 【請求項１７】　　噴霧乾燥が、１３０〜１７０℃の熱
    風を用いて行われるものである請求項１０記載の製造方
    法。
  18. 【請求項１８】　　酵素が、リパーゼ、セルラーゼ、プ
    ロテアーゼ、アミラーゼ、エステラーゼ及びデキストラ
    ナーゼから選ばれる１種又は２種以上である請求項１０
    記載の製造方法。
  19. 【請求項１９】　　酵素が、セルラーゼ及び／又はプロ
    テアーゼである請求項１８記載の製造方法。
  20. 【請求項２０】　　酵素が、アルカリプロテアーゼＫ−
    １６である請求項１０又は１９記載の製造方法。
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Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996002631A1 (fr) * 1994-07-20 1996-02-01 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Procede pour produire une carboxyesterase seche stabilisee
WO1996015235A1 (fr) * 1994-11-11 1996-05-23 Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha Composition de transcriptase inverse stable a la conservation
JPH11504035A (ja) * 1995-04-28 1999-04-06 インヘイル・セラピユーテイツク・システムズ 糖により安定化されたガラス相の組成物
JP2009195250A (ja) * 2006-03-31 2009-09-03 Toyobo Co Ltd 可溶性グルコースデヒドロゲナーゼ（ｇｄｈ）を含む組成物の安定性を向上する方法
US7871805B2 (en) 2006-03-31 2011-01-18 Toyo Boseki Kabushiki Kaisha Glucose dehydrogenase
JP2012504421A (ja) * 2008-10-03 2012-02-23 イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー ペルヒドロラーゼの安定化
WO2022071417A1 (ja) * 2020-09-29 2022-04-07 キッコーマン株式会社 フラビン依存性乳酸デヒドロゲナーゼを含む組成物の安定性を向上する方法

Families Citing this family (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0748225B1 (en) * 1994-03-04 2004-06-09 Genentech, Inc. PHARMACEUTICALLY ACCEPTABLE DNase FORMULATION
DK0758018T3 (da) * 1995-07-28 2004-08-16 Basf Ag Saltstabiliserede enzympræparater
US6156715A (en) 1997-01-13 2000-12-05 Ecolab Inc. Stable solid block metal protecting warewashing detergent composition
US6258765B1 (en) 1997-01-13 2001-07-10 Ecolab Inc. Binding agent for solid block functional material
US6177392B1 (en) 1997-01-13 2001-01-23 Ecolab Inc. Stable solid block detergent composition
US6150324A (en) 1997-01-13 2000-11-21 Ecolab, Inc. Alkaline detergent containing mixed organic and inorganic sequestrants resulting in improved soil removal
TW409035B (en) 1997-06-04 2000-10-21 Gist Brocades Bv Starch-based enzyme granulates
CZ299636B6 (cs) * 1997-06-04 2008-10-01 Basf Aktiengesellschaft Zpusob prípravy granulátu obsahujícího fosfatázu,tento granulát, kompozice obsahující tento granulát, zpusob podporení rustu zvírat a použití uvedeného granulátu
DE69836098T3 (de) * 1997-12-20 2014-04-30 Genencor International, Inc. In einem wirbelschichtbett hergestelltes matrixgranulat
US5902844A (en) * 1998-02-02 1999-05-11 Applied Analytical Industries, Inc. Spray drying of pharmaceutical formulations containing amino acid-based materials
CA2324002C (en) * 1998-03-18 2008-10-07 Ecolab Inc. Solid block enzymatic cleaning with electrolytic control for clean-in-place systems
JP2002536005A (ja) * 1999-02-10 2002-10-29 デーエスエム・ナムローゼ・フェンノートシャップ 飼料酵素含有粒状物
DE19929257A1 (de) 1999-06-25 2000-12-28 Basf Ag Polymerbeschichtete, granulierte enzymhaltige Futtermittelzusätze und Verfahren zu deren Herstellung
US6624132B1 (en) 2000-06-29 2003-09-23 Ecolab Inc. Stable liquid enzyme compositions with enhanced activity
US7795199B2 (en) 2000-06-29 2010-09-14 Ecolab Inc. Stable antimicrobial compositions including spore, bacteria, fungi, and/or enzyme
DK1307547T3 (da) 2000-07-28 2006-03-20 Henkel Kgaa Hidtil ukendt amylolytisk enzym fra Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368) samt vaske- og rengöringsmidler med dette hidtil ukendte amylolytiske enzym
US6638902B2 (en) 2001-02-01 2003-10-28 Ecolab Inc. Stable solid enzyme compositions and methods employing them
US6632291B2 (en) 2001-03-23 2003-10-14 Ecolab Inc. Methods and compositions for cleaning, rinsing, and antimicrobial treatment of medical equipment
DK1397155T3 (en) 2001-06-21 2015-12-07 Genentech Inc Prolonged release formulation
KR100906838B1 (ko) 2002-01-15 2009-07-08 바스프 에스이 사료-효소를 함유하는 과립화물
US8399230B2 (en) 2006-10-12 2013-03-19 Kemin Industries, Inc. Heat-stable enzyme compositions
US7723281B1 (en) 2009-01-20 2010-05-25 Ecolab Inc. Stable aqueous antimicrobial enzyme compositions comprising a tertiary amine antimicrobial
US7964548B2 (en) 2009-01-20 2011-06-21 Ecolab Usa Inc. Stable aqueous antimicrobial enzyme compositions
CN101601441B (zh) * 2009-07-07 2012-09-05 广东溢多利生物科技股份有限公司 可溶性饲用酶及其制造方法
CN103773751A (zh) * 2012-10-22 2014-05-07 丰益(上海)生物技术研发中心有限公司 脂肪酶稳定剂

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR746391A (fr) * 1931-11-13 1933-05-27 Kalle & Co Ag Procédé pour la fabrication de préparations sèches et stables d'amylases pancréatiques
JPS60244288A (ja) * 1984-05-18 1985-12-04 Ookura Seiyaku Kk 安定なセラペプタ−ゼ粉末の製造方法

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996002631A1 (fr) * 1994-07-20 1996-02-01 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Procede pour produire une carboxyesterase seche stabilisee
WO1996015235A1 (fr) * 1994-11-11 1996-05-23 Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha Composition de transcriptase inverse stable a la conservation
JPH11504035A (ja) * 1995-04-28 1999-04-06 インヘイル・セラピユーテイツク・システムズ 糖により安定化されたガラス相の組成物
JP2009195250A (ja) * 2006-03-31 2009-09-03 Toyobo Co Ltd 可溶性グルコースデヒドロゲナーゼ（ｇｄｈ）を含む組成物の安定性を向上する方法
JP2010239969A (ja) * 2006-03-31 2010-10-28 Toyobo Co Ltd 可溶性グルコースデヒドロゲナーゼ（ｇｄｈ）を含む組成物の安定性を向上する方法
US7871805B2 (en) 2006-03-31 2011-01-18 Toyo Boseki Kabushiki Kaisha Glucose dehydrogenase
JP2012504421A (ja) * 2008-10-03 2012-02-23 イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー ペルヒドロラーゼの安定化
JP2012504420A (ja) * 2008-10-03 2012-02-23 イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー ペルヒドロラーゼの安定化
WO2022071417A1 (ja) * 2020-09-29 2022-04-07 キッコーマン株式会社 フラビン依存性乳酸デヒドロゲナーゼを含む組成物の安定性を向上する方法

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